DD159644A5 - Verfahren zur herstellung von makroliden - Google Patents

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DD159644A5
DD159644A5 DD81230761A DD23076181A DD159644A5 DD 159644 A5 DD159644 A5 DD 159644A5 DD 81230761 A DD81230761 A DD 81230761A DD 23076181 A DD23076181 A DD 23076181A DD 159644 A5 DD159644 A5 DD 159644A5
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Richard H Baltz
Gene M Wild
Eugene T Seno
Herbert A Kirst
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Lilly Co Eli
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Description

Aktenzeichen: X-5216
Vertreter; Patentanwaltsbüro Berlin
Titel der Erfindung; Verfahren zur Herstellung von Makroliden Anwendungsgebiet der Erfindung;
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Makroliden, die wertvolle Arzneimittel sind und sich vor allem durch eine besonders interessante antibiotische Wirksamkeit auszeichnen.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen;
Die vorliegenden Makrolide ähneln in ihrer Struktur dem als therapeutisches Mittel bekannten Tylosin, das beispielsweise in Tetrahedron Letters, 2339 (1970) beschrieben wird. Tylosin stellt ein sehr bedeutendes Antibiotikum dar. ünab-
19..1Uh. 1981*040572
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hängig davon besteht jedoch stets die Notwendigkeit zur Entwicklung neuer Antibiotika, und zwar unter anderem allein schon infolge der Möglichkeit der Entwicklung resistenter Stämme im Laufe der Zeit. Weiter können auch entsprechende strukturelle Abwandlungen zu Veränderungen im Spektrum suszeptibler Mikroorganismen führen. Eine chemische Abwandlung der Struktur tylosinähnlicher Makrolide hat sich nun leider jedoch als äußerst schwierig erwiesen. In J. Org. Chem. 44 (12), 2050 bis 2052 (1979) werden beispielsweise die Probleme angesprochen, die bei der Spaltung der Mycinosylglycosidbindung von Tylosin durch chemische Mittel auftreten. Das Hauptaugenmerk der entsprechenden Forschungsarbeiten mit dem Ziel der Schaffung und Untersuchung neuer Strukturen ist daher auf neue, in der Natur vorkommende oder synthetische Mikroorganismen mit der Hoffnung gerichtet, daß sich durch deren Züchtung mit Tylosin verwandte und wirkungsmäßig interessante Strukturen ergeben.
Aufgabe der Erfindung;
Infolge der interessanten Wirksamkeit von Tylosin und des oben angesprochenen ständigen Bedarfs an neuen Antibiotika infolge der im Laufe der Zeit sich ergebenden Resistenzbildung hat sich die Erfindung nun die Aufgabe gestellt, antibiotisch wirksame und tylosinähnliche Makrolide zu schaffen, die sich durch eine besonders interessante pharmakologische Wirksamkeit, und insbesondere eine wertvolle antibiotische Wirksamkeit auszeichnen.
Darlegung des Wesens der Erfindung;
Die obige Aufgabe wird erfindungsgemäß nun gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung antibiotisch wirksamer Makrolide, die dem Tylosin ähnlich sind, dessen Mycinosylbaustein jedoch nicht enthalten, und die sich durch submerse aerobe
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Fermentation bestimmter Stämme von Streptomyces fradiae herstellen lassen.
Im einzelnen wird die obige Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Makrolids der allgemeinen Formel (I)
h ig sVC
U ~. , 119 ZO
CHa-Ih a ig sV-CHs-Q
HC-CHs-t^ 4 9 \v (I)
CHa-CHa-Ai 5 ,ft ,*-0ί
H Y Y1
worin Q für -CH-OH oder -CHO steht, oder eines Acylesters hiervon, oder von Säureadditionssalzen der obigen Verbindungen oder Estern hiervon, mit der Maßgabe, daß dann, falls die Stellung 3 des Moleküls von einer O-Acetylgruppe besetzt ist, die Stellung 4'' keine O-Isovalerylgruppe enthalten kann.
Für obige allgemeine Formel ist zwar keine stereochemische Konfiguration angegeben, doch ist diese selbstverständlich identisch mit der stereochemischen Konfiguration von Tylosin. Der Neutralzucker ist Mycarose und der Aminozucker Mycaminose.
Steht in obiger allgemeiner Formel I der Rest Q für -CHO, dann ist das neue Makrolid 23-Demycinosyltylosin, das vorliegend einfach auch als Demycxnosyltylosin oder DMT bezeichnet wird und die folgende Formel hat:
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-CHa · *K:H2
Eine weitere erfindungsgemäß herstellbare Verbindung stellt das Dihydroderivat von DMT dar, nämlich das 20-Dihydro-23-demycinosyltylosin, welches im folgenden abgekürzt auch als Dihydro-DMT bezeichnet wird, ebenfalls ein antibiotisch wirk sames Makrolid ist und die Struktur
'V-CHa
V-CH2-CH2CH
Ϊ"
Vn-CHa ,· «^CHa
S -0 / ^)·-0Η
"L
hat. _ ρ-^-
CHa
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen hemmen das Wachstum von Mikroorganismen, die für warmblütige Tiere pathogen sind. Sie stellen insbesondere antibakterielle Mittel dar, welche besonders wirksam sind gegenüber grampositiven Mikroorganismen und Arten von Mycoplasma.
Die Hydroxylgruppen von DMT und von Dihydro-DMT, nämlich die in den Stellungen 2", 4"; 3", 23 und 3 befindlichen Hydroxylgruppen, lassen sich verestern, wodurch wertvolle Acylesterderivate gebildet werden. Ferner kann das Dihydro-DMT auch an der in Stellung 20 befindlichen Hydroxylgruppe verestert werden. Die Veresterung der Hydroxylgruppe in Stellung 2' verläuft am einfachsten. Beispiele für derartige Ester sind die Ester von Monocarbonsäuren oder die Halbester von Dicarbonsäuren mit jeweils 2 bis 18 Kohlenstoffatomen.
Bei DMT, Dihydro-DMT und ihren Acylesterderivaten handelt es sich um basische Verbindungen, die sich durch Behandlung mit Säuren in Säureadditionssalze überführen lassen. Solche Säureadditionssalze gehören ebenfalls zur Erfindung. Wird im folgenden daher von DMT-Verbindungen gesprochen, dann versteht man hierunter DMT, Dihydro-DMT, ein bestimmtes Acylesterderivat dieser Verbindungen oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Säureadditionssalz von DMT, Dihydro-DMT oder einem Acylesterderivat hiervon.
Die Erfindung bezieht sich ferner auch auf einen neuen Stamm von Streptomyces fradiae, nämlich den Stamm NRRL 12170 von Streptomyces fradiae, sowie auf ein Verfahren zur Herstellung von DMT oder Dihydro-DMT durch Züchtung dieses Stammes unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung eines wesentlichen Ausmaßes an antibiotischer Aktivität. DMT oder Dihydro-DMT können aus dem basisch gestellten Filtrat jder Kulturbrühe mit polaren organischen Lösungsmitteln extrahiert, und sie können durch Extraktion, Adsorption und/oder Kristallisation weiter gereinigt werden.
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Die Erfindung bezieht sich demnach auf verbesserte Verfahren zur Herstellung von 5-O-Mycaminosyltylonolid (OMT) und 20-Dihydro-5-0-mycaminosyltylonolid (Dihydro-OMT) durch schwach saure Hydrolyse von DMT oder Dihydro-DMT»
Dihydro-DMT läßt sich durch chemische Reduktion oder durch Fermentation erhalten. Die Herstellung von Dihydro-DMT durch chemische Reduktion erfolgt durch bekannte Verfahren, beispielsweise durch Behandlung mit einer etwa: stöchiometrischen Menge eines chemischen Reduktionsmittels, wie Natriumborhydrid, in einem alkoholischen Lösungsmittel. Dihydro-DMT kann ferner auch durch Züchtung des vorliegenden Mikroorganismus Streptomyces fradiae NRRL 12170 unter gesteuerten Fermentationsbedingungen gebildet werden.
DMT und Dihydro-DMT können in ihren Stellungen 21, 4", 3", 23 und 3 durch übliche Behandlung mit Acylierungsmitteln verestert und hierdurch in die entsprechenden Acylesterderivate überführt werden. Dihydro-DMT läßt sich ferner auch in Stellung 20 verestern. Am einfachsten läuft die Veresterung der in Stellung 21 befindlichen Hydroxylgruppe. Zu hierfür geeigneten Acylierungsmitteln gehören beispielsweise Anhydride, Halogenide (gewöhnlich in Kombination mit einer Base oder einem anderen Säuref: anger) und aktive Ester organischer Säuren. Ferner lassen sich solche Acylierungen auch unter Einsatz eines Gemisches aus einer organischen Säure und einem Dehydratisierungsmittel erreichen, wie Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid. Weiter können derartige Acylierungen auch enzymatisch durchgeführt werden, wie dies beispielsweise aus US-PS 4 092 473 hervorgeht. Die entsprechenden Acylderivate lassen sich nach ihrer Bildung in bekannter Weise abtrennen und reinigen.
Das 2'-Monoesterderivat läßt sich durch allgemein bekannte selektive Veresterungstechniken herstellen, beispielsweise
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durch Behandlung des Antibiotikums mit einer stöchiometrischen Menge (oder einer leicht überschüssigen Menge) eines Acylierungsmittels, wie eines Acylanhydrids, bei etwa Raumtemperatur über eine Zeitdauer von etwa 1 bis 24 Stunden bis zur praktischen Beendigung der Veresterung. Der erhaltene 2'-Monoester kann aus dem Reaktionsgemisch durch übliche Verfahren isoliert werden, beispielsweise durch Extraktion, Chromatographie oder Kristallisation.
Brauchbare Acylester sind solche organischer Säuren unter Einschluß aliphatischer, cycloaliphatischer, arylischer, aralkylischer oder heterocyclischer Carbonsäuren, Sulfonsäuren und Alkoxycarbonsäuren, die jeweils vorzugsweise 2 bis 18 Kohlenstoffatome, und insbesondere 2 bis 12 Kohlenstoff atome, enthalten.
Zu Beispielen für geeignete Ester gehören Ester von Säuren, wie Essigsäure, Chloressigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Isovaleriansäure, Alkoxycarbonsäure, Stearinsäure, Cyclopropancarbonsäuren Cyclohexancarbonsäure, ß-Cyclohexylpropionsäure, 1-Adamanty!carbonsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, Phenoxyessigsäure, Mandelsäure oder 2-Thienylessigsäure, von Alkylsulfonsäuren, Arylsulfonsäuren oder Aralkylsulfonsäuren, wobei/die Alkylsulfonsäuren und Aralkylsulfonsäuren an ihrem aromatischen Rest gegebenenfalls Substituenten enthalten können, wie Halogen, Nitro oder Niederalkoxy. Zu geeigneten Estern gehören ferner auch die Halbester von Dicarbonsäuren, wie Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Malonsäure oder Phthalsäure.
Pharmazeutisch unbedenkliche Esterderivate werden bevorzugt. Es sind jedoch auch andere Esterderiväte geeignet, wenn auch nur als Zwischenprodukte.
DMT, Dihydro-DMT und ihre entsprechenden Acylderivate bilden auch Säureadditionssalze. Die Säureadditionssalze von
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DMT, Dihydro-DMT und ihren Acylderivaten gehören ebenfalls zur Erfindung. Solche Säureadditionssalze eignen sich beispielsweise zur Abtrennung,Feir»t7"n dun Kristallisation von DMT,Dihydi DMT und ihren Acylderivaten. Darüber hinaus verfügen diese Salze auch über eine bessere Löslichkeit in Wasser.
Beispiele für geeignete Salze sind solche, die durch übliche Reaktion sowohl mit organischen Säuren als auch mit anorganischen Säuren gebildet werden, beispielsweise mit Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholsäure, Pamoäsäure, Mucinsäure, D-Glutaminsäure, d-Camphersäure, Glutarsäure, Glykolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Ameisensäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure, Picrinsäure, Benzoesäure oder Zimtsäure.
Pharmazeutisch unbedenkliche Säureadditionssalze sind eine besonders bevorzugte Gruppe erfindungsgemäßer Salze. Hierunter werden Salze verstanden, die so wenig toxisch sind, daß sie sich zur chemotherapeutischen Behandlung von Bakterieninfektionen bei warmblütigen Tieren verwenden lassen.
Die Erfindung bezieht sicih auf verbesserte Verfahren zur Herstellung von OMT und Dihydro-OMT durch schwach saure Hydrolyse von DMT oder Dihydro-DMT. OMT und Dihydro-OMT haben die gleichen Strukturen wie DMT und Dihydro-DMT mit der Ausnahme, daß die Mycarosylgruppe durch Wasserstoff ersetzt ist. Die hierfür anzuwendenden schwach sauren Hydrolysebedingungen sind bekannt. Zur Durchführung dieser Hydrolyse lassen sich entsprechende Lösungen mit einem pH-Wert von etwe 4 oder darunter verwenden. Es kann bei Temperaturen von etwa 20 bis 1000C gearbeitet werden. Die zur Durchführung dieser Hydrolyse erforderliche Umsetzungszeit ist abhängig vom pH-Wert des Reaktionsgemisches und der angewandten Temperatur.
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Bei höheren pH-Werten ist die Reaktionsgeschwindigkeit langsamer, während die Umsetzung:bei höheren Temperaturen rascher abläuft. Die Reaktion wird durchgeführt, indem man entweder DMT oder Dihydro-DMT solange mit einer schwach sauren Lösung behandelt, bis die Mycarosylgruppe entfernt und das gewünschte OMT oder Dihydro-OMT entstanden ist.
Wahlweise und gelegentlich auch vorzugsweise werden OMT oder Dihydro-OMT hergestellt, indem man DMT oder Dihydro-DMT in der Fermentationsbrühe, in welcher sie gebildet werden, solange bei den oben beschriebenen schwach sauren Bedingungen umsetzt, bis das DMT oder das Dihydro-DMT zu OMT oder Dihydro-OMT umgewandelt ist. Das auf diese Weise hergestellte OMT oder Dihydro-OMT läßt sich in bekannter Weise aus der Fermentationsbrühe isolieren.
OMT und Dihydro-OMT werden in.US-PS 3 459 853 beschrieben. Sie werden demnach hergestellt durch gesteuerte saure Hydrolyse von Tylosin, Desmycosin, Macrocin, Lactenocin oder ihren Dihydroderivaten. Dieses bekannte Verfahren besteht in einer Entfernung aller neutralen Zucker von Tylosin, Desmycosin, Macrocin oder Lactenocin unter Bildung von OMT. In analoger Weise erfolgt auch die Herstellung von Dihydro-OMT. Die Entfernung des n/eutralen Zuckers in Stellung 23 macht Bedingungen erforderlich, die zu beachtlichen Produktverlusten führen. Solche Produktverluste werden nun durch das vorliegende Verfahren vermieden.
Die Erzeugung von DMT und Dihydro-DMT erfolgt, wie oben bereits erwähnt, durch Züchtung eines diese Verbindungen produzierenden Stammes von Streptomyces fradiae unter submersen aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium bis zur Erzeugung einer wesentlichen antibiotischen Aktivität. Hierbei wird natürlich das DMT zuerst gebildet. Das Dihydro-DMT entsteht dann, wenn die Fermentation über eine längere
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Zeitdauer durchgeführt wird, so daß es zu einer enzymatischen Reduktion des vorhandenen DMT kommen kann.
Zum Wachsen von Streptomyces fradiae NRRL 12170 läßt sich irgendeines der verschiedenen Kulturmedien verwenden. Aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion, optimalen Ausbeute und leichten Isolierung des gewünschten Produkts werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Zu bevorzugten Kohlenstoffquellen für eine großtechnische Fermentation gehören beispielsweise Kohlehydrate, wie Dextrin, Glucose, Stärke oder Maismehl, oder auch öle, wie Sojabohnenöl. Zu bevorzugten Stickstoffquellen gehören Maismehl, Sojabohnenmehl, Fischmehl oder Aminosäuren. Zu den anorganischen Nährsalzen, die den Kulturmedien einverleibt sein können, gehören die üblichen löslichen Salze, welche beispielsweise Ionen von Eisen, Kalium, Natrium, Magnesium, Calcium, Ammonium, Chlorid, Carbonat, Sulfat oder Nitrat liefern.
Im Kulturmedium sollen ferner auch essentielle Spurenelemente vorhanden sein, die zum Wachstum und zur Entwicklung des Mikroorganismus erforderlich sind. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums jln so hoher Menge vor, wie sie für ein Wachsen des Mikroorganismus erforderlich sind. Besteht das Problem einer zu starken Schaumbildung, dann kann erforderlichenfalls der Zusatz kleiner Mengen (nämlich Mengen von etwa 0,2 ml/1) eines Antischaummittels, wie PoIypropylenglykol (mit einem Molekulargewicht von etwa 2000) zu großtechnischen Fermentationsmedien erforderlich sein.
Zur Bildung wesentlicher Mengen an DMT oder Dihydro-DMT wird eine submerse aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt. Kleine Mengen an DMT oder Dihydro-DMT lassen sich auch durch Züchtung in Schüttelkolben erreichen. Infolge der verzögerten Produktion des Antibiotikums bei einer Beimpfung großer
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Tanks mit der Sporenform des Organismus wird vorzugsweise ein vegetatives Impfgut verwendet. Die Herstellung eines <' solchen vegetativen Inoculums erfolgt durch Beimpfen eines kleinen Volumens an Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Mycelbruchstücken des Organismus, wodurch man zu einer frischen und aktiv wachsenden Kultur des Organismus gelangt. Das hierdurch erhaltene vegetative Inoculum läßt sich dann in einen größeren Tank übertragen. Das für das vegetative Inoculum verwendete Medium kann das gleiche sein wie es auch für größere Fermentationen verwendet wird, es lassen sich hierfür jedoch auch andere Medien einsetzen.
Streptomyces fradiae NRRL 12170 kann bei Temperaturen zwischen etwa 10 und 37°C wachsen. Zu einer optimalen Bildung an Antibiotikum scheint es bei einer Temperatur von etwa 280C zu kommen.
Wie bei aeroben submersen Züchtungsverfahren üblich, wird auch bei vorliegendem Verfahren durch das Kulturmedium sterile Luft geblasen. Für eine entsprechend wirksame Bildung an Antibiotikum soll die prozentuale Luftsättigung bei einer Tankproduktion etwa 30 % oder darüber betragen (bei 280C
und 1 bar Druck).
Die Bildung des Antibiotikums läßt sich während der Fermentation verfolgen, indem man Proben der Brühe gegenüber Organismen untersucht, von denen man weiß, daß sie gegen diese Organismen empfindlich sind. Ein hierzu brauchbarer Versuchsorganisraus ist Staphylococcus aureus ATCC 9144. Der Bioversuch wird normalerweise durch eine automatische turbidometrische Methode durchgeführt. Darüber hinaus läßt sich die Bildung an Antibiotikum auch ohne weiteres durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter UV-Detektion überwachen.
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Nach erfolgter Bildung unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen kann man das DMT oder das Dihydro-DMT unter Anwendung von in der Fermentationstechnik üblichen Methoden aus dem Fermentationsmedium gewinnen. Der Gewinnung von DMT oder Dihydro-DMT geht eine anfängliche Filtration der Fermentationsbrühe voran. Die hierdurch erhaltene filtrierte Brühe läßt sich dann gewünschtenfalls weiter reinigen, wodurch man zum gewünschten Antibiotikum gelangt. Diese Reinigung kann unter Anwendung der verschiedensten Techniken durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Reinigungsverfahren für die filtrierte Brühe besteht darin, daß man den pH-Wert der Brühe auf 9 einstellt, die Brühe mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert, wie Ethylacetat, Amylacetat oder Methylisobutylketon, die organische Schicht mit einer wäßrigen sauren Lösung extrahiert und das Antibiotikum dann durch Basischstellen des wäßrigen Extrakts ausfällt. Das hierdurch erhaltene Antibiotikum kann gewünschtenfalls dann durch Extraktion, Adsorption und/oder Umfällung weiter gereinigt werden.
Der erfindungsgemäße neue Mikroorganismus wird erhalten durch chemische Mutagenese eines tylosinproduzierenden Stammes von Streptomyces fradiae. Der durch Mutagenese erhaltene Mikroorganismus produziert lediglich minimale Mengen Tylosin, bildet DMT jedoch als überwiegende Komponente.
Der neue Organismus ist zur Charakterisierung mit dem Stamm Streptomyces fradiae M48-E 2724.1 verglichen worden, nämlich einem von Streptomyces fradiae NRRL 2702 abgeleiteten tylosinproduzierenden Stamm. Der Stamm Streptomyces fradiae NRRL 2702 wird in US-PS 3 178 341 beschrieben. Die tylosinproduzierende Kultur von Streptomyces fradiae M48-E 2724.1 wird im folgenden auch einfach als E2724.1 bezeichnet.
Der neue DMT und Dihydro-DMT produzierende Stamm NRRL 12170
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stellt ebenfalls einen Stamm von Streptomyces fradiae dar. Die Charakterisierung dieses Mikroorganismus erfolgte unter Anwendung der vom Internationalen Streptomyces Projekt zur Charakterisierung von Streptomyces-Arten empfohlenen Methoden (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md., 1974, Seite 815, und Internal. Journal of Systematic Bacteriology 18 (2), 118, (1968)).
Die folgende Beschreibung des DMT-produzierenden Stammes stellt einen Vergleich seiner charakteristischen Eigenschaften mit den Eigenschaften des tylosinproduzierenden Stammes Streptomyces fradiae E2724.1 dar.
Die Sporenkettenmorphologie des neuen Stammes und des Stammes E2724.1 liegt im Abschnitt des Retinaculum-Apertum (RA). Die Haken, Schlaufen und irregulären Spiralen sind kurz und haben im allgemeinen keinen großen Durchmesser. Dies läßt sich am besten auf ISP#2 beobachten (Hefe-Malzextrakt-Agar). Die Sporenoberfläche ist glatt. Die Sporenform ist sphärisch mit einer mittleren Größe von 0,65 μπ» Durchmesser. Der Durchmesserbereich liegt zwischen 0,61 und 0,71 μπι.
Die auffälligsten Unterschiede zwischen diesen Stämmen liegen in ihren Züchtungseigenschaften. Der Stamm E2724.1 bildet auf den meisten Medien ziemlich leicht Luftmycelien und ist weiß gefärbt. Der DMT-produzierende Stamm bildet, wenn überhaupt, nur sehr wenig Luftmycelien. Diese sind dann weiß bis grau gefärbt. Auf den Unterseiten dieser Kolonien sind keine unterscheidbaren Pigmente vorhanden. Sie sind hell bis mittelgelb gefärbt. Die Bildung an Melanoidpigment ist negativ1 .
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Die Bildung an Melanoidpigment wird unter Verwendung von ISP#1 (Trypton-Hefeextrakt-Brühe), ISP#6 (Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar), ISP#7 (Tyrosin-Agar) und ISP#7 Agar ohne Tyrosin untersucht.
Die wichtigen Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen dem Stamm E2724.1 und dem erfindungsgemäßen Stamm gehen aus der folgenden Tabelle I hervor.
Tabelle I
Vergleich zwischen Streptomyces fradiae E2724.1 und NRRL 12170 -__
Ähnlichkeiten Unterschiede
Sporenkettenmorphologie Kulturcharakteristiken —k
Sporenoberflächenornamentierung NaCl-Verträglichkeit
Sporengröße pH-Bereich
Fehlen von Chromogenität Temperaturbereich
Fehlen löslicher Pigmente Kohlenstoffverwertung
Wachstum in ausgewählten vegetativen Medien Gelatineverflüssigung
Stärkehydrolyse
Negative Reaktion in Magermilch
Nitratreduktion
Positive Katalase
Positive Phosphatase
Negative Urease
Antibiotisches Empfindlichkeitsmuster
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Wachstumscharakteristiken und Morphologie der Stämme Streptomyces fradiae E2724.1 und NRRL 12170 gehen vergleichsweise aus der folgenden Tabelle II hervor. In den sich daran anschließenden Tabellen sind vergleichend die antibiotischen Empfindlichkeiten (Tabelle III), die Kohlenstoffverwertung (Tabelle IV) und verschiedene physiologische Eigenschaften (Tabelle V) angegeben.
Tabelle II
Wachstumscharakteristiken und Morphologie E2724.1 NRRL 12170
Sporophoreh. 1 RA
Sporenketten >10
Sporenoberfläche G2 R Am Sp glatt
Sporenform G R Am Sp sphärisch
ISP#2 G R Am Sp gut . 87. m. gelb gut 263-,weiß nichts
ISP#3 schlecht 263. weiß schlecht 263. weiß nichts
ISP#4 reichlich 87. m. gelb reichlich 263. weiß nichts
RA
glatt sphärisch
'_ gut : 87.- m~.~ gelb
ausreichend 26 3-^-weiß nichts ""
schlecht — 263, weiß—
Spur nichts
gut
87v.m. gelb • schlecht
nichts
Tabelle II Wachstumscharakteristiken (Fortsetzung)
G R Am Sp E2724.1
ISP#5 G R Am Sp gut 86.1 gelb gut 92. y. weiß nichts
ISP#7 G R Am Sp reichlich . 87. m. gelb reichlich 263. weiß nichts
Bennett G R Am Sp schlecht 90. gy. gelb nichts nichts
Calciummalat G R Am Sp gut 263. weiß gut 263. weiß nichts
Czapek gut 87. m. gelb reichlich 263. weiß keines
NRRL 1217
gut
86.1. gelb . . .. nichts. -?.-nichts
gut
87. m. gelb
ausreichend 265.* mittelgelb hellbraun
kein Wachstum
schlecht 92, y. weiß keines keines
ausreichend
87. in." gelb Spur ^
nichts
Glucose-Asparagin
6 R
Am Sp
Tomatenpaste- G Hafermehl R Am Sp
Tabelle II Wachstumscharakteristiken (Fortsetzung)
E2724.1
kein Wachstum
NRRL 12170 kein Wachstum
reichlich 92. y. weiß reichlich 263. weiß nichts
gut
87. m. gelb nichts nichts
Die Oberflächenornamentierung wird unter Verwendung eines Abtastelektronenmikroskops bestimmt.
"G = Wachstum, R = Rückseite oder Unterseite der Kolonie, Am = Luftmycel, Sp = lösliches Pigment
Die Zuordnung der Farbbezeichnungen.erfolgt unter Verwendung der Farbkarten ISCC-NBS. (K. L. Kelly und D. B. Judd, "The ISCC-NBS Centroid Color Charts Standard Sample No. 2106," U.S. Dept. of Commerce, National Bureau of Standards, Washington, D.C. 20234
Tabelle III Antibiotische Empfindlichkeit^
Antibiotikum
Konzentration Verbindungsklasse
E2724.1
Chloramphenicol Erythromycin Cephaloridin Lincomycin Polymyxin B Streptomycin Tetracyclin Vancomycin
30 μg Nitrophenyl
15 μg Makrolid
30 μg ß-Lactam
2 μg Lincosaminid 300 Einheiten Peptid
10 μ9 Aminoglycosid
30 μg Tetracyclin
30 μ9 Glycopeptid
NRRL 1217 0
Bestimmt unter Verwendung von Empfindlichkeitsscheiben, die auf angeimpfte Agarplatten geklotzt sind.
- = Resistenz (keine Hemmzonen) -:-+ = Empfindlichkeit (Hemmzonen) S = Spur an Empfindlichkeit
Tabelle IV KohlenstoffVerwertung Kohlenstoffquelle
E2724.1
NRRL 12170
Kontrolle: Kein Kohlenstoff Kontrolle: Glucose L-Arabinose D-Fructose D-Galactose i-Inosit D-Mannit Raffinose SaIicin Sucrose D-Xylose D-Rhamnose
- = Keine Verwertung + = Verwertung
Bestimmt unter Verwendung' von Grundmedium gemäß dem Internationalen Streptomyces Projekt (ISP)#9 (Kohlenstoffverwertungsagar) unter Zusatz von durch Filtrieren sterilisierten.Kohlenstoffquellen bis zu einer Endkonzentration von 1,0 %. Die Platten werden bei 300C bebrütet und nach 7 Tagen sowie nach 12 Tagen ausgewertet.
Tabelle V Verschiedene physiologische Eigenschaften
E2724.1 NRRL 12170
ISP#1 (Chromogenität)
ISP#6 (Chromogenität) - — -_.
ISP#7 (Chromogenität)
Gelatineverflüssigung - -
Reaktion in Magermilch
pH-Wachstumsbereich1/2 6,1 bis 8,8 . 6,1 bis 7,8 ·£**
1 3
Temperaturwachstumsbereich ' 10 bis 37°C 10 bis 300C
.NaCl-Verträglichkeit1'4 - __ 8 % 4 %
Stärkehydrolyse5 + + ι
Nitratreduktion + + μ
Katalane6 + + ι
Phosphatase + +
Urease6
Bestimmt-unter Verwendung von Medium ISP#2 (Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar) sowie unter 7-tägiger Bebrütung.
Ermittelt unter Verwendung folgender Puffer in einer jeweils 0,05-molaren Konzentration: Zitronensäure, pH-Werte 3, 4 und 5; 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, pH-Wert 6, 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure, pH = 7; N-2-Hydroxyethylpiperäzin-N'-2-ethansulfonsäure, pH = 8; 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-i,3-propandiol, pH = 9; 3-Cyclohexylamino-i,1-propansulfonsäure, pH = 10,'11.
Tabelle V (Fortsetzung)
Der pH-Wert des Agars nach 7-tägiger Bebrütung wird als korrekter Wert angesehen, da einige 4er verwendeten Puffer ihren eingestellten pH-Wert nicht beibehalten. Die Toxizität der Puffer wird ermittelt, indem man alle Puffer auf pH 7,0 einstellt und das Wachstum untersucht. Hierbei läßt sich keinerlei Toxizität beobachten.
3Untersucht bei 5, 10, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 45, 50 und 550C
Gemessen durch Zugabe von Natriumchlorid zum Agar in folgenden Mengen: 0, 2, 4, 6, 8, 10 und 12 Gew.-%
Die Bestimmung der Stärkehydrolyse erfolgt durch Untersuchung der Anwesenheit von ι Stärke mittels Iod auf Platten von ISP#4 (anorganische Salze-Stärke-Agar) Μ
Die Enzyinuntersuchungen werden unter Befolgung der Methoden von Blazevic und Ederer ' durchgeführt (D. J. Blazevic und G. M. Ederer, "Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology," John Wiley and Sons, New York, N.Y. , 1975).
230 76 1
Auf Basis der oben angeführten charakteristischen Eigenschaften wird der DMT- und Dihydro-DMT -bildende Mikroorganismus, nämlich der Organismus NRRL 12170, als neuer Stamm von Streptomyces fradiae klassifiziert. Er ist in der Kulturensammlung von Northern Regional Research Center, Agricultural Research, North Central Region, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604, hinterlegt und kann von dort unter der Nummer NRRL 12170 frei bezogen werden.
Der Mikroorganismus Streptomyces fradiae NRRL 12170 ist genauso wie auch andere Organismen einer.Variation zugänglich. So lassen sich beispielsweise Rekombinanten, Mutanten oder künstliche Varianten des Stammes NRRL 12170 herstellen, indem man diesen Stamm mit verschiedenen bekannten physikalischen und chemischen mutagenen Mitteln behandelt, wie beispielsweise Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen oder N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Alle natürlichen und künstlichen Varianten, Mutanten und Rekombinanten von Streptomyces fradiae NRRL 12170, die die charakteristische Bildung von DMT ι beibehalten, können erfindungsgemäß verwendet werden.
Die DMT-Verbindungen hemmen das Wachstum pathogener Bakterien, und zwar insbesondere grampositiver Bakterien und Species von Mycoplasma. Aus der folgenden Tabelle VI gehen beispielsweise die Werte für die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC-Werte) hervor, gemessen durch die üblichen Agar-Verdünnungs-Versuche, in denen DMt · (freie Base) bestimmte Bakterien hemmt.
230761 4
Tabelle VI Wirksamkeit der freien Base von DMT in vitro
Organismus MIC (p.g/ml)
Streptococcus pyogenes C203 0,25
Streptococcus pneumoniae Park I 0,13
Streptococcus sp. (Group D) 282 0,5
Staphylococcus aureus 3055 1/0
Pasteurella multocida 6,25
Pasteurella hemolytica 25,00
Mycoplasma gallisepticum 0,097
Mycoplasma hyopneumoniae 0,39
Mycoplasma hyorhinis 0,78
(MIC = Minimale Hemmkonzentration)
Die DMT-Verbindungen haben sich auch in vivo gegenüber experimentellen Bakterieninfektionen als antibiotisch wirksam erwiesen. Zu diesem Zweck verabreicht man Mäusen mit experimentell hervorgerufenen Infektionen zwei Dosen der jeweils zu untersuchenden Verbindung und ermittelt die sich hierdurch ergebende Wirksamkeit in Form des jeweiligen ED50-Wertes (wirksame Dosis in mg/kg, die einen 50 %-igen Schutz der untersuchten Tiere ergibt, J. Bacteriol. 81, 233 bis 235 (1961)). Die für DMT und DMT-Tartrat beobachteten ED5Q-Werte gehen aus der folgenden Tabelle VII hervor.
Subkutane Tabelle VII (mg/kg χ 2) Oral
Streptococcus pyogenes C203 und orale ED5Q-Werte 64 NU 26
Subkutan Oral Streptococcus pneumoniae Park I
Verbindung 2,2 218 2,3 172 13 1*1 ,3 Subkutan Oral Staphylococcus aureus 3055
DMT-Base DMT-Tartrat Bakterielle Herausforderung (X-LD50) 15,7 66 <9,9 100 3 2,7 Subkutan
2,7 NU* 21
*NU = nicht untersucht
230761 ί,
Die Wirksamkeit gegenüber Arten von Mycoplasma ist eine besonders interessante Eigenschaft der vorliegenden DMT-Verbindungen. Aus den folgenden Tabellen VIII und IX geht eine Zusammenfassung von Untersuchungsergebnissen unter Verwendung von DMT und DMT-Tartrat bei der Behandlung von mit Mycoplasma gallisepticum bei Hühnchen hervorgerufenen Infektionen hervor. Die Verabreichung der jeweiligen Verbindungen erfolgt zusammen mit dem Trinkwasser (0,25 und 0,5 g/l über eine Zeitdauer von 1 bis 3 Tagen) oder durch Injektion in einer Menge von 15 oder 30 mg/kg Körpergewicht.
Tabelle VIII
Behandlung einer durch Mycoplasma gallisepticum hervorgerufenen Infektion bei Hühnchen mit DMT-Base
Anzahl der Tiere Anzahl der Tiere mit
Anzahl toter Tie- mit Luf tsackver- Antikörpern gegen Myco-
re durch Gesamtan- letzungen durch An- Mittleres plasma gallisepticum durch
Verbindung Dosierung zahl der Tiere zahl der gesamten Tiere Gewicht (g) Gesamtanzahl der Tiere
DMT-Base 1 0,5 g/l, bis 3 Tage 9/30 (30 %) 26/30 (86,7 %) 397 21/21 (100 %) ι
DMT-Base 1 0,25 g/l, bis 3 Tage 13/30 (43,3 %) 28/30 (93,3 %) 392 15/17 ( 88, 2 %) to 00 I
DMT-Base 15 mg Ag 10/30 (33,3 %) 24/30 (80 %) 453 20/20 (100 %)
Infizierte Kontrolle 19/30 (63 %) 30/30 (100 %) 304 11/11 (100 %)
Tabelle IX
Behandlung einer durch Mycoplasma gallisepticum hervorgerufenen Infektion CZ3 bei Hühnchen mit DMT-Base _
Anzahl der Tiere Anzahl der Tiere mit
Anzahl toter Tie- mit Luftsackver- Antikörpern gegen Myco- .«_*
re durch Gesamtan- letzungen durch An- Mittleres plasma gallisepticum durch
Verbindung Dosierung zahl der Tiere zahl der gesamten Tiere Gewicht (g) Gesamtanzahl der Tiere
DMT-Tartrat 0,5 g/l, 0/30 ( 0 %) 1 bis 3 Tage
DMT-Tartrat 0,25 g/l, 2/30 ( 6,7 %) 1 bis 3 Tage
DMT-Tartrat 30 mg/kg 10/30 (33,3 %)
Infizierte
Kontrolle — 15/30 (50 %)
13/30 (43,3 %) 458 17/30 (56,7 %)
22/29 (75,9 %) 354 27/28 (96,4 %)
27/30 (90 %) 330 16/20 (80 %)
30/30 (100 %) 231 15/15 (100 %)
230761 k
Zur Verhinderung oder Behandlung von Infektionen durch Mycoplasma bei Geflügel verabreicht man solchen Tieren oral oder parenteral eine wirksame nichttoxische Menge einer DMT-Verbindung. Die DMT-Verbindungen werden meistens zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger verabfolgt, beispielsweise dem Trinkwasser der Tiere.
Untersuchungen der akuten Toxizität von DMT gehen aus der folgenden Tabelle X hervor. Für diese Untersuchungen werden 4 bis 5 Wochen alte Mäuse (Harlan-ICR-Mäuse) verwendet. Die Bestimmung der mittleren lethalen Dosis (LD50) für DMT erfolgt durch orale (p.o.), subkutane (s.c), intravenöse (i.v.) und intraperitoneale (i.p.) Verabreichung.
Tabelle X Akute Toxizität von DTM
Verabreichunqsart
p.o. s.c. i.v. i.p.
Zur Behandlung von Erkrankungen bei warmblütigen Tieren werden die vorliegenden Verbindungen selbstverständlich in Form veterinärer Formulierungen verabreicht. Zur Erfindung gehört daher auch eine Veterinäre Formulierung aus einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder einem pharmazeutisch unbedenklichen Salz oder Ester hiervon als Wirkstoff in Verbindung mit wenigstens einem geeigneten inerten Träger hierfür.
LD50 (mg/kg) 5000
Hähnchen 5447
^m mm Hühnchen 186
über 325
100
721
230761
Die bei solchen Formulierungen zu verwendenden Träger entsprechen in ihrer Art selbstverständlich weitgehend den Trägern, wie sie bereits zusammen mit Tylosin eingesetzt werden.
Ausführungsbeispiele;
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert.
Beispiel 1
A. Schüttelkolbenfermentation von DMT
Ein lyophilisiertes Pellet von Streptomyces fradiae NRRL 12170 wird in 1 bis 2 ml sterilem Wasser dispergiert. Mit einer Teilmenge der hierdurch erhaltenen Lösung (0,5 ml) beimpft man dann ein vegetatives Medium (150 ml) folgender Zusammensetzung:
Bestandteile Menge (%)
Maisquellwasser , 1,0
Hefeextrakt - 0,5
Sojabohnenschrot 0,5
CaCO3 0,3
Sojabohnenöl (roh) 0,45
Deionisiertes Wasser 97,25
Statt dessen kann man auch eine in flüssigem Stickstoff aufbewahrte vegetative Kultur von Streptomyces fradiae NRRL 12170 in jeweils einem Volumen von 1 ml verwenden, rasch auftauen und zum Beimpfen des vegetativen Mediums verwenden.
230761 4
Das inokulierte vegetative Medium wird in einem 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben bei 290C über eine Zeitdauer von etwa 48 Stunden in einem verschlossenen Schüttelkasten bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM bebrütet.
Mit dem hierdurch erhaltenen bebrüteten vegetativen Medium (0,5 ml) beimpft man dann 7 ml eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung:
Bestandteile Menge (%)
Rübenmelasse 2,0
Maismehl 1,5
Fischmehl 0,9
Maisgluten 0,9
NaCl 0,1
(NH4)2HPO4 0,04
CaCO3 0,2
Sojabohnenöl (roh) 3,0
Deionisiertes Wasser 91,36
Das inokulierte Fermentationsmedium wird in einem 50 ml fas senden Kolben bei 290C über eine Zeitdauer von etwa 6 Tagen auf einen geschlossenen Kastenschüttler bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM bebrütet.
23076 1 4
B. Tankfermentation von DMT
Zur Bildung eines größeren Volumens an Inoculum verwendet man 1200 ml des inkubierten vegetativen Mediums, das in ähnlicher Weise wie oben unter Abschnitt A. beschrieben hergestellt wird, zum Beimpfen von 950 1 eines vegetativen Wachstumsmediums der zweiten Stufe mit folgender Zusammensetzung:
Bestandteile Menge (%)
Maisquellwasser 1,0
Soj abohnenölmehl 0,5
Hefeextrakt 0,5
CaCO3 0,3
Sojabohnenöl (roh) 0,5
Lecithin (roh) . 0,015
Wasser 97,185
Der pH-Wert wird mit 50 %-iger Natriumhydroxidlösung auf 8,5 eingestellt.
Dieses vegetative Medium der zweiten Stufe wird in einem 1330 fassenden Tank etwa 48 StuViden bei 2 8°C unter ausreichender Belüftung und Rührung bebrütet.
Mit dem auf diese Weise erzeugten inkubierten Medium der zweiten Stufe (547:1) beimpft man hierauf3800 1 steriles Produktionsmedium folgender Zusammensetzung:
230761 4
Bestandteile ' Menge (%)
Fischmehl 0,875
Maismehl 1,5
Maisgluten 0,87 5
CaCO3 0,2
NaCl 0,1
(NH4) 2HPO4 0,04 .j
Rübenmelasse 2,0 '
Sojabohnenöl (roh) 3,0 ;
Lecithin 0,09
Wasser 91,32 '.
Der pH-Wert wird mit 50 %-iger Natriumhydroxidlösung auf 7,2 eingestellt.
Man läßt das inokulierte Produktionsmedium in einem 6000 1 fassenden Tank etwa 8 bis 9 Tage bei 280C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mit steriler Luft belüftet, um hierdurch dii Menge an gelöstem Sauerstoff zwischen etwa 30 und 50 % zu halten, und es wird mitteJs herkömmlicher Rührer bei einer Geschwindigkeit von etwa 250 UpM gerührt.
2 3 O / b I
Beispiel 2 Isolierung von DMT
Die nach Beispiel 1 erhaltene geerntete Gesamtbrühe (3800 1) ' wird mittels einer Filterhilfe filtriert. Der Mycelkuchen wird mit Wasser gewaschen und das Waschwasser zum Filtrat gegeben.
Der pH-Wert des Filtrats wird mit 50 %-iger wäßriger Lösung von Natriumhydroxid (9,5 1) auf 9,2 eingestellt, worauf man das Filtrat mit Ethylacetat (2000 1) extrahiert. Der Ethylacetatextrakt wird mit deionisiertem Wasser (450 1) und 1-basischem Natriumphosphat (6,4 kg) versetzt, und die erhaltene Lösung wird gründlich durchmischt. Anschließend stellt man den pH-Wert dieser Lösung von pH 6,0 unter Verwendung einer Phosphorsäurelösung (3300 ml, 2 Teile Wasser auf 1 Teil Phosphorsäure) auf pH 4,35 ein. Sodann wird die wäßrige Schicht abgetrennt. Der pH-Wert der angereicherten wäßrigen Schicht wird mittels 50 %-iger wäßriger Natriumhydroxidlösung (700 ml) auf pH 6,5 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird jsodann unter Vakuum auf ein Volumen von etwa 225 1 konzentriert. Der pH-Wert der konzentrierten Lösung wird durch Zugabe von 10 %-igem wäßrigem Natriumhydroxid (16 1) auf 9,2 eingestellt. Die basische Lösung läßt man dann über Nacht stehen. Die entstandenen Kristalle werden abfiltriert, mit deionisiertem Wasser (50 1) gewaschen und getrocknet, wodurch man zu etwa 8,6 kg Produkt gelangt. Ein Teil dieses Produkts (3 kg) wird aus einem Gemisch aus Aceton und Wasser umkristallisiert, wodurch man etwa 2,07 kg freie Base von DMT erhält.
DMT erweicht bei etwa 132°C und schmilzt langsam bis zu etwa 1500C. Eine Elementaranalyse von DMT ergibt folgende
230761
ungefähre prozentuale Zusammensetzung: Kohlenstoff =61 %, Wasserstoff = 8,5 %, Stickstoff = 2 %, Sauerstoff = 28 %. DMT hat eine empirische Formel von C38H63NO13 und ein Mole~ kulargewicht von etwa 742 (741 durch Massenspektrometrie bestimmt).
Das Infrarotspektrum der freien Base von DMT in Chloroform geht aus der beiliegenden Zeichnung hervor. Es lassen sich Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen (cm ) beobachten: 3634 (sehr schmal), 3559 (Schulter), 3423 (breit), 2955 (stark), 2907 (stark), 1710 (stark) 1676 (Schulter), 1588 (stark), 1447 (Schulter), 1396 (Schulter), 1359 (schmal), 1309 (sehr schmal), 1178 (Schulter), 1156 (stark), 1111 (Schulter), 1072 (Schulter), 1048 (stark), 1013 (Schulter), 984 (Schulter), 926 (sehr schmal), 898 (sehr schmal) und 833 (sehr schmal).
Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von DMT in neutralem Ethanol zeigt ein Absorptionsmaximum bei 283 nm (£= 22 296, Ε] *m = 300,9).
Die freie Base von DMT hat folgenden spezifischen Drehwert:
/ JCC/q5 = 53,5° (c'= 1, CH3OH).
Eine elektrometrische Titration von DMT in 66 %-igem wäßrigem Dimethylformamid zeigt die Gegenwart einer titrierbaren Gruppe mit einem pK -Wert von etwa 7,25.
el
Die Base von DMT ist in Wasser und den meisten organischen Lösungsmitteln löslich, wie Aceton, Methanol, Ethanol, Chloroform, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid. Die Säureadditionssalze von DMT sind in Wasser besser löslich als die Base von DMT.
23076 1
DMT läßt sich von Tylosin und anderen bekannten Faktoren von Tylosin durch Papierchromatographie und Dünnschichtchromatographie unterscheiden. Die ungefähren Rf- und Rx-Werte von DMT und verschiedenen anderen Tylosinfaktoren gehen aus den folgenden Tabellen XI und XII hervor. Der in Tabelle XII enthaltene Rx-Wert entspricht dem Verhältnis der Bewegung in bezug auf die Bewegung von Tylosin, welchem der Wert 1,0 zugeordnet worden ist. Die Detektion, erfolgt bioautographisch unter Verwendung von Bacillus subtilis.
Tabelle XI Dünnschichtchromatoqraphie von DMTC Verbindung
Tylosin DMT
Desmycosin Macrocin Relomycin
Rf-Werte C
B 0,67
0,53 0,53 0,61
0,45 0,52 0,17
0,47 0,24 0,60
0,23 0,49 0,63
0,34 0,51
Medium: Merck, Darmstadt - Silicagel 60
Lösungsmittel: A = Ethylacetat:Diethylamin (96:4)
B = Aceton:Ethanol (2:1) C = Chloroform:Methanol (3:1)
230761
Tabelle XII Papierchromatographie von DMT Verbindung
Tylosin DMT
Desmycosin Macrocin Relomycin
Rx-Werte Db E 0
1/0 1, 95
0,76 o, 83
0,22 o, 87
0,43 o, 0
0,63 1,
Papier: Whatman No. 1 mit 0,75-molarem KH-PO4-PUffer vom pH 4,0 behandelt und getrocknet
lösungsmittel: D = mit Wasser gesättigtes Ethylacetat
E = mit Wasser gesättigtes n-Butanol
Beispiel 3 Herstellung von OMT
Das nach Beispiel 2 hergestellte DMT wird in verdünnter ChlorwasserstoffSäurelösung gelöst (Zugabe von HCl zu Wasser, bis die Lösung einen pH-Wert von 1,8 hat). Die erhaltene Lösung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann durch Zusatz von Natriumhydroxid auf pH 9,0 eingestellt. Die basische Lösung wird mit Ethylacetat, Dichlormethan oder Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu OMT gelangt.
230761 A
Beispiel 4 Herstellung von OMT
Das nach Beispiel 2 hergestellte DMT (500 g) wird mit einem Mörser und einem Pistill vermählen und zu deionisiertem Wasser (1,5 1) gegeben. Der pH-Wert wird durch bedarfsweisen Zusatz von Schwefelsäure (20 %-ig) zwischen 3,5 und 7,5 gehalten. Nach 30 Minuten ist das gesamte DMT in Lösung gegangen. Sodann stellt man den pH-Wert der Lösung.auf etwa 1,4 ein und läßt die Lösung 42 Stunden bei 220C stehen. Nach üblicher Aufarbeitung gelangt man zu 366 g OMT, dessen Identität durch Vergleich seines Dünnschichtchromatogramms mit einer bekannten authentischen Probe bestätigt wird, die man unter Anwendung des in US-PS 3 459 853 beschriebenen Verfahrens erhält.
Beispiel 5 Herstellung von Dihydro-DMT
Man löst das nach Beispiel 2 hergestellte DMT (50 mg) in einer wäßrigen Isopropyla'lkohollösung (etwa 40 %, 25 ml). In einer 30 %-igen wäßrigen Isopropylalkohollösung (10 ml) löst man Natriumborhydrid (20 mg). Die Natriumborhydridlösung (1 ml) wird dann zur DMT-haltigen Lösung gegeben. Das erhaltene Gemisch wird 5 Minuten gerührt, mit Phosphorsäure auf pH 7,5 eingestellt und dann zur Entfernung des Isopropylalkohols unter Vakuum konzentriert. Das Konzentrat wird mit Chloroform (50 ml) versetzt. Der pH-Wert der wäßrigen Schicht wird auf 7,5 eingestellt. Nach Extraktion wird das Chloroform abgetrennt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft, wodurch man zu Dihydro-DMT gelangt.
2 3 0 7 6 1 A
Beispiel 6 Herstellung von Dihydro-OMT
Das nach Beispiel 5 hergestellte Dihydro-DMT wird genauso behandelt wie bei Beispiel 3, wodurch man Dihydro-OMT erhält.
Beispiel 7 Anderes Verfahren zur Herstellung von OMT
Zur Herstellung von OMT aus DMT behandelt man DMT in der Fermentationsbrühe, in der es gebildet wird, mit einer schwachen Säure nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren. Die Isolierung von OMT erfolgt nach einem ähnlichen Verfahren wie für DMT bei Beispiel 2.
Beispiel 8 2'-O-Acetyl-DMT
Man löst DMT (10 q\ 13,5 mMol) in Aceton (260 ml) und behandelt die Lösung unter Rühren bei Raumtemperatur tropfenweise mit Essigsäureanhydrid (1,6 ml, 15,7 mMol). Die Lösung wird über Nacht (18 Stunden) weiter gerührt und das Lösungsmittel dann unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in Ethylacetat (200 ml) gelöst und die Lösung mit gesättigter Natrxumbicarbonatlösung (2 χ 200 ml) extrahiert. Die organische Lösung wird getrocknet (Natriumsulfat), filtriert und eingedampft. Der Rückstand wird in einem kleinen Volumen Ethylacetat gelöst, worauf man die Lösung auf eine Silicagelsäule (Waters Prep 500) aufgibt und die Säule mit
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Ethylacetat (4 1) eluiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden durch dünnschichtchromatographische Analyse identifiziert, vereinigt und zur Trockne eingedampft, wodurch man zu 6,5 g (61 %) 2'-O-Acetyl-DMT gelangt.
Beispiel 9 2'-O-Propionyl-DMT
In analoger Weise behandelt man DMT (6,0 g, 8,1 mMol) in Aceton (120 ml) mit Propionsäureanhydrid (1,2 ml, 9,2 mMol). Nach Aufarbeitung und chromatographischer Reinigung gelangt man zu 3,7 g (57 %) 2'-O-Propionyl-DMT.
Beispiel 10 2',23-Di-O-acetyl-nMT
Man löst DMT (3 g, 4,05 mMol) in Methylenchlorid (90 ml) und Pyridin (7,8 ml) und behandelt die Lösung unter Rühren bei Raumtemperatur tropfenweise mit 1,4 ml (13,7 mMol) Essigsäureanhydrid. Die Lösung wi'rd über Nacht (17 Stunden) gerührt, worauf man sie mit Toluol (15 ml) verdünnt und zur Entfernung der Lösungsmittel unter verringertem Druck eindampft. Der Rückstand wird in einem kleinen Volumen Ethylacetat gelöst, worauf man die Lösung auf eine Silicagelsäule (Waters Prep 500) aufgibt und die Säule mit Ethylacetat (4 1) eluiert. Auf diese Weise gelangt man zu 2,1 g eines Rohprodukts. Dieses Material wird in einem minimalen Volumen Toluol gelöst. Die Lösung wird auf eine Schnelldiromatograhiersäule aus Silicagel (300 ml) aufgegeben und die Säule mit (a) einem 3:1-Gemisch aus Toluol und Ethylacetat (300 ml), (b) einem 5:4-Gemisch aus Toluol und Ethylacetat (600 ml) und (c) einem
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1:1-Gemisch aus Toluol und Ethylacetat (1000 ml) eluiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden durch dünnschichtchromatographische Analyse lokalisiert/ vereinigt und zur Trockne eingedampft, wodurch man 1,7 g (64 %) 2',23-Di-O-acetyl-DMT erhält.
Beispiel 11 2' ,2 3-Di-O-propionyl-DMT
Man löst DMT (3 g, 4,05 mMol) in Methylenchlorid (90 ml) und Pyridin (7,8 ml) und behandelt die Lösung dann unter Rühren bei Raumtemperatur tropfenweise mit 1,8 ml (13,8 mMol) Propionsäureanhydrid. Die Lösung wird über Nacht gerührt, worauf man sie mit Toluol (15 ml) versetzt und unter verringertem Druck zur Trockne eindampft. Der Rückstand wird in Toluol (20 ml) gelöst, worauf man die Lösung auf eine mit Silicagel (E. Merck 60, 300 ml) gefüllte Schnellchromatographiersäule gibt und die Säule mit (a) einem 3:1-Gemisch aus Toluol und Ethylacetat (300 ml), (b) einem 5:4-Gemisch aus Toluol und Ethylacetat (300 ml) und (c) einem 1:1-Gemisch aus Toluol und Ethylacetat (1000 ml) eluiert. Auf diese Weise gelangt man zu 2,5 g (72 ,%) 2',23-Di-O-propionyl-DMT.
Beispiel 12 2'-O-Acetyl-23-O-propionyl-DMT
Man löst 2'-O-Acetyl-DMT (6 g, 7,7 mMol) in Methylenchlorid (180 ml) und Pyridin (15 ml) und behandelt die erhaltene Lösung unter Rühren bei Raumtemperatur dann tropfenweise mit 1,2 ml (9,2 mMol) Propionsäureanhydrid. Die Lösung wird über Nacht (17'Stunden) gerührt, worauf man sierait Toluol (300 ml) verdünnt und unter vermindertem Druck zur Trockne ein-
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dampft. Der Rückstand wird in Toluol gelöst und die Lösung mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die Toluolschicht wird getrocknet (Natriumsulfat), filtriert und eingedampft. Der Rückstand wird in einem kleinen Volumen Toluol gelöst, worauf man die Lösung auf eine mit Silicagel (300 ml) in einem 1:1-Gemisch aus Toluol und Ethylacetat gefüllte Schnellchromatographiersäule gibt und die Säule mit einem 1:1-Gemisch aus Toluol und Ethylacetat (1 1 ) eluiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch identifiziert, vereinigt und unter verringertem Druck eingedampft, wodurch man zu 4,5 g (70 %) 2'-0-Acetyl-23-0-propionyl-DMT gelangt.
Beispiel 13 2'-O-Propionyl-23-O-acetyl-DMT
In ähnlicher Weise behandelt man auch 2·-O-Propionyl-DMT (1,5 g, 2 mMol) in Methylenchlorid (45 ml) und Pyridin (3,9 ml) mit 0,3 ml (2,9 mMol) Essigsäureanhydrid. Nach chromatographischer Reinigung über Silicagel (Waters Prep 500) erhält man 0,81 g (51 %) 2'-O-Propionyl-23-O-acetyl-DMT.
Beispiel 14 2'-O-Acetyl-23-O-phenylacetyl-DMT
Man löst 2'-OrAcetyl-DMT (2,75 g, 3,5 mMol) in Methylenchlorid (75 ml) und Pyridin (0,8 ml) und behandelt die Lösung unter Rühren bei Raumtemperatur dann tropfenweise mit einer Lösung von 0,56 ml (3,5 mMol) Phenylacetylchlorid in Methylenchlorid (13 ml). Das Ganze wird 1,5 Stunden gerührt und dann mit weiterem Phenylacetylchlorid (0,56 ml) in Methylenchlorid (13 ml) behandelt. Nach weiteren 1,5 Stunden ist-das Aus-
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gangsmaterial verbraucht, wie sich durch dünnschichtchromatographische Analyse zeigt. Die Lösung wird dann unter verringertem Druck zur Trockne eingedampft, worauf man den Rückstand in Methylenchlorid löst und die Lösung mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die organische Schicht wird getrocknet (Natriumsulfat), filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Toluol gelöst und die Lösung über eine Silicagelsäule (Waters Prep 500) chromatographiert. Die Eluierung wird mit einem linearen Gradienten aus einem 1:1-Gemisch aus Toluol und Ethylacetat (4 1) und aus Ethylacetat (4 1) durchgeführt. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden eingedampft, wodurch man 1,1 g (35 %) 2l-O-Acetyl-23-O-phenylacetyl-DMT erhält. Aus den früheren Fraktionen gelangt man zu weiteren 0,86 g (24 %) 2'-O-Acetyl-23,4·'-di-O-phenylacetyl-DMT.
Beispiel 15 23-O-Propionyl-DMT
Man löst 2'-0-Acetyl-23-0-propionyl-DMT (1,6 g, 1,9 mMol) in 95 %-igem Methanol (80 ml) und rührt die Lösung 42 Stunden bei Raumtemperatur. Die Lösung wird dann unter verringertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in einem geringen Volumen Toluol gelöst, worauf man die Lösung auf eine mit Silicagel (E. Merck 60, 200 ml) gefüllte Schnellchroma tographier säule gibt und die Säule mit einem 1:1-Ge~ misch aus Toluol und Ethylacetat (2 1) eluiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden durch dünnschichtchromatographische Analyse identifiziert, vereinigt und unter verringertem Druck eingedampft, wodurch man zu 1,2 g (79 %) 23-O-Propionyl-DMT gelangt.
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Beispiel 16 23-O-Phenylacety1-DMT ·
Man löst 2'-O-Acetyl-23-O-phenylacety1-DMT (0,6 g, 0,67 mMol) in 80 %-igem wäßrigem Methanol (50 ml) und erhitzt die Lösung 4,5 Stunden leicht auf Rückflußtemperatur. Die Lösung wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt und unter verringertem Druck zur Trockne eingedampft, wodurch man 0,39 g (68 %) 23-O-Phenylacetyl-DMT erhält.
Beispiel 17 23,4''-Di-O-phenylacetyl-DMT
Man löst 2'-O-Acetyl-23,4·'-di-O-phenylacetyl-DMT (0,36 g, 0,36 mMol) in 80 %-igem wäßrigem Methanol (30 ml) und erhitzt die Lösung 4,5 Stunden auf Rückflußtemperatur. Die Lösung wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt und unter verringertem Druck zur Trockne eingedampft, wodurch man zu 0,29 g (84 %) 23,4''-Di-O-phenylacetyl-DMT gelangt.
/ Beispiel 18
2'-O-Acetyl-3,23,4''-tri-O-propiony1-DMT
Man löst 2'-O-Acetyl ^-DMT (2 g, 2,6 mMol) in Aceton (40 ml) und Pyridin (8 ml) und behandelt die Lösung unter Rühren bei Raumtemperatur tropfenweise mit einer Lösung von 40 ml Propionsäureanhydrid in Aceton (20 ml). Man rührt insgesamt 5 Tage und dampft das Gemisch dann unter verringertem Druck ein. Das zurückbleibende öl wird in Ethylacetat gelöst und die Lösung mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung extrahiert.
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Die organische Schicht wird getrocknet (Natriumsulfat), filtriert und eingedampft. Der Rückstand wird in einem geringen Volumen Toluol gelöst und die Lösung über Silicagel (Waters Prep 500) chromatographiert. Die Säule wird mit einem linearen Gradienten aus Toluol (4 1) und Ethylacetat (4 1) eluiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft, wodurch man zu 1,4 g (57 %) 2'-O-Acetyl-3,23,4''-tri-O-propionyl-DMT gelangt.
Beispiel 19 3,23,4''-Tri-O-propionyl-DMT
Man löst 2!-O-Acetyl-3,23,4''-tri-O-propionyl-DMT (0,7 g, 0,74 mMol) in 80 %-igem wäßrigem Methanol (55 ml) und erhitzt die erhaltene Lösung 5 Stunden auf Rückflußtemperatur. Sodann wird die Lösung abgekühlt und anschließend unter verringertem Druck zur Trockne eingedampft. Das dabei erhaltene Produkt wird in Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wird abgetrennt, getrocknet (Natriumsulfat), filtriert und unter verringertem Druck zur Trockne eingedampft, wodurch man zu 0,3£ g (56 %) 3,23,4''-Tri-O-propionyl-DMT gelangt.
Beispiel 20 2 ' , 4 ' ' , 2 3-Tri-Or-acetyl-DMT
Man löst DMT (10,0 g, 13,5 mMol) in Pyridin (150 ml) und behandelt die erhaltene Lösung dann unter Rühren bei Raumtemperatur mit-5,8 ml (60,7 mMol) Essigsäureanhydrid. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht gerührt und anschließend zur Entfernung des Lösungsmittels unter verringertem Druck eingedampft.
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Das zurückbleibende öl wird in Dichlormethan gelöst, worauf man den Extrakt mit Natriumbicarbonatlösung sättigt, die organische Schicht abtrennt, trocknet (Natriumsulfat), filtriert und unter verringertem Druck eindampft. Das hierbei zurückbleibende Material wird über eine mit Silicagel (Waters Prep 500) gefüllte Säule chromatographiert, wobei man die Säule mit einem linearen Gradienten eines 3:1-Gemisches aus Toluol und Ethylacetat (4 1) sowie mit Ethylacetat (4 1) eluiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch identifiziert, vereinigt und unter verringertem Druck eingedampft, wodurch man zu 4,5 g 2',4'',23-Tri-O-acetyl-DMT gelangt.
Beispiel 21 2'-O-Acetyl-23-O-phenoxyacetyl-DMT
Man löst 2'-O-Acetyl-DMT (2,75 g, 3,5 mMol) in Dichlormethan (75 ml) und Pyridin (0,8 ml) und behandelt das Ganze unter Rühren bei Raumtemperatur tropfenweise mit einer Lösung von 1,2 ml (8,8 mMol) Phenoxyacetylchlorid in Dichlormethan (25 ml). Nach 1 Stunde gießt man das Reaktionsgemisch in eine gesättigte Natriumbicarbonatlösung (200 ml), worauf man die organische Schicht abtrennt, trocknet (Natriumsulfat), filtriert und unter verringertem Druck eindampft. Der zurückbleibende feste Schaum wird auf eine mit Silicagel gefüllte Schnellchromatographiersäule gegeben, und die Produkte werden abgetrennt und unter Verwendung eines 1:1-Gemisches aus Toluol und Ethylacetat als Lösungsmittel eluiert. Auf diese Weise gelangt man zu 1,5 g 2'-0-Acetyl-23-0-phenoxyacetyl-DMT zusammen mit 0,55 g 2'-O-Acetyl-23,4''-di-0-phenoxyacetyl-DMT und 0,03 g 2'-O-Acetyl-3,23-di-O-phenoxyacetyl-DMT.
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Beispiel 22 2'-O-Acetyl-23-O--(p-chlörphehyläcetyl)-DMT
Man löst p-Chlorphenylessigsäure (4,3 g, 25 mMol) und 1-Hydroxybenzotriazol (3,4 g, 25 mMol) in Tetrahydrofuran (150 ml). Die Lösung wird in einem Eisbad gekühlt und mit Dicyclohexylcarbodiimid (5,2 g, 25,3 mMol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei O0C gerührt und dann über Nacht in einen Kühlschrank gestellt. Das Gemisch wird filtriert und das Filtrat unter verringertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Aceton (75 ml) gelöst, worauf man die Lösung filtriert und mit 10 g (12,8 mMol) 2·-O-Acetyl-DMT und 0,87 g (12,8 mMol) Imidazol behandelt. Durch Zusatz von Aceton wird die Lösung auf ein Volumen von insgesamt 125 ml gebracht und dann mit 1,87 ml (12,8 mMol) Triethylamin versetzt. Die Lösung wird 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf man das Lösungsmittel unter verringertem Druck verdampft. Der Rückstand wird auf eine mit Silicagel gefüllte Schnellchromatographiersäule gegeben und die Säule unter Anwendung eines Gradienten mit einem 4:1-Gemisch aus Toluol und Ethylacetat bis zu Ethylacetat allein eluiert. Auf diese Weise gelangt man zu 4,/75 g 2 '-O-Acetyl-23-O- (p-chlorpheny!acetyl)-DMT.
Beispiel 23 2'-O-Acetyl-4''-Q-propionyl-DMOT
Man löst 2'-O-Acetyl-DMOT (1,0 g, 1,3 mMol) in Pyridin (30 ml] und behandelt die erhaltene Lösung unter Rühren bei Raumtemperatur tropfenweise mit 0,6 ml (4,6 mMol) Propionsäureanhydrid. Nach 20 Stunden gibt man weitere 3,0 ml (23 mMol) Propionsäureanhydrid zu und rührt die erhaltene Lösung 26 Stun-
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den bei Raumtemperatur weiter. Das Gemisch wird mit Toluol (30 ml) verdünnt, und die Lösungsmittel werden unter verringertem Druck verdampft.. Das zurückbleibende Öl wird in Dichlormethan (50 ml) gelöst, worauf man die Lösung mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung extrahiert, die organische Schicht abtrennt, trocknet (Natriumsulfat), filtriert und eindampft. Der Rückstand wird auf eine mit Silicagel (Waters Prep 500) gefüllte Säule gegeben und die Säule mit einem linearen Gradienten aus Toluol (4 1) und Ethylacetat (4 1) eluiert. Zuerst werden 305 mg 2'-O-Acetyl-3,4''-di-O-propionyl-DMOT und anschließend 286 mg 2'-O-Acetyl-4''-O-propionyl-DMOT eluiert.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung eines Makrolids der allgemeinen Formel (I)
HO-CHs-γ CH3-CH2-·.
OH3
worin Q für -CH3OH oder -CHO steht, oder eines Acylesters hiervon, oder von Säureadditionssalzen der obigen Verbindungen oder Estern hiervon,
mit der Maßgabe, daß dann, falls die Stellung 3 des Moleküls von einer O-Acetylgruppe besetzt ist, die Stellung 4'' keine O-Isovalerylgruppe enthalten kann,
dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) Streptomyces fradiae NRRL 12170 unter submersen aeroben Bedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen antibiotischen Aktivität und Erzeugung des gewünschten Makrölids züchtet oder
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(b) 23-Demycinosyltylosin mit einem chemischen Reduktionsmittel unter Bildung des Makrolids, worin Q für -CH2OH steht, reduziert und
(c) durch Ansäuerung oder Veresterung gewünschtenfalls ein Salz oder einen entsprechenden Ester bildet.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 23-Demycinosyltylosin herstellt.
3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 20-Dihydro-23-demycinosyltylosin herstellt.
Hierzu ή Seite Zeichnung
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