Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania pochodnych makrolidowych, zwlaszcza zwiazków pod¬ obnych do dobrze znanego srodka leczniczego tylozyny [patrz np. TetrahedronLctters, 2339 (1970)].Pomimo wielkiej wartosci tylozyny, istnieje stale zapotrzebowanie na nowe antybiotyki, miedzy innymi ze wzgledu na mozliwosc pojawienia sie uodpornionych szczepów. Ponadto, modyfikacja struktury czastki moze prowadzic do zmiany spektrum dzialania na wrazliwe mikroorganizmy. Niestety, chemiczna modyfikacja struk¬ tury makrolidów typu tylozyny jest nieslychanie trudna. Na przyklad, w J. Org. Chem. 44 (12), 2050-2 (1979) wskazano na trudnosci zwiazane z rozszczepieniem wiazania glikozydu mycynosylowego w tylozynie za pomoca srodków chemicznych. Rzeczywiscie, w znacznej wiekszosci przypadków badacze tej dziedziny, chcac zbadac nowe struktury, zmuszeni byli do poszukiwan nowych mikroorganizmów, wystepujacych w przyrodzie lub synte¬ tycznych w nadziei, ze ich hodowla da podobne struktury.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze zwiazki podobne do tylozyny ale pozbawione jej reszty mycynosylowej mozna wytwarzac podczas podpowierzchniowej, aerobowej fermentacji pewnych szczepów Streptomyces fradiae.Sposób wedlug wynalazku zapewnia wytwarzanie nowej pochodnej makrolidowej o dzialaniu antybioty- cznym do stosowania w srodkach weterynaryjnych, o ogólnym wzorze 1, w którym Q oznacza grupe -CH2OH lub-CHO.Chociaz nie ma wskazówek co do konfiguracji stereochemicznej zwiazku o ogólnym wzorze 1, przyjmuje sie, ze jego konfiguracja stereochemiczna jest identyczna z konfiguracja tylozyny. Obojetnym cukrem jest myka- roza, a aminocukremjest mykaminoza.Gdy w zwiazku o ogólnym wzorze 1 Q oznacza grupe -CHO, zwiazek ten jest nowym antybiotykiem makrolidowym 23-de/mycynosyloksy/tylozyna, zwanym dalej de/mycynosyloksy/tylozyna lub DMOT, który ma budowe przedstawiona wzorem 2.Dihydro pochodna DMOT, to jest 20-dihydro-23-de/mycynosyloksy/tylozyna, zwana dalej dihydro-DMOT, ma budowe przedstawiona wzorem 3.DMOT i dihydro-DMOT inhibituja wzrost mikroorganizmów patogenicznych wobec zwierzat. Odznaczaja sie one zwlaszcza dzialaniem przeciwbakteryjnym i sa szczególnie aktywne wobec mikroorganizmów Gram-do- datnich i szczepów Mycoplasma.2 131731 Cecha sposobu wedlug wynalazku jest to, ze prowadzi sie hodowle szczepu Streptomyces fradiae NRRL 12171 w warunkach podpowierzchniowej hodowli aerobowej, az do uzyskania znacznego poziomu aktywnosci antybiotycznej.W procesie fermentacji najpierw wytwarzany jest DMOT. Dihydro-DMOT jest wytwarzany wówczas, gdy fermeijta&jy growadzi sie wciagu dluzszego okresu czasu, pozwalajac tym samym na enzymatyczna redukcje obefcne|o^lSM&T.Pozywka, stosowana do hodowania Streptomyces fradiae NRRL 12171 moze byc dowolna z licznych znanych pozywek. Dla zapewnienia ekonomii wytwarzania, optymalnej wydajnosci i latwego wydzielania produ¬ ktu pewne pozywki sa jednak korzystne. I tak, np. jako korzystne zródlo wegla w fermentacji prowadzonej na wielka skale pozywka zawiera weglowodany takie jak dekstryna, glikoza, skrobia i maczka kukurydziana oraz oleje takie jak olej sojowy. Korzystnymi zródlami azotu sa maka kukurydziana, maka sojowa, maczka rybna, aminokwasy i podobne. Jako nieorganiczne sole stanowiace skladniki odzywcze, które zwykle wprowadza sie do pozywki, stosuje sie rozpuszczalne sole zdolne do tworzenia jonów potasowych, sodowych, magnezowych, wapniowych, amonowych, chlorkowych, weglanowych, siarczanowych, azotanowych i podobnych.Pozywka powinna zawierac takze istotne pierwiastki sladowe, konieczne do wzrostu i rozwoju organizmu.Takie pierwiastki sladowe wystepuja czesto jako zanieczyszczenia w innych skladnikach pozywki w ilosciach wystarczajacych, aby spelnic wymagania wzrostowe hodowanego drobnoustroju. W przypadku prowadzenia fer¬ mentacji na wielka skale, gdy pienienie sie przysparza trudnosci, konieczne moze byc dodawanie niewielkiej ilosci (to jest 0,2 ml/litr) srodka przeciwpieniacego, takiego jak glikol polipropylenowy (o ciezarze czasteczko¬ wym okolo 2000).Do wytwarzania znacznych ilosci DMOT lub dihydro-DMOT, korzystna jcjst podpowierzchniowa fermenta¬ cja aerobowa w fermentorze. Male ilosci DMOT lub dihydro-DMOT mozna otrzymywac w hodowli prowadzonej we wstrzasanych kolbach. Ze wzgledu na opóznienie czasowe w wytwarzaniu antybiotyku, zwiazane zwykle z zaszczepieniem duzych fermentorów sporami mikroorganizmu, korzystnie stosuje sie szczepionke wegetaty¬ wna. Szczepionke wegetatywna otrzymuje sie, zaszczepiajac mala objetosc pozywki sporami lub fragmentami grzybni mikroorganizmu w celu otrzymania jego swiezej, aktywnie wzrastajacej hodowli. Szczepionke wegetatyw¬ na przenosi sie nastepnie do wiekszego zbiornika. Pozywka, uzywana do otrzymywania szczepionki wegetatyw¬ nej moze byc taka sama jak stosowana w fermentacji prowadzonej na duza skale, mozna jednak takze stosowac inne pozywki.Hodowle S. fradiae NRRL 12171 mozna prowadzic w temperaturze od okolo 10°C do okolo 37°C. Optymalne wytwarzanie antybiotyku nastepuje w temperaturze okolo 28°C.Jak zwykle w podpowierzchniowej hodowli aerobowej, przez pozywke przepuszcza sie pecherzyki steryl¬ nego powietrza. Dla wydajnego wytwarzania antybiotyku przy fermentacji prowadzonej fermentorze procentowe nasycenie powietrzem powinno wynosic okolo 30% lub wiecej (w temperaturze 28°C i pod cisnieniem 980,66 hPa).Wytwarzanie antybiotyku mozna sledzic podczas fermentacji, badajac dzialanie próbek brzeczki fermenta¬ cyjnej na mikroorganizmy, o których wiadomo, ze sa wrazliwe na dzialanie wytwarzanych antybiotyków.Przydatnym mikroorganizmem jest tu Staphylococcus aureus ATCC 9144. Próbe biologiczna prowadzi sie dogod¬ nie zautomatyzowana metoda turbinometryczna. Oprócz tego wytwarzanie antybiotyku mozna latwo sledzic stosujac wysokosprawna chromatografie cieczowa z wykrywaniem w ultrafiolecie.DMOT i dihydro-DMOT mozna odzyskiwac z hodowli podpowierzchniowej w warunkach aerobowych z pozywki hodowlanej w znany sposób. Odzyskiwanie DMOT i dihydro-DMOT prowadzi sie, saczac najpierw brzeczke fermentacyjna, która mozna nastepnie dalej oczyszczac, otrzymujac pozadany antybiotyk. Oczyszcza¬ nie mozna prowadzic w rózny sposób. Korzystny sposób oczyszczania przesaczonej brzeczki polega na nastawie¬ niu pH na wartosc okolo 9, ekstrakcji brzeczki odpowiednim rozpuszczalnikiem, takim jak octan etylu, octan amylu lub keton metylowoizobutylowy, ekstrakcji fazy organicznej kwasnym roztworem wodnym i wytraceniu antybiotyku przez zalkalizowanie kwasnego ekstraktu. Dalsze oczyszczanie polega na stosowaniu ekstrakcji, adsorpcji i/lub wytracania.Grupy hydroksylowe DMOT i dihydro-DMOT mozna estryfikowac w pozycjach 2\ 4", 3" i 3 tworzac przydatne pochodne acyloestrowe. Ponadto w dihydro-DMOT mozna estryfikowac grupe hydroksylowa w pozy¬ cji 20. Najlatwiejsza jest estryfikacja grupy 2'-hydroksylowej. Typowymi estrami sa estry kwasu jednokarboksy- lowego lub pólestry kwasu dwukarboksylowego o 2- 18 atomach wegla.Typowymi srodkami acylujacymi sa bezwodniki, halogenki (zwykle w polaczeniu z zasada lub innym srod¬ kiem wiazacym kwas) i aktywne estry kwasów organicznych. Acylowanie mozna tez prowadzic, stosujac miesza¬ niny kwasu organicznego i srodka odwadniajacego, takiego jak dwucykloheksylokarbodwuimid. Acylowanie moz-131731 3 na tez prowadzic enzymatycznie, jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 092 473 udzielonym na rzecz Okamoto i innych. Raz utworzone pochodne acylowe mozna wydzielac i o- czyszczac w znany sposób.Pochodne 2'-monoestrowe mozna wytwarzac na drodze ogólnie znanej selektywnej estryfikacji, np. przez traktowanie antybiotyku stechiometryczna iloscia (lub niewielkim nadmiarem) srodka acylujacego, takiego jak bezwodnik acylowy, prowadzonej w temperaturze pokojowej w ciagu 1-24 godzin, az do calkowitego zakoncze¬ nia estryfikacji. 2'-monoester wydziela sie z mieszaniny reakcyjnej w znany sposób, taki jak ekstrakcja, chromato¬ grafia i krystalizacja.Przydatnymi estrami acylowymi sa estry kwasów organicznych takich jak kwasy alifatyczne, cykloalifatycz- ne, arylowe, aralkilowe, heterocykliczne kwasy karboksylowe, kwasy sulfonowe i alkoksyweglowe, korzystnie o 2-18 atomach wegla, a zwlaszcza o 2—12 atomach wegla.Przedstawicielami odpowiednich estrów sa estry pochodzace od kwasów takich jak kwas octowy, chloro- octowy, propionowy, maslowy, izowalerianowy, alkoksyweglowy, stearynowy, cyklopropanokarboksylowy, cykloheksanokarboksylowy, ;B-cykloheksylopropionowy, 1-adamantanokarboksylowy, benzoesowy, fenyloocto¬ wy, fenoksyoctowy, migdalowy i 2-tienylooctowy, od kwasów alkilo-, arylo- i aralkilosulfonowych, przy czym kwasy arylo- i aralkilosulfonowe sa ewentualnie podstawione w reszcie aromatycznej podstawnikami, takimi jak atom chlorowca, grupa nitrowa, nizsza grupa alkoksylowa i podobnymi. Odpowiednimi estrami sa takze pólestry kwasów dwukarboksylowych, takich jak kwas bursztynowy, maleinowy, fumarowy, malonowy i ftalowy.Korzystna grupe stanowia pochodne estrowe dopuszczalne w farmaqi, jednak i inne pochodne estrowe sa przydatne jako produkty posrednie.DMOT, dihydro-DMOT i ich acylowe estrowe pochodne tworza sole addycyjne z kwasami. Sole takie sa przydatne np. do wydzielania i oczyszczania DMOT, dihydro-DMOT i ich pochodnych acylowych. Ponadto sole odznaczaja sie lepsza rozpuszczalnoscia w wodzie.Do odpowiednich soli naleza sole utworzone w znanej reakcji z kwasami zarówno organicznymi jak i nieor¬ ganicznymi, takimi jak np. kwas siarkowy, solny, fosforowy, octowy, bursztynowy, cytrynowy, mlekowy, male¬ inowy, fumarowy, palmitynowy, cholowy, embonowy, sluzowy, D-glutaminowy, d-kamforowy, glutarowy, gliko- lowy, ftalowy, winowy, mrówkowy, laurowy, stearynowy, salicylowy, metanosulfonowy. benzenosulfonowy, sorbowy, pikrynowy, benzoesowy, cynamonowy i podobne.Szczególnie korzystna grupa soli zwiazków o wzorze 1 sa farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasami. Sole „farmaceutycznie dopuszczalne" sa to sole wystarczajaco nietoksyczne, aby nadawaly sie do chemoterapii zwierzat cieplokrwistych.DMOT i dihydro-DMOT stanowia cenne zwiazki wyjsciowe do wytwarzania 23-dezoksy«5-0-mykaminosylo- tylonolidu (DOMT) i 20-dihydro-23-dezoksy-5-0- mykaminosylotylonolidu (dihydro-DOMT), na drodze lagodnej hydrolizy kwasowej. DOMT i dihydro-DOMT maja dzialanie antybiotyczne. DOMT ma budowe przedstawiona wzorem 4.Warunki prowadzenia lagodnej hydrolizy kwasowej sa znane w technice. Dla przeprowadzenia hydrolizy mozna stosowac odpowiednie roztwory opH okolo 4 lub mniej. W sposobie tym stosuje sie temperature 20—100°C. Czas reakcji podobny do przeprowadzenia hydrolizy zmienia sie w zaleznosci od pH mieszaniny reakcyjnej i stosowanej temperatury. Przy wyzszym pH szybkosc reakcji jest mniejsza, a w wyzszej temperaturze reakcja przebiega szybciej. Reakcje prowadzi sie, traktujac DMOT lub dihydro-DMOT slabokwasnym roztworem w ciagu okresu czasu wystarczajacego do skutecznego usuniecia grupy mykarosylowej i otrzymania odpowiednio DOMT lub dihydro-DOMT.Alternatywnie, a niekiedy korzystnie, DOMT lub dihydro-DOMT mozna wytwarzac, traktujac DMOT lub dihydro-DMOT w brzeczce fermentacyjnej, w której jest wytwarzany, przy uzyciu opisanych slabokwasnych warunków w ciagu okresu czasu wystarczajacego do przeprowadzenia DMOT lub dihydro-DMOT odpowiednio w DOMT lub dihydro-DOMT. Takwytworzony DOMT lub dihydro-DOMT mozna wydzielac z brzeczki fermenta¬ cyjnej w znany sposób.DOMT jest zblizona budowa do depoksycyrramycyny Ai (de-epoksycyrramycyny Ai). Wytwarzanie i dzia¬ lanie depoxycyrramycyny Ai opisano w publikacji H.Tsukiura et al J.Antibiotics 22 (3), 89-99 i 100-105 (1969). Tsukiura i inni otrzymywali depoxycyrramycyne Ai, dzialajac na cyrramycyne Aj jodkiem potasu w kwasie octowym.Mikroorganizm. Nowe mikroorganizmy stosowane w sposobie wedlug wynalazku otrzymano przez chemi¬ czna mutageneze szczepu Streptomyces fradiae wytwarzajacego tylozyne. Mikroorganizm otrzymany na drodze mutagenezy wytwarza tylko minimalna ilosc tylozyny, natomiast jako glówny produkt wytwarza DMOT.W celu scharakteryzowania, nowy mikroorganizm porównano ze szczepem Streptomyces fradiae M48-E 2724.1, to jest szczepem wytwarzajacym tylozyne pochodzacym z S.fradiae NRRL 2702. S.fradiae NRRL 27024 131731 zostal opisany przez Hamilla i innych w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 3 178 341. W dalszym opisie kulture Siradiae M48-E 2724-1 wytwarzajaca tylozyne okresla sie jako „E 2724.1".Nowy szczep NRRL 12171 wytwarzajacy DMOT i dihydro-DMOT klasyfikuje sie równiez jako szczep Streptomyces fradiae. Charakteryzujac ten mikroorganizm, stosowano metody zalecane przez International Strep- tomyces Project do charakteryzowania szczepu Streptomyces [E.P.Shirling and D.Gottlieb, „Methodsfor Chara- cterization of Streptomyces Species", Internal. Journal od Systematic Bacteriology, 16 (3), 313-340, (1966)] oraz pewne próby dodatkowe. Brano tez pod uwage nastepujace wzmianki w literaturze, odnoszace sie do S.fradiae: (1) R.E. Buchanam and M.E. Gibbons, „Bcrgey's Manual of Determinative Bacteriology", 8th edition, The Williams and Wilkins Co., Baltimora, Md., 1974, str. 815 i (2) E.B.Shirling and D.Gottlieb, „CooperatWe Description of Streptomyces. II Species Desoription from First Study", Internal. Journal of Systematic V Bacter¬ iology, 18, (2), 118 (1968).Porównanie charakterystyki szczepu wytwarzajacego DMOT z charakterystyka szczepu S.fradiae „E - 2724.1" wytwarzajacego tylozyne przedstawia sie nastepujaco.Charakterystyka mikroorganizmu. Morfologia lancucha sporów nowego szczepu i szczepu E 2724.1 odpo¬ wiada przekrojowi Retinaculum - Apertum (RA). Wystepy haczykowate, petle i nieregularne spirale sa krótkie i zwykle o niewielkiej srednicy. Najlepiej obserwuje sie to na agarze ISP nr 2 (agar z drozdzy i ekstraktu slodowe¬ go) dla szczepu E 2724.1 i na roztworze agaru Chapeka dla nowego szczepu. Powierzchnia zarodników jest gladka, maja one ksztalt kulisty o przecietnej srednicy 0,65 jum. Wymiary srednie zarodników wynosza od 0,61 Mm do 0,71 /im.Najbardziej oczywiste róznice pomiedzy tymi szczepami sa widoczne przy porównywaniu ich charaktery¬ styk hodowlanych. Szczep E 2724 tworzy dosc latwo powietrzna grzybnie na wiekszosci pozywek i w szeregu charakterystycznym odpowiada barwie bialej. Nowy szczep stosowany w sposobie wedlug wynalazku tworzy bardzo mala grzybnie powietrzna, o ile tworzy ja wogóle. Grzybnia ta, o ile wystepuje, w szeregu kolorysty¬ cznym odpowiada barwie od bialej do szarej. Odwrotne strony tych kolonii nie wykazuja tworzenia wyrózniaja¬ cych je pigmentów. Maja one barwe od jasno do umiarkowanie zóltej. Wytwarzanie pigmentu melanoidowego jest negatywne (wytwarzanie pigmentu melanoidowego bada sie, stosujac agar ISP nr 1, to jest agar z ekstraktu peptonu z drozdzy - zelazo, agar ISP nr 7, to jest agar tyrozynowy i agar ISP nr 7 bez tyrozyny).Zestawienie wazniejszych podobienstw i róznic pomiedzy szczepem E 2724.1 a nowym szczepem stosowa¬ nym w sposobie wedlug wynalazku podano w tablicy 1.Tablica 1 Porównanie Streptomyces fradiae E 2724.1 i NRRL 12171 Podobienstwa Morfologia lancucha zarodników Ornamentacja powierzchniowa zarodników Rozmiary zarodników Brak wytwarzania barwnika Brak rozpuszczalnych pigmentów Wzrost w wybranych pozywkach wegetatywnych Hydroliza skrobi Negatywna reakcja na odtluszczone mleko Redukcja azotanów Dodatnia ketolaza Dodatnia fosfataza Ujemna ureaza Model wrazliwosci antybiotycznej Wykorzystanie wegla Uplynnianie zelatyny Róznice Charakterystyki hodowli Tolerancja na NaCl Zakres pH Zakres temperatury Porównanie charakterystyki morfologicznej i charakterystyki hodowlanej szczepów Siradiae E 2724.1 i NRRL 12171 podano w tablicy 2. W dalszych tablicach podano porównanie wrazliwosci antybiotycznej (tablica 3), wykorzystania wegla (tablica 4) i róznych wlasciwosci fizjologicznych (tablica 5).131731 Tablica 2 Charakterystyka hodowlana i morfologiczna 1 Zarodniki 1 Lancuchy zarodników 1 Powierzchnia zarodników 1 / 1 Ksztalt zarodników Agar ISP nr 2 1 Agar ISP nr 3 Agar ISP nr 4 Agar ISP nr 5 1 Agar ISP nr 7 Agar Benetta Jablczan wapnia Agar Czapeka 1 G2/ 1 R Am Sp i G R Am Sp G R Am Sp G R Am Sp G R Am Sp G R Am Sp G R Am Sp G R Am Sp E 2724.1 RA 10 gladka Kulisty dobry 87.srednio-zólty3/ dobra 263.biala brak slaby 263.bialy slaba 263.biala brak obfity 87.srednio-zólty obfita 263.biala brak dobry 86.jasno-zólty dobra 92.y.biala brak obfity 87.srednio-zólty obfita 263.biala brak slaby 90.szaro-zólty brak brak dobry 263.bialy dobry 263.bialy brak dobry 87.srednio-zólty obfita 263.biala brak NRRL 12171 RA 10 gladka kulisty dostateczny 87.srednio-zólty brak 1 brak brak wzrostu — — I — dobry 87.srednio-zólty | dobra 92iólto-biala | brak j dobry j 86.jasno-zólty | slady 93.zólto-szara | brak i dobry | 87.srednio-zólty | dobra 264.jasno-szara | jasno-brazowy j brak wzrostu ] — 1 — — 1 slaby [ 92.zólto-bialy brak | brak | dobry | 87.srednio-zólty | dobra 92.zólto-biaia | brak |131 731 Tablica 2 (ciag dalszy) Agar glikozowo- asparginowy Pasta pomidorowa - maczka owsiana G R Am Sp G R Am Sp brak wzrostu ...._. — — obfity 92.zólto-bialy obfita 263.biala brak brak wzrostu ¦ — — — dobry 87.srednio-zólty brak brak 1/ Ornamentacje powierzchni zarodników okreslano przy uzyciu mikroskopu elektronowego skanningowego 2/ G = wzrost; R = odwrotna strona lub spód kolonii; Am = grzybnia powietrzna; Sp = rozpuszczalny pigment 3/ Nazwy kolorów podano, uzywajac ISCC - NBS color charts (K.L. Kelly and D.B. Judd, „The ISCC - NBS Centroid Color Charts Standard Sample No. 2106", U.S.Dept. of Commerce, National Bureau of Standards, Washington, D.C. 20234) Tablica 3 Wrazliwosc antybiotyczna a' ' Antybiotyk Chloramfenikol Erytromycyna Cefalorydyna linkomycyna Polimyxina B Streptomycyna Tetracyklina Vankomycyna Stezenie 30 /ig 15Mg 30 /ig 2jug 300 jednostek 10Mg 30;ug 30 Mg Klasa zwiazku zwiazek nitrofenylowy makrolid j3-laktam linkosaminid peptyd aminoglikozyd tetracyklina glikopeptyd E 2724.1 + tr + — tr + + + NRRL 12171 + + + — tr + + + a/ Okreslona przy uzyciu krazków do badania wrazliwosci wylozonych na posiewowych plytkach agarowych b/ - oznacza odpornosc (brak stref inhibitowania) + oznacza wrazliwosc (strefy inhibitowania) tr oznacza slady wrazliwosci131731 7 Tablica 4 Wykorzystanie weglaa,b' Zródlo wegla Próba kontrolna: brak wegla Próba kontrolna: glikoza L-arabinoza D-fruktoza D-galaktoza , i-inozyt D-mannit Rafinoza Salicyn Sacharoza D-ksyloza D-ramnoza E 2724.1 - + — + + + — - - + + - NRRL 12171 — + — + + + — — — + + - a/ - oznacza brak wykorzystania + oznacza wykorzystanie b/ Oznaczano na agarze International Streptomyces Project (ISP) nr 9 (agar do okreslania wykorzystania wegla), do którego dodano sterylizowane na filtrze zródla wegla do jednakowego ostatecznego stezenia 1%. Plytki inkubowano w temperaturze 30°C i obserwowano po 7 i 12 dniach.Tablica 5 Rózne wlasciwosci fizjologiczne 1 Agar ISP nr 1 (chromogenicznosc) Agar ISP nr 6 (chromogenicznosc) 1 Agar ISP nr 7 (chromogenicznosc) 1 Uplynnianie zelatyny Reakcja z odtluszczonym mlekiem 1 Zakres pH w którym nastepuje wzrost 1 2/ Temperatura w której nastepuje wzrost 13/ TolerancjaNaClM/ 1 Hydroliza skrobi5/ 1 Redukcja azotanów Katalazac/ Fosfataza**/ Ureaza^/ E 2724. - — - — — 6,1-8,8 10-37°C 8% + + + + - NRRL 12171 1 — — — — - 6,1-7,8 10-30°C 4% + + + + - 1 1/ Na agarze ISP nr 2 (agar z ekstraktu drozdzy i slodu), inkubacja w ciagu 7 dni 2/ Okreslano przy uzyciu nastepujacych buforów o stezeniu 0,05 m: kwas cytrynowy, pH 3,4, 5; kwas 2-/N-mor- folino/- etanosulfonowy, pH 6; kwas 3-/N-morfolino/propanosulfonowy, pH 7; kwas N-2-hydroksyetylopipera- zyno-N'- 2-etanosulfonowy, pH8; 2-amino-2-/hydroksymetylo/ propanodiol-1,3, pH9; kwas 3-cykloheksylo- amino-l,l-propanosulfonowy, pH 10, 11. Jako prawidlowa wartosc przyjmowano pH agaru po inkubowaniu w ciagu 7 dni, poniewaz niektóre bufory nie zachowuja nastawionego pH. Toksycznosc buforu badano, dopro- . wadzajac kazdy z buforów do pH 7,0 i okreslajac wzrost. Nie stwierdzono toksycznosci.8 131 731 3/ Badano w temperaturze 5, 10, 15, 20, 25, 30, 37,40,45, 50 i 55°C. 4/ Badano dodajac do agaru NaCl do uzyskania stezenia 0, 2,4, 6, 8, 10 i 12% wagowych. 5/ Hydrolize skrobi oznaczano badajac na plytkach z agarem ISP nr 4 (agar skrobiowy zawierajacy sole nieorga¬ niczne) obecnosc skrobi jodem. 6/ Próbki enzymów badano postepujac wedlug metod Blazowica i Ederera (D.J.Blazevic and G.M.Ederer, „Prin- ciples of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology", John Wiley and Sons, New York,N.Y., 1975).Opierajac sie na przedstawionych wyzej charakterystykach, mikroorganizm wytwarzajacy DMOT i dihydro- -DMOT, NRRL 12171, sklasyfikowano jako nowy szczep Streptomycesfradiae. Kulture te zdeponowano i uczy¬ niono czescia kolekcji Northern Regional Research Center, Agricultural Research, North Central Region, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604, w której sa dostepne pod numerem NRRL 12171.Jak i w przypadku innych mikroorganizmów, charakterystyki Streptomyces fradiae NRRL 12171 ulegaja zmianom. Np. sztuczne warianty i mutanty szczepu NRRL 12171 mozna otrzymac przez traktowanie róznymi znanymi fizycznymi i chemicznymi czynnikami mutagennymi, takimi jak promieniowanie ultrafioletowe, promie¬ niowanie rentgenowskie, promieniowanie gamma i N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna. Wszystkie naturalne i sztuczne warianty, mutanty i rekombinacje Streptomyces fradiae NRRL 12171, zachowujace wlasciwosc wytwarzania DMOT moga byc stosowane w omawianym procesie fermentacji.Zwiazki DMOT inhibituja wzrost patogennych bakterii zwlaszcza bakterii Gram-dodatnich i szczepów Mycoplasma. Np. w tablicy 6 podano minimalne stezenia inhibitujace (MIC) mierzone metoda rozcienczania próbek standardowego agaru, w którym DMOT (w postaci wolnej zasady) inhibitujace wzrost penwych bakterii.Tablica 6 Aktywnosc DMOT w postaci wolnej zasady in vitro Mikroorganizm Streptococcus pyogenes*C203 Streptococcus pneumoniae Park I Streptococcus sp. (Group D) 282 Staphylococcus aureus 3055 Pasteurella multocida Pasteurella hemolytica Mycoplasma gallisepticum Mycoplasma hyopneumoniae Mycoplasma hyorhinis MIC (Mg/l) 0,25 0,13 s, 0,5 1,0 6,25 25,00 0,097 0,39 0,78 Zwiazki DMOT wykazuja dzialanie przeciwmikrobowe in vivo wobec eksperymentalnie wywolanych infek¬ cji bakteryjnych. Gdy myszom zakazonym eksperymentalnie podano dwie dawki badanego zwiazku, obserwowa¬ na aktywnosc mierzono jako wartosc ED50 (skuteczna dawka w mg/kg chroniaca 50% badanych zwierzat: patrz Warren Wiek i inni, J.Bacteriol. 81, 233-235 (1961)). Wartosc ED50 zaobserwowana dla DMOT podano w tablicy 7.Tablica 7 Wartosci ED50 (mg/kg x 2) przy podawaniu podskórnym Zwiazek DMOT w postaci zasady Zakazenie kontrolne (xLD5Q) Streptococcus pyogenes podskórnie 6,3 268131731 9 W celu zapobiegania lub leczenia infekcji drobiu powodowanych przez Mycoplasma, ptakom podaje sie doustnie lub pozajelitowo nietoksyczna ilosc zwiazku DMOT. Zwiazki DMOT najdogodniej podaje sie z dopu¬ szczalnym farmaceutycznie nosnikiem, takim jak woda do pojenia ptaków.Wynalazek jest blizej wyjasniony w nastepujacych przykladach.Przyklad I. Fermentacja DMOT we wstrzasanych kolbach.Liofilizowana pastylke Streptomyces fradiae NRRL 12171 dysperguje sie w 1-2 ml sterylizowanej wody.Czesc tego roztworu (0,5 ml) uzywa sie do zaszczepienia pozywki wegetatywnej (150 ml) o nastepujacym skla¬ dzie: Skladnik Ilosc (%) Wyciag namokowy kukurydzy ifl Ekstraktdrozdzy 0,5 Grubo zmielonasoja 0,5 CaC03 0,3 Olej sojowy(surowy) 0,45 Woda demineralizowana 97,25 Alternatywnie, wegetatywna hodowle S.fradiae NRRL 12171 przechowywana w objetosciach 1 ml w ciek¬ lym azocie stapia sie gwaltownie i stosuje do zaszczepienia wegetatywnej pozywki. Zaszczepiona wegetatywna pozywke inkubuje sie w kolbach Erlenmeyera w ciagu 48 godzin w temperaturze 29°C na wytrzasarce z zamknie¬ ta skrzynka przy szybkosci 300 obrotów/minute.Te inkubowana wegetatywna pozywke (0,5 ml) stosuje sie do zaszczepienia 7 ml pozywki produkcyjnej o nastepujacym skladzie: Skladnik Dosc (%) Melasa zburaków 2,0 Makakukurydziana 1,5 Maczkarybna 0,9 Gluten kukurydziany 0,9 NaCl 0,1 NH4/2HPO4 0,04 CaC03 0,2 Olej sojowy(surowy) 3,0 Odmineralizowana woda 91,36 Zaszczepiona pozywke, fermentacyjna inkubuje sie w butlach o pojemnosci 50 ml w temperaturze 29" C w ciagu 6 dni na wytrzasarce o zamknietej skrzyni przy szybkosci 300 obrotów/minute.Fermentacja DMOT w fermentorze. W celu zapewnienia wiekszej ilosci inokulum, 60 ml pozywki wegeta¬ tywnej sporzadzonej podobnie jak opisano wyzej stosuje sie do zaszczepienia 38 litrów pozywki wegetatywnej stosowanej w drugim etapie hodowli, o nastepujacym skladzie: Skladnik Hosc (%) Wyciag namokowy kukurydzy 1,0 Maczkasojowa 0,5 Ekstraktdrozdzy 0,5 CaC03 0,3 Olej sojowy(surowy) 0,5 Lecytyna(surowa) 0,015 Woda 97,185 Wartosc pH pozywki ustawia sie na 8,5 za pomoca 50% roztworu NaOH.Te pozywke wegetatywna stosowana w drugim etapie hodowli inkubuje sie w fermentatorze o pojemnosci 68 litrów w temperaturze 29°C w ciagu 47 godzin.Tak otrzymana inkubowana pozywka (4 litry) stosowana w drugim etapie fermentacji zaszczepia sie 40 litrów sterylnej pozywki produkcyjnej o nastepujacym skladzie: Skladnik Ilosc (%) Maczkaryba 0,9188 Maka kukurydziana 1,575 Gluten z kukurydzy 0,9188 CaC03 0,210 NaCl 0,10510 131731 /NH4/2HPO4 0,042 Melasa zburaków 2,10 Olej sojowy(surowy) 3,15 Lecytyna 0,0945 Woda 90,8859 Wartosc pH pozywki nastawia sie na 7,2 za pomoca 50% roztworu NaOH.Zaszczepiona pozywke produkcyjna pozostawia sie do fermentacji wciagu 5 dni w temperaturze 28° C w fermentorze o pojemnosci 68 litrów. Pozywke podczas fermentacji napowietrza sie sterylnym powietrzem tak, aby utrzymac zawartosc rozpuszczonego tlenu na poziomie od okolo 30% do okolo 50% i miesza konwencjonal¬ nymi mieszadlami z szybkoscia okolo 300 obrotów/minute.Przyklad II. Wydzielanie DMOT. Brzeczke fermentacyjna, otrzymana jak opisano w przykladzie I, o pH 7,2, saczy sie, stosujac substancje ulatwiajace saczenie. Do przesaczu (1450 ml) dodaje sie octan etylu (400 ml). Wartosc pH roztworu nastawia sie na 9,1, dodajac wodorotlenek sodowy. Roztwór miesza sie w ciagu 10 minut i oddziela octan etylu (przesaczajac go przy uzyciu srodka ulatwiajacego saczenie aby uwolnic go od wszelkich powstajacych emulsji). Przesacz ekstrahuje sie ponownie octanem etylu (200 ml). Do polaczonych ekstraktów eterowych dodaje sie wode (200 ml) i nastawia wartosc pH otrzymanego roztworu na 4,1 dodajac kwas fosforowy. Po ekstrakcji oddziela sie faze wodna a faze organiczna odrzuca sie. Wartosc pH fazy wodnej nastawia sie wodorotlenkiem sodowym na 9,1 i nastepnie zateza pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 100 ml. Wytraca sie amorficzny osad. Po odstaniu w ciagu nocy osad odsacza sie, rozpuszcza w acetonie (20 ml) i dodaje wode (75 ml). Roztwór zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem w celu usuniecia acetonu.Powstaly osad odsacza sie i przemywa woda, otrzymujac okolo 500 mg DMOT. Dodatkowe 260 mg DMOT otrzymuje sie w podobny sposób w przesaczu.Przyklad III. Wytwarzanie DOMT. DMOT (11 g), otrzymany jak w przykladzie II, rozpuszcza sie w rozcienczonym roztworze kwasu solnego (HC1 dodawany do wody az do osiagniecia przez roztwór pH 1,8).Powstaly roztwór pozostawia sie do odstania w ciagu 24 godzin w temperaturze pokojowej i nastepnie dodat¬ kiem wodorotlenku sodu doprowadza jego pH do wartosci 9,0. Zasadowy roztwór ekstrahuje sie chloroformem i ekstrakt suszy pod zmniejszonym cisnieniem otrzymujac 9,65 g DOMT. DMOT jest bialym amorficznym cialem stalym, które mieknie w temperaturze okolo 158°C i topnieje w temperaturze okolo 165—167°C. Wyniki anali¬ zy elementarnej wskazuja na nastepujacy sklad procentowy: C - 62%, H- 8%, N - 2%, O - 27%. DMOT ma ciezar czasteczkowy okolo 726 (725 jak oznaczono metoda spektrometrii masowej).Widmo absorpcyjne DMOT (w postaci wolnej zasady) w podczerwieni, oznaczone w chloroformie przedsta¬ wiono na rysunku. Obserwuje sie maksima absorpcji wystepujace ; przy nastepujacych czestotliwo¬ sciach {cm"1): 3653 (male), 3588 (przegiecie), 3470 (szerokie), 3026 (przegiecie), 2998 (przegiecie), 2969 (intensywne), 2932 (intensywne), 2873 (przegiecie), 1709 (intensywne), 1669 (srednie), 1616 (bardzo male), 1583 (intensywne), 1447 (srednie), 1400 (srednie), 1364 (srednie), 1309 (srednie), 1278 (male), 1175 (srednie), 1151 (srednie), 1106 (male), 1066 (przegiecie), 1036 (intensywne), 1001 (srednie), 982 (srednie), 972 (przegie¬ cie), 946 (male), 913 (bardzo male), 891 (bardzo male), 853 (bardzo male), 826 (male).Widmo absorpcyjne DMOT w obojetnym etanolu w ultrafiolecie wykazuje maksimum absorpcji przy 283 nm(e 21500).Skrecalnosc wlasciwa DMOT w postaci wolnej zasady: [a]£5 =-62,75° (cl,CH3OH).Miareczkowanie elektryczne DMOT w 66% wodnym roztworze dwumetyloformamidu wskazuje obecnosc grup ulegajacych miareczkowaniu i wartosc pKa okolo 7,25.DMOT w postaci wolnej zasady jest slabo rozpuszczalny w wodzie, ale rozpuszczalny w wiekszosci polar¬ nych rozpuszczalników organicznych, takich jak aceton, metanol, etanol, chloroform, dwumetyloformamid i dwumetylosulfotlenek. Sole addycyjne DMOT z kwasami sa lepiej rozpuszczalne w wodzie niz DMOT w postaci wolnej zasady.DMOT mozna odróznic od tylozyny i DOMT na podstawie chromatografii bibulowej i cienkowarstwowej.Przyblizone wartosci Rf i Rx dla tych antybiotyków podano wablicach 8 i 9. W tablicy 8 wartosc Rx oznacza stosunek przesuniecia wyrazony wzgledem przesuniecia tylozyny, dla którego przyjeto wartosc 1. Dla detekcji stosowano bioautografie z Bacillus subtilis.131731 11 Tablica 8 Chromatografia cienkowarstwowa DMOT3/ Zwiazek Tylozyna DMOT DOMT Wartosc Rf Ab/ 0,53 0,70 0,48 B 0,53 0,56 0,17 C 0,67 0,67 0,24 a/ Pozywka: Merck, Darmstadt - Silica Gel 60 b/ Rozpuszczalnik: A - octan etylu:dwuetyloamina (96:4) B - aceton:etanol (2:1) C - chloroform:metanol (3:1) Tablica 9 Chromatografia bibulowa DMOTa' Zwiazek Tylozyna DMOT DOMT Rx 1 Db/ 1,0 1,50 0,50 E 1,0 1,09 0,97 a/ Bibula: Whatman nr 1 nasycona 0,75 m buforem KH2PO4 o pH 4,0 i suszona b/ Rozpuszczalnik: D — octan etylu nasycony woda E — n-butanol nasycony woda Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania pochodnej makrolidowej o ogólnym wzorze 1, w którym Q oznacza grupe -CH2 OH lub -CHO, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle szczepu Streptomyces fradiae NRRL 12171 w warunkach podpowierzchniowej hodowli aerobowej az do uzyskania znacznego poziomu aktywnosci antybio- tycznej.131 731 19 20 «i-CHa- a hfzor 1131 731 CH-CHr-v CH3 CH-CHjOH OC% OH CH.CHS U I OH CK tvzor 3131 731 wzór 4131 731 (%) osomvzozsnd3zvd PL PL PL PL