HU189512B

HU189512B - Process for preparing macrolide anibiotics

Info

Publication number: HU189512B
Application number: HU811737A
Authority: HU
Inventors: Richard H Baltz; Gene M Wild; Eugene T Seno; Herbert A Kirst
Original assignee: Eli Lilly And Co,Us
Priority date: 1980-06-12
Filing date: 1981-06-11
Publication date: 1986-07-28
Also published as: AR226899A1; IL63075A; PT73165B; NZ197359A; PL131733B1; ZA813579B; DK255681A; GB2077731B; AU7144681A; IL63075A0; IE51614B1; EP0042250A1; GB2077731A; JPS5731699A; PT73165A; KR840001956B1; KR830006429A; YU144381A; CS225841B2; ES8203962A1

Description

A találmány tárgya eljárás az ismert terápiás ^! használatú tilozinnal (lásd például Tetrahedron

Letters, 2339, 1970) rokon makrolid antibiotikumok előállítására.

A tilozin nagy értéke ellenére állandóan szükség van új antibiotikumok iránti kutatásra, mivel rezisztens törzsek jelenhetnek meg. Ezen felül a vegyületek szerkezetének módosítása megváltoztathatja az érzékeny mikroorganizmusok spektrumát. Sajnálatos módon a tilozinnal rokon makrolidok szerkezetének kémiai módosítása különösen nehéz, így például a J. Org. Chem., 44, 2050-2952, 1979., cikkben jelzik a tilozin molekuláról való micinozilglükozid kötés hasításának nehézségeit. Az ezen a területen dolgozó kutatók túlnyomó többségben { oly módon kutatnak újszerű szerkezetű vegyületek után, hogy új, a természetben előforduló, vagy mesterségesen előállított új mikroorganizmusokat keresnek, abban a reményben, hogy tenyésztésük soj. rán hasonló szerkezetű vegyületek bioszintetizálódi nak.

! Úgy találtuk, hogy a tilozinhoz hasonló vegyülej teket, de a tilozinban lévő micinozil-cukorrészt nem j tartalmazó vegyületeket állíthatunk elő bizonyos

Streptomyces fradiae törzsek süllyesztett, levegőz) tetett körülmények közötti fermentációjával, j A találmány tárgya eljárás egy új, az (í) általános

I képleten bemutatott szerkezetű makrolid antibiotif kumot tartalmazó állatorvosi készítmény előállítá< sára, ahol az általános képletben ( Q —CHjOH vagy —CHO csoport.

A találmány tárgya továbbá eljárás az (I) általános képletű vegyületek 1-5 szénatomos alkanoil-, j fenil-( 1-4 szénatomos)-alkanoil-, fenoxi-(l-4 szénj atomos)-alkanoil- és halogén-fenil-(l-4 szénatomos)-alkanoil-észtereinek előállítására. Az (I) álta- lános képletben ha a 3-as helyzetű csoport O-acetilcsoport, úgy a 4-helyzetben nem lehet O-izovalerilcsoport.

Bár a fenti szerkezetű képletben sztereokémiái konfigurációt nem jelöltünk, nyilvánvaló, hogy a j vegyület sztereokémiái konfigurációja azonos a tij lozinéval. A neutrális cukor mikaróz és az aminoi cukor mikaminóz.

ξ Abban az esetben, ha az általános képletben ί Q aldehidcsoport, úgy a vegyület új makrolid antibiotikum, nevezetesen a 23-demicinozil-tilozin, amit demicinozil-tÍlozinnak, vagy DMT-nek nevezünk, kényelmi szempontból. A vegyület a (II) általános képletben megadott szerkezetű.

A DMT dihidro-származékát, azaz a 20-dihidro23-demicinozil-tilozint dihidro-DMT-nek nevezzük, kényelmi szempontból. Ennek a vegyületnek a szerkezetét a (III) képleten mutatjuk be.

A találmány szerinti vegyületek gátolják a melegvérű állatok számára patogén mikroorganizmusok növekedését. Részletesebben, ezek olyan baktériumellenes szerek, amelyek különösen aktívak j Gram-pozitív mikroorganizmusokkal, és Mycoplasma fajokkal szemben.

í Használható acil-észter-származékok előállításaf ra a DMT hidroxilcsoportjait és a dihidro-DMT? hidroxilcsoportjait észterezhetjük a 2'-, 4*-, 3'-, 23• és 3-hidroxilcsoportokon. Ezen felül a dihidroDMT-t észterezhetjük a 20-hidroxilcsoporton is. A 2'-hidroxilcsoport észterezése a legkönnyebb.

A találmány szerinti eljárást új Streptomyces fradiae törzzsel végezzük, e törzs száma NRRL ⁵ 12 170. A találmány tárgya továbbá eljárás DMT vagy dihidro-DMT előállítására oly módon, hogy ezt a törzset süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között addig tenyésztjük, míg jelentős mennyiségű antibiotikum termelődik. A DMT-t ¹⁰ vagy dihidro-DMT-t a lúgos fermentlé szürletéből extrahálhatjuk poláris, szerves oldószerekkel, majd tovább tisztíthatjuk extrakcióval, adszorpcióval és/ vagy kristályosítással.

A DMT dihidro-származékát kémiai redukció⁵ val vagy fermentációval állítjuk elő. Ha a dihidroDMT-t kémiai redukcióval állítjuk elő, úgy ismert módon járunk el, például a DMT-t közelítőleg sztöchiometrikus mennyiségű kémiai redukálószerrel, például nátrium-bórhidriddel reagáltatjuk, pél²⁰ dául alkoholos oldószerrel készült reakcióelegyben. A dihidro-DMT előállítására eljárhatunk oly módon is, hogy a találmány szerinti S. fradiae NRRL 12 170 törzzsel szabályozott körülmények között végzünk fermentációt.

²⁵ Az acil-észter-származékok előállítására a DMT-t és dihidro-DMT-t észterezzük a 2'-, 4-, 23és 3-heIyzetben oly módon, hogy ismert módon acilezőszerekkel reagáltatjuk. A dihidro-DMT-t a 20-helyzetben is észterezhetjük. A legkönnyebben ³⁰ a 2'-hidroxilcsoport észtereződik. Acilezcszerként például anhidrideket, halogenideket (rendszeriül bázissal, vagy más savelnyelővel együtt), és szerves savak aktív észtereit használjuk. Az acilezést szerves sav és egy dehidratálószer, például N,N'-dicik³⁵ lohexil-karbodiimid elegyével is végezhetjük. Az acilezés történhet enzimatikusan is, ahogy azt Okamoto és munkatársai írják a 4 092 473 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. A keletkező acil-származékokat ismert módszerek⁴⁰ kel különítjük el és tisztítjuk.

A 2'-monoészter-származékokat az irodalomból ismert szelektív észterezéssel állíthatjuk elő, például oly módon, hogy az antibiotikumot sztöchiometrikus mennyiségű (vagy ennyi fölöslegben jelenlévő) acilezőszerrel reagáltatjuk, acilezőszerként például acil-anhidridet használunk; a reakciót szobahőmérsékleten, 1-24 órán át végezzük, míg az észtereződés gyakorlatilag teljessé válik. A 2'-monoésztert a reakcióelegyből ismert módszerekkel, például extrakcióval, kromatográfiával vagy kristályosítással különítjük el.

Előnyös vegyületcsoportot képviselnek a gyógyszerészeti szempontból elfogadható észter-származékok. Más észter-származékokat is használhatunk intermedierként.

A DMT, a dihidro-DMT és ezek acil-észter-származékai savaddíciós sókat képeznek. A DMT, dihidro-DMT és ezek acil-származékainak savaddíciós sói a találmány oltalmi köréhez tartoznak. Eze60 két a sókat felhasználhatjuk például a DMT, dihidro-DMT és ezek acil-származékainak elkülönítésére, tisztítására és kristályosítására.

Ahogy azt az előzőekben megjegyeztük, a DMT-t és dihidro-DMT-t oly módon állítjuk elő, hogy a 55 Streptomyces fradiae egy törzsét tenyésztjük, olyan

.189 512 .

törzset használunk, amely ezeket a vegyületeket termeli süllyesztett és levegőztetett fermentációs körülmények között, megfelelő összetételű táptalajban. A tenyésztést addig folytatjuk, míg jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel. A témában jártas szakember előtt nyilvánvaló, hogy először a DMT termelődik a fermentáció során. A dihidro-DMT akkor keletkezik, ha a fermentációt hosszabb időn át végezzük, amikor a jelenlévő DMT enzimatikusan redukálódik.

A Streptomyces fradiae NRRL 12 170 mikroorganizmus tenyésztéséhez többféle táptalajt használhatunk. A termelés gazdaságossága, az optimális hozam és a termék izolálásának egyszerűsítése érdekében azonban bizonyos összetételű táptalajok előnyösek. így például szénforrásként előnyösen, különösen a nagy térfogatú fermentációkkor szénhidrátokat, például dextrint, glükózt, keményítőt, kukoricalisztet és olajokat, például szójabab-olajat használunk. Nitrogénforrásként előnyösen például kukoricalisztet, szójalisztet, hallisztet, aminosavakat, vagy más, hasonló készítményeket használunk.

A táptalajhoz adott szervetlen sók például a vízben oldódó, vasionokra, káliumionokra, nátriumionokra, magnéziumionokra, kalciumionokra, ammóniumionokra, kloridionokra, karbonátionokra, szulfátionokra, nitrátionokra és más, hasonló ionokra disszociáló sók.

A mikroorganizmus növekedéséhez és kifejlődéséhez szükséges nyomelemeket szintén hozzáadhatjuk a táptalajhoz. Ezek a nyomelemek általában szennyezőanyagként jelen vannak a táptalaj többi összetevőjében, mégpedig a mikroorganizmus igényének megfelelő mennyiségben. Esetenként kevés (például literenként 0,2 ml) habzásgátló szert, például polipropilén-glikolt (molekulasúlya körülbelül 2000) adunk a nagytérfogatú fermentációk táptalajához, abban az esetben, ha a habzás problémát okoz.

Nagyobb mennyiségű DMT vagy dihidro-DMT előállításához tankfermentorban süllyesztett, levegőzteti körülmények között végzünk fermentációt. Kismennyiségü DMT-t vagy dihidro-DMT-t úgy állítunk elő, hogy rázott lombikban végzünk tenyésztést. Az antibiotikum termelésben mutatkozó lag-fázis miatt, amely általában akkor jelentkezik, ha nagymennyiségű táptalajt oltunk be a mikroorganizmus spóráival, előnyösen vegetatív inokulumot használunk. A vegetatív inokulum előállítására kismennyiségü táptalajt oltunk a mikroorganizmus spóráival vagy micélium darabkáival, ilyenkor friss, aktívan növekvő tenyészetet kapunk. A vegetatív inokulummal ezután beoltjuk a nagymennyiségű táptalajt. A vegetatív inokulum előállítására használt táptalaj a főfermentációs táptalajjal azonos lehet, használhatunk azonban más összetételű táptalajt is.

A S. fradiae NRRL 12 170 mikroorganizmust 10 ’C és 37 ’C közötti hőmérsékleten növeszthetjük. Az antibiotikum termelés szempontjából optimális a 28 ’C.

Ahogy az a levegőztetett, sülyesztett fermentációknál szokásos, a táptalajon steril levegőt buborékoltatunk át. A nagymennyiségű antibiotikum termelés érdekében tankfermentációkor 28 ’C hőmérsékleten és 1 atmoszféra nyomáson 30%-os, vagy ennél magasabb levegő-telítettséget biztosítunk.

A fermentáció során az antibiotikum termelést oly módon követjük, hogy mintákat az antibiotikumokra érzékeny mikroorganizmussal szemben mérünk. Mérőorganizmusként például Staphylococcus aureus ATCC 9144 mikroorganizmust használunk. A biológiai értékmérést előnyösen automatizált turbidimetriás módszerrel végezzük. Az antibiotikum termelést ezen kívül követhetjük nagyfelbontású folyadék-kromatográfiával UV fényben.

A süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között kivitelezett tenyésztés után a DMT-t vagy a dihidro-DMT-t a fermentációs szakmában ismert módszerekkel különítjük el a tenyészléből. A DMT vagy a dihidro-DMT kinyerésére szűrjük a tenyészlevet. A szűrt levet ezután tovább tisztíthatjuk az előállítandó antibiotikum kinyerésére. A tisztítás során több módszert használhatunk. A szűrt lé tisztítása például oly módon történhet, hogy pH-ját 9-re állítjuk be, megfelelő oldószerrel, például etil-acetáttal, amil-acetáttal vagy metilizobutil-ketonnal extraháljuk, a szerves fázist elkülönítjük és vizes, savas oldattal extraháljuk. Ezt követően kicsapjuk az antibiotikumot oly módon, hogy a vizes extrakt pH-ját lúgosra állítjuk be. A további tisztítási lépéseket extrakcióval, adszorpcióval és/vagy kicsapással végezzük.

A találmány szerinti új mikroorganizmust a tilozint termelő Streptomyces fradiae kémiai mutagenezisével állítottuk elő. A mutagenizált mikroorganizmus csak kismennyiségü tilozint termel, termeli viszont a DMT-t, mégpedig major komponensként.

Jellemzés céljából az új mikroorganizmust összehasonlítottuk a Streptomyces fradiae M48-E 2724.1 törzzsel, ez a törzs a S. fradiae NRRL 2702 mikroorganizmusból származik, és tilozint bioszintetizál. A S. fradiae NRRL 2702 mikroorganizmust Hamill és munkatársai írják le a 3 178 341 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. A jelen leírásban a tilozint termelő S. fradiae M48-E 2727.1 tenyészetet E2724.1 törzsnek nevezzük.

Az új DMT- és dihidro-DMT-t termelő NRRL 12 170 törzset szintén Streptomyces fradiae-nek határoztuk meg. A meghatározás során az International Streptomyces Project Streptomyces fajokra érvényes módszereit használtuk [Shirling és Gottlieb, Methods Fór Characterization of Streptomyces Species; Internál. Journal of Systematic Bacteriology, 16 (3), 313-340 (1966)]; a vizsgálat során bizonyos kiegészítő vizsgálatokat is végeztünk. Az összehasonlítást az alábbi S. fradiae mikroorganizmusra vonatkozó irodalom figyelembevételével végeztük: 1) Buchanan és Gibbons, Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8. kiadás, The Williams és Wilkins Co., Baltimore, Md., 1974, 815. oldal; és 2) Shirling és Gottlieb. Cooperative Description of Streptomyces. II. Species Description from First Study, Internál. Journal of Systematic Bacteriology, 18 (2), 118, 1968].

Az új törzs és az E2724.1 törzs spóraláncainak .189 512

II. táblázat

Növekedési tulajdonságok és morfológia morfológiája: Retinaculum Apertum (RA) csoportba tartozó. Horgok, hurkok és szabálytalan gördületek láthatók, ezek rövidek, és általában keskeny átmérőjűek. Ezek legjobban az ISP*2 (élesztő kivonat-maláta-agar) táptalajon figyelhetők meg. A spórák felszíne sima; a spórák alakja ovális, átmérőjük 0,65 pm. Átmérőjük 0,61 pm és 0,71 pm között változik.

A törzsek között a legnyilvánvalóbb különbség tenyésztési jellemzőikben mutatkozik. Az E2724.1 törzs a legtöbb táptalajon légmicéliumot fejleszt, a légmicéliumok jól fejlettek, és a fehér színsorozathoz tartoznak. A DMT-t termelő törzs egyáltalán nem, vagy csak kevéssé fejlett légmicéliumot fejleszt. Ha jelen van a légmicélium, úgy az a fehérszürke színsorozathoz sorolható. A telepek hátoldalán nem látszik színanyag-termelés. Színűk világos-közepesen sárga. A melanoid-pigment-termelés szempontjából a törzs negatív. (A melanoidtipusú színanyag termelését ISP# 1 (tripton-élesztő kivonat), ISP*6 (pepton-élesztő kivonat-vasagar), ISP *7 (tirozin-agar) és IPS tirozin nélküli agaron vizsgáltuk).

Az E2724.1 törzs és a DMT-t termelő törzs közötti hasonlóságokat és különbözőségeket az I. táblázatban ismertetjük.

I. Táblázat

Streptomyces fradiae E2724.1 és az NRRL 12 170 törzs összehasonlítása

Hasonlóságok Különbségek

A spóraláncok morfoló- tenyésztési tulajdonságiája gok

A spórák felületének or- szénforrás hasznosítás namentikája

Spóra méret zselatin elfolyósitás

A kromogenitás hiánya nátrium-klorid tolerancia

Oldható színanyag hiá- pH-érték nya

Növekedés szelektált, ve- hőmérséklet-érték getatív táptalajon Keményítő-hidrolízis Negatív fölözött tej-reakció

Nitrát-redukció

Kataláz-pozitív

Foszfatáz-pozitív

Ureáz-negatív

Antibiotikum érzékenységi vizsgálat.

A II. táblázatban ismertetjük a S. fradiae E2724.1 és NRRL 12 170 törzsek morfológiai és növekedési tulajdonságait.

A III. táblázatban az antibiotikum-érzékenységet, a IV. táblázatban a szénforrás-hasznosítási spektrumot, végül az V. táblázatban az egyéb élettani tulajdonságokat hasonlítjuk össze.

		E2724.1	NRRL 12 170
Spóra tartók	RA	RA
Spróraláncok	10	10
Spórák felülete¹ sima	sima
Spórák alakja	ovális	ovális
ISP #2	G²	jó	jó
	R	87. középsárga³	87. középsárga
	Am	jól fejlett,	fejlett,
		263. fehér	263. fehér
	Sp	nincs	nincs
ISP* 3	G	gyengén fejlett	gyengén fejlett
	R	263. fehér	263. fehér
	Am	gyengén fejlett, 263. fehér	nyomokban
	Sp	nincs	nincs
ISP *4	G	rendkívül jól fejlett	jól fejlett
	R	87. középsárga	87. középsárga
	Am	rendkívül jól fejlett, 263. fehér	gyengén fejlett
	Sp.	nincs	nincs
ISP#5	G	jó	jó
	R	86.1. sárga	86.1. sárga
	Am	jól fejlett, 92.y. fehér	nincs
	Sp	nincs	nincs
ISP #7	G	rendkívül jól fejlett	jól fejlett
	R	87. m. sárga	87. m. sárga
	Am	rendkívül jól	fejlett, 265.
		fejlett, 263. fehér	középszürke
	Sp	nincs	világosbarna
Bennett	G	gyengén fejlett	nincs növekedés
	R	90. gy. sárga	—
	Am	nincs	—
	Sp	nincs	—
Kalcium-	G	jó	jó
-maláta	R	263. fehér	92. y. fehér
	Am	jól fejlett, 263. fehér	nincs
	Sp	nincs	nincs
Czapek	G	jól fejlett	fejlett
	R	87. m. sárga	87. m. sárga
	Am	rendkívül jól fejlett, 263. fehér	nyomokban
	Sp	nincs	nincs
Glükóz-	G	nincs	nincs növekedés
-aszpa-		növekedés
ragin	R	—	—
	Am	—	___
	Sp	—	—

.189 512

II. táblázat (folytatás)

	E2724.1	NRRL 12 170
Paradi- csom-	G	rendkívül jól fejlett	jól fejlett
paszta-	R	92. y. fehér	87. m. sárga
zabliszt	Am	rendkívül jól fejlett, 263. fehér	nincs
	Sp	nincs	nincs

* = A spórák felületének ornamentációját elektronmikroszkóppal vizsgáltuk.

² = G: növekedés; R; a telepek hátoldala, vagy oldalaik; Am: légmicélium; Sp: oldódó színanyag. ³= A színek jeleit az ISCC-NBS színskála szerint adjuk meg (Kelly és Judd, The ISCC-NBS Centroid Color Charts Standard Sample No. 2106, „U.S. Dept. of Commerce, National Bureau of Standards, Washington, D. C. 20234).

III. Táblázat

Antibiotikumérzékenység^{0 h}

Antibiotikum Koncentráció E2724.1 V-ÍV™

kloramfeni- kol	30 pg	nitrofenil- vcgyülct	+	+
eritromicin	15 pg	makrolid	tr	tr
Cefaloridin	30 pg	β-laktám	+	+
linkomicin	2 pg	linkózaminid	-	-
polimíxin B	300 egység	peptid	tr	tr
streptomicin	10 pg	aminoglükö- zid	+	+
tetraciklin	30 pg	tetraciklin	+	+
vankomicin	30 pg	glükopeptid	+	+

a = Az érzékenységet beoltott agarlemezekre helyezett korongokkal határoztuk meg.

b = - rezisztens (nincs gátlási zóna) = + érzékeny (gátlási zóna látható) = tr érzékenység nyomai.

IV. Táblázat

Szénforrás hasznosítás^{0 b}

Szénforrás	E2724.1	NRRL 12 170
kontroll: nincs szénforrás	-	-
kontroll: glükóz	+	+
L-arabinóz	-	+
D-fruktöz	+	+
D-galaktóz	+
i-inozit	+	+
D-mannit	-	+
raffinóz	-	-
szalicin	-	-
szaccharóz	+
D-xilóz	+	+
D-rhamnóz	-	+

a - = nincs hasznosítás; + - hasznosítja.

b = Az International Streptomyces Project (ISP#9) (szénforrás hasznosítási agar) alaptáptalajon határoztuk meg. amihez szűrve sterilezett szénforrást adtunk minden esetben 1,0%-os menynyiségben. A lemezeket 30 ’C-on tenyésztettük, és a 7-12. napon olvastuk le.

V. táblázat

Egyéb élettani tulajdonságok

	E2724.1	NRRL 12 170
ISP# 1 (kromogenitás)	-	-
ISP# 6 (kromogenitás)	-	-
ISP#7 (kromogenitás)	-	-
zselatin-elfolyósitás	-	+
fölözött tej-reakció	-	—
növekedés különböző pH-értékeken¹·²	6,1-8,8	6,1-7,8
növekedés különböző hőmérsékle-	10-37 ’C	10-30’C
ten^1,3 nátrium-klorid tolerancia¹⁴	8%	4%
keményítő-hidrolízis¹	+	+
nitrát-redukció	+	+
kataláz*	+	+
foszfatáz*	+	+
ureáz⁶	—	—

^{1 =} ISP#2 táptalajon (élesztő kivonat-maláta kivonat-agar); 7 napon át inkubálva.

²= 0,05 mólos, alábbi puffereket használtuk: citromsav, pH 3, 4, 5; 2-(N-morfolino)-ctán-szulfonsav, pH 6; 3-(N-morfolino> propán-szuifonsav, pH 7; N-2-hidroxi-etil-piperazin-N'-2-etánszulfonsav, pH 8; 2-amino-2-(hidroxi-metil)-l,3-propán-diol, pH 9; 3-ciklohexil-amino-1,1-propán-szuifonsav, pH 10, 11.

Az agarok pH-ját 7 napos inkubációt követően megmértük, mivel egyes pufferek nem tartották az eredetileg beállított pHértéket. A puffét toxieitását oly módon vizsgáltuk, hogy az összes puffer pH-ját 7,0-ra állítottuk be, és vizsgáltuk a növekedést. Toxicitást nem figyeltünk meg.

’= 5, 10, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 45, 50 és 55 ’C hőmérsékleten vizsgáltuk.

‘= Az agárhoz nátrium-klorídot adtunk, 0, 2, 4, 6, 8, 10 és 12%-os koncentrációban.

’= A keményítő hidrolízisét szervetlen só-keményítő-agaron (ISP# 4) vizsgáltuk, oly módon, hogy a jelenlévő keményítőt jóddal mutattuk ki.

‘ = Az enzim méréséhez Blazevic és Ederer módszerét használtuk (Blazevic és Ederer, Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology, John Wiley and Sons, New York, N. Y., 1975).

Az előző tulajdonságok alapján a DMT- és dihidro-DMT-t termelő NRRL 12 170 mikroorganizmust a Streptomyces fradiae új törzsének határoztuk meg. A tenyészetet letétbe helyeztük a Northern Régiónál Research Center, Agricultural Research, North Central Region, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61 604 törzsgyűjteményébe, ahonnan ez NRLL 12 170 szám alatt hozzáférhető.

Ahogy az más mikroorganizmusoknál is előfordul, a Streptomyces fradiae NRRL 12 170 tulajdonságai variálnak. így például az NRRL törzs mesterséges variánsai és mutánsai állíthatók elő oly módon, hogy a sejteket különböző ismert fizikai és kémiai mutagénekkel kezeljük, például ultraibolya sugarakkal, X-sugarakkal, gamma-sugarakkal, és N-metil-N'-nitro-N-nitrozó-guanidinnal. A találmány oltalmi köréhez tartoznak a Streptomyces fradiae NRRL 12 170 összes természetes és mesterséges variánsai, mutánsai és rekombinánsai, amelyek termelik a DMT-t.

A DMT vegyületek gátolják a patogén baktériumok, különösen a Gram-pozitiv festödésű baktériumok és a Mycoplasma fajok növekedését. A VI. táblázatban összefoglaljuk az ismert agar-higitásos módszerrel meghatározott legkisebb növekedésgát5

J89.512 ló koncentrációkat, amely koncentrációk mellett a DMT szabad bázis alakban gátolja bizonyos baktériumok növekedését.

VI. Táblázat

A DMT szabad bázis in vitro aktivitása

Mikroorganizmus	Legkisebb növekedésgátló koncentráció (pg/ml)
Streptococcus pyogenes C203	0,25
Streptococcus pneumoniae Park I	0,13
Streptococcus sp. (Group D) 282	0,5
Staphylococcus aureus 3055	1,0
Staphylococcus aureus 209P	0,25
Pasteurella multocida	3,12
Pasteurella hemolytica	12.5
Mycoplasma gallisepticum	0,097
Mycoplasma hyopneumoniae	0,195
Mycoplasma hyorhinis	0,78 .

táblázatban megadjuk a DMT és DMT-tartarát vizsgálatakor kapott ED_S0-értékeket.

VII. Táblázat

Az ED_S0-értékek (mg/kg* 2) szubkután vágy orális adagolással

Vegyület	Strepto- coccus pyogenes C2O3	Streptococcus pneumoniae Park Ϊ	Staphylococcus aureus 3055
szub- kután	orális	szub- kután	orális	szub- kután	orális
DMT-bázis	2,2	218	15,7	66	2,7	64
DMT-tartarát	2,3	172	59,9	100	NT*	NT
Baktériumfertőzés
(x LD_J0)	13	11,3	3	2,7	21	26

* = Nem vizsgáltuk.

A találmány szerinti DMT-vegyületek in vivő baktériumellenes aktivitással rendelkeznek kísérleti bakteriális fertőzésekkor. Ha egereknek kísérleti fertőzéskor két dózisban adjuk a vizsgált vegyületeket, az aktivitást ED_S0-értékben határozhatjuk meg (hatásos dózis mg/testsúlykilogrammban, amely a vizsgált állatok 50%-át megvédi: lásd Wick és munkatársai, J. Bacteriol., 81, 233-235, 1961). A VII.

A találmány szerinti DMT-vegyületek aktivitása a Mycoplasmafajokkal szemben különösen értékes tulajdonság. A VIII. és IX. táblázatokban összefoglaljuk a DMT- és DMT-tartaráttal végzett kísérletek eredményeit, amelyek során indukált My25 coplasma gallisepticum fertőzéseket kezeltünk csirkékben. A vegyületeket az ivóvízben oldva adagoltuk 1-2 gramm/4,2 liter víz mennyiségben, 1-3 napon át, vagy testsúlykilogrammra számítva 15-30 mg-os mennyiségben, injekcióval.

VIII. Táblázat

Indukált Mycoplasma gallisepticum fertőzés kezelése csirkékben DMT-bázissal

Vegyület	Dózis	Elpusztult állatok száma/összes állat száma	A légzési traktus sérülésével rendelkező állatok száma/ összes állat száma	Átlagos súly (g)	M. gallisepticum antitesttel rendelkezők száma/ összes állat száma
DMT-bázis	2,0 g/4,2 1; 1-3 nap	9/30 (30%)	26/30 (86,7%)	397	21/21 (100%)
DMT-bázis	1,0 g/4,2 1; 1-3 nap	13/30 (43,3%)	28/30 (93,3%)	392	15/17(88,2%)
DMT-bázis	15 mg/kg	10/30 (33,3%)	24/30 (80%)	453	20/20 (100%)
Fertőzött kontroll	—	19/30 (63%)	30/30 (100%)	304	11/11 (100%)

IX. Táblázat

Indukált Mycoplasma gallisepticum fertőzés kezelése csirkékben DMT-tartaráttal

Vegyület	Dózis	Elpusztult állatok száma/összes állat száma	A légzési traktus sérülésével rendelkező állatok száma/összes állat száma	Átlagos súly (g)	M. gallisepticum antitesttel rendelkezők száma/ összes állat száma
DMT-tartarát	2,0 g/4,2 1; 1-3 nap	0/30 (0%)	13/30 (43,3%)	458	17/30 (56,7%)
DMT-tartarát	1,0 g/4,2 I; 1-3 nap	2/30 (6,7%)	22/29 (75,9%)	354	27/28 (96,4%)
DMT-tartarát	30 mg/kg	10/30 (33,3%)	27/30 (90%)	330	16/20(80%)
Fertőzött kontroll	—	15/30 (50%)	30/30(100%)	231	15/15(100%)

A baromfiak Mycoplasma fertőzéseinek megakadályozására vagy kezelésére a DMT-vegyületek egyikének nem-toxikus mennyiségét orálisan vagy párén terálisan adagoljuk a szárnyasoknak. A DMT-vegyületeket előnyösen gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal, például vízzel együtt adagoljuk az állatoknak.

A X. táblázatban összefoglaljuk a DMT akut 60 toxicitásának adatait. A vizsgálatok során 4-5 hetes Harlan ICR egereket használtunk. A közepes letális dózist (LDjq) a DMT esetén határoztuk meg orális, szubkután, intravénás és intraperitoneális adagolással.

.189 512

X. Táblázat

A DMT akut toxicitása

Adagolás módja	LD_S0 (mg/kg)
Hímek	Nőstények
p.o.		5000
s.c.	-	5447
i.v.	100	186
i.p.	721	325

Abban az esetben, ha melegvérű állatok betegségét kezeljük, úgy a találmány szerinti vegyületeket állatorvosi készítmények alakjában adagoljuk. A találmány tárgya egyrészről eljárás állatorvosi készítmény előállítására, amely készítmény aktív összetevőként egy (I) általános képletű vegyületet, vagy ennek gyógyszerészeti szempontból elfogadható sóját vagy észterét tartalmazza, legalább egy, semleges vivőanyaggal együtt.

A témában jártas szakemberek előtt nyilvánvaló, hogy ezen készítményekben használt vivőanyagok természete hasonló lehet a tilozin esetében használt vivőanyagokhoz.

A találmány szerinti eljárást a továbbiakban példákkal szemléltetjük.

I. példa

A) A DMT előállítása a rázott lombikban kivitelezett fermentációval

A Streptomyces fradiae NRRL 12 170 liofilezett tenyészetét 1-2 ml steril vízbe szuszpendáljuk. 0,5 ml szuszpenzióval 150 ml alábbi összetételű vegetatív táptalajt oltunk:

kukoricalekvár	1,0 %
élesztő kivonat	0,5 %
szójabab dara	0,5 %
kalcium-karbonát	0,3 %
szójabab olaj (nyers)	0,45%
ionmentes víz	97,25%
Eljárhatunk oly módon is,	hogy az S. fradiae

NRRL 12 170 vegetatív tenyészetének 1 ml-ét, amelyet előzőleg folyékony nitrogénben tároltunk, felolvasztunk, és ezzel oltjuk a vegetatív táptalajt. A beoltott vegetatív táptalajt 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban tenyésztjük 29 ’C hőmérsékleten, 48 órán át, percenként 300-at forduló, zárt rázógépben.

A kinőtt vegetatív táptalaj 0,5 ml-ével 7 ml alábbi összetételű termelő táptalajt oltunk:

répamelasz	2,0 %
kukoricaliszt	1,5 %
halliszt	0,9 %
kukoricadara	0,9 %
nátrium-klorid	0,5 %
diammónium-hidrogén-foszfát	0,04%
kalcium-karbonát	0,2 %
szójabab olaj (nyers)	3,0 %
ionmentes víz	91,36%
A beoltott fermentációs táptalajt 50 ml térfogatú

lombikokban tenyésztjük 29 ’C hőmérsékleten, 6 napon át, percenként 300-at forduló, zárt rázógépben.

B) A DMT előállítása tankfermentorban ' Nagy térfogatú inokulum előállítására az A) pontban megadottak szerint 1200 ml kinőtt vegetatív táptalajjal 4300 liter második fázisú vegetatív táptalajt oltunk, amelynek összetétele a következő:

kukoricalekvár	1,0	%
szójaliszt	0,5	%
élesztő kivonat	0,5	%
kalcium-karbonát	0,3	%
szójabab olaj (nyers)	0,5	%
lecitin (nyers)	0,015%
víz	97,185%
A táptalaj pH-ját 50%-os	nátrium-hidroxid-

oldattal 8,5-re állítjuk be.

Ezt a második fázisú vegetatív tenyészetet 1500 liter térfogatú fermentorban inkubáljuk 48 órán át 28 ’C hőmérsékleten, levegőztetés és keverés közben.

Körülbelül 700 liter második fázisú tenyészettel 4300 liter térfogatú steril, termelő táptalajt oltunk, aminek az alábbi az összetétele:

halliszt	0,875%
kukoricaliszt	1,5 %
kukoricadara	0,875%
kalcium-karbonát	0,2 %
nátrium-klorid	0,5 %
diammónium-hidrogén-foszfát	0,04 %
répamelasz	2,0 %
szójaolaj (nyers)	3,0 %
lecitin	0,09 %
víz	91,32 %

A táptalaj pH-ját 50 %-os nátrium-hidroxidoldattal 7,2-re állítjuk be.

A beoltott termelő táptalajt 9000 liter térfogatú fermentorban tenyésztjük 8-9 napon át, 28 ’C hőmérsékleten. A fermentációs táptalajba steril levegőt vezetünk át olyan mennyiségben, hogy az oldott oxigén koncentrációja 30% és 50% között legyen, a táptalajt továbbá percenként 250-et forduló, hagyományos keverővei keverjük.

2. példa

A DMT izolálása

Az 1. példában megadottak szerint előállított 3800 1 teljes fermentlevet szűrjük, szűrési segédanyagjelenlétében. Vízzel mossuk a micéliumot, és a vizes mosófolyadékot hozzáadjuk a szűrlethez.

%-os, vizes nátrium-hidroxid-oldat 9,5 1-ével 9,2-re állítjuk be a szűrlet pH-ját, ezután 2000 1 etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos extraktumhoz 450 1 ionmentes vizet és 6,4 kg nátriumhidrogén-foszfátot adunk, a kapott elegyet erőteljesen keverjük. Az oldat pH-ját 3300 ml, 33%-os foszforsav-oldattal 6,0-ról 4,35-re állítjuk be. A vizes fázist elkülönítjük. Az elkülönített vizes fázis pH-ját 700 ml 50%-os, vizes nátrium-hidroxidoldattal 6,5-re állítjuk be.

Az így kapott oldatot csökkentett nyomáson 225 1 térfogatra töményitjük. A sűrítmény pH-ját 16 1 10%-os, vizes, nátrium-hidroxid-oldattal 9,2-re állítjuk be. A kapott lúgos oldatot egy éjszakán át állni hagyjuk. Az oldatból kivált kristályokat szűréssel elkülönítjük, 50 1 ionmentes vízzel mossuk, .189 512

X/f. Táblázat

A DMT papír-kromatográfiás vizsgálata majd szárítjuk, ami után 8,6 kg terméket kapunk. A termék 3 kg-ját aceton és víz elegyéből kikristályosítjuk, ezután 2,07 kg DMT szabad bázist kapunk.

A DMT 132 ’C hőmérsékleten lágyul, és 150’C hőmérsékleten lassan olvad. A DMT elemanalízise a következő: szén: 65 %; hidrogén: 8,5 %; nitrogén: 2%; oxigén: 28%. A DMT tapasztalati képlete: C₃₈H_Ó3NO₁₃, molekulasúlya: 742 (a tömegspektrometriás mérés szerint: 741).

A DMT szabad bázis kloroformos oldatban vizsgált infravörös abszorpciós spektrumában maximumok figyelhetők meg. A maximumok az alábbi frekvencián láthatók (cm¹): 3634 (kicsiny), 3559 (váll), 3423 (széles), 2955 (intenzív), 2907 (intenzív), 1710 (intenzív), 1676 (váll), 1588 (intenzív), 1447 (váll), 1396 (váll), 1359 (kicsiny), 1309 (kicsiny), 1178 (váll), 1156 (intenzív), 1111 (váll), 1072 (váll), 1048 (intenzív), 1013 (váll), 984 (váll), 926 (kicsiny), 898 (kicsiny), és 833 (kicsiny).

A DMT ultraibolya abszorpciós spektrumában semleges etanolos oldatban vizsgálva a 283 nm-es hullámhosszon látunk elnyelési maximumot (ε: 22,296; E!: 300,9).

A DMT szabad bázis az alábbi specifikus forgatással rendelkezik: [ajp : -53,5’ (konc.: 1, metanolban).

A DMT 66%-os, vizes dimetil-formamidos oldatában vizsgált elektrometrikus titrálás szerint 7,25 pK_a-értékkel jellemezhető titrálható csoporttal rendelkezik.

A DMT bázis vízben oldódik, oldódik továbbá a legtöbb poláris, szerves oldószerben, például acetonban, metanolban, etanolban, kloroformban, dimetil-formamidban és dimetil-szulfoxidban. A DMT savaddíciós sói vízben jobban oldódnak, mint maga a DMT bázis.

A DMT papír- és vékonyréteg-kromatográfiával megkülönböztethető a tilozintól, és más, ismert tilozin-komponensektől. A XI. és XII. táblázatban összefoglaljuk a DMT és a különböző tilozinkomponensek R_f- és R_x-értékeit. A XII. táblázatban megadott R_x-értékek a tilozin elmozdulásához viszonyított értékeket jelentik, a tilozin elmozdulását 1,0-nak véve. A vegyületek kimutatását Bacillus subtilis bioautográfiával végeztük.

Xf. Táblázat

A DMT vékonyréteg-kromatográfiás adatai

Vegyület	R.-értck
A^b	B	C
tilozin	0,53	0,53	0,67
DMT	0,45	0.52	0,61
dezmikozin	0,47	0,24	0,17
makrozin	0,23	0,49	0,60
relomicin	0,34	0,51	0,63

“ = Merck, Darmstadt - szilikagél 60 ^{b =} oldószer-elegy: A: etil-acetát és dietil-amin 96 :4 arányú elegye

B: aceton és etanol 2 : 1 arányú elegye C: kloroform és metanol 3 : 1 arányú elegye·

Vegyület
	D⁶	E
tilozin	1,0	1,0
DMT	0.76	0,95
dezmikozin	0,22	0,83
makróéin	0,43	0,87
relomicin	0,63	1,0

'= Papír: Whatman No. 1, amit 0,75 mólos kálium-dihidrogénfoszfát pufferrel kezeltünk 4,0 pH-η, majd szárítottunk. ^b” Oldószer-elegy: D: vízzel telített etil-acetát

E: vízzel telített n-butanol.

A 3, 4, 6. és 7. példa célja tájékoztatás.

3. példa

Az OMT izolálása

A 2. példában megadottak szerint előállított DMT-t híg hidrogén-klorid-oldatban oldjuk (addig adunk sósavat a vízhez, míg az oldat pH-ja 1,8 lesz). A kapott oldatot 24 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk állni, majd pH-ját nátrium-hidroxiddal 9,0-ra állítjuk be. A lúgos oldatot etil-acetáttal, diklór-metánnal vagy kloroformmal extraháljuk. Az extraktumot csökkentett nyomáson desztilláljuk, ami után megkapjuk az OMT-t.

4. példa

Az OMT izolálása

A 2. példában megadottak szerint előállított DMT 500 g-ját malomban porítjuk és 1,51 ionmentes vízhez adjuk. 20%-os kénsav szükség szerinti adagolásával 3,5 és 7,5 között tartjuk az oldat pHját. 30 perc múlva az összes DMT feloldódik. Ezután 1,4-re állítjuk be az oldat pH-ját, és 22 ’C hőmérsékleten, 42 órán át hagyjuk állni. Ismert módon feldolgozva az oldatot, 366 g OMT-t kapunk, a termék azonosságát ismert mintával összehasonlítva vékonyréteg-kromatográfiával bizonyítjuk. Az ismert mintát a 3 459 853 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint állítjuk elő.

5. példa

A dihidro-DMT előállítása

A 2, példában megadottak szerint előállított. DMT 50 mg-ját 25 ml 40%-os, vizes izopropil-alkoholban oldjuk. Ugyanakkor 10 ml 30%-os, vizes izopropil-alkoholban 20 mg nátrium-bórhidridet oldunk. 1 ml nátrium-bórhidrid-oldatot adunk a DMT-t tartalmazó oldathoz. 5 percen át keverjük a reakcióelegyet, pH-ját foszforsavval 7,5-re állítjuk be, majd az izopropil-alkohol eltávolítására csökkentett nyomáson desztilláljuk. Ezután vizet adunk a vizes sűrítményhez, a 25 ml térfogatú ol-8189 512 dalhoz 50 ml kloroformot adunk. A vizes fázis pH-ját 7,5-re állítjuk be. Extrakciót követően elkülönítjük a kloroformot, és csökkentett nyomáson desztillálva eltávolítjuk, ami után desztillációs maradékként dihidro-DMT-t kapunk.

6. példa

A dihidro-OMT előállítása

Az 5. példában megadottak szerint előállított dihidro-DMT-t a 3. példában megadott módon reagáltatjuk, amikor dihidro-OMT-t kapunk.

7. példa

Az OMT előállítása más módon

A DMT-ből OMT-t állítunk elő oly módon, hogy a DMT-t abban a tenyészlében reagáltatjuk, amelyben azt előállítottuk. A reakciót a 3. példában megadott módon, enyhén savas körülmények között végezzük. Az OMT izolálását a 2. példában, a DMT-re vonatkozóan megadottak szerint végezzük.

8. példa

A 2'-O-Acetil-DMT előállítása

260 ml acetonban 10 g (13,5 mmól) DMT-t oldunk, az oldathoz 1,6 ml (15,7 mmól) ecetsavanhidridet adunk cseppenként, miközben szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet. 18 órán át folytatjuk a keverést, majd csökkentett nyomáson eltávolítjuk az oldószert. A desztillációs maradékot 200 ml etil-acetátban oldjuk, és telített nátriumhidrogén-karbonát-oldattal extraháljuk (2 x 200 ml-rel). A szerves, oldószeres oldatot elkülönítjük, nátrium-szulfáttal vizmentesítjük, szűrjük és desztilláljuk. A desztillációs maradékot kevés etilacetátban oldjuk, az oldatot szilikagélből (Waters Prep. 500) készült oszlopon kromatografáljuk, az eluálást 4 1 etil-acetáttal végezve. Az előállítandó terméket tartalmazó frakciókat vékonyrétegkromatográfiával vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat egyesítjük és szárazra desztilláljuk. Ily módon

6,5 g (61%) 2'-O-acetil-DMT-kapunk. FDMS (térdeszorpciós tömegspektrum): m/e 783 (P⁺O), UVspektrum: λ“^Η: 283 nm (ε=19 300), NMRspektrum: 2,08 (s, acetil)

9. példa

A 2'-O-propionil-DMT előállítása

Az előzőekhez hasonló módon 6,0 g (8,5 mmól) DMT-t oldunk 120 ml acetonban, és 1,2 1 (9,2 mmól) propionsav-anhidriddel reagáltatjuk. A feldolgozást és kromatográfiát követően 3,7 g (57%) 2'-O-propionil-DMT-t kapunk. FDMS: m/e 797 (P⁺), UV-spektrum: λ^θ^Η 282 nm (ε=19 500), NMR-spektrum: 1,26 (t) és 2,40 (g) (propionil).

10. példa

A 2' -23-di-O-acetil- D MT előállítása ml metilén-klorid és 7,8 ml piridin elegyében 3 g (4,05 mmól) DMT-t oldunk, az elegyhez cseppenként, keverés közben és szobahőmérsékleten 1,4 ml (13,7 mmól) ecetsav-anhidridet adunk. 17 órán át keverjük a reakcióelegyet, ami után 15 ml toluollal hígítjuk, majd csökkenteti nyomáson eltávolítjuk az oldószereket. A desztillációs maradékot kevés etil-acetátban oldjuk, az oldatot szilikagélből (Waters Prep 500) készült oszlopon kromatografáljuk, az eluálást 4 1 etil-acetáttal végezve. Ily módon

2,1 g nyersterméket kapunk. Ezt a lehető legkisebb mennyiségű toluolban oldjuk, az oldatot 300 ml szilikagélből készült oszlopon gyors kromalográfiával tisztítjuk, az eluálást toluoi és étil-acetát 3 : I arányú elegyének 300 ml-ével, toluol és etil-acetát 5 : 4 arányú elegyének 600 ml-ével, majd toluol és etil-acetát 1 : 1 arányú elegyének 1000 ml-ével végezzük. A terméket tartalmazó frakciókat vékonyréteg-kromatográfiás analízissel határozzuk meg, a megfelelő frakciókat egyesítjük és szárazra desztilláljuk, amikor desztillációs maradékként 1,7 g (64%) 2',23-di-O-acetil-DMT-t kapunk. FDMS: m/e 826 (P+H‘). UV-spektrum: λ,',,’θ: 280 nm (ε : 19 500), NMR-spektrum: 2.06 és 2.08 (s, 2-acetü)

11. példa

A 2' ,23-di-O-propionil-DMT előállítása ml metilén-klorid és 7,8 ml piridin elegyében 3 g (4,05 mmól) DMT-t oldunk, az oldathoz 1,8 ml (13,8 mmól) propionsav-anhidridet adunk cseppenként, keverés közben, szobahőmérsékleten. 1 éjszakán át keverjük a reakcióelegyet, ezután 15 ml toluolt adunk hozzá, és csökkentett nyomáson desztilláljuk az elegyet. A desztillációs maradékot 20 ml toluolban oldjuk, az oldatot szilikagélből (Merck 60, 300 ml) készült oszlopon kromatográfiával tisztítjuk, az eluálást toluol és etil-acetát 3 :1 arányú elegyének 300 ml-ével, toluol és etil-acetát 5 : 4 arányú elegyének 300 ml-ével, végül toluol és etil-acetát 1 : 1 arányú elegyének 1000 ml-ével végezzük. Ily módon 2,5 g (72%) 2',23-di-O-propionil-DMT-t kapunk. FDMS m/e: 854 (P + H⁺), UV-spektrum: λ£θ^Η 279 nm (ε = 2Ο8ΟΟ), NMRspektrum: 1,15 és 1,2 (t, 2-propionil)

12. példa

2~O-acetil-23-O-propionil-DMT előállítása

180 ml metilén-klorid és 15 ml piridin elegyében 6 g (7,7 mmól) 2'-O-acetil-DMT-t oldunk, az oldathoz cseppenként, keverés közben, szobahőmérsékleten 1,2 ml (9,2 mmól) propionsav-anhidridet adunk. 17 órán át keverjük a reakcióelegyet, az elegyhez ezután 300 ml toluolt adunk, és csökkentett nyomáson szárazra desztilláljuk. A desztillációs maradékot toluolban oldjuk, és telített nátriumhidrogén-karbonát-oldattal extraháljuk. Elkülönítjük a toluolos fázist, nátrium-szulfáttal vizmente9

189 512 sítjük, szűrjük és desztilláljuk. A desztillációs maradékot kevés toluolban oldjuk, az oldatot 300 ml szilikagélből készült oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot toluol és etil-acetát 1 : 1 arányú elegyével töltjük meg, az eluálást toluol és etil-acetát 1 : 1 arányú elegyének 1000 ml-ével végezzük. A vékonyréteg-kromatográfiás analízis szerint az előállítandó terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson desztilláljuk, ami után desztillációs maradékként 4,5 g (70%) 2'-O-acetil23-O-propionil-DMT-t kapunk. FDMS: m/e 840 (P + H⁺), UV-spektrum: λ™^Η 280nm (e = 21 500), NMR-spektrum: 2,08 (s, acetil), 1,15 (t) és 2,35 (q) (propionil)

13. példa

A 2'-O-propionil-23-O-acetil-DMT előállítása

Az előzőekhez hasonló módon, 45 ml metilénkloridban és 3,9 ml piridinben 1,5 g (2 mmöl) 2'-Opropionil-DMT-t oldunk, és az elegyet 0,3 ml (2,9 mmól) ecetsav-anhidriddel reagáltatjuk. A terméket szilikagélből (Waters Prep 500) készült oszlopon kromatografáljuk, ami után 0,81 g 2'-O-propionil-23-O-acetil-DMT-t kapunk. FDMS: m/e 840 (P + H⁺), UV-spektrum: K^_a°^H 279 nm (ε= 19 700), NMR-spektrum: 2,07 (s, acetil), 1,17 (t) és 2,33 (q) (propionil)

14. példa

A 2'-O-acetil-23-O-fenil-acetil-DMT előállítása ml metilén-klorid és 0,8 ml piridin elegyében

2,75 g (3,5 mmól) 2'-O-acetil-DMT-t oldunk, az oldathoz 0,56 ml (3,5 mmól) fenil-acetil-kloridot adunk 13 ml metilén-kloridban cseppenként, keverés közben, szobahőmérsékleten. 1,5 óra múlva további 0,56 ml, 13 ml metilén-kloridban oldott fenil-acetil-kloridot adunk a reakcióelegyhez.

1,5 óra múlva a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint a kiindulási vegyület elfogyott. Ekkor csökkentett nyomáson szárazra desztilláljuk az elegyet, a desztillációs maradékot metilén-kloridban oldjuk, és telített nátrium-hidrogén-karbonátoldattal extraháljuk. A szerves oldószeres fázist nátrium-szulfáttal vízmentcsitjük, szűrjük és szárazra desztilláljuk. A desztillációs maradékot toluolban oldjuk, és szilikagélből (Waters Prep 500) készült oszlopon kromatografáljuk. Az eluálást lineáris gradienssel végezzük, toluol és etil-acetát 1 : 1 arányú elegyének 4 1-ével, és etil-acetát 4 1ével.

A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és desztilláljuk, desztillációs maradékként 1,1 g (35%) 2'-O-acetil-23-O-fenil-acetil-DMT-t kapunk.

A korábbi frakciókból 0,86 g (24%) 2'-O-acetil23,4-di-O-fenil-acetil-DMT-t nyerünk. FDMS: m/e 901 (P⁺), UV-spektrum: λ™^Η 280 nm (ε = 20 400) és 204 nm (ε= 14000), NMR-spektrum : 7,23 (m, fenil), 3,62 (s, benzil), 2,08 (s, acetil).

15. példa

A 23-O-propionil-DMT előállítása ml 95%-os metanolban 1,6 g (1,9 mmól) 2'-Oacetil-23-O-propionil-DMT-t oldunk, az oldatot szobahőmérsékleten 42 órán át keverjük. Ezután csökkentett nyomáson szárazra desztilláljuk az oldatot. A desztillációs maradékot kevés toluolban oldjuk, az oldatot szilikagélből (Merck 60, 200 ml) készült oszlopon kromatografáljuk, az eluálást toluol és etil-acetát 1 : 1 arányú elegyének 2 1-ével végezzük. A vékonyréteg-kromatográfiás analízis szerint a terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson desztilláljuk, ami után

1,2 g (79%) 23-O-propionil-DMT-t kapunk. FDMS: m/e 793 (P+ H⁺), UV-spektrum: λ^^Η280 nm (ε= 17 700), NMR-spektrum: 1,14 (t) és 2,36 (q) (propionil)

16. példa

A 23-O-fenil-acetil-DMT előállítása ml 80%-os vizes metanolban 0,6 g (0,60 mmól) 2'-O-acetil-23-fenil-acetil-DMT-t oldunk, az oldatot 4,5 órán át visszafolyató hűtő alatt enyhén forraljuk. Szobahőmérsékletre hűtjük az elegyet, és csökkentett nyomáson szárazra desztilláljuk, ily módon 0,39 g (68%) 23-O-fenil-acetil-DMT-t kapunk. FDMS m/e 860 (P + H⁺), UV-spektrum λΕΐο^Η 281 _nm (_ε = 20 600, végabszorpció), NMRspektrum: 7,26 (m, fenil), 3,61 (s, benzil).

17. példa

A 23,4-di-O-fenil-acetil-DMT előállítása ml 80%-os, vizes metanolban 0,36 g (0,36 mmól) 2'-O-acetil-23,4-di-O-fenil-acetil-DMT-t oldunk, az oldatot 4,5 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk. Szobahőmérsékletre hütjük a reakcióelegyet, és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, amikor desztillációs maradékként 0,29 g (84%) 23,4-di-O-fenil-acetil-DMT-t kapunk. FDMS: m/e 978 (P + H⁺), UV-spektrum: λ™^Η 281 (ε = 20 100) és 204 nm (ε = 20 000, váll), NMRspektrum: 7,22-7,34 (m, 2-fenil), 3,63 és 3,72 (s, 2benzil).

18. példa

A 2'-O-acetil-3,23,4-tri-O-propionil-DMT előállítása ml aceton és 8 ml piridin elegyében 2 g (2,6 mmól) 2'-O-acetil-DMT-t oldunk, az oldathoz cseppenként, keverés közben, szobahőmérsékleten 20 ml acetonnal elegyített 40 ml propionsav-anhidridet adunk. 5 napon át keverjük a reakcióelegyet, majd ezt követően csökkentett nyomáson desztilláljuk. A desztillációs maradékként kapott olajos anyagot etil-acetátban oldjuk, és az oldatot telített nátrium-hidrogén-karbonáttal extraháljuk. A szerves oldószeres fázist elkülönítjük, nátrium-szulfát10

-101

189 512 tál vízmentesítjük, szűrjük és desztilláljuk. A desztillációs maradékot kevés toluolban oldjuk, és szilikagélből (Waters Prep 500) készült oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot lineáris grádienssel eluáljuk, a grádienst 4 1 toluollal és 4 1 etil-acetáttal készítjük. Az előállítandó terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és desztilláljuk, ily módon 1,4 g (57%) 2'-0-acetil-3,23,4'-tri-0-propionilDMT-t kapunk. FDMS: m/e 951 (P⁺), UV-spektrum: λ^°^Η 278 nm (ε = 22 000), NMR-spektrum: 2,06 (s, acetil), 1,1 (m, 3-propionil).

19. példa

A 3,23,4-tri-O-propionil-DMT előállítása ml 80%-os, vizes metanolban 0,7 g (0,74 mmól) 2'-O-acetil-3,23,4-tri-O-propionil-DMT-t oldunk, az oldatot 5 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk. Lehűtjük a reakcióelegyet, és csökkentett nyomáson vizes, desztillációs maradékig desztilláljuk. A desztillációs maradékot metilénkloriddal extraháljuk, elkülönítjük a szerves oldói szeres oldatot, nátrium-szulfáttal vízmentesítjük, szűrjük, csökkentett nyomáson szárazra desztilláljuk, amikor 0,38 g (56%) 3,23,4-tri-O-propionilDMT-t kapunk. FDMS m/e 910 (P + H⁺)> UVspektrum λ^^Η 277 nm (ε = 22 300), NMR-spektrum: 1,1-1,2 (m, 3-propionil)

20. példa

A 2,4“,23-tri-O-acetil-DMT előállítása

150 ml piridinben 10,0 g (13,5 mmól) DMT-t oldunk, az oldathoz keverés közben, szobahőmérsékleten 5,8 ml (60,7 mmól) ecetsav-anhidridet adunk. 1 éjszakán át keverjük a reakcióelegyet, az oldószert ezután csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A desztillációs maradékként kapott olajat diklór-metánban oldjuk, és telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal extraháljuk. A szerves oldószeres fázist elkülönítjük, nátrium-szulfáttal vízmentesítjük, szűrjük, és csökkentett nyomáson desztilláljuk. A desztillációs maradékként kapott terméket szilikagélből (Waters Prep 500) készült oszlopon keresztül kromatografáljuk, eluensként lineáris grádienst használunk, ezt toluol és etilacetát 3 : 1 arányú elegyének 41-éből, és etil-acetát 41-éből állítjuk elő. A vékonyréteg-kromatográfiás analízis szerint az előállítandó terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson desztilláljuk, ami után 4,5 g 2',4-23-tri-O-acetilDMT-t kapunk. FDMS: m/e 868 (P + H⁺), UVspektrum: 280 nm, (ε=21 100), NMRspektrum: 2,06 (s, 2-acetil), 2,09 (s, 1-acetil).

21. példa

A 2'-O-acetil-23-O-fenoxi-acetil-DMT előállítása ml diklór-metán és 0,8 ml piridin elegyében

2,75 g (3,5 mmól) 2'-O-acetil-DMT-t oldunk, az oldathoz cseppenként, keverés közben, szobahőmérsékleten 1,2 ml (8,8 mmól) 25 ml diklór-melánban oldott fenoxi-acetil-kloridot adunk. Egy óra múlva 200 ml telített nátrium-hidrogén-karbonátoldathoz öntjük a reakcióelegyet, elkülönítjük a szerves oldószeres fázist, nátrium-szulfáttal vízmentesítjük, szűrjük és csökkentett nyomáson desztilláljuk. A desztillációs maradékként kapott, szilárd halmazállapotú habot szilikagélből készült oszlopon kromatografáljuk, a termékei toluol és etil-acetát 1 : 1 arányú elegyével eluáljuk. Az 1,5 g mennyiségű 2'-O-acetil-23-O-fenoxi-aeetil-DMT-t 0,55 g 2'-O-acetil-23,4-di-O-fenoxi-acetil-DMTvel és 0,03 g 2'-O-acetil-3,23-di-O-fenoxi-acetilDMT-vel együtt izoláljuk. FDMS: me 918 (P + H⁺), UV-spektrum: λ*°^Η: 276 (ε = 22 5ΟΟ), 214nm (ε = 9000). NMR-spektrum: 6,9-7,3 (m, fenti), 4,65 (s, fenoxi-metil), 2,06 (s, acetil).

22. példa

A 2'-O-acetil-23-O-(p-klór-fenil-acciilt-DMT előállítása

150 ml tetrahidro-furánban 4,3 g (25 mmól) p-klór-fenil-ecetsavat és 3,4 g (25 mmól) 1-hidroxibenzotriazolt oldunk. Jégfürdőben lehűtjük az elegyet, és 5,2 g (25,3 mmól) diciklo-hexil-karbodiimidet adunk hozzá. 3 órán át 0 °C hőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet, majd egy éjszakán át hűtőszekrényben tároljuk. Reggel szűrjük a reakcióelegyet, a szürletet csökkentett nyomáson desztilláljuk. A desztillációs maradékot 75 ml acetonban oldjuk, az oldatot szűrjük és 10 g (12,8 mmól) 2'-O-acetil-DMT-t és 0.87 g (12.8 mmól) imidazolt adunk hozzá. 125 ml-re egészítjük ki az oldat térfogatát aceton adagolásával, ezután 1,87 ml (12,8 mmól) trietil-amint adagolunk. 20 órán át szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet, ezt követően csökkentett nyomáson eltávolítjuk az oldószert, és a desztillácós maradékot szilikagélből készült oszlopra töltjük. A terméket gradiens elucióval eluáljuk, a gradienst toluol és etil-acetát 4 : 1 arányú elegyéből, és etil-acetátból készítjük. Ily módon

4,75 g 2'-O-acetil-23-O-(p-klór-fenil-acetil)-DMT-t kapunk. FDMS: m/e 936 (P + H ⁺ ), UV-spektrum: λ*°^Η: 280 (ε=19 000), 219 (ε= 16 000), NMRspektrum: 7,2-7,3 (m, fenil), 3,6 (s, p-klór-benzil), 2,06 (s, acetil).

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás (I) általános képletű makrolid antibiotikumok és ezek 1-5 szénatomos alkanoii-, fenil(1-4 szénatomos)-alkanoil-, fenoxi-(l-4 szénatomos)-alkanoil- és halogén-fenil-(l-4 szénatomos)alkanoil-észtereinek előállítására, ahol

Q jelentése —CH₂OH vagy —CHO csoport - azzal a feltétellel, hogy ha a molekula 3-helyzetében O-acetilcsoport van, a 4-helyzet O-izovalerilcsoporttól eltérő -, azzal jellemezve, hogy

a) Streptomyces fradiae NRRL 12 170 mikroorganizmust süllyesztett, levegőztetett körülmények között tenyésztünk, a keletkezett terméket elvá11

-11I .189 512 lasztjuk és kívánt esetben redukálószerrel kezeljük, vagy

b) olyan (1) általános képletű vegyület előállítására, ahol 0—CH₂OH csoport, olyan (I) általános kcpletű vegyületet, ahol Q jelentése —CHO csoport, redukálószerrel kezelünk, és kívánt esetben egy a) vagy b) eljárás szerint kapott (I) általános képletű vegyületet a tárgyi körben megadott acilcsoportokat tartalmazó acilezőszerrel kezelünk.
2. Eljárás állatgyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletű antibiotikumot, ahol Q az 1. igénypontban megadott, vagy annak 1. igénypontban megadott acil-észterét legalább egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható semleges vivőanyaggal együtt szokásos dózisformává alakítunk.