Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania pochodnych makroiidowych, zwlaszcza zwiazków podo¬ bnych do dobrze znanego srodka leczniczego tylozyny fpatrz np. TetrahedronLetters, 2339 (1970)].Pomimo wielkiej wartosci tylozyny istnieje stale zapotrzebowanie na nowe antybiotyki, miedzy innymi ze wzgledu na mozliwosc pojawienia sie uodpornionych szczepów. Ponadto, modyfikacja struktury czasteczki moze prowadzic do zmiany spektrum dzialania na wrazliwe mikroorganizmy. Niestety, chemiczna modyfikaqa struk¬ tury makrolidów typu tylozyny jest nieslychanie trudna. Na przyklad, w J. Org. Chem. 44 (12), 2050-2 (1979) wskazano na nieprzezwyciezone trudnosci zwiazane z rozszczepieniem wiazania glikozydu mycynosylowego w tylozynie za pomoca srodków chemicznych. Rzeczywiscie, w znacznej wiekszosci przypadków badacze tej dziedziny, chcac zbadac nowe struktury, zmuszeni byli do poszukiwan nowych mikroorganizmów, wystepuja¬ cych w przyrodzie lub syntetycznych w nadziei, ze ich hodowla da podobne struktury.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze zwiazki podobne do tylozyny ale pozbawione jej mycynosylowej reszty cukrowej mozna wytwarzac podczas podpowierzchniowej aerobowej fermentacji pewnych szczepów Streptomy- ces fradiae.Sposób wedlug wynalazku zapewnia wytwarzanie nowej pochodnej makrolidowej o dzialaniu antybioty- cznym, do stosowania w srodkach weterynaryjnych, o ogólnym wzorze 1, w którym Q oznacza grupe —CH2OH lub-CHO.Chociaz nie ma wskazówek co do konfiguracji stereochemicznej zwiazku o ogólnym wzorze 1, przyjmuje sie, ze jest ona identyczna z konfiguracja stereochemiczna tylozyny. Obojetnym cukrem jest mykaroza, a amino- cukrem mykaminoza.Gdy w zwiazku o ogólnym wzorze l,Qi oznacza grupe —CHO, to zwiazek ten jest nowym antybiotykiem makrolidowym, 23-demycynosylotylozyna? zwanym dalej demycynosylotylozyna lub DMT, który ma budowe przedstawiona wzorem 2.1 131733 Dwuwodoropochodna DMT, to jest 20-dihydro-23-demycynosylotylozyna, zwana dalej dihydro-DMT, ma budowe przedstawiona wzorem 3.Zwiazki o ogólnym wzorze 1 inhibituja wzrost mikroorganizmów patogenicznych wobec zwierzat cieplo- krwistych. Odznaczaja sie one zwlaszcza dzialaniem przeciwbakteryjnym i sa szczególnie aktywne wobec mikro¬ organizmów Gram-dodatnich i szczepów Mycoplasma.Cecha sposobu wedlug wynalazku jest to, ze prowadzi sie hodowle szczepu Streptomyces fradiae NRRL 12170 w warunkach podpowierzchniowej hodowli aerobowej az do uzyskania znacznego poziomu aktywnosci antybiotycznej.Dihydro-DMT jest wytwarzany wówczas, gdy fermentacje prowadzi sie w ciagu dluzszego okresu czasu, pozwalajac tym samym na enzymatyczna redukcje obecnego DMT.Pozywka, stosowana do hodowania Streptomyces fradiae NRRL 12170 moze byc dowolna z licznych znanych pozywek. Dla zapewnienia ekonomii wytwarzania, optymalnej wydajnosci i latwego wydzielania pro¬ duktu pewne pozywki sa jednak korzystne. I tak, np. jako korzystne zródlo wegla w fermentacji prowadzonej na wielka skale pozywka zawiera weglowodany takie jak dekstryna, glikoza, skrobia i maka kukurydziana oraz oleje, takie jak olej sojowy. Korzystnymi zródlami azotu sa maka kukurydziana, maka sojowa, maczka rybna, amino¬ kwasy i podobne. Jako nieorganiczne sole stanowiace skladniki odzywcze, które zwykle wprowadza sie do pozywki, stosuje sie rozpuszczalne sole zdolne do tworzenia jonów potasowych, sodowych, magnezowych, wapniowych, amonowych, chlorkowych, weglanowych, siarczanowych, azotanowych i podobnych.Pozywka powinna zawierac takze istotne pierwiastki sladowe, konieczne do wzrostu i rozwoju organizmu.Takie pierwiastki Sadowe wystepuja czesto jako zanieczyszczenia w innych skladnikach pozywki w ilosciach wystarczajacych, aby spelnic wymagania wzrostowe hodowanego drobnoustroju. W przypadku prowadzenia fer¬ mentacji na wielka skale, gdy pienienie sie przysparza trudnosci, konieczne moze byc dodawanie niewielkiej ilosci (to jest 0,2 ml/litr) srodka przeciwpieniacego, takiego jak glikol polipropylenowy (o ciezarze czasteczko¬ wym okolo 2000).Do wytwarzania znacznych ilosci DMT lub dihydro-DMT, korzystna jest podpowierzchniowa fermentacja aerobowa w fermentorze. Mala ilosc DMT lub dihydro-DMT mozna otrzymywac w hodowli prowadzonej we wstrzasanych kolbach. Ze wzgledu na opóznienie czasowe w wytwarzaniu antybiotyku, zwiazane zwykle z zasz¬ czepieniem duzych fermentorów sporami mikroorganizmu, korzystnie stosuje sie szczepionke wegetatywna.Szczepionke wegetatywna otrzymuje sie, zaszczepiajac mala objetosc pozywki sporami lub fragmentami grzybni mikroorganizmu w celu otrzymania jego swiezej, aktywnie wzrastajacej hodowli. Szczepionke wegetatywna prze¬ nosi sie nastepnie do wiekszego zbiornika. Pozywka, uzywana do otrzymywania szczepionki wegetatywnej moze byc taka sama jak stosowana w fermentacji prowadzonej na duza skale, mozna jednak takze stosowac inne pozywki.Hodowle SJradiae NRRL 12170 mozna prowadzic w temperaturze od okolo 10°C do okolo 37°C. Opty¬ malne wytwarzanie antybiotyku nastepuje w temperaturze okolo 28°C.Jak zwykle w podpowierzchniowej hodowli aerobowej, przez pozywke przepuszcza sie pecherzyki steryl¬ nego powietrza. Dla wydajnego wytwarzania antybiotyku przy fermentacji prowadzonej w fermentorze procen¬ towe nasycenie powietrzem powinno wynosic okolo 30°C lub wiecej (w temperaturze 28°C i pod cisnieniem 980,66 hPa).Wytwarzanie antybiotyku mozna sledzic podczas fermentacji, badajac dzialanie próbek brzeczki fermenta¬ cyjnej na mikroorganizmy, o których wiadomo, ze sa wrazliwe na dzialanie wytwarzanych antybiotyków.Przydatnym mikroorganizmem jest tu Staphylococcus aureus ATCC 9144. Próbe biologiczna prowadzi sie dogod¬ nie zautomatyzowana metoda turbidometryczna. Oprócz tego wytwarzanie antybiotyku mozna latwo sledzic stosujac wysokosprawna chromatografie cieczowa z wykrywaniem w ultrafiolecie.DMT i dihydro-DMT mozna odzyskiwac z hodowli podpowierzchniowej prowadzonej w warunkach aerobo- wych z pozywki hodowlanej w znany sposób. Odzyskiwanie DMT i dihydro-DMT prowadzi sie, saczac najpierw brzeczke fermentacyjna, która mozna nastepnie dalej oczyszczac, otrzymujac pozadany antybiotyk. Oczyszcza¬ nie mozna prowadzic w rózny sposób. Korzystny sposób oczyszczania przesaczonej brzeczki polega na nastawie¬ niu pH na wartosc okolo 9, ekstrakcji brzeczki odpowiednim rozpuszczalnikiem, takim jak octan etylu, octan amylu lub keton metylowoizobutylowy, ekstrakcji fazy organicznej kwasnym roztworem wodnym i wytraceniu antybiotyku przez zalkalizowanie kwasnego ekstraktu. Dalsze oczyszczanie polega na stosowaniu ekstrakcji, adsorpcji i/lub wytracania.Grupy hydroksylowe DMT i dihydro-DMT w pozycjach 2', 4'*, 3", 23 i 3 mozna estryfikowac tworzac przydatne pochodne acyloestrowe. Ponadto w dihydro-DMT mozna estryfikowac grupe hydroksylowa w pozycji 20. Najlatwiejsza jest estryfikacja grupy 2'-hydroksylowej. Typowymi estrami sa estry kwasu jednokarboksylo-131733 3 wego lub pólestry kwasu dwukarboksylowego o 2 -12 atomach wegla.DMT, dihydro-DMT i ich pochodne acyloestrowe sa zwiazkami zasadowymi, które po potraktowaniu kwa¬ sami ulegaja przemianie w sole addycyjne z kwasami.Typowymi srodkami acylujacymi sa bezwodniki, halogenki (zwykle w polaczeniu z zasada lub innym sro¬ dkiem wiazacym kwas) i aktywne estry kwasów organicznych. Acylowanie mozna tez prowadzic, stosujac miesza¬ nine kwasu organicznego i srodka odwadniajacego, takiego jak dwucykloheksylokarbodwuimid. Acylowanie moz¬ na tez prowadzic enzymatycznie, jak opisano w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4 092 473. Raz utworzone pochodne acylowe mozna wydzielac i oczyszczac w znany sposób.Pochodne 2'-monoestrowe mozna wytwarzac na drodze ogólnie znanej selektywnej estryfikacji, np. przez traktowanie antybiotyku stechiometryczna iloscia (lub niewielkim nadmiarem) srodka acylujacego, takiego jak bezwodnik acylowy, prowadzonej w temperaturze pokojowej w ciagu 1—24 godzin, az do calkowitego zakoncze¬ nia estryfikacji. 2'-monoester wydziela sie z mieszaniny reakcyjnej w znany sposób, taki jak ekstrakcja, chromato¬ grafia i krystalizacja.Przydatnymi estrami acylowymi sa estry kwasów organicznych takich jak kwasy alifatyczne, cykloalifaty- czne, arylowe, aralkilowe, heterocykliczne kwasy karboksylowe, kwasy sulfonowe i alkoksyweglowe, korzystnie o 2-18 atomach wegla, a zwlaszcza o 2-12 atomach wegla.Przedstawicielami odpowiednich estrów sa estry pochodzace od kwasów takich jak kwas octowy, chloro- octowy, propionowy, maslowy, izowalerianowy, alkoksyweglowy, stearynowy, cyklopropanokarboksylowy, cykloheksanokarboksylowy, 0-cykloheksylopropionowy, 1-adamantanokarboksylowy, benzoesowy, fenyloocto¬ wy, fenoksyoctowy, migdalowy i 2-tienylooctowy, od kwasów alkilo-, arylo- i aralkilosulfonowych, przy czym kwasy arylo- i aralkilosulfonowe sa ewentualnie podstawione w reszcie aromatycznej podstawnikami takimi jak atom chlorowca, grupa nitrowa, nizsza grupa alkoksylowa i podobnymi. Odpowiednimi estrami sa takze pólestry kwasów dwukarboksylowych, takich jak kwas bursztynowy, maleinowy, fumarowy, malonowy i ftalowy.Korzystna grupe stanowia pochodne estrowe dopuszczalne w farmacji, jednak i inne pochodne estrowe sa przydatne jako produkty posrednie.DMT, dihydro-DMT i ich acylowe estrowe pochodne tworza sole addycyjne z kwasami. Sole takie sa przydatne np. do wydzielania, oczyszczania i krystalizowania DMT, dihydro-DMT i ich pochodnych acylowych.Ponadto sole odznaczaja sie lepsza rozpuszczalnoscia w wodzie.Do odpowiednich soli naleza sole utworzone w znanej reakcji z kwasami zarówno organicznymi jak i nieor¬ ganicznymi, takimi jak np. kwas siarkowy, solny, fosforowy, octowy, bursztynowy, cytrynowy, mlekowy, male¬ inowy, fumarowy, palmitynowy, cholowy, embonowy, sluzowy, D-glutarninowy, d-kamforowy, glutarowy, gliko- lowy, ftalowy, winowy, mrówkowy, laurynowy, stearynowy, salicylowy, metanosulfonowy, benzenosulfonowy, sorbowy, pikrynowy, benzoesowy i podobne.Szczególnie korzystna grupa soli zwiazków o wzorze 1 sa farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasami. Sole „farmaceutycznie dopuszczalne" sa to sole wystarczajaco nietoksyczne, by nadawaly sie do chemoterapii infekcji bakteryjnych u zwierzat cieplokrwistych.Z DMT i dihydro-DMT mozna wytwarzac na drodze lagodnej hydrolizy odpowiednio 5-C-mykaminosyloty- lonolid (OMT) i 20-dihydro-5-C-mykaminosylotylonolid (dihydro-OMT), bedace zwiazkami o dzialaniu antybio- tycznym Zwiazki te znane sa z opisu patentowego Stanów Zjedn. Ameryki nr 3459853.Dla przeprowadzenia hydrolizy mozna stosowac odpowiednie roztwory o pH okolo 4 lub mniej. W sposo¬ bie tym stosuje sie temperature 20-100° C. Czas reakcji potrzebny do przeprowadzenia hydrolizy zmienia sie w zaleznosci od pH mieszaniny reakcyjnej i stosowanej temperatury. Przy wyzszym pH szybkosc reakcji jest mniejsza, a w wyzszej temperaturze reakcja przebiega szybciej. Reakcje prowadzi sie, traktujac DMT lub dihydro- -DMT slabokwasnym roztworem w ciagu okresu czasu wystarczajacego do skutecznego usuniecia grupy mykaro- zylowej i otrzymania odpowiednio OMT lub dihydro-OMT.Alternatywnie, a niekiedy korzystnie, OMT lub dihydro-OMT mozna wytwarzac, traktujac DMT lub di¬ hydro-DMT w brzeczce fermentacyjnej, w której jest wytwarzany, przy uzyciu opisanych slabokwasnych warun¬ ków, w ciagu okresu czasu wystarczajacego do przeprowadzenia DMT lub dihydro-DMT odpowiednio w OMT lub dihydro-OMT. Tak wytworzony OMT lub dihydro-OMT mozna wydzielic z brzeczki fermentacyjnej w znany sposób.Nowe mikroorganizmy stosowane w sposobie wedlug wynalazku otrzymano przez chemiczna mutageneze szczepu Streptontyces fradiae wytwarzajacego tylozyne. Mikroorganizm otrzymany na drodze mutagenezy wytwarza tylko minimalna ilosc tylozyny, natomiast jako glówny produkt wytwarza DMT.4 131733 W celu scharakteryzowania, nowy mikroorganizm porównano ze szczepami Streptomyces fradiae M48-E 2724.1, to jest szczepem wytwarzajacym tylozyne, pochodzacym z S. fradiae NRRL 2702. S.fradiae NRRL 2702 zostal opisany przez Hamilla i innych w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 3.178.341. W dalszym opisie kulture S.fradiae M48-E 2724.1 wytwarzajaca tylozyne okresla sie jako „E 2724.1".Nowy szczep NRRL 12170 wytwarzajacy DMT i dihydro-DMT klasyfikuje sie równiez jako szczep Strepto¬ myces fradiae. Charakteryzujac ten mikroorganizm, stosowano metody zalecane przez International Streptomy¬ ces Project do charakteryzowania szczepu Streptomyces [E.B. Shirling and D.Gottlieb, „Methods for Characteri- zation of Streptomyces Species", Internal. Journal of Systematic Bacteriology, 16 (3), 313-340 (1966)] oraz pewne próby dodatkowe. Brano tez pod uwage nastepujace wzmianki w literaturze, odnoszace sie S.fradiae: (1) E.E.Buchman and N.E.Gibbons, „Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", Sth edition, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md., 1974, str. 815 i (2) E.B.Shirling and D.Gottlieb, „Cooperative Desorption of Streptomyces,. II Species Description from First Study", Internal. Journal of Systematic Bacteriology, 18, (2), 118(1968).Porównanie charakterystyki szczepu wytwarzajacego DMT z charakterystyka szczepu S.fradiae „E 2724.1" wytwarzajacego tylozyne przedstawia sie nastepujaco: Morfologia lancucha sporów nowego szczepu i szczepu E 2724.1 odpowiada przekrojowi Retinaculum- Apertum (RA). Wystepy haczykowate, petle i nieregularne spirale sa krótkie i zwykle o niewielkiej srednicy.Najlepiej obserwuje sie to na agarze ISP nr 2 (agar z ekstraktu slodowego). Powierzchnia zarodników jest gladka, maja one ksztalt kulisty o przecietnej srednicy 0,65 Mtn. Wymiary srednie zarodników wynosza od 0,61 firn do 0,71 Mm.Najbardziej oczywiste róznice pomiedzy tymi szczepami widoczne sa przy porównywaniu ich charaktery¬ styk hodowlanych. Szczep E 2724 tworzy dosc latwo powietrzna grzybnie na wiekszosci pozywek i w szeregu kolorystycznym odpowiada barwie bialej. Szczep wytwarzajacy DMT tworzy bardzo mala grzybnie powietrzna, o ile tworzy ja wogóle. Grzybnia ta, o ile wystepuje, w szeregu kolorystycznym odpowiada barwie od bialej do szarej. Odwrotne strony tych kolonii nie wykazuja tworzenia wyrózniajacych je pigmentów. Maja one barwe od jasno- do umiarkowanie zóltej. Wytwarzanie pigmentu melanoidowego jest negatywne (Wytwarzanie pigmentu melanoidowego bada sie, stosujac pozywke ISP nr 1, to jest agar z ekstraktu peptonu z drozdzy — zelazo, ISP nr 7, to jest agar tyrozynowy i agar ISP nr 7 bez tyrozyny).Zestawienie wazniejszych podobienstw i róznic pomiedzy szczepem E 2724.1 a szczepem wytwarzajacym DMT podano w tablicy 1.Tablica 1 Porównanie Streptomyces fradiae E 2724.1 i NRRL 12170 Podobienstwa Morfologia lancucha zarodników Ornamentacja powierzchniowa zarodników Rozmiary zarodników Brak wytwarzania barwnika Brak rozpuszczalnych pigmentów Wzrost w wybranych pozywkach wegetatywnych Hydroliza skrobi Negatywna reakcja na odtluszczone mleko Redukcja azotanów Dodatnia kataliza Dodatnia fosfatoza Ujemna ureaza Model wrazliwosci antybiotycznej Róznice Charakterystyki hodowli Wykorzystanie wegla Uplynnianie zelatyny Tolerancja na NaCl Zakres pH Zakres temperatury131 733 5 Porównanie charakterystyki morfologicznej i charakterystyki hodowlanej szczepów S.fradiae E 2724.1 i NRRL 12170 podano w tablicy 2. W dalszych tablicach podano porównanie wrazliwosci antybiotycznej (tablica 3), wykorzystania wegla (tablica 4) i róznych wlasciwosci fizjologicznych (tablica 5).Tablica 2 Charakterystyka hodowlana i morfologia | Zarodniki 1 Lancuchy zarodników 1 Powierzchnia zarodników 1 / 1 Ksztalt zarodników I Agar ISP nr 2 1 Agar ISP nr 3 [ Agar ISP nr 4 Agar ISP nr 5 Agar ISP nr 7 Agar Benetta Jablczan wapnia | G2/ 1 R Am Sp G R Am Sp G R Am Sp G R Am Sp G R Am Sp G R Am Sp G R Am sP ! E 2724.1 RA 10 gladka kulisty dobry 87.srednio-zólty dobra 263.biala brak slaby 263.bialy slaba 263.biala brak obfity 87.srednio-zólty obfita 263.biala brak dobry 86.jasno-zólty dobra 92.y .biala brak obfity 87.srednio-zólty obfita 263.biala brak slaby 90.szaro-zólty brak brak i dobry 263.bialy | dobry 263.bialy brak ! NRRL 12170 . ' RA 10 gladka kulisty dobry 87.srednio-zólty dostateczny 263.biala brak slaby 263.bialy sladowa | brak ] dobry | 87.srednio-zólty | slaba 1 brak | dobry [ 86.jasno-zólty | brak | brak | dobry | 87.srednio-zólty | dostateczna 265.srednio-szara | jasno-brazowy | brak wzrostu | - — — slaby 1 92.zólto-bialy | brak j brak J6 131 733 Tablica 2 (ciag dalszy) Agar Czapeka Agar glikozowo- asparaginowy Pasta pomidorowa - maczka owsiana G R Am Sp G R Am Sp G R Am Sp dobry 87.srednio-zólty obfita 263.biala brak brak wzrostu — — - obfity 92iólto-bialy obfita 263.biala brak dostateczny 87.srednio-zólty sladowa brak brak wzrostu — - - dobry 87.srednio-zólty 1 brak | brak 1/ Ornamentacje powierzchni zarodników okreslano przy uzyciu mikroskopu elektronowego skanningowego 2/ G = wzrost; R = odwrotna strona lub spód kolonii; Am = grzybnia powietrzna; Sp = rozpuszczalny pigment 3/ Nazwy kolorów podano, uzywajac ISCC - NBS color charts (K.L.Kelly and D.BJudd, „The ISCC - NBS Centroid Color Charts Standard Sample No. 2106", U.S.Dept. of Commerce, National Bureau of Standards, Washington, D.C.20234) Tablica 3 Wrazliwosc antybiotycznaaib/ Antybiotyk | Chloramfenikol Erytromycyna | Cefalorydyna [ Linkomycyna Polymyxina B Streptomycyna Tetracyklina Yankomycyna Stezenie 30 Mg 15 Mg 30 Mg 2 Mg 300 jednostek 10 Mg 30 Mg 30 Mg Klasa zwiazku zwiazek nitrofenylowy makrolid /3-laktam linkosaminid peptyd aminoglikozyd tetracyklina glikopeptyd E 2724.1 + tr + — tr + + + NRRL 12170 + tr + — tr + + + a/ Okreslona przy uzyciu krazków do badania wrazliwosci wylozonych na posiewowych platkach agarowych b/ — oznacza odpornosc (brak stref inhibitowania) + oznacza wrazliwosc (strefy inhibitowania) tr oznacza slady wrazliwosci131733 7 Tablica 4 Wykorzystanie weglaa»W Zródlo wegla Próba kontrolna: brak wegla Próba kontrolna: glikoza L-arabinoza D-fruktoza D-galaktoza i-inozyt D-mannit Rafinoza Salicyn Sacharoza D-ksyloza D-ramnoza E 2724.1 — + • — + + + — — — + + - NRRL12170 ] — + + + 1 + + + — — + + + a/ - oznacza brak wykorzystania + oznacza wykorzystanie b/ Oznaczano na agarze International Streptomyces Project (ISP) nr 9 (agar do okreslania wykorzystania wegla) do którego dodano sterylizowane na filtrze zródla wegla do jednakowego ostatecznego stezenia 1%. Plytki inkubowano w temperaturze 30° C i obserwowano po 7 i 12 dniach.Tablica 5 Rózne wlasciwosci fizjologiczne | Pozywka ISP nr 1 (chromogenicznosc) Pozywka ISP nr 6 (chromogenicznosc) | Pozywka ISP nr 7 (chromogenicznosc) [ Uplynnianie zelatyny Reakcja z odtluszczonym mlekiem Zakres pH w którym nastepuje wzrost 1 2/ Temperatura, w której nastepuje wzrost 1 3/ Tolerancja NaClM/ Hydroliza skrobi^/ Redukcja azotanów 1 Katalazaó/ Fosfataza^/ Ureazaó/ E 2724.1 — — — — — 6,1-8,8 10-37°C 8% + + + + - NRRL 12170 — — - ! + ! — 6,1-7,8 10-30°C 4% + + + + - 1/ Na pozywce ISP nr 2 (agar z ekstraktu drozdzy i slodu), inkubacja w ciagu 7 dni 2/Okreslano przy uzyciu nastepujacych buforów w stezeniu 0,05 m: kwas cytrynowy, pH 3, 4, 5; kwas 2-/N-morfolino/ etanosulfonowy, pH 6; kwas 3-/N-morfolino/ propanosulfonowy, pH 7; kwas N-2-hydroksy- etylopiperazyno -N'-2-etanosulfonowy, pH 8; 2-amino-2-/hydroksymetylo/ propandiol-1,3, pH 9; kwas8 131733 3-cykloheksyloamino-l,l- propanosulfonowy, pH 10, 11. Jako prawidlowa wartosc przyjmowano pH agaru po inkubowaniu w ciagu 7 dni, poniewaz niektóre bufory nie zachowuja nastawionego pH. Toksycznosc buforu badano, doprowadzajac kazdy z buforów do pH 7,0 i okreslajac wzrost. Nie stwierdzono toksycznosci. 3/ Badano'w temperaturze 5, 10, 15, 20, 25, 30, 37,40,45, 50 i 55°C. 4/ Badano dodajac do agaru NaCl do uzyskania stezenia 0, 2,4, 6, 8,10 i 12% wagowych. 5/ Hydrolize skrobi oznaczano badajac na plytkach z pozywka ISP nr 4 (agar skrobiowy zawierajacy sole nieorga¬ niczne) obecnosc skrobi jodem. 6/ Próbki enzymów badano postepujac wedlug metod Blazewica i Ederera (D.J.Blazevic and CM.Ederer, „Prin- ciples of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology", John Wiley and Sons, New York,N.Y., 1975).Opierajac sie na przedstawionych wyzej charakterystykach, mikroorganizm wytwarzajacy DMT i dihydro- DMT, NRRL 12170 sklasyfikowano jako nowy szczep Streptomyces fradiae. Kulture te zdeponowano i uczynio¬ no czescia kolekcji Northern Regional Research Center, Agricultural Research, North Central Region, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604, w której sa dostepne pod numerem NRRL 12170.Jak i w przypadku innych mikroorganizmów, charakterystyki Streptomyces fradiae NRRL 12170 ulegaja zmianom. Np. sztuczne warianty i mutanty szczepu NRRL 12170 mozna otrzymac przez traktowanie róznymi znanymi fizycznymi i chemicznymi czynnikami mutagennymi, takimi jak promieniowanie ultrafioletowe, promie¬ niowanie rentgenowskie, promieniowanie gamma i N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna. Wszystkie naturalne i sztuczne warianty, mutanty i rekombinacje Streptomyces fradiae NRRL 12170, zachowujace wlasciwosc wytwarzania DMT moga byc stosowane w omawianym procesie fermentacji.Zwiazki DMT inhibitujace wzrost patogennych bakterii, zwlaszcza bakterii Gram-dodatnich i szczepów Mycoplasma. W tablicy 6 podano minimalne stezenia inhibitujace (MIC) mierzone metoda rozcienczania próbek standardowego agaru, w którym DMT (w postaci wolnej zasady) inhibituje wzrost pewnych bakterii.Tablica 6 Aktywnosc DMT w postaci wolnej zasady in vitro | Mikroorganizm Streptococcus pyogenes C 203 Streptococcus pneumoaniae Park I | Streptococcus sp. (Group D) 282 Staphylococcus aureus 3055 Staphylococcus aureus 209 P Pasteurella multocida Pasteurella hemolytica My .oplasma gallisepticum Mycoplasma hyopneumoniae Mycoplasma hyorhinis MIC Cug/l) 0,25 0,13 0,5 1.0 0,25 3,12 12,5 0,097 0,195 0,78 Zwiazki DMT wykazuja dzialanie przeciwmikrobowe in vivo wobec eksperymentalnie wywolanych infekcji bakteryjnych. Gdy myszom zakazonym eksperymentalnie podano dwie dawki badanego zwiazku, obserwowana aktywnosc mierzono jako wartosc ED50 (skuteczna dawka w mg/kg chroniaca 50% badanych zwierzat: patrz Warren Wiek i inni, J.Bacteriol. 81, 233-235 (1961)). Wartosc ED50 zaobserwowana dla DMT i winianu DMT podano w tablicy 7.131733 9 Tablica 7 Wartosci ED50 (mg/kg x 2) przy podawaniu podskórnym i doustnym Zwiazek DMT w postaci zasady Winian DMT Zakazenie kontrolne I (x LD50) Streptococcus pyogenes Podskórnie 2,2 2,3 13 Doustnie 218 172 11,3 Streptococcus pneumoniae Park I Podskórnie 15,7 «9,9 3 Doustnie 66 100 2,7 Staphylococcus aureus 305 5 Podskórnie 2,7 nie badano 21 Doustnie 64 nie badano 26 Aktywnosc wobec szczepów Mycoplasma stanowi szczególnie przydatna ceche zwiazków DMT. W tabli¬ cach 8 i 9 przedstawiono wyniki prób, przeprowadzonych przy uzyciu DMT i winianu DMT do leczenia wywola¬ nych u kurczat infekcji Mycoplasma gallisepticum. Zwiazki podawano w wodzie do picia (1 i 2 g na 3,87 litra w ciagu 1-3 dni) lub przez injekcje w dawce 15 lub 30 mg/kg ciezaru ciala.Tablica 8 Leczenie przy uzyciu DMT w postaci zasady infekcji Mycoplasma gallisepticum wywolanej u kurczat Zwiazek DMT w postaci zasady DMT w postaci zasady DMT w postaci zasady Zakazona próba porównawcza Dawka g/3,87 1 2,0 1-3 dni 1,0 1-3 dni 15 mg/kg liczba przypadków smiertelnych/ ogólna liczba 9/30 (30%) 13/30 (43,3%) 10/30 (33,3%) 19/30 (63%) Liczba przypadków porazenia woreczka powietrznego/ ogólna liczba 26/30 (86,7%) 28/30 (93,3%) 24/30 (80%) 30/30 (100%) Sredni ciezar (g) 397 392 453 304 liczba przypadków wystepowania antycial M.gallisepticum/ ogólna liczba 21/21 (100%) 15/17 (88,2%) 20/20 (100%) 11/11 (100%) Tablica 9 Leczenie przy uzyciu winianu DMT wywolanej u kurczat infekcji Mycoplasma gallisepticum Zwiazek Winian DMT Winian DMT Winian DMT Zainfekowana próba porów¬ nawcza Dawka g/3,87 1 2,0 1-3 dni 1,0 1-3 dni 30 mg/kg - Liczba przypadków smiertelnych/ ogólna liczba 0/30 (0%) 2/30 /6,7%/ 10/30 (33,3%) 15/30 (50%) Liczba przypadków porazenia woreczka powietrznego/ ogólna liczba 13/30 (43,3%) 22/29 (75,9%) 27/30 (90%) 30/30 (100%) Sredni ciezar GD 458 354 330 231 liczba przypadków wystepowania antycial M.gallisepticum/ ogólna liczba 17/30 (56,7%) 27/28 (96,4%) 16/20 (80%) 15/15 (100%) 1 * ' '10 131 733 W celu zapobiegania lub leczenia infekcji drobiu powodowanych przez Mycoplasma ptakom podaje sie doustnie lub pozajelitowo nietoksyczna ilosc zwiazku DMT. Zwiazki DMT najdogodniej podaje sie z dopuszczal¬ nym farmaceutycznie nosnikiem, takim jak woda do pojenia ptaków.Wyniki badania ostrej toksycznosci DMT podsumowano w tablicy 10. Do badan uzywano 4- lub 5-tygod- niowych myszy Harlan ICR. Srednia dawke smiertelna (LD50) okreslano dla DMT przy podawaniu doustnym (p.o.), podskórnym (s.c), dozylnym (i.v.) i dootrzewnowym (i.p.).Tablica 10 Toksycznosc ostra DMT Droga podawania p.o. s.c. i.v r ±2i LD50 (mg/kg) Samce — — 100 721 Samice 5000 5447 186 .325 Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, stosowane do leczenia zwierzat cieplokrwistych, podaje sie zwykle w postaci preparatów weterynaryjnych, zawierajacych jako substancje czynna zwiazek o ogólnym wzorze 1 lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól lub ester, w polaczeniu z co najmniej jednym odpowiednim nosnikiem. Fachowiec latwo dobierze odpowiedni nosnik do stosowania w takich preparatach, przy czym nosniki te sa podobne do nosników stosowanych w przypadku tylozyny.Wynalazek jest blizej wyjasniony w nastepujacych przykladach.Przyklad I. Fermentacja DMT we wstrzasanych kolbach.Liofilizowana pastylke Streptomyces fradiae NRRL 12170 dysperguje sie w 1-2 ml sterylizowanej wody.Czesc tego roztworu (0,5 ml) uzywa sie do zaszczepienia pozywki wegetatywnej (150 ml) o nastepujacym skla¬ dzie: Skladnik Dosc (%) Wyciag namokowykukurydzy 1,0 Ekstraktdrozdzy 0,5 Grubo zmielonasoja 0,5 CaCOa 0,3 Olej sojowy(surowy) 0,45 Wodademineralizowana 97,25 Alternatywnie, wegetatywna hodowle Siradiae NRRL 12170 przechowywana w objetosciach 1 ml w cie¬ klym azocie stapia sie gwaltownie i stosuje sie do zaszczepienia wegetatywnej pozywki. Zaszczepiona wegeta¬ tywna pozywke inkubuje sie w kolbach Erlenmeyera w ciagu 48 godzin w temperaturze 29°C na wytrzasarce z zamknieta skrzynia przy szybkosci 300 obrotów/minute.Te inkubowana wegetatywna pozywke (0,5 ml) stosuje sie do zaszczepienia 7 ml pozywki produkcyjnej o nastepujacym skladzie: Skladnik Ilosc (%) Melasa zburaków 2,0 Makakukurydziana 1,5 Maczkarybna 0,9 Glutenkukurydziany 0,9 NaCl 0,1 /NH4/2HPO4 0,04 CaCOa 0,2 Olej sojowy(surowy) 3,0 Odmineralizowanawoda 91,36 Zaszczepiona pozywke fermentacyjna inkubuje sie w butlach o pojemnosci 50 ml w temperaturze 29°C w ciagu 6 dni na wytrzasarce o zamknietej skrzyni przy szybkosci 300 obrotów/minute.131 733 11 Fermentacja DMT w fermentatorze. W celu zapewnienia duzej ilosci inokulum, 1200 ml pozywki wegeta¬ tywnej sporzadzonej podobnie jak opisano wyzej stosuje sie do zaszczepienia 967,5 1 pozywki wegetatywnej stosowanej w drugim etapie hodowli, o nastepujacym skladzie: Skladnik Ilosc (%) Wyciag namokowykukurydzy 1,0 Maczkasojowa 0,5 Ekstraktdrozdzy 0,5 CaCOa 0,3 Olej sojowy(surowy) 0,5 Lecytyna(surowa) 0,015 Woda 97,185 Wartosc pH pozywki ustawia sie na 8,5 za pomoca 50% roztworu NaOH.Te pozywke wegetatywna stosowana w drugim etapie hodowli inkubuje sie w fermentatorze o pojemnosci 1354,5 litra w temperaturze 28° C w ciagu 48 godzin, przy odpowiednim napowietrzeniu i mieszaniu.Tak otrzymana inkubowana pozywka stosowana w drugim etapie fermentacji (557,28 litra) zaszczepia sie 3870 litrów sterylnej pozywki produkcyjnej o nastepujacym skladzie: Skladnik Ilosc (%) Maczkarybna 0,875 Makakukurydziana 1,5 Gluten zkukurydzy 0,875 CaCCb 0,2 NaCl 0,1 /NH4/2HPO4 0,04 Melasa zburaków 2,0 Olej sojowy(surowy) 3,0 Lecytyna 0,09 Woda 91,32 Wartosc pH pozywki nastawia sie na 7,2 za pomoca 50% roztworu NaOH.Zaszczepiona pozywke produkcyjna pozostawia sie do fermentami w ciagu 8-9 dni w temperaturze 28° C w fermentorze o pojemnosci 6192 litry. Pozywke podczas fermentacji napowietrza sie sterylnym powietrzem tak, aby utrzymac zawartosc rozpuszczonego tlenu na poziomie od okolo 30% do okolo 50% i miesza konwen¬ cjonalnymi mieszadlami z szybkoscia okolo 250 obrotów/minute.Przyklad II. Wydzielanie DMT. Zbiera sie cala brzeczke (3800 litrów) otrzymana jak w przykladzie I i saczy, stosujac substancje ulatwiajace saczenie. Placek grzybni przemywa sie woda i wode te dodaje sie do przesaczu.Nastawia sie pH przesaczu na wartosc 9,2 za pomoca 50% wodnego roztworu wodorotlenku sodu (9,5 1) i nastepnie ekstrahuje go octanem etylu (20001). Do ekstraktu octanowego dodaje sie odmineralizowana wode (4501) i wodorofosforan sodu (6,4 kg) a powstaly roztwór dokladnie miesza. Nastawia sie pH otrzymanego roztworu z wartosci 6,0 do wartosci 4,35, stosujac roztwór kwasu fosforowego (3300 ml, 2 czesci wody na jedna czesc kwasu fosforowego). Oddziela sie faze wodna i doprowadza jej pH do wartosci 6,5, stosujac 50% wodny roztwór wodorotlenku sodu (700 ml).Powstaly roztwór zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 225 1. Nastawia sie pH zatezonego roztworu na wartosc 9,2 dodajac 10% wodny roztwór wodorotlenku sodu (161). Otrzymany zasadowy roztwór pozostawia sie do odstania wciagu nocy. Powstale krysztaly odsacza sie, przemywa odmineralizowana woda (501) i suszy, otrzymujac 8,6 kg produktu. Czesc tak otrzymanego produktu (3 kg) przekrystalizowuje sie z mie¬ szaniny aceton-woda, otrzymujac okolo 2,7 kg DMT w postaci wolnej zasady.DMT mieknie w temperaturze okolo 132°C i powoli topnieje do temperatury okolo 150°C. Wyniki analizy elementarnej: C - 61%, H - 8,5%, N - 2%, O - 28%. DMT ma wzór empiryczny C38H<,3NOi3 i ciezar czasteczkowy okolo 742 (741 jak oznaczono metoda spektrometrii masowej).Widmo absorpcyjne DMT w postaci wolnej zasady w podczerwieni, oznaczone w chloroformie przedstawio¬ no na rysunku. Obserwuje sie maksima absorpcji wystepujace przy nastepujacych czestotliwosciach (cm"1): 3634 (bardzo male), 3559 (przegiecie), 3423 (szerokie), 2955 (intensywne), 2907 (intensywne), 1710 (intensy¬ wne), 1676 (przegiecie), 1588 (intensywne), 1447 (przegiecie), 1396 (przegiecie), 1359 (male), 1309 (bardzo male), 1178 (przegiecie), 1156 (intensywne), 1111 (przegiecie), 1072 (przegiecie), 1048 (intensywne), 101412 131733 (intensywne), 984 (przegiecie), 926 (bardzo male), 898 (bardzo male) i 833 (bardzo r-mle).Widmo absorpcvin« DMT w obojetnym etanolu w ultrafiolecie wykazuje maksimum absorpcji przy 283 nm (E 22296; Ej^ =300,9).Skrecalnosc wlasciwa DMT w postaci wolnej zasady: [a]^ = -53,5° (c 1, CH30H).Miareczkowanie elektryczne DMT w 66% wodnym roztworze dwumetyloformamidu wskazuje obecnosc grup ulegajacych miareczkowaniu i wartosc pKa okolo 7,25.DMT w postaci wolnej zasady jest rozpuszczalny w wodzie i w wiekszosci polarnych rozpuszczalników organicznych, takich jak aceton, metanol, etanol, chloroform, dwumetyloformamid i dwumetylosulfotlenek. Sole addycyjne DMT z kwasami sa bardziej rozpuszczalne w wodzie niz DMT w postaci wolnej zasady.DMT mozna odróznic od tylozyny i innych czynników tylozynowych na podstawie chromatografii bibulo¬ wej i denkowarstwowej. Przyblizone wartosci Rf i Rx dla DMT i róznych innych czynników tylozynowych podano w tablicach 11 i 12. W tablicy 12 wartosc Rx oznacza stosunek przesuniecia wyrazony wzgledem przesu¬ niecia tylozyny, dla którego przyjeto wartosc 1. Dla detekcji stosowano bioautografie z Bacillus subtilis.Tablica 11 Chromatografia cienkowarstwowa DMT Zwiazek Tylozyna DMT Desmykozyna Makrocyna Relomycyna Wartosc Rf Ab/ 0,53 0,45 0,47 0,23 0,34 B 0,53 0,52 0,24 0,49 0,51 C 0,67 0,61 0,17 0,60 0,63 a/ Pozywka: Merck, Darmstadt - Silica Gel 60 b/ Rozpuszczalnik: A - octan etylu: dwuetyloamina (96:4) B - aceton; etanol (2:1) C - chloroform.* metanol (3:1) Tablica 12 Chromatografia bibulowa DMT3/ Zwiazek Tylozyna DMT Desmykozyna Makrocyna Relomycyna Rx Db/ 1,0 0,76 0,22 0,43 0,63 E 1,0 0,95 0,83 0,87 1,0 a/ Bibula: Whatman nr 1 nasyona 0,75 m buforem KH2PO4 o pH 4,0 i suszona b/ Rozpuszczalnik: D = octan etylu nasycony woda E = n-butanol nasycony woda Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania pochodnych makrolidowych o ogólnym wzorze 1, w którym Q oznacza grupe —CH2OH lub —CHO, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle szczepu Streptomyces fradiae NRRL 12170 w warunkach podpowierzchniowej hodowli aerobowej az do uzyskania znacznego poziomu aktywnosci antybiotycznej.131 733 HO-CH, 17 16 CH3-CH O 3Vn-CM3 CHs 6' Wzór 1 V 3"\ ^r13 5" ^HM CU HO-CH2 CH3- CH2 O CH2-CH fYzór 2131 733 O CH CH2-CH20H 0H-CH2 LH3 L/H2 Wzór 3131 733 -CO O ID 0SONlVZ3Z9nd3Zad PL PL PL PL PL PL