DE2332065A1 - Verfahren zur herstellung von antiobiotika ws-3442 a,b,c,d und e, deren acylderivate und verfahren zur herstellung der acylderivate - Google Patents

Description

T 48 932

Anmelder: Fujisawa Pharmaceutica?.. Co, »Ltd.

Mo. 3, 4-chome, Dosho-ruaclii, IIigci3hi-:ai, Osaka/Japan

Verfahren zur Herstellung von Antiobiotika WS-3442 A,B,C,D und E, deren Acylderivate und Verfahren zur Herstellung der Acyl-

derivate

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antibiotika WS-3442 A,B,C₁D und E, wobei eine neue, Streptomyces wadayamensis genannte Spezies von Streptomyces in einem Nährmedium kultiviert wird, und sie betrifft ferner die Acylderivate dieser Antibiotica WS-3442 A,B,C,D und E sowie ein Verfahren zur Herstellung derselben.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Herstellung von Antibiotica Y/S-3442 A,B,C,D und E anzugeben, was durch Fermentierung von Streptomyces wadayamensis in einem Nährmedium bewirkt wird.

Aufgabe der Erfindung ist es ferner, die Acylderivate von WS-3442 A,B,C,D und E anzugeben, die ebenfalls gegenüber Mikroorganismen aktiv sind.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung der Acylderivate der Antibiotika WS-3442 A,B,O,D und E anzugeben, wobei das WS-3442 A,B,C,D und E enthaltende Nährmedium mit einem Acylierungsmittel behandelt wird.

WS-3442 A,B,C,D und E sind bekannte Verbindungen, denen in der Literatur die folgende chemische Struktur zugeordnet wird:

309883/U81

HOOC-CH (CHs) 3

L j_r_Hl^-ca₂R- (I)

2 ö COOH

R JRj

H	H
H	OCONH2
OCH5	OCONH2

A
B
C

D OCH₅ H E H OH

Literatur:

WS-3442 A : Britische Patentschrift 957

WS_r3442 B : Journal of the American Chemical Society, _9_3, Nr. 9, S. 2308 - 2310

WS-3442 C : Japanische Patentveröffentlichung 3286/1971 Journal of the American Chemical Society, 93,, Nr. 9, S. 2308 - 2310

WS-3442 D : Japanische Patentveröffentlichung 3286/1971 WS-3442 E : Biochemical Journal, 81, S. 591 - 596 (196I)

Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung von WS-3442 B durch Kultivierung von Streptomyces clavuligerus in "Program and Abstracts", S. I3 von "ELEVElWH INTERSCIEHCE CONFERENCE ON

309883/U81

ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY" (19. - 22. Oktober 1971) beschrieben.

Ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums WS-3442 C durch Kultivierung von Streptomyees lactamduratis wird in der japanischen Patentveröffentlichung 3286/1971 beschrieben.

Ein Verfahren zur Herstellung der Antibiotika WS-3442 A,D und E durch Fermentierung wurde jedoch in keiner Druckschrift gefunden.

Das Verfahren zur Herstellung der Antibiotika WS-3442 A,B,C,D und E wird durch Kultivierung einer neuen Spezies von Streptomyees , die Streptomyees wadayamensis genannt wurde, durchgeführt.

Bei dem zum erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Antibiotika WS-3442 A,B,C,D und E verwendbaren Mikroorganis¹-mus handelt es sich um eine vor kurzem aufgefundene Spezies von Streptomyces, die aus einer Bodenprobe isoliert wurde, welche in Wadayamacho, Hyogo Prefecture, Japan entnommen wurde.

Eine Kultur des lebenden Organismus wurde hinterlegt und zugefügt der permanenten Kulturtypensammlung der American iype Culture Collection unter der Nummer ATCC 21948, und wird hier und im folgenden Streptomyees wadayamensis genannt.

Es ist zu betonen, daß zur Herstellung dieser Antibiotika die Erfindung nicht auf die Verwendung des speziellen hier beschriebenen Organismus, der zur Erläuterung angegeben wird, beschränkt ist. Erfindungsgemäß sind auch Mutanten verwendbar, dtie von dem angegebenen Organismus in üblicher bekannter Weise erzeugt werden, z. B. durch Rö*nt genstrahl en, Ultraviolettbestrahlung oder Stickstofflost.

3Ü988 3/U81

Streptomyces wadayamensis ATCC 21948 zeigt die folgenden morphologischen, Kultur- und physiologischen Charakteristxka.

1. Morphologische Eigenschaften.

Die Morphologie der Kultur wurde mikroskopisch untersucht mit Mycel, das auf anorganische]
15 Tage lang gewachsen war.

Mycel, das auf anorganischen Salzen-Stärkeagar bei 3O⁰C Λ0 bis

Die Lufthyphen: dieser Kultur ist eng verzweigt und die Spitze der Lufthyphen geschlungen oder spiralförmig und bildet eine Kette von Konidien.

Die Konidie ist kugelförmig oder ellyptisch und die Oberfläche der Konidie ist dornig.

2· Kultur-Charakteristika.

Der Stamm weist die folgenden Kultur-Charakteristika auf, wenn er auf Medien des in der folgenden Tabelle angegebenen Typs unter 30⁰C 10 bis 15 Tage lang gewachsen ist.

309883/-U81

_ 5 —

Medium

Wachstum

Luftmycel lösliches Pigment Bemerkungen

CZAPEK^fs-Agar

Glucose-Asp aragin—
agar

Glycerin-

Asparagin-

anorganische

Salze-Stärke-

Tyrosinagar

Nähragar

Hefemalzagar

Hafermehlagar

Pepton-Hefe-Eisenagar

BENNETT'S
Agar

Milch

Gelatineansatz

(bei Zimmertemperatur
Tage lang)

flach, sich ausbreitend, schwach kremig gelb

flach, sich ausbreitend, elfenbeinfarbig

flach, sich ausbreitend, schwach
kremfarbig

runzelig, etwas erhoben, graugelb

runzelig, dunkelbraun

hefeähnlich, grau-kremfarbig

schwach
braun

schwach gelb

flach, dunkelgrau

weiß

gering, pul\e*ig weiß

gering, weiß

gering, pulwezig weiß

pulverig,grau und weiß

pulverig,schwach graubraun

keines

baumwollarti g, bestand Wassertropfen ,schwach grau, weiß

pulverig, gary keines

baumwollartig, grauweiß Hydrolyse von Stärke: mäßig bis stark

ringförmig, pulverig, teildunkelgrau weise weiß

runzelig, pulverig, grau schwarz

keines keines keines keines

keines braun

keines

keines

dunkelbraun

keines dasselbe

Wachstum bei 37^bC

grau- Koagulation: braun schwach

Peptonisierung: schwach

schwarz Verfltissi-(begung:schwach schränkte Diffusion)

309883/1481

3. Physiologische Eigenschaften.

(1) Optimale Wachsturnstemperatür: 30 bis 37⁰C

(2) Optimaler pH-Wert für Wachstum: 6 bis 8

(3) Erzeugung von Tyrosinase: nicht festgestellt

(4) Erzeugung von Melanin-ähnlichem Pigment: festgestellt

(5) Hydrolyse von Stärke: hydrolysiert

(6) Verflüssigung von Gelatine: nicht verflüssigt

(7) Koagulation und Peptonisierung von entrahmter Milch: nicht festgestellt

4. Kohlenstoff quell e-Verwertungsmust er nach der Pridham-Gottlieb-Methode:

Kohlenstoffquelle Wachstum L-Arabinose +

D-Xylose +

D-Glucose +

D-Fructose +

Ehamnose —

Saccharose ++

Eaffinose -

D-Mannit ++

Inosit +

++ = gute Verwertung

+ s Verwertung

+ β wahrscheinliche Verwertung

- =s keine Verwertung

ORIGINAL INSPECTED

309883/ 1481

Die Antibiotika WS-3442 A,B,C,D und E werden erzeugt, wenn ein zu Streptomyces wadayamensis gehöriger Stamm in einem Nährme— dium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und ein anorganisches Salz enthält, unter gesteuerten submersen aeroben Bedingungen gezüchtet wird. Beim Nährmedium kann es sich um ein beliebiges Medium handeln, das durch einen zu Streptomyces wadayamensis gehörenden Stamm verwertet werden kann,-

Di e bevorzugten Kohlenstoff quell en in dem Nährmedium sind Kohlehydrate, z. B. Glucose, Fructose, Saccharose, Mannit, Glycerin oder Stärke. Andere verwendbare Kohlenstoffquellen sind Arabinose, Xylose, Inosit, Zucker, Dextrin und Melasse.

Die bevorzugten Stickstoff quellen sind z. B. Fleischextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenmehl, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser und getrocknete Hefe, sowie ferner anorganische und organische Stickstoffverbindungen, z. B. Ammoniumsalze (z. B. Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat), und Harnstoff.

Die Kohlenstoff- und Stickstoff quell en brauchen, obwohl sie in vorteilhafter Weise in Kombination miteinander verwendet werden, nichitin reiner Form angewandt zu werden, da weniger reine Stoffe, die Spuren an Wuchsfaktoren und beträchtliche Mengen an Mineralnährstoffen enthalten, ebenfalls verwendbar sind. Gewünschtenfalls können dem Nährmedium Mineralsalze zugesetzt werden, z. B. Calciumcarbonat, Natrium- oder Kaliumphosphat, Natrium- oder Kaliumchlorid, Magnesiumsalz oder Kupfersalz. Erforderlichenfalls, insbesondere wenn das Kulturmedium merklich schäumt, kann ein Entschäumungsmittel zugegeben werden, z. B. flüsiiges Paraffin, Fettöl, Pflanzenöl, Mineralöl oder Silicone.

ORlGI¹NAL INSPECTED

309883/1-481

- 8 - 2

Wie es zur Herstellung anderer Antibiotika in großen Mengen ebenfalls bevorzugt ist, werden zur Erzeugung von WS-3442 A,B,C,D und E in großen Mengen submerse aerobe Kulturbedin— gungen bevorzugt. Zur Erzeugung in kleinen Mengen wird eine Schüttel- oder Oberflächenkultur in einem Kolben oder einer Flasche angewandt. Wird die Züchtung in großen Tanks durchgeführt, so wird es ferner bevorzugt, die vegetative Form des Organismus zum Animpfen in den Produktionstanks zu verwenden, um Wachstumsverzögerungen im Verfahren zur Herstellung der Antibiotika zu vermeiden. Es erweist sich daher als wünschenswert, zunächst ein vegetatives Impfmaterial des Organismus herzustellen durch Eeimpfen einer vergleichsweise geringen Menge an Kulturmedium mit Sporen oder Mycelien des Organismus und diese zu kultivieren und das kultivierte vegetative Impfmaterial unter aseptischen Bedingungen in große Tanks zu überführen. Das Medium, in dem das vegetative Impfmaterial erzeugt wird, kann praktisch dasselbe oder verschieden sein von demjenigen Medium, das zur Erzeugung von WS-3442 A,B,C,D und E verwendet wird.

Das Rühren und die Belüftung des Kulturgemisches kann in verschiedenster Weise bewirkt werden. Das Rühren kann bewirkt werden durch einen Propeller oder eine ähnliche mechanische Rührvorrichtung, durch Drehen oder Schütteln des Fermenters, durch verschiedene Pump vorrichtungen oder durch Durchleiten von steriler Luft durch das Medium.· Die Belüftung kann durch Durchleiten von steriler Luft durch das Fermentierungsgemisch bewirkt werden.

Die Fermentierung wird in der Regel bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 40⁰C, vorzugsweise von 30⁰C, über eine Zeitdauer von 30 bis 100 Stunden durchgeführt.

ORIGINAL INSPECTEO

3/1481

23:>065

Die erfindungsgemäß gewonnenen Antibiotika WS-3442 A,B,C,D und E können aus dem Kulturmedium nach bekannten, zur Isolierung anderer Antibiotika üblicherweise verwendeten Methoden isoliert werden.

In der Regel werden die meisten dieser gebildeten Antibiotika in der kultivierten Brühe gefunden und demzufolge können diese Antibiotika aus dem Piltrat, das durch Filtrieren oder Zentrifugieren der Nänrbrühe gewonnen wurde, nach üblichen bekannten Methoden abgetrennt werden, z.B. durch Extraktions- oder Adsorptionstechniken·

Die Extraktion wird durchgeführt durch Behandlung des Piltrats mit einem organischen Lösungsmittel, in welchem diese Antibiotika gelöst werden können, z. B. Pyridin, Alkohole, beispielsweise Methanol, Äthanol oder Butanol, Ketone, z. B. Aceton, oder wäßrige Alkohole, z. B. wäßriges Methanol, Äthanol oder Butanol, oder mit einer alkalischen wäßrigen Lösung, z. B. wäßrigem Pyridin, wäßrigem Ammoniak oder wäßrigem Natriumhydroxyd. Andere Lösungsmittel mit ähnlichem Charakter sind ebenfalls verwendbar. Kombinationen dieser Lösungsmittel sind in vorteilhafter Weise anwendbar·

Wahlweise können diese Antibiotika aus der Kulturbrühe dadurch abgetrennt werden, daß die Antibiotika in der filtrierten Brühe an Adsorptionsmitteln adsorbiert werden, z. B. an Aktivkohle, aktiviertem Aluminiumoxyd, Silicagel, Magnesiumaluminiumsilicat, Ionenaustauscherharz oder Cellulosepulver, worauf diese adsorbierten Antibiotika von dem Adsorptionsmittel eluiert werden mit Hilfe eines polaren organischen Lösungsmittels, in denen die Antibiotika löslich sind.

ORIGINAL INSPECTED 109883/ U81

Die Antibiotika können von dem in der angegebenen Weise gewonnenen Extrakt oder Eluat isoliert werden durch Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels, in dem diese Antibiotika unlöslich sind, zu der Lösung, oder wahlweise durch Einstellen des pH-Werts der Lösung, so daß diese Antibiotika in der Lösung ausgefällt werden können. In diesem Isolierprbzeß können der Extrakt oder das Eluat selbstverständlich gewünschi,enfalls auf ein vergleinsweise kleines Volumen konzentriert werden durch Verdampfen des Lösungsmittels, Die auf diese Weise isolierten Antibiotika werden in üblicher bekannter Weise gereinigt, z. B. durch Umkristallisation oder Chromatographie.

Für jedes der in der angegebenen Weise isolierten Antibiotika WS-3442 A,B,C,D und E wurde der Kachweis erbracht, daß es sich um eine bekannte Verbindung der im folgenden angegebenen chemischen Struktur handelt aufgrund der Ergebnisse der folgenden Experimente, der Interpretation der physikalischen und chemischen Eigenschaften wie unten angegeben, sowie anderer Untersuchungen.

WS-3442 A

HOOC-CH (CH₂), CONH

'6 COOH

7-( S-Amino-S-carboxyval eramido) -B-

ORiGINAL INSPECTED

30 9 883/1481

33/HG5

23

WS-3442 A ist ein weißes Pulver und das in der beigefügten Figur 1 dargestellte Ultraviolett-Absorptionsspektrum (!lösungsmittel: Phosphatpufferlösung von pH 6,4) zeigt das Maximum bei 262 nyu ( E # 143). Das Infrarot-Absorptionsspektrum (suspendiert in Nujolmull) ergibt den Gipfel bei 1760 cm" , der bedingt ist durch das Carbonyl des 4-gliedrigen Lactams. Das kernmagnetische Resonanz Spektrum gibt die folgenden Signale ( S ppm; in Deuterium; TKB interner Standard).

1,85 (4H, Multiplett)

2,01 (3H, Singlett)

2,45 (2H, Multiplett)

3,23 - 3,65 (2H, Dublett, J = 18 HZ)

3,80 (1H, Multiplett)

5,1 (1H, Dublett, J = 4,5 HZ)

5,58 (1H, Dublett, J = 4,5 HZ)

8,32 (1H, Singlett)

Der Rf-Wert in der Dünnschicht-Chromatographie wurde bestimmt unter Verwendung von ITinhydrin als Anfärbemittel und unter Verwendung des Gemisches aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4:1:2) als Lösungsmittelsystem, wobei der Rf-Wert 0,19 betrug.

Experiment 1

40 mg eines Pulvers von WS-3442 A, das gemäß dem folgenden Beispiel 1 erhalten worden war, wurde in 2 ml einer Phosphatpufferlösung von pH 7,0 gelöst und die erhaltene Lösung wurde tropfenweise unter Rühren mit 0,1 ml Phenylisocyanat versetzt. Danach wurde das Gemisch 1 Stunde lang gerührt und Diphenylharnstoff wurde abgetrennt, sobald festgestellt worden war, daß der Ninhydrintest negativ ist. Die wäßrige Schicht wurde auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 mit 0,1 η-Salzsäure eingestellt

" 30988 3/U81

ORIGINAL INSPECTS)

- 12 - 233,1065

und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde mit einer wäßrigen Lösung, die mit Natriumchlorid gesättigt war, gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet, worauf das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert wurde. Der erhaltene Rückstand wurde getrocknet und ergab 30 mg eines weißen Pulvers.

Kernmagnetische Resonanz:

Lösungsmittel: Deuterium + Natriumbicarbonat Innerer Standard: TMS

S -Wert (ppm)	(4H, Quartett)	= 18	HZ)
1,80	(3H, Singlett)
1,90	(2H, Multiplett)	4,5	HZ)
2,40	(2H, Quartett, J	4,5	HZ)
3,02 bis 3,52	(1H, Multiplett)
4,17	(1H, Dublett, 3 =
5,06	(1H, Dublett, J =
5,55	(5H, Multiplett)
7,35

Dünn s chichtChromatographie:

lösungsmittelsystem: Essigsäure : Äthylacetat (1:2) Rf-Wert: 0,58

Schmelzpunkt des Di-dicyclohexylaminsalzes: P = 201 bis 205⁰C Analyse für C.-H^₀NgO-S.2H₂O (das Di-dicyclohexylaminsalz)

ber.t C 61,80, H 8,51, N 9,60 gef.: C 62,09, H 8,35, N 9,67

3 0 9 8 8 3 / 1 4 8 1 ORIGINAL INSPECTED

13- 2337065

Experiment 2

2,0 g Natrium-7-(5-amino-5-cart)oxyvaleramido)-3-niethyl-3-cephem-4-carboxylat (l), bei dem es sich um eine bekannte Verbindung handelt (vgl. z. B. die britische Patentschrift 957 543) wurde in 75 ml einer Phosphatpufferlösung von pH 7,0 gelöst, worauf 2,0 ml Phenyliso'cyanat tropfenweise unter Rühren bei Zimmertemperatur zugegeben wurden. Nachdem festgestellt worden war, daß der Ninhydrintest negativ war, wurde der ausgefallene Diphenylharnstoff abfiltriert. Die wäßrige Schicht wurde mit n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 eingestellt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde mit einer wäßrigen, mit Natriumchlorid gesättigten Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet, worauf das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert wurde. Es wurden 500 mg eines schwach gelben Pulvers erhalten. Dieses Pulver wurde aus 60 $> Methanol umkristallisiert, wobei ein weißes Pulver von l-£"5-( 3-phenylureido ) -S-carboxyvaleramido^-S-methyl-^-cephem-^- carbonsäure erhalten wurden; P a 150 bis 165 C.

Analyse für C₂₁H₂₄N₄SO₇.1/2 H₂O

ber.: C 52,0, H 5,16, N 11,55, H₂O 1,85 gef.: C 52,18, H 5,19, N 11,49, H₂O 1,99

Kernmagnetische Resonanz:

Lösungsmittel: Deuterium + Natriumbicarbonat Timer er Standard: THS

ό -Wert	(ppm)	(4H, Multiplett)
1,80		(3H, Singlett)
1,90		(2H, Multiplett)
2,40		(;2H, Quartett)
3,02	bis 3,52	309883/1401

OFMGlNAL INSPECTED

4,17 (1H, Multiplett)

5,06 (1H, Dublett, J = 4,5 HZ)

5,55 (1H, Dublett, J = 4,5 HZ)

7,35 (5H, Multiplett)

Dünnschichtchromatographie;

Lösungsmittel syst em: Essigsäure : Äthylacetat (1:2) Rf-Wert: 0,58

Schmelzpunkt des Di-dicyclohexylaminsalzes: P = 203 bis 205°ί

WS-3442 B

HOOC-CH (CH₂), CONH

OCOHH₉ OOH

7-( S-Amino-S-carboxyvaleramido) -3-( carbamoyloxymethyl) -3-cephem-4-carbonsäure.

Das in der beigefügten Figur 2 wiedergegebene Ultraviolett-Absorptionsspektrum von WS-3442 B (Lösungsmittel: Wasser) zeigt ein Maximum bei 261 m/u. Das Infrarot-Absorptionsspektrum (suspendiert in Nujolmull) ergibt einen Gipfel bei 1770 cm , der bedingt ist durch das Carbonyl des 4-gliedrigen Lactams. Da3 kernmagnetische Resonanzspektrum gibt die folgenden Signale ( 6 ppm; in Deuterium; TMS innerer Standard)·

ORiGlNAL INSPECTED 309883/148 1

1,84 (4H_t Multiplett)

2,40 (2H, Multiplett)

3,30 Ms 3,80 (2H, Quartett, J = 18 HZ)

3,80 (1H, Multiplett)

4,78 (2H, Quartett, J = 13,0 HZ)

5,12 (1H, Dublett, J =4,5 HZ)

5,60 (1H, Dublett, J = 4,5 HZ)

WS-3442 C

OCH HOOC CH (CH₂), CONH ·

COOH

₂OCONH₂

7-( 5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-( carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure

Das in der beigefügten Figur 3 wiedergegebene Ultraviolett-Absorptionsspektrum von WS-3442 C (Lösungmittel: Wasser) zeigt Maxima bei 242 m/a und 264 m/u. Das Infrarot-Absorptionsspektrum (suspendiert in Nujolmull) gibt den Gipfel bei 1770 cm" , der bedingt ist durch das Carbonyl des 4-gliedrigen Lactams. Das kernmagnetische Resonanzspektrum gibt die folgenden Signale ( <£ ppm; in Deuterium; TMS innerer Standard).

OWGlNAL INSPECTED

3 09883/ UBi

1,90 (4H, Multiplett)

2,50 (2H, Multiplett)

3,25 bis 3,70 (2H, Quartett, J = 18 HZ)

3,58 (3H, Singlett)

3,75 (1H, Multiplett)

4,75 (2H, Quartett, J = 13,0 HZ)

5,20 (1H, Singlett)

WS-3442 D

OCH HOOC-CH (CH₂)^ CONH I

NH₂ V

^υ COOH

7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-methyl-7-methoxy~3-cephem-4-carbonsäure

WS-3442 D ist ein schwach gelbes Pulver und das in der beigefügten Figur 4 wiedergegebene Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Lösungsmittel: Phosphatpufferlösung von pH 6,4) zeigt das Maximum bei 263 m/u (E # = 106)· Das Infrarot-Absorptionsspektrum (suspendiert in Nujolmull) ergibt den Gipfel bei 1760 cm , der bedingt ist durch das Carbonyl des 4-gliedri- gen Lactams. Das kernmagnetische Resonanzspektrum gibt die folgenden Signale ( <S ppm; in Deuterium; TMS innerer Standard),

303883/ U81

1,85 (4H, Multiplett)

2,04 (3H, Singlett)

2,45 (2H, Multiplett)

3,17 Ms 3,68 (2H, Dublett, J = 18 HZ)

3,56 (3H, Singlett)

3,85 (1H, Multiplett)

5,15 ' (1H, Singlett)

Der Rf-Wert in der Dünnschichtchromatographie wurde bestimmt unter Verwendung von Ninhydrin als Anfärbemittel und unter Verwendung eines Gemisches aus Acetonitril und Wasser (5i2) als Lösungsmittelsystem, wobei der Hf-Wert 0,55 betrug.

Experiment 1

Zu einem Gemisch aus 12,0 g 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3--carbamoylo3cymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, das eine vorbeschriebene bekannte Verbindung ist (vgl. Journal of the American Chemical Society, Band 93, Nr. 9, S. 2308), 120 ml Wasser und 5,0 g Natriumbicarbonat, wurde eine Lösung aus 5,5 g t-Butoxycarbonylazid in 60 ml Dioxan unter Rühren zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 6 Stunden lang gerührt, worauf das Dioxan abdestilliert wurde_r Zu dem Rückstand wurde Eis-Wasser gegeben und das Gemisch wurde mit Natriumchlorid gesättigt und mit Äthylaoetat extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde unter Eiskühlung auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet, worauf das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert wurde. Es wurden 2,2 g eines schwach gelben Pulvers von 7-(5-t-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido ) ^-carbamoyloxymethyl^-methoxy^-cephem^-carbonsäure erhalten.

309883/ U81

Kernmagietische Resonanz:

Lösungsmittel: Deuterium + Natriumbicarbonat Innerer Standard: TlVB

ö -Wert (ppm):	(9H, Singlett)
1,43	(4H, Multiplett)
1,75	(2H, Multiplett)
2,40	(2H, Dublett, J = 18 HZ)
3,25 Ms 3,72	(3H, Singlett)
3,53	(1H, Multiplett)
3,85	(1H, Singlett)
5,16	Düimschichtohromatographie ϊ

Lösungsmittelsystem: Essigsäure : Äthylacetat (1 : 2) Hf-Wert: 0,49

Experiment 2

Ein Gemisch aus Palladiumhydroxyd und Bariumsulfat wurde zu 2,1 g der oben erhaltenen 7-(5-t-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-earbonsäure, 20 ml Wasser und 1,02 g Natriumbicarbonat in einem 250 ml-Kolben zur mäßigen katalytischen Reduktion gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 3 Stunden lang einer mäßigen Reduktion unterworfen in Gegenwart von 6,8 g eines Gemisches aus Palladiumhydroxyd und Bariumsulfat, worauf Eiswasser und Äthylacetat in der angegebenen Reihenfolge zugegeben wurden. Das erhaltene Gemisch wurde mit 0,5 η-Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt, filtriert und mit Äthylacetat gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde mit Natriumchlorid gesättigt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen

309883/1481

und über Magnesiumsulfat getrocknet, worauf das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert wurde. Es wurden 1,1 g eines schwach gelben Pulvers von 7-( 5-t-Butoxycarbonylamino-5~carboxyvaleramido)-3-methyl-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erhalten.

Kernmagnetische Resonanz:

Lösungsmittel : Deuterium + Natriumbicarbonat Innerer Standard: TMS

o-Y/ert (ppm)	(9H, Singlett)
1,43	(4H, ffiultiplett)
1,75	(3H, Singlett)
1,92	(2H, Multiplett)
2,40	(2H, Dublett, J = 18 HZ)
3,10 bis 3,60	(3H, Singlett)
3,51	(1H, Multiplett)
3,90	(1H, Singlett)
5,11

Dünnsehichtchromatographi e t

Lösungsmittelsystem: Essigsäure : Äthylacetat (1:2) Rf-Wert: 0,67

Experiment 3

Ein Gemisch aus 1,0 g 7-(5-t-Butoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-niethyl-7-meth03cy-3--cephem-4-carbonsäure und 10 ml 98 #Lger Ameisensäure wurde 1 Stunde lang gerührt, worauf die Ameisensäure abdestilliert wurde.

30 9 8 8.3/U8 1

Zu dem erhaltenen Rückstand wurden 10 ml Äthylacetat zugegeben und das Äthylacetat wurde unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in 10 ml Wasser gelöst und 10 ml der 25 i» Amberlite LA-1:methyl:isobutyl:keton-Lösung (Handelsname) wurden zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 1 Stunde lang gerührt und die wäßrige Schicht wurde daraus abgetrennt. Die organische Lösungsmittelschicht wurde mit 5 ml Wasser gewaschen und die Waschwasser und die zuvor erhaltene wäßrige Schicht wurden miteinander vereinigt und mit Äthylacetat gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde mit Aktivkohle behandelt und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druäc abdestilliert. Der Rückstand wurde lyophilisiert, wobei 650 mg eines schwach gelben Pulvers von 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido) -B-methyl-T-methoxy-S-cephem-^carbonsäur e erhalten wurden.

Kernmagnetische Resonanz;

Lösungsmittel: Deuterium + ITatriumbicarbonat Innerer Standard: TMS

b -Wert (ppm)

1,85 (4H, Multiplett)

2,40 (3H, Singlett)

2,45 (2H, Multiplett)

3,17 Ms 3f68 (2H, Dublett, J = 18 HZ)

3,56 (3H, Singlett)

3,85 (1H, Multiplett)

5,15 (1H, Singlett)

Dünnschichtchromatographie:

Lösungsmittelsystem: Acetonitril:Wasser (5s2) Rf-Wert: 0,55

309883/1481

Ultraviolett-Absorptionsspektrum: .

X max 263 nyu (E # 106) in Phosphatpufferlösung von pH 6,4

Infrarot-Absorptionsspektrum (Nujol):
1760 cm (Lactam)

WS-3442 E

. _ _ TVI

is
COOH

7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-hydroxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure

WS-3442 E ist ein schwach gelbes Pulver und das in der beigefügten Figur 5 wiedergegebene Ültraviolett-Absorptionsspektrum (Lösungsmittel: Wasser) zeigt ein Maximum bei 260 m/u (E %> = 141)· Das Infrarot-Absorptionsspektrum (suspendiert in Nujolmull) gibt einen Gipfel bei 1740 cm , der bedingt ist durch das Carbonyl des 4-gliedrigen Lactams.

Das kernmagnetische Resonanzspektrum gibt die folgenden Signale ppm; in Deuterium; TMS innerer Standard).

309883/U81

1,83 (4H, Multiplett)

2,45 (2H, Multiplett)

3,55 (2H, Dublett, J = 18 HZ)

4,27 (2H, Singlett)

5,15 (1H, Dublett, J = 4,5 HZ)

5,62 (1H, Dublett, J = 4,5 HZ')

Der Rf-Wert in der Dünn schicht Chromatographie wurde "bestimmt mit Hilfe von Ninhydrin als Anfärbemittel und mit Hilfe eines Gemisches aus n—Butanol, Essigsäure und Wasser (4s1s2) als Lösungsmittelsystem, wobei ein Rf-Wert von 0,27 bis 0,32 gefunden wurde.

Experiment

Zu einer lösung von 2,35 g des Natriumsalzes von Cepharosporin C in 23,5 ml Wasser wurden 8,5 ml Acetylesterase unter Rühren bei Zimmertemperatur zugegeben. Das Gemisch wurde mit 0,2 n-Hatriumhy- droxyd auf einen pH-Wert von 6,6 eingestellt und 90 Minuten lang reagieren gelassen, wobei der pH-Wert auf 6,6 gehalten wurde. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch lyophi- lisiert, wobei 2,1 g eines gelblichen kristallinen Pulvers von Natrium-7-( 5-amino-5-carboxyvaleramido) -S-hydroxymethyl^-cephem- 4-carboxylat erhalten wurden.

Kernmagietische Resonanz:

Lösungsmittel; Deuterium Innerer Standard: TES

309883/U61

b -Wert (ppm)	(4H, Multiple«)	J	= 18 HZ)
1,83	(2H, MuI tipi ett)		*
2,45	(2H, a.b. Quartett,	5	HZ)
3,55	(2H, Singlett)	5	HZ)
4,27	(1H, Dublett, J = 4,
5,15	(1H, Dublett, J = 4,
5,62

Dünnschichtchromatographie;

Lösungsmittelsystem: n-Butanol!Essigsäure:Wasser (4:1:2) Rf-Wert: 0,24 bis 0,25 ' ' .

Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

λ- max 262 m/u (E 56 142) in Citratpufferlösung von pH 6,4 Infrarot-Absorptionsspektrum (Nujol): 1740 cm" (Lactam)

Die nach dem Verfahren der Erfindung erhaltenen Antibiotika WS-3442 A,B,C,D und E zeigen Aktivitäten gegenüber beispielsweise Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, und Proteus vulgaris.

Zur Herstellung der Acylderivate von WS-3442 A,B,C,D und E wird eine Fermentier-Nährlösung, die WS-3442 A,B,C,D und E enthält, mit einem Acylierungsmittel umgesetzt. Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das folgende Reaktionsschema erläutert: *

(Eine Fermentations-Nährlösung mit einem Gehalt an WS-3442 A,B,C,D und E)

309883/ U81

Acyiierungsmittel

HH

HQ₀C CH (CH₂J₃ com-f T j _(II)

(worin R ein Wasserstoff atom oder einen Methoxyrest, R' ein Wasserstoffatom, einen Hydroxy- oder einen Carbamoyloxyrest und A einen Acylrest bedeutet).

Als Acyiierungsmittel können in der angegebenen Reaktion alle bekannten, üblicherweise verwendeten Acyiierungsmittel eingesetzt werden. Typische geeignete Acyiierungsmittel sind z. B. aliphatisch^, aromatische und heterocyclische Carbonsäuren, die entsprechenden Sulfonsäuren, Carbonsäureester, Carbaminsäuren und Thiosäuren sowie die reaktiven Derivate dieser Säuren.

Typische geeignete reaktive Derivate sind z. B. ein Säureanhy— drid, ein aktiviertes Amid, ein aktivierter Ester, ein Isocyanat und ein Isothiocyanat.

Als Beispiele für derartige reaktive Derivate können genannt werden ein Säureazid, ein Gemisch des Säureanhydrids mit einer Säure, die beispielsweise sein kann Dialkylphosphorsäure, Phenylphosphorsäure, Diphenylphosphorsäure, Dibenzylphosphorsäure, halogenierte Phosphorsäure, Dialkylphosphorsäure, Schweflige Säure, Thioschwefelsäure, Halogenwasserstoff säure (z· B. Salzsäure), Schwefelsäure, Alkylcarbonsäure, aliphatische Carbonsäure (z· B. Pivalinsäure, Pentansäure, Isopentansäure, 2-Äthylbut-

309883/148 1

tersäure oder Trichloroessigsäure), aromatische Carbonsäure (ζ. B. Benzoesäure), oder ein symmetrisches Säureanhydrid, ein Säureamid mit Imidazol, 4-substituiertem Imidazol, Dimethylpyrazol, Triazol oder Tetrazol, ein Ester (z. B. Cyano— methylester, Methoxymethylester, Vinylester, Propargylester, p-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester, Trichlorophenylester, Pentachlorophenylester, Methansulfonylphenylester, Phenylazophenylester, Phenylthioester, p-Nitrophenylthioester, p-Cresylthioester, Carboxymethylthioester, Pyranylester, Pyridylester, Piperidylester, 8-Chinolylthioester oder ein Ester mit Ν,Ιϊ-Dimethylhydroxylamin, 1-Hydroxy-2-(iH)-pyridon, N-Hydroxysuccinimid oder N-Hydroxyphthalimid).

Aus den angegebenen Verbindungen kann ein geeignetes Derivat gegebenenfalls ausgewählt werden entsprechend dem Typ der zu verwendenden Säure. In der Acylierungsreaktion wird, wenn freie Säure verwendet wird, in besonders vorteilhafter Weise ein Kondensationsmittel zugesetzt. Typische geeignete Kondensationsmittel sind z. B. NjIP-Dicyclohexylcarbodiimid, N-Cyclohexyl-H'-morpholinoäthylcarbodiimid, K-Cyclohexyl-N* -( 4-diäthylaminocyclohexyl)carbodiimid, N,H^f-Diäthylcarbodiimid, N,N^f-Diisopropylcarbodiimid, N-Äthyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, N,N»-Carbonyldi(2-methylimidazol), Pentamethylen-keten-IT-cyclohexylimin, Diphenylketen-H-cyclohexylimin, Alkoxyacetylen, 1-Alkoxy-i-chloroäthylen, Trialkylphosphit, Äthylpolyphosphat, Isopropylpolyphosphat, Phosphoroxychlorid, Phosphortrichlorid, Thionylchlorid, Oxalylchlorid, Triphenylphosphin, 2-Äthyl-7-hydroxybenzisoxazoliumsalz, 2-Äthyl-5-(m-sulfophenyl)-isoxazoliumh ydroxi d-Int ermol ekular sal ζ und (Chloromethylen)-dimethylammoniumchlorid.

Bei der während der Acylierungsreaktion in die Aminogruppe der Verbindung der Formel (II) eingeführten Acylgruppe kann es sich z. B. um einen Rest handeln, der durch Dehydroxylierung einer aliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen Carbonsäure oder einer entsprechenden Siifonsäure, eines Carbonsäureesters, einer Carbaminsäure oder von Thiosaunen anfällt.

Typische geeignete Acylgruppen des angegebenen Typs sind z. B. ein Alkanoylrest (z. B. Acetyl, Propionyl, Acryloyl, Butyryl, Isobutyryl, Valeryl, Isovaleryl, Caproyl, Heptanoyl oder Oetanoyl), ein Cycloalkancarbonylrest (z. B. Cyclopentancarbonyl oder Cyclohexancarbonyl) mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, ein Alkenoylrest (z. B. Acryloyl, Metaacryloyl, Crotonoyl, Oleoyl, Linoleoyl, oder Linolenoyl) mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, ein Aryloylrest (z. B. Benzoyl, Toluoyl oder Naphthoyl), ein Alkoxycarbonylrest (z. B. Methoxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, Propoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, oder Butoxycarbonyl) mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, ein Aryloxycarbonylrest (z. B. Phenyloxycarbonyl, Tolyloxycarbonyl oder Naphthyloxycarbonyl), ein Aralkyloxycarbonylrest (z. B. Benzyloxycarbonyl oder Phenäthyloxycarbonyl),

heterocyclische Carbonylgruppen

(z. B. Nieotinoyl, Piperazin-1-carbonyl, Morpholin-4-carbonyl, Pyrrol-2-carbonyl und Furan-2-carbonyl), ein Alkylcarbonoylrest (z· B. Succinyl, Malonyl, Maleoyl, Phthaloyl, Benzolsulfonyl, Carbamoyl, Methylcarbamoyl, Dimethylcarbamoyl, Äthylcarbamoyl, Propylcarbamoyl, Isopropylcarbamoyl und Butylcarbamoyl), ein Arylcarbamoylrest (z. B. Phenylcarbamoyl, Tolylcarbamoyl, und ITaplithalcarbamoyl) und ein Alkylarylcarbamoylrest (z. B. Methylphenylcarbamoyl und Äthyltolylcarbamoyl), sowie die entsprechenden Thiocarbamoylreste.

In den angegebenen Alkanoylresten, Cycloalkancarbonylresten, Alkenoylresten, Aryloylresten, Alkoxycarbonylresten, Aryloxycarbonylresten, heterocyclisch-Carbonylresten Aralkyloxycarbonylresten, Alkylcarbamoylresten, Arylcarbamoylresten und Alkylarylcarbamoylresten können ein oder mehrere mögliche Substituenten vorliegen, z. B. Halogenatome (Fluor, Chlor, Brom oder Jod), Alkoxyreste (z. B. Methoxy, Äthoxy, oder Propoxy), Alkylthioreste (z. B. Methylthio, Äthylthio, Propylthio oder Butylthio), Aryloxyreste,(z. B. Phenyloxy, Tolyloxy,oder Haphthyloxy), Arylreste z. B. Phenyl, Tolyl oder Naphthyl), Alkoxycarbonylreste (z. B. Methoxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, Propoxycarbonyl oder Butoxycarbonyl), Acyloxyreste (z. B. Acetyloxy, Propionyloxy, Butyryl-

309883/ 1481

oxy oder Benzoyloxy), Acylthioreste (z. B. Acetylthio, Propio— nylthio, Butyrylthio oder Benzoylthio), Acylaminoreste (z. B. Formamido, Acetamido, Butylamido, Propionamido, Benzamido, t-Butoxycarbonylamido, Allyloxycarbonylamino, Cyclohexyloxycarbonylamino, Phenoxycarbonylamino, Phenylthiocarbonylamino, Benzyl oxycarbonylamino, oder Toluol sulfonylamino) oder heterocyclische Reste (ζ. B. Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Indolyl, 2-Oxobenzothiazolyl-3-yl oder Imidazolidinyl).

Die Acylierungsreaktion wird vorzugsweise unter Bedingungen zwischen schwacher Azidität und schwacher Alkalinität durchgeführt, nämlich durch Einstellen der Fermentierungsbrühe auf einen geeigneten pH-Wert mit Hilfe einer Base, z. B. Alkalimet allhydroxyd (z. B. Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd), Alkalimetallbicarbonat (z. B, Natriumbicarbonat oder Kaliumbicarbonat), Alkalimetallphosphat (z. B. Natriumphosphat, Natriumhydrogenphosphat oder Kaliumhydrogenphosphat), Alkalimetalldihydrogenphosphat (z. B. Natriumdihydrogenphosphat oder Kaliumdihydrogenphosphat), einer tertiären organischen Base (z· B. Trimethylamin, Triäthylamin, N-Methylpiperazin oder Pyridin).

Nach Vervollständigung der Reaktion können die gebildeten Acylderivate (II) von WS-3442 A,B,C,D und E isoliert werden und gereinigt werden, z. B. durch Extraktion des erhaltenen Reaktionsgemisches mit einem Lösungsmittel (z. B. Äthylacetat oder Methylisobutylketon), Entfernung des Lösungsmittels von dem Extrakt, z. B. durch Abdampfen, und anschließende Behandlung desjsrhaltenen Rückstands mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel (z. B. Methanol, Äthanol, Aceton, Tetrahydrofuran, Tbxan oder Acetonitril), worauf das erhaltene Produkt gewünschtenfalls mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels behandelt werden kann, z. B. aromatischen Kohlenwasserstoffen (z. B. Benzol oder Toluol), oder mit halogensubstituierten aliphatischen Kohlenwasserstoffen, mit Estern (z. B. Äthylacetat), oderlüt üblichen bekannten Hilfsmitteln, z. B. Chromatographie

30 9'8 83/1481 " .■ '

tinter Verwendung von Silicagel, Aluminiumoxyd oder Cellulosepulver. In der angegebenen Weise können die Aeylderivate leicht isoliert und gereinigt werden in freier Form oder in Salzform, z. B. als Metallsalz (z. B. Natriumsalζ oder Calciumsalz), oder als organisches Aminsalz (z. B. Dicyclohexalaminsalz oder Irialkylaminsalz).

Die erfindungsgemäß hergestellten Acylderivate der Formel (II) der Antibiotika WS-3442 A,B,C,D und E, die durchwegs neue Verbindungen darstellen, sind gegenüber Mikroorganismen aktiv und als Arzneimittel brauchbar, insbeson-dere als Antibiotika.

Die erfindungsgemäßen Acylderivate der Antibiotika WS-3442 A, B,C,D und E sind auch als Zwischenprodukte zur Herstellung von Cephalosporinderivaten mit antimikrobiologischer Aktivität brauchbar. So kann z. B. das Acylderivat von WS-3442 A desacyliert, z. B. hydrolysiert werden unter Bildung einer Verbindung der Formel

die acyliert wird unter Bildung des entsprechenden 7-acylierten Cephalosporinderxvats, z. B. CEX, d. h. 7-(tt. -Aminophenylacetoamido)-3-methyl-3-cephem-4-carbonsäure (verwiesen sei z. B. auf die USA-Patentschrift 3 507 861).

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

309883/U81

- .29 -

Beispiel 1

Es wurde ein vegetatives Medium der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Glycerin 3 i°

Sojabohnenmehl 2 9^

Glutenmehl 1 <$>

Baumwollsamenmehl . 1 # D,L - Methionin 0,2 i»

Leitungswasser nach Bedarf

100 ml des Mediums in 30 Stück 500 ml-Kolben wurden in üblicher bekannter Weise sterilisiert und danach beimpft mit Sporen und Mycelien von Streptomyces wadayamensis ATCC 21948. Diese ersten Vermehrungskulturen wurden bei 3O⁰C 48 Stunden lang inkubiert.

Außerdem wurden 60 1 des angegebenen Kulturmediums zusammen.mit 60 ml eines Antischaummittels in einem 200 1-Tankfermenter ebenfalls in üblicher bekannter Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen der ersten Vermehrungskulturen wurde in diesen Tankvermenter eingeimpft. Diese zweite Vermehrungskultur wurde bei 30⁰C 24 Stunden lang inkubiert.

Ferner wurden 65O 1 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 3OO ml eines Antischaummittels in einem 1 Tonnen-Tankfermenter nach einer üblichen Methode sterilisiert. Das gesamte Volumen .der zweiten Vermehrungskultur wurde bei 30⁰C 96 Stunden lang inkubiert.

Nach beendeter Fermentation wurde dem Kulturmedium unter Rühren Diatomeenerde zugesetzt. Die Kulturlösung wurde unter steigendem Druck mit Hilfe einer vorbeschichteten Filterpresse filtriert. Das erhaltene Filtrat (640jL) wurde auf einen pH-Wert von 4 bis eingestellt und danach wurdeE|dem Filtrat 20 kg Aktivkohle zuge-

3 0 9 8 8 3 / U 8 1

setzt. Der durch Filtration erhaltene Kohlekuchen wurde mit 600 - 1 80 folgern wäßrigen Aceton extrahiert. Der Acetonextrakt wurde konzentriert und mit dem Kationenaustauscherharz "Deolite C-20" (H⁺-Form) (Handelsname) auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und anschließend durch eine Säule geleitet, die mit einem Anionenaustauscherharz "Deolite A-6" (CH^COO"-Form) (Handelsname) gepackt war. Aktives Material wurde -eluiert mit 150 1 eines Gemisches aus Pyridin—Essigsäure—Wasser (100 : 7 ϊ 900). Das erhaltene Eluat wurde auf ein Volumen von etwa 8 1 konzentriert und mit "Deolite C-20" (H⁺-Form) (Handelsname) auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt. Von der konzentrierten Lösung wurden Verunreinigungen durch zweimaliges Waschen mit Äthylacetat und einmaliges Waschen mit n-Butanol entfernt. Die erhaltene wäßrige Schicht wurde durch eine Säule von "Amberlite XAD-2" (Handelsname) geleitet und die durchgeleitete Lösung wurde sodann durch eine Säule von "AF-Harz" (CH,COO~-Form) (Handelsname) geleitet. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser, wurde aktives Material eluiert mit etwa 10 1 eines Gemisches aus Pyridin-Essigsäure-Wasser (100 ϊ 7 ϊ 9Ό0) Das Eluat wurde konzentriert und danach auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt mit "Deolite C-20" (H⁺-Form) (Handelsname). Verunreinigungen wurden entfernt durch zweimaliges Waschen mit Äthylacetat und einmaliges Waschen mit n-Butanol. Die wäßrige Schicht wurde auf einem pH-Wert von 5 bis 6 eingestellt mit einer wäßrigen Natriumhydroxydlösung, worauf sie konzentriert wurde. Das Konzentrat weurde mit dem 5-fachen Volumen eines Gemisches aus Methanol-Aceton (1:3) versetzt unter Bildung eines Niederschlags. Der Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet, wobei etwa 25 g des Rohproduktes in Pulverform erhalten wurden.

Das rohe Pulver wurde chromatographiert an einer Cellulose säule mit einem Gemisch aus n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:2). Das eluierte aktive Material wurde identifiziert durch Dünnschicht Chromatographie (unter Verwendung von Celluloseblättern) durch Bestimmung der antibakteriellen Aktivität, der IJV-Absorption, der Ninhydrinreaktion und des Hf-Werts (0,46 bis Q_S4S),

309883/ U8 1

Aktive Fraktionen wurden gesammelt. Das Eluat wurde konzentriert und mit Aceton versetzt, um einen Niederschlag zu bilden. Der Niederschlag wurde mit Aceton gewaschen und danach in Wasser gelöst. Die wäßrige Lösung wurde mit wäßriger Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 6 eingestellt und nach dem Entsalzen lyophilisiert, wobei 18 g WS-3442 A in Form eines weißen Pulvers erhalten wurden.

Beispiel 2

Eine Haupt-Fermentationslösung, die in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurde filtriert. Zu dem Pil trat (8 l) wurde 1 1 Aceton gegeben. Die erhaltene Lösung wurde mit 10 $iger wäßriger Natriumhydroxydlösung unter Rühren bei Zimmertemperatur auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, worauf die Lösung mit 95 g Phenylisocyanat in 150 ml Aceton tropfenweise versetzt wurde. Die Lösung wurde auf einen pH-Wert yon 7,5 bis 8,0 eingestellt mit 10 $-iger wäßriger Natriumhydroxydlösung. Nach der Stabilisierung des pH-Werts der Lösung und Erbringung des Nachweises, daß die Ninhydrinreaktion negativ war, wurde Diphenylharnstoff durch Filtration entfernt. Aktives Material wurde mit Äthylacetat extrahiert, nachdaem die wäßrige Schicht mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war. Die Emulsion wurde abfiltriert. Aktives Material in der Äthylacetatschicht wurde in eine 3 #ige Natriumacetatlösung überführt. Nachdem die überführte Lösung auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 mit 6 η-Salzsäure eingestellt worden war, wurde das aktive Material mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 28 g einer gelblichen öligen Substanz erhalten wurden.

3Ü9B83/ U81

Die ölige Substanz wurde chromatographiert unter Verwendung einer Silicagel-Säule und mit einem Äthylacetat-Essigsäuregeraisch (4:1) entwickelt, wobei 5 g 7-/~5-(3-phenylureido)-5-carboxyvaleramido__7-3-methyl-3-cephem-4-carbonsäure in Form eines weißen Pulvers erhalten wurden.

Das kernmagnetische Resonanzspektrum ergab: L· (ppm)

1,80 (4H, Multiplett)

1,90 (3H₁ Singlett)

2,40 (2H, Multiplett)

3,02 bis 3,52 (2H, Quartett, J = 18 HZ)

4,17 ' (1H, Multiplett)

5,06 (1H, Dublett, J = 4,5 HZ)

5,55 (1H, Dublett, J = 4,5 HZ)

7,35 (5H, Multiplett)

Beispiel 3

7-(5—6-Butoxycarbonylamino-5—carboxyvaleramido)— 3-methyl-3-eephem-4-earbonsäure wurde nach praktisch dem selben Verfahren wie in Beispiel 2 beschrieben unter Verwendung von t-Butoxycarbonylazid als Acylierungsmittel erhalten.

Das kernmagnetische Resonanzspektrum zeigte: k (ppm)

1,45 (9H, Singlett)

1,70 (4H, Multiplett)

1,95 (3H, Singlett)

2,35 (2H, Multiplett)

3Ü2883/U31

2""* "■' 'j O f* Γ" jjiub b

3,20 Ms 3,65 (2H, Quartett, J = 18 HZ)

3,90 (1H, Multiplett)

5,08 (1H, Dublett, J = 4,5 HZ)

5,55 (1H, Dublett, J = 4,5 HZ)

DünnschichtChromatographie;

Lösungsmittelsystem: Essigsäure-Äthylacetat (i/2) Rf = 0,68

Beispiel 4

Es wurde ein Vegetationsmedium der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Glycerin	3 %
So jabohnenmehl	2 *
Glutenmehl	1 *
Baumwollsamenmehl	1 *
D,L - Methionin	0,2 *
Leitungswasser	nach Bedarf

100 ml des Mediums in 30 Stück 500 ml-Kolben wurden in üblicher bekannter Weise sterilisiert und danach mit Sporen und Mycelien von Streptomyces wadayamensis ATCC 21948 inokuliert. Diese ersten Vermehrungskulturen wurden bei 30⁰C 48 Stunden lang inkubiert. Außerdem wurden 60 1 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 60 ml eines Antischäummifcbels in einem 200 1-Tankfermenter in üblicher bekannter Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen der ersten Vermehrungskulturen wurde in diesen Tankfermenter eingeimpft. Diese zweite Vermehrungskultur wurde bei 30⁰C 24 Stunden lang inkubiert.

INSPECTED

3 Q 9 8 3 2 / 1 A 8 1

2 3 J _ -■ -; ο

Ferner wurden 650 1 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 300 ml eines Antisehäummittels in einem 1 t-Tankfermenter in üblicher bekannter Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen der zweiten Vermehrungskultur wurde in diesen 1 t-Tankfermenter eingeimpft. Die Hauptkultur wurde bei 30⁰O 96 Stunden lang inkubiert.

Nach der Fermentierung wurde die Kulturbrühe unter Rühren mit Diatomeenerde versetzt. Die Kulturlösung wurde unter steigendem Druck mit Hilfe einer vorbeschichteten Filterpresse filtriert, wobei 640 1 Filtrat erhalten wurden. Zu 8 1 des Filtrats wurde 1 1 Aceton zugegeben und die Lösung wurde gerührt. Die Lösung wurde mit 10 ?Siger wäßriger Natriumhydroxydlösung unter Rühren bei Zimmertemperatur auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, worauf die Lösung tropfenweise mit 95 g Phenylisocyanat in 150 ml Aceton versetzt wurde.

Die erhaltene Lösung wurde mit 10 $iger wäßriger Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 7,5 bis 8,0 eingestellt. Nach Stabilisierung des pH-Werts der Lösung und Feststellung, daß die Ninhydrin-Reaktion negativ war, wurde Diphenylharnstoff durch Filtration entfernt. Aktives Material wurde mit Äthylacetat extrahiert, nachdem die wäßrige Schicht mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0 Ibis 1,5 eingestellt worden war. Die Emulsion wurde abfiltriert und in der Äthylacetat vorhandenes aktives Material wurde in eine 3 /£ige Natriumacetatlösung überführt. Nachdem der pH-Wert der überführten Lösung mit 6 n-Salzsäure auf 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war, wurde das aktive Material mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde gewaschen mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung und anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet. Durch Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurden 28 g einer gelblichen öligen Substanz erhalten.

ORIGINAL INSPECTED

309083/1^81

Die ölige Substanz wurde Chromatograph!ert an einer Silicagel Säule und mit einem Äthylacetat-Essigsäuregemisch (4:1) entwickelt, wobei 5 g 7-/""S-O-i'henylureidoJ-S-carboxyvaleramido 3-methyl-3-cephem-4-earbonsäure in Form eines weißen Pulvers erhalten wurden.

Kernmagnetisehes Resonanzspektrum:

1,80 (4H, Multiplett)

1,90 (3H, Singlett)

2,40 (2H, Multiplett)

3,02 bis 3,52 · (2H, Quartett, J. = 18 HZ)

4,17 ' (1H,'Multiplett)

5,06 (1H, Dublett, J = 5 HZ).

5,55 (1H, Dublett, J = 5 HZ)

7,35 (5H, Multiplett)

Beispiel 5

Es wurde ein vegetatives Medium der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Glyc/ierin 3 #

Sojabohnenmehl 2 $

Glutenmehl 1 ?5

D,L - Methionin 0,2 fi

Leitungswasser nach Bedarf

ml des Mediums jeweils in 30 Stück 500 ml-Kolben wurden in üblicher bekannter Weise sterilisiert und danach mit Sporen und Mycelien von Streptomyces wadayamensis ATGC 21948 angeimpft.

3ÜU883/ U 8

ORJGJNAL INSPECTED

Diese ersten Vermehrungskulturen wurden bei 30 C 48 Stunden lang inkubiert.

Außerdem wurden 60 1 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 60 ml eines Antischäummittels in einem 200 1-Tankfermenter nach üblicher Methode sterilisiert. Das gesamte Volumen der ersten Vermehrungskulturen wurde in diesen Tankfennejtiter eingeimpft. Diese zweite Vermehrungskultur wurde bei 30⁰C 24 Stunden lang inkubiert.

Ferner wurden 650 1 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 300 ml eines Antischäummittels in einem 1 t-Tankfermenter in üblicher bekannter Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen der zweiten Vermehrungskultur wurde bei 30⁰C 96 Stunden lang inkubiert.

Nach Beendigung der Fermentation wurde die Kulturlösung unter Rühren mit Diatonerde versetzt. Die Kulturlösung wurde unter steigendem Druck mit Hilfe einer vorbeschichteten Filterpresse filtriert. Das erhaltene Filtrat (640 l) wurde auf einen pH-Wert von 4 bis 5 eingestellt und das Filtrat wurde mit 20 kg Aktivkohle versetzt. Der durch Filtration erhaltene Kohlekuchen wurde mit 600 :.l 80 tigern wäßrigem Aceton extrahiert. Der Acetonextrakt wurde konzentriert und mit dem Kationenaustauscherharz "Deolite C-20" (H⁺-Form) (Handelsname) auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt, worauf er durch eine Säule des Anionenaustauscherharzes "Deolite A-6ⁿ (CH,C00"-Form) (Handelsname) geleitet wurde. Das aktive Material wurde mit 15o 1 eines Gemisches aus Pyridin-Essigsäure-Wasser (100 : 7 : 900) eluiert. Das ELuat wurde konzentriert auf ein Volumen von etwa 8 1, worauf mit Hilfe von "Deolite C-20" (H⁺-Form) (Handelsname) der pH-Wert auf 3,0 eingestellt wurde.

309883/ H81

Von der konzentrierten Lösung wurden Verunreinigungen durch zweimaliges Waschen mit Äthylacetat und einmaliges Waschen · mit n-Butanol entfernt. Die erhaltene wäßrige Schicht wurde durch eine Säule mit "Amberlite XAD-2" (Handelsname) geleitet, worauf die durchgelaufene Lösung durch eine Säule von "AP-Harz" (CH^COO~-Porm) (Handelsname) geleitet wurde. Nachdem die Säule mit Wasser gewaschen worden war, wurde aktivea Material mit etwa 10 1 eines Gemisches aus Pyridin-Essigsäure-Wasser (100 : 7 ϊ 900) eluiert. Das Eluat wurde konzentriert, worauf dessen pH-Wert mit "Deolite C-20" (H⁺-Porm) (Handelsname) auf 3,0 eingestellt wurde. Zur Entfernung von Verunreinigungen wurde zweimal mit Äthylacetat und einmal mit n-Butanol gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde auf einen pH-Wert von 5 his 6 mit einer wäßrigen Natriumhydroxydlösung eingestellt und danach konzentriert. Das Konzentrat wurde mit dem 5-fachen Volumen eines Gemisches aus Methanol-Aceton (1:3) versetzt, wobei ein Niederschlag gebildet wurde. Der Niederschlag wurde gesammelt und getraknet, wobei etwa 25 g eines Rohproduktes in Form von Pulver erhalten wurden.

Das rohe Pulver wurde Chromatograph!ert an einer Säule von Cellulose. Aktives Material wurde eluiert mit einem Gemisch aus n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:2). Das Vorliegen von aktivem Material im ELuat wurde durch Dünnschichtchromatographie (unter Verwendung von Celluloseblättern) bestätigt durch Untersuchung der antibakteriellen Aktivität, der UV-Absorption, der Ninhydrin-Reaktion und des Rf-Werts (0,27 bis 0,30). Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt. Das Eluat wurde konzentriert und mit Aceton versetzt, um im Konzentrat einen Niederschlag zu bilden.

Die Niederschläge wurden getrocknet und auf einer Säule von Cellulose chromatographiert. Das aktive Material wurde mit einem Gemisch aus Acetonitril-Propanol-Wasser (2:2:1) eluiert,

309683/U81

ORIGINAL

Die Fraktionen, die eine ausgeprägte antibakterielle Aktivität gegen Escherichia coli und einen Rf-Wert von etwa 0,3 aufwiesen, wurden gesammelt. Ferner wurden die Fraktionen gesammelt, die eine ausgeprägte antibakterielle Aktivität gegenüber Bacillus subtilis zeigten und einen Rf-Wert von etwa 0,3 aufwiesen. Jede der beiden, diese unterschiedliehen Typen Von Fraktionen enthaltenden Lösungen wurde konzentriert und jedes der beiden erhaltenen Konzentrate wurde zur Niederschlagsbildung mit Aceton versetzt. Jeder der beiden Niederschläge wurde lyophilisiert und aus der Fraktion mit antibakterieller Wirkung gegen Escherichia coli wurden 50 g WS-3442 C erhalten und aus der Fraktion mit antibakterieller Wirkung gegen Bacillus subtilis wurden 50 g WS-3442 B gewonnen.

Beispiel 6

Eine Haupt-Fermeirbierungslösung, die in ähnlicher Weise wie in Beispiel 5 beschrieben, erhalten worden war, wurde filtriert.

Das Filtrat (0,8 l) wurde mit einer wäßrigen, 1 n-Natriumhydroxydlösung unter Kühlung auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und mit 700 ml Aceton versetzt. Zu der erhaltenen Lösung wurden 35 ml Phenylisocyanat in 35 ml Aceton tropfenweise zugegeben und die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 7,5 his 8,0 mit wäßriger 1 n-Natriumhydroxydlösung eingestellt. Nach der Stabilisierung des pH-Werts der Lösung und Feststellung, daß die Ninhydrin-Reaktion negativ war, wurde Diphenylharnstoff durch Filtration entfernt. Das aktive Material wurde mit Äthylacetat extrahiert, nachdem die wäßrige Schicht mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war. Die Emulsion wurde abfiltriert. Das aktive Material in der Äthylacetat schicht wurde in eine 3 $ige Natriumacetatlösung überführt. Nachdem die überführte Lösung mit 6 η-Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war, wurde das aktive Material mit Ätnylaeetat extrahiert. Der erhaltene Extrakt wurde mit gesättig-

309883/1481

ORIGINAL INSPECTED

ter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen und danach über Magnesiumsulfat getrocknet.

Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 29,7 g einer gelblichen öligen Substanz erhalten wurden.

Die ölige Substanz wurde in 100 ml Methanol gelöst und die erhaltene Lösung wurde unter Kühlung mit 18,5 g Dicyclohexylamin versetzt. Zu der Lösung wurden 250 ml Äther zugegeben, worauf sie stehen gelassen wurde zur Ausbildung von Kristallen. Die gebildeten Kristalle wurden in Äthylacetat suspendiert und die Suspension wurde mit 1 η-Salzsäure behandelt, wobei 1,2 g 7-/~"5-( 3-Phenylureido)-5-carboxyvaleramido__j7-3-( carbamoyloxymethyl)-3-eephem-4-carbonsäure erhalten wurden'.

Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

Lösungsmittel: Deuterium + Natriumbicarbonat Innerer Standard: TMS

(ppm)

1,80	(4H, Multiplett)	= 18 HZ)
2,40	(2H, Multiplett)
3,08 bis 3,55	(2H, Quartett, J	=4,5 HZ)
4,15	(1H, Multiplett)	=4,5 HZ)
5,05	(1H, Dublett, J
5,60	(1H, Dublett, J
7,35	(5H, Multiplett)
Dünnschichtchromatographie:

Lösungsmittelsystem: Essigsäure-Äthylacetat (1:2) Rf-Wert =0,39

309883/1481 ORIGINAL INSPECTED

Beispiel 7

Eine Haupt-Fermentierungslösung, die nach einem ähnlichen Fermentierungsverfahren wie in Beispiel 5 beschrieben erhalten worden war, wurde filtriert.

Das Piltrat (8 l) wurde auf einen pH-Wert von 7,5 mit wäßriger 1 n-Natriumhydroxydlösung eingestellt und anschließend mit ι 1 Aceton versetzt. 95 g Phenylisocyanat in 150 ml Aceton wurden tropfenweise zu der Lösung zugegeben, worauf deren pH-Wert mit 10 folger wäßriger Natriumhydroxydlösung auf 7,5 bis 8,0 eingestellt wurde. Nach der Stabilisierung des pH-Werts der Lösung und dem Nachweis, daß die Ninhydrin—Reaktion negativ war, wurde Diphenylharnstoff durch Filtration entfernt. Das aktive Material wurde mit Äthylacetat extrahiert, nachdem die wäßrige Schicht mit Salzsäure auf einen pH-Y/ert von 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war. Die Emulsion wurde abfiltiriert. Das in der Äthylacetatschicht vorliegende aktive Material wurde in eine 3 $ige Natriumacetatlösung überführt. Nachdem die überführte Lösung auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 mit 6 η-Salzsäure eingestellt worden war, wurde das aktive Material mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit einer wäßrigen gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen und danach über Magnesiumsulfat getrocknet.

Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 28 g einer gelblichen öligen Substanz erhalten wurden.

Die ölige Substanz wurde auf einer Säule von Silicagel chromatographiert und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat-Essigsäure (4:1) entwickelt, wobei 10 g 7-/~5-(3-Phenylureido)-S-carboxyvaleramido^/—3-( carbamoyloxymethyl) — 7-methoxy— 3—cephem-4-carbonsäure in Form eines weißen Pulvers erhalten wurden.

309883/1481 OR₁GINAL₁NSPECrBO

Kernmagnetische Resonanz:

Lösungsmittel: Deuterium + Hatriumbicarbonat Innerer Standard: TMS

(ppm)

• 1,80	(4H, Multiplett)	*
2,40	(2H, Multiplett)
3,02 bis 3,53	(2H, Quartett, J. =	18 HZ)
3,54	(3H, Singlett)
4,18	(1H, Multiplett)
5,15	(1H, Singlett)
7,30	(5H, Multiplett)
Dünnschichtchromatographie:

Lösungsmittelsystem: Essigsäure-Äthylacetat (1:2) Rf = 0,39

Beispiel 8

7—(5—t—Butoxycarbonylamino-S-carboxyvaleramido)—3—(carbamoyl— oxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure wurde praktisch nach dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 7 beschrieben, erhalten unter Verwendung von t-Butoxycarbonylazid als Acylierungsmittel.

Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

Lösungsmittel: Deuterium + Hatriumbicarbonat Innerer Standard: TMS

309883/ U81

2 ό < -L U O

(ppm)

1,43	(9H, Singlett)	18 HZ)
1,75	(4H, Multiplett)
2,40	(2H, Multiplett)
3,25 Ms 3,72	'(2H, Quartett, J =
3,53	(3H, Singlett)
3,85	(1H, Multiplett)
5,16	(1H, Singlett)
Dünnschichtchromatοgraphie:

Lösungsmittelsystem:.EssigsäuretÄtliylacetat (1:2) Rf = 0,49

Beispiel 9

Das verwendete Vegetationsmedium wies die folgende Zusammensetzung auf:

Glycerin	3 %
Sojabohnenmehl	2 <$>
Glutenmehl	1 #
Baumwollsamenmehl	1 #
D,L — Methionin	0,2 1o
Leitungswasser	nach Bedarf

100 ml dieses Mediums in jedem von 30 Stück 500 ml-Kolben wurden in üblicher bekannter Weise sterilisiert und danach mit Sporen und Mycelien von Streptomyces wadayamensis ATCC 21948 beimpft. Diese ersten Vermehrungskulturen wurden bei 30°C 48 Stunden lang inkubiert.

ORIGINAL INSPECTED 309883/148 1

Außerdem wurden, 60 1 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 60 ml eines Antisehäummittels in einem 200 1-Tankfermenter in üblicher Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen der ersten Vermehrungskulturen wurde in diesen Tankfermenter inokuliert. Diese zweite Vermehrungskultur wurde bei 30⁰C 24 Stunden lang inkubiert. "

Ferner wurden 650 1 des angegebenen Kulturmediums zusammen nit 300 ml eines Antischäummittels in einem 1 t-Tankfermenter in üblicher Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen der zweiten Vermehrungskultur wurde bei 30°C 96 Stunden lang inkubiert.

Nach beendeter Fermentation wurde die Kulturlösung unter Rühren mit Diatomeenerde (Diatonerde) versetzt. Die Kulturlösung wurde unter steigendem Druck mit Hilfe einer vorbeschichteten Filterpresse filtriert, wobei 640 1 Filtrat erhalten wurden.

0,8 1 Filtrat wurden mit wäßriger 1 n-Natriumhydroxydlösung unter Kühlung auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, worauf das Filtrat mit 700 ml Aceton versetzt wurde. Zu der Lösung wurden 35 ml Phenylisocyanat in 3,5 ml Aceton tropfenweise zugegeben und die Lösung wurde mit wäßriger 1 n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 7,5 bis 8,0 eingestellt. Nach der Stabilisierung des pH-Werts der Lösung und dem Nachweis, daß die Ninhydrin-Reaktion negativ war, wurde Diphenylharnstoff durch Filtration entfernt. Das aktive Material wurde mit Äthylacetat extrahiert, nachdem die wäßrige Schicht mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war. Die Emulsion wurde abfiltriert. Das in der Äthylacetatschicht vorliegende aktive Material wurde in eine 3 #ige Natriumacetatlösung überführt. Nachdem die überführte Lösung auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 mit 6 η-Salzsäure eingestellt worden war, wurde das aktive Material mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen und danach über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter verminder—

3 09883/148 1

tem Druck abdestilliert, wobei 29,7 g einer gelblichen öligen Substanz erhalten wurden.

Die ölige Substanz wurde in 100 ml Methanol gelöst und die Lösung wurde unter Kühlung mit 18,5 g Dicyclohexylamin versetzt. Zu der erhaltenen Lösung wurden 250 ml Äther zugegeben, worauf die Lösung zur Kristallbildung stehengelassen wurde. Die gebildeten Kristalle wurden in Äthylacetat suspendiert und die Suspension wurde mit 1 η-Salzsäure behandelt, wobei 1,2 g 7-/""5-(3-phenylureido)—5-carboxyvaleramido_/^r-3-(carbamoyloxymethyl)-3-cephem-4-carbonsäure erhalten wurden.

Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

Lösungsmittel: Deuterium +Natriumbicarbonat Innerer Standard: TMS

6 (ppm)

1,80	(4H, Multiplett)	= 18 HZ)
2,40	(2H, Multiplett)
3,08 bis 3,55	(2H, Quartett, J	4,5 HZ)
4,15 '	(1H, Multiplett)	4,5 HZ)
5,05	(1H, Dublett, J =
5,60	(1H, Dublett, J =
7,35	(5H, Multiplett)
Dünnschi chtchroinatographie:

Lösungsmittelsystem: Essigsäure-Äthylacetat (1:2) Rf = 0,39

309883/U81

Beispiel 10

Das verwendete vegetative Medium hatte die folgende Zusammensetzung:

Glycerin	3 f>
Sojabohnenmehl	2 *
Glutenmehl	1 #
Baumwollsamenmehl	1:*
D,L - Methionin	0,2 $,
Leitungswasser	nach Bedarf

100 ml des Mediums in jedem von 30 Stück 500 ml-Kolben wurden in üblicher bekannter Weise sterilisiert und danach mit Sporen und Mycelien von Streptomyces wadayamensis ATCC 21948 inokuliert. Diese ersten Vermehrungskulturen wurden bei 30⁰C 48 Stunden lang inkubiert.

Ferner wurden 60 1 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 60 ml eines Antischäuramit-fcels in einem 200 1-Tankfermenter in üblicher bekannter Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen der ersten Vermehrungskulturen wurde in diesen Tankfermenter eingeimpft. Diese zweite Vermehrungskultur wurde bei 30⁰C 24 Stunden lang inkubiert.

Ferner wurden 6 50 1 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 300 ml eines Antischäummittels in einem 1 t-Tankfermenter in üblicher bekannter Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen der zweiten Vermehrungskultur wurde bei 30⁰C 96 Stunden lang inkubiert. -

Nach beendeter Fermentierung wurde die Kulturlösung unter Rühren mit Diatonerde versetzt. Die Kulturlösung wurde unter steigendem Druck mit Hilfe einer vorbeschichteten Filterpresse filtriert, wobei 64Ο 1 FiItrat erhalten wurden. 8 1 des FiItrats wurden mit

309883/1481

einer 10 $igen wäßrigen Natriumhydroxydlösung unter Kühlung auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, worauf das Piltrat mit 1 1 Aceton-versetzt wurde. Zu der Lösung wurden 95 g Phenylisocyanat in 150 ml Aceton tropfenweise zugegeben und die Lösung wurde mit einer 10 #igen wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 7»5 bis 8,0 eingestellt. Nach der Stabilisierung des pH-Werts der Lösung und dem Fachweis, daß die Ninhydrin—Reaktion negativ war, wurde Diphenylharnstoff durch Filtration entfernt. Das aktive Material wurde nLt Äthylacetat extrahiert, nachdem die wäßrige Schicht mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war. Die Emulsion wurde abfiltriert. Das aktive Material in der Äthylacetatschicht wurde in eine 3 $ige Natriumacetatlösung überführt. Nachdem der pH-Wert der überführten Lösung mit 6 η-Salzsäure auf 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war, wurde das aktive Material mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchlorid! δ sung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 28 g einer gelblichen öligen Substanz erhalten wurden.

Die ölige Substanz wurde Chromatograph!ert an einer Silicagel-Säule und in einem Gemisch aus Äthylacetat-Essigsäure (4:1) entwickelt, wobei 10 g 7-/~5-(3-Phenylureido)-5-carboxyvalerami-00^-3-C carbamoyloxymethyl) ^-methoxy^-cephem-^earbonsäure in Form eines weißen Pulvers erhalten wurden.

Kernmagnetische Resonanz:

Lösungsmittel: Deuterium + Natriumbicarbonat Innerer Standard: TMS

309883/ U81

(ppm)

1,80 (4Η, Multiplett)

2,40 (2H, Multiplett)

3,02 Ms 3,53 (2H, Quartett, J = 18 HZ)

3,54 (3H, Singlett)

4,18 . (1H, Multiplett)

5,15 (1H, Singlett)

7,30 (5H, Multiplett) -

Dünnschichtchromatographie;

Lösungsmittelsystem: Essigsäure-Äthylacetat (1 : 2) Rf = 0,39

Beispiel 11

Das verwendete vegetative Medium wies die folgende Zusammensetzung auf:

Glycerin	3 %
S ο j abohnenmehl	2 £
Grlutenmehl	1 £
Baumwollsamenmehl	1 $
D,L - Methionin	0,2 i>
Leitungswasser	nach Bedarf

ml dieses Mediums in jedem von 30 Stück 500 ml-Kolben wurden in üblicher bekannter Weise sterilisiert und danach mit Sporen und Mycelien von Streptomyces wadayamensis ATCC 21948 inokuliert. Diese ersten Vermehrungskulturen wurden bei 30⁰C 48 Stunden lang inkubiert.

309883/U81

Außerdem wurden 60 1 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 60 ml eines Antischäummittels in einem 200 1-Tankfermenter in üblicher bekannter Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen der ersten Vermehrungskulturen wurde in diesen Tankfermenter eingeimpft. Diese zwe
lang inkubiert.

impft. Diese zweite Vermehrungskultur wurde bei 30⁰C 24 Stunden

Ferner wurden 650 1 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 300 ml eines Antischäummitteis in einem 1 t-Tankfermenter in üblicher bekannter Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen der zweite]
biert.

zweiten Vermehrungskultur wurde bei 30 C 96 Stunden lang inku-

Nach Beendigung der Fermentierung wurde die Kulturlösung unter Rühren mit Diatonerde versetzt. Die Kulturlösung wurde unter steigendem Druck mit Hilfe einer vorbeschichteten Filterpresse filtriert. Das erhaltene FiItrat (640 1) wurde auf einen pH-Wert von 4 bis 5 eingestellt und mit 20 kg Aktivkohle versetzt. Der durch Filtration erhaltene Kohlekuchen wurde mit 600 1 80 tigern wäßrigem Aceton extrahiert. Der Acetonextrakt wurde konzentriert und mit einem Kationenaustauscherharz "Deolite C-20" (H⁺-Form) (Handelsname) auf einen pH-Wert von 3*0 eingestellt und danach durch eine Säule mit dem Anionenaustauscherharz "Deolite A-6" (CH-.C00""-Form) (Handelsname) geleitet. Aktives Material wurde mit 150 1 eines Gemisches aus Pyridin-Essigsäure-Wasser (100 : 7 : 900) eluiert. Das KLuat wurde auf ein Volumen von etwa 8 1 konzentriert und danach auf einen pH-Wert von 3,0 mit "Deolite C-20" (H⁺-Form) (Handelsname) eingestellt. Von der konzentrierten Lösung wurden Verunreinigungen entfernt, indem zweimal mit Äthylacetat und einmal mit n-Butanol gewaschen wurde. Die erhaltene wäßrige Schicht wurde durch eine Säule von "Amberlite XAD-2" (Handelsname) geleitet und die durchgelaufene Lösung wurde durch eine Säule von "AF-Harz¹* (CH,C00~-Form) (Handelsname) geleitet. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde aktives Material eluiert mit etwa 10 1 eines Gemisches aus Pyri-

3 0 9 8 8 3 / 1 U 8 1 original inspected

2 3 3 2 O δ 5

din-Essigsäure-Wasser (100 : 7 · 900). Das Eluat wurde konzentriert ViQd danach mit "Deolite G-20" (H⁺-Form) (Handelsname )-auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt. Verunreinigungen wurden entfernt durch,zweimaliges Waschen mit Äthylacetat und einmaliges Waschen mit n-Butanol. Die wäßrige Schicht wurde mit einer wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf einen ρΉ-Wert von 5 bis 6 eingestellt und danach konzentriert. Das Konzentrat wurde mit einem Gemisch aus Methanol-Aceton (1 : 3) in einer dem 5-fachen Volumen des Konzentrats entsprechenden Menge versetzt, um einen Niederschlag auszufällen. Der gebildete Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet, wobei etwa 25 g Rohprodukt in Form eines Pulvers erhalten wurden.

Das rohe Pulver wurde chromatographiert an einer Säule mit Cellulose. Aktives Material wurde eluiert mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4 5 1 · 2). Der Nachweis für aktives Material im Eluat wurde mit Dünnschichtchromatographie (unter Verwendung von Celluloseblättern) erbracht durch Untersuchung der antibakteriellen Aktivität, der UV-Absorption, der Ninhydrin-Reaktion und des Rf-Werts (0,48 bis 0,50). Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt. Das Eluat wurde konzentriert und mit Aceton versetzt zur Ausfällung. Der gebildete Niederschlag wurde mit Aceton gewaschen und anschließend in Wasser gelost. Die wäßrige Lösung wurde mit einer wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 6 eingestellt und nach dem Entsalzen lyophilisiert, wobei 4 g WS-3442 D in Form eines weißen Pulvers erhalten wurden.

Beispiel 12

Eine Haupt-Fermentierungslösung, die nach einem ähnlichen Ferment ierungsverfahr en, wie in Beispiel 11 beschrieben, erhalten worden war, wurde filtriert. Zu 1,0 1 FiItrat wurden 200 ml Aceton zugegeben und die erhaltene Lösung wurde unter Rühren

309883/U81

ORIGINAL INSPECTED

bei Zimmertemperatur mit 15 ml Phenylisocyanat in 15 ml Aceton tropfenweise versetzt. Die Lösung wurde mit wäßriger 1 n-Eatriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 7,5 bis 8,0 eingestellt. Nach der Stabilisierung des pH-Werts der Lösung und der Bestätigung, daß die Ninhydrin-Reaktion negativ war, wurde Diphenylharnstoff durch Filtration entfernt. Das aktive Material wurde mit Äthylacetat extrahiert, nachdem die wäßrige Schicht mit Hilfe von Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war. Die Emulsion wurde abfiltriert. Das aktive Material in der Äthylacetatschicht wurde in eine 3 #ige Natriumacetatlösung überführt. Nachdem der pH-Wert der überführten Lesung mit 6 η-Salzsäure auf 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war, wurde das aktive Material mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 4 g einer gelblichen öligen Substanz erhalten wurden.

Die ölige Substanz wurde sau! enchromatographisch behandelt unter Verwendung von Silicagel, Die Entwicklung erfolgte mit einem Gemisch aus Äthylacetat-Essigsäure (4 : 1), wobei 50 mg 7-/~5-( 3-Phenylureido ) -5-carboxyvaleramido_7'-3-methyl-7-methoxy-3—cephem-4-carbonsäure erhalten wurden.

Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

Lösungsmittel: Deuterium + Natriumbicarbonat Timer er Standard: TMS

S (ppm)

1,80 (4H, Multiplett)

1,88 (3H, Singlett)

2,45 (2H, Multiplett)

2,93 bis 3,44 (2H, Dublett, J = 18 HZ)

309883/1481

ORIGINAL INSPECTED

3,54 (3H, Singlett)

4,18 (1H, Muitiplett)

5,08 (1H, Singlett)

7,35 (5H, Muitiplett)

Dünnschichtchromatographie;

Lösungsmittelsystem: Essigsäure-Äthylacetat (1:2) Rf = 0,56

Beispiel 13

7-(5-t-Butoxyearbonylamino-5-carboxyTraleramido)-3-methyl-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure wurde nach praktisch dem selben Verfahren wie in Beispiel 12 beschrieben, erhalten unter Verwendung von t-Butoxycarbonylazid als Acylierungsmittel.

Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

Lösungsmittel: Deuterium + Natriumbicarbonat Innerer Standard: TMS

S (ppm)

1,43 (9H, Singlett)

1,75 (4H, Muitiplett)

1,92 (3H, Singlett)

2,40 (2H, Muitiplett)

3.10 bis 3,60 (2H, Dublett, J = 18 HZ) 3,51 (3H, Singlett)

3,90 (1H, Muitiplett)

5.11 . (1H, Singlett)

30988 3/ 148

Dünn s chi cht chromat ο graphiβ;

Lösungsmittelsystem: Essigsäure (Eisessig)-Äthylacetat (1:2) Ef = 0,67

Beispiel 14

Das verwendete vegetative Medium hatte die folgende Zusammensetzung:

Glycerin 3 $>

Sojabohnenmehl 2 fo

Glutenmehl 1 #

Baumwollsamenmehl 1 ?S

D,L - Methionin 0,2 #

Leitungswasser nach Bedarf

100 ml dieses Mediums in jedem von 30 Stück 500 ml—Kolben wurde in üblicher bekannter Weise sterilisiert und danach mit Sporen und Mycelien von Streptomyces Wadayamensis ATGC 21948 beimpft. Diese ersten Vermehrungskulturen wurden bei 30°C 48 Stunden lang inkubiert.

Ferner wurden 60 1 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 60 ml eines Antischäummittels in einem 200 1-Tankfermenter ebenfalls in üblicher bekannter Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen der ersten Vermehrungskulturen wurde in diesen Tankfermenter eingeimpft. Die erhaltene zweite Veraehrungskultur wurde bei 30⁰C 24 Stunden lang inkubiert.

Ferner wurden 650 1 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 300 ml eines Antischäummittels in einem 1-Tonnen-Tankfermenter in üblicher bekannter Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen

3 Ü 3 β 1< 3 / 1481

der zweiten Vermehrungskultur wurde bei 3O°C 96 Stunden lang, inkubi ert.

Nach Beendigung der Fermentation wurde die Kulturflüssigkeit unter Rühren mit Diatonerde versetzt. Die Kulturlösung wurde unter steigendem Druck filtriert mit Hilfe einer vorbeschich— teten Filterpresse, wobei 640 1 FiItrat erhalten wurden.. Zu 1,0 1 Filtrat wurden 200 ml Aceton gegeben und die erhaltene Lösung wurde unter Rühren bei Zimmertemperatur mit 15 ml Phe— nylisocyanat in 15 ml Aceton tropfenweise versetzt. Die Lösung wurde mit wäßriger 1 n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH—Wert von 7,5 bis 8,0 eingestellt. Nach der Stabilisierung des pH-Werts der Lösung und der Bestätigung, daß die Ninhydrin—Reak—. tion negativ war, wurde Diphenylharastoff durch Filtration entfernt. Das aktive Material wurde mit Äthylacetat extrahiert, nachdem die wäßrige Schicht mit Salzsäure auf einen pH—Wert von 1,0 bis 1,5 eingestellt worden war. Die Emulsion wurde abfiltriert. Das aktive Material in der Äthylacetatschicht wurde in eine 3 $ige Natriumaeetatlösung überführt. Nachdem die überführte Lösung auf einen pH-Wert von 1,0 bis 1,5 mit 6 n-Salzsäure eingestellt worden war, wurde das aktive Material mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 4 g einer gelblichen öligen Substanz erhalten wurden.

Die ölige Substanz wurde chromatographiert an einer Säule von Silicagel. Die Säule wurde entwickelt in einem Gemisch aus Äthylacetat-Essigsäure (4 : 1), wobei 50 mg 7-/~"5-( 3-Phenylureido)-5~carboxyvaleramido_/-3-methyl-7-methoxy-3-cephein-4-carbonsäure erhalten wurden.

309883/1481

~ ⁵⁴ " 2332055

Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

Lösungsmittel: Deuterium + Natriumbicarbonat Innerer Standard: TMS

(ppm)

1,80	(4H, Multiplett)
1,88	(3H, Singlett)
2,45	(2H, Multiplett)
2,93 Ms 3,44	(2H, Dublett, J = 18 HZ)
3,54	(3H, Singlfitt)
4,18	(1H, Multiplett)
5,08	(1H, Singlett)
7,35	' (5H, Multiplett)
Dünnschichtchromatographie:

Lösungsmittelsystem: Essjgsäure-Äthylacetat (1:2) Ef = 0,56

Beispiel 15

Das verwendete vegetative Medium hatte die folgende Zusammensetzung;

Stärke	4 %
Baumwollsamenmehl	2 $>
"Ebios" (Handelsname)	1 $>
KH2PO4	0,1 tf
DfL - Methionin	0,1 Ίο
Sojabohnenöl	0,5 1>
Leitungswasser	q..s.

ORIGINAL INSPECTED

309883/1481

100 ml dieses Mediums in jedem von 30 Stück 500 ml-Kolben wurde in üblicher bekannter Weise sterilisiertfcind danach mit Sporen und Mycelien von Streptomyees wadayamensis ATCC 21948 beimpft. Diese ersten Vermehrungskulturen wurden bei 30⁰C 48 Stunden lang inkubiert.

Außerdem wurden 60 1 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 60 ml eines Antischäummittels in einem 200 1-Tankfermenter in üblicher bekannter Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen der ersten Vermehrungskulturen wurde in diesen Tankfermenter eingeimpft. Diese zweite Vermehrungskultur wurde bei 30⁰C 24 Stunden lang inkubiert.

Ferner wurden 65O 1 des angegebenen Kulturmediums zusammen mit 3OO ml eines Antischäummittels in einem 1 t—Tankfermenter in üblicher bekannter Weise sterilisiert. Das gesamte Volumen der zweiten Vermehrungskultur wurde in diesen 1 t-Tankfermenter eingeimpft. Die erhaltene Hauptkultur wurde bei 30⁰C 96 Stunden lang inkubiert.

Nach Beendigung der Fermentation wurde diese Kultur unter Rühren mit Diatonerde versetzt. Die Kulturlösung wurde unter steigendem Druck mit Hilfe einer vorbeschichteten Filterpresse filtriert. Das erhaltene Kulturfiltrat (640 l) !wurde, auf 100⁰C 20 bis 30 Minuten lang erhitzt und danach wurde das Filtrat auf einen pH-Wert von 4 eingestellt. Das Filtrat wurde mit dem Kationenaustauscherharz "Deolite C-20" (H⁺-Form) (Handelsname) auf einen pH-Wert von 2 bis 2,5 eingestellt und auf eine Säule von "AF-Harz^w (CH-,COO~-Form) (Handelsname) aufgebracht. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde aktives Material eluiert mit einem Gemisch aus Pyridin-Essigsäure-Wasser (10 : 1 : 90). Das Eluat wurde konzentriert. n-Butanol wurde zu dem Konzentrat zugegeben und es wurde gerührt.

OR)GINAL INSPECTED

3G0Ü3J/U31

Die wäßrige Schicht wurde mit Wasser auf 60 1 verdünnt und die erhaltene Lösung wurde durch eine Säule von "Deolite A-6" (CH^COO"~-Form) geschickt. Die durchgelaufene Lösung wurde konzentriert und das Konzentrat wurde auf einen pH-Wert von 5 bis 6 eingestellt und danach konzentriert. Fünf Volumen eines Gemisches auf Methanol-Aceton (1 : 3) wurden zu dem Konzentrat zugegeben, um einen Niederschlag zu bilden. Der ausgefallene Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet, wobei etwa 300 g Rohprodukt in Form eines Pulvers erhalten wurden.

Das rohe Pulver wurde auf einer Säule von Cellulose chromatographiert. Die Säule wurde eluiert mit einem Gemisch aus Acetonitril-Propanol-Wasser (2 : 2 : 1). Das Eluat wurde mit Hilfe der DünnschichtChromatographie (unter Verwendung von Celluloseblättern) untersucht durch Bestimmung der antibakteriellen Aktivität, der UV-Absorption, der Ninhydrin-Reaktion und des Rf-Werts (0,27). Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde mit n-Butanol versetzt und gerührt.

Die abgetrennte wäßrige Schicht wurde mit Wasser auf 60 1 verdünnt und die erhaltene Lösung wurde durch eine Säule des Anionenaustauschers "Deolite A-6" (CH-,COO""-Form) (Handelsname) geschickt.

Die durchgelaufene Lösung wurde konzentriert und das Konzentrat wurde auf e~- η pH-Wert von 5 bis 7 eingestellt. Die konzentrierte Lösung wurde sodann mit einem Gemisch aus Methanol-Aceton (1 : 1) versetzt zur Niederschlagsbildung. Die erhaltenen Niederschläge wurden gesammelt und getrocknet, wobei 150 g eines Pulvers erhalten wurden. Das erhaltene Pulver wurde an einer Cellulose-Säule chromatographiert und mit einem Gemisch aus Acetonitril-Propanol-Wasser (2:2:1) entwickelt. Das Eluat wurde untersucht mit Hilfe der DünnschichtChromatographie (unter Verwendung von Celluloseblättern) durch Bestimmung der antibak-

309883/1481

teriellen Aktivität, der UV-Absorption, der Ninhydrin-Reaktion und des Rf-Werts (0,27). Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, Aceton wurde zu den Fraktionen zugesetzt zur Niederschlagsbildung. Der gebildete Niederschlag wurde mit Aceton gewaschen und in Wasser gelöst. Die wäßrige Lösung wurde mit wäßriger 1 n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und danach entsalzen Hind lyophilisiert, wobei 60 g WS-3442 E erhalten wurden.

Beispiel 16

7-^~5-( 3-Phenylureido) -S-earboxyvaleramido^-S-hydroxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure wurde in analoger V/eise wie in Beispiel 12 beschrieben erhalten.

Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

Lösungsmittel: Deuterium + Natriumbicarbonat Innerer Standard: TMS

L· (ppm)

1,80 (4H, Multiplett)

2,42 (2H, Multiplett)

3.62 bis 3,65 (2H, ab. Quartett, J ^ 18 HZ)

4,20 (1H, Multiplett)

4,26 (2H, ainglett)

5,08 (1H, Dublett, J = 4,5 HZ)

5.63 (1H, Dublett, J = 4,5 HZ) 7,35 (5H, Multiplett)

„ _{Λ Λ} OF«GINAL INSPECTED

3 0 9 8 8 3 / 1 A 8 1

Claims (30)

1. IS 3/U b b

   Patentansprüc he

   •1,' Verfahren zur Herstellung von Antibiotika V/S—3442 der Formel

   R HOOC-CH(CH₂) COM-!

   I θ' COOH A

   worin "bedeuten:

   R ein Wasserst off atom oder einen Methoxyrest, R* ein Wasserstoffatom, einen Hydroxy- oder einen Carbamoyloxyrest und

   A ein Wasserstoffatom oder einen Acylrest, umfassend WS-3442 A,B,C,D und E, wobei

   WS-3442 A die obige Formel hat mit R = H, R» = H und A = H entsprechend der Formel

   HOOC-CH (CH₂) COKH-

   OOH

   WS-3442 B die obige Formel hat mit R = H, R^f = OCONH₂ und A=H entsprechend der Formel

   ; HOOC-CH( CH₂) ₃C01JH -j j^^

   NHo 0 ^CrZ"² "² O^GiNAL INSPECTED

   c- OUUH

   ' 309883/U81

   WS-3442 G die obige Formel hat mit R und A=H entsprechend der Formel

   = OCH₃, R' = OCONH₂

   HOOC-CH( CH )
   I

   OCH_ S 42f

   ^C00H

   WS-3442 D die obige Formel hat mit R = OCH₃, R«· = H und A=H entsprechend der Formel

   ' "OCH, _q

   ! HOOC-CHC CH₂ ) ₅C0EH _j-_2_^ ^s>>

   _tmd

   WS-3442 E die obige Formel hat mit R = H, R» = OH und A=H entsprechend der Formel

   HOOC-CH(CH₂) CONH

   dadurch gekennzeichnet, daß man einen WS-3442-erzeugenden Stamm von Streptomyces wadayamensis in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert, bis das Nährmedium eine ausgeprägte, durch die Erzeugung von WS-3442 bedingte antibiotische Aktivität aufweist, und WS-3442 isoliert oder vor der Isolierung die Nährlösung mit einem Acylierungsmittel reagieren läßt und die gebildeten Verbindungen der angegebenen Formel, in der A einen Acylrest bedeutet, isoliert.

   309883/U81
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Streptomyces wadayamensis ATCC 21948 in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert, bis das Nährmedium eine ausgeprägte, durch die Erzeugung von WS-3442 bedingte antibiotische Aktivität aufweist, und WS-3442 isolierte
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces wadayamensis in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert, das eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle enthält.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces wadayamensis ATCC 21948 in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert, das eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoff quelle enthält.
5. 5. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der Nährlösung WS-3442 A isoliert.
6. 6. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der Nährlösung WS-3442 B isoliert.
7. 7. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der Nährlösung WS-3442 C isoliert.
8. 8. Verfahrer nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der Nährlösung WS-3442 D isoliert.
9. 9. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der Nährlösung WS-3442 E isoliert.
10. 10. Verbindung der Formel

    ! "R₃"

    HOOC-CH(CH₂) COHH-%

    I 3 09883/ U81C00H /

    worin bedeuten:

    R ein Wasserstoffatom oder einen Methoxyrest,

    R¹ ein Wasserstoffatom oder einen Hydroxy- oder Carbamoyloxy-

    rest und
    A einen Acylrest.
11. 11. Verbindung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß R und R¹ Wasserstoffatome und A ein Acylrest sind.
12. 12. Verbindung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß R ein Wasserstoffatom, R^f ein Carbamoyloxyrest und A ein Acylrest ist.
13. 13. Verbindung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß

    R ein Methoxyrest, R¹ ein Carbamoyloxyrest und A ein Acylrest sind.
14. 14« Verbindung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß R ein Methoxyrest, R¹ ein Wasserstoffatom und A ein Acylrest sind.
15. 15. Verbindung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß R ein Wasserstoffatom, R* ein Hydroxyrest und A ein Acylrest sind.
16. 16. Verbindung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Acylrest ein Alkoxycarbonyl- oder Arylcarbamoylrest ist.
17. 17· Verbindung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Acylrest ein Alkoxycarbonyl- oder Arylcarbamoylrest ist.
18. 18. Verbindung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Acylrest ein Alkoxycarbonyl- oder Arylcarbamoylrest ist.

    309883/1481
19. 19· Verbindung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Acylrest ein Alkoxycarbonyl- oder Arylcarbamoylrest
    ist.
20. 20. Verbindung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Acylrest ein Alkoxycarbonyl- oder Arylcarbamoylrest
    ist.
21. 21. Verbindung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Acylrest ein Phenylcarbamoyl- oder t-Butoxycarbonylrest ist.
22. 22. Verbindung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Acylrest ein Phenylcarbamoyl- oder t-Butoxycarbonylrest ist.
23. 23. Verbindung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Acylrest ein Phenylcarbamoyl- oder t-Butoxycarbonylrest ist.
24. 24. Verbindung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Acylrest ein Phenylcarbamoyl— oder t-Butoxycarbonylrest ist.
25. 25. Verbindung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Acylrest ein Phenylcarbamoyl- oder t-Butoxycarbonylrest ist.
26. 26. Verfahren zur Herstellung der Acylderivate der Antibiotika WS-3442 A,B,C,D und S nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Fermentationsnährlösung mit einem Gehalt an den Antibiotika

    WS-3442 A der Formel

    H- ;■ -JGHIi-T- ■■ N

    WS-3442 B der Formel

    HOOC-CH (CH₂ )

    __i:

    h

    WS-3442 E der Formel

    ² · ° COOH

    WS-3442 C der Formel

    OCH H0OC-CH( CH₂ ) ^CONH-J 2γ^κ

    NH,

    COOH

    WS-3442 D der Formel

    OCH. HOOC-CH(CH₂) CONH > f ^ΰ ^ und

    ■ 1

    HOOC-CH (CH₂) -CONH

    NH₉ ^

    ^d ° OOH

    mit einem Acylierungsmittel umsetzt unter Bildung der entsprechenden Acylderivate der in Anspruch 1 angegebenen Formel mit R = Wasserstoffatom oder Methoxyrest, R* = Wasserstoffatom, Hydroxylödei¹ Cafbamoyloxyrest und A = Acylrest.

    3'Ö9883/U81
27. 27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentationsnährlösung mit einem Gehalt an dem Antibiotikum WS-3442 A mit einem Acylierungsmittel behandelt unter Bildung eines Acylderivats von WS-3442 A der Formel

    HOOC-CH(CH₂),COUH

    •i COOH

    worin A einen Acylrest bedeutet.
28. 28. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentationsnährlösung mit einem Gehalt an dem Antibiotikum WS-3442 B mit einem Acylierungsmittel behandelt unter Bildung eines Acylderivats von WS-3442 B der Formel

    ' HOOC-CH ( CH₂; ,COHH-

    I ^w COOH

    worin A einen Acylrest bedeutet.
29. 29. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentationsnährlösung mit einem Gehalt an dem Antibiotikum WS-3442 C mit einem Acylierungsmittel behandelt unter Bildung eines Acylderivats von WS-3442 C der Formel

    ■ OCH HOOC-CH(CH₂),COHH- ' ^

    NH

    [ COOH

    309883/1481

    worin A einen Acylrest bedeutet
30. 30. Verfahren nach. Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man die Permentationsnährlösung mit einem Gehalt an dem Antibiotikum WS-3442 D mit einem Acylierungsmittel behandelt unter Bildung eines Acylderivats von WS-3442 D der Formel

    OCH„ HOOG-CH(CH₂) COKH » ^

    NH
    A

    worin A einen Acylrest bedeutet.

    31· Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentationsnährlösung mit einem Gehalt an dem Antibiotikum WS-3442 E mit einem Acylierungsmittel behandelt unter Bildung eines Acylderivats von WS-3442 E der Formel

    HOOC-CH(CH₂

    I ^w COOH

    worin A einen Acylrest bedeutet.

    30988 3/U81

    Cf

    Leerseite