DE2928373A1

DE2928373A1 - Antibiotische substanz

Info

Publication number: DE2928373A1
Application number: DE19792928373
Authority: DE
Inventors: Takeo Deushi; Hisakatsu Itoh; Akio Iwasaki; Kazuhiro Kamiya; Toshimi Mizoguchi; Toshihito Mori; Masahito Nakayama
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 1978-07-13
Filing date: 1979-07-13
Publication date: 1980-01-24
Also published as: FR2430951A1; GB2028806B; FR2430951B1; GB2028806A; FR2457893B1; ES482443A1; NL7905464A; FR2457893A1; DE2928373C2; US4312858A; IT1122181B; US4329426A; IT7924358A0

Description

Es wurde ein ein Antibiotikum erzeugender Stamm der Gattung Streptomyces aus der Erde von Sannan-cho, Hikami-gun, Hyogo Prefecture, Japan, isoliert. Aufgrund der morphologischen
und physiologischen Eigenschaften sowie der Wachstumseigenschaften, wie hierin beschrieben, wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß es sich um eine neue Art der Gattung Streptomyces, bezeichnet als Streptomyces sp. KC-7038, handelt.
Der Stamm KC-7038 wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 4388, bei der American Type
Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31530 und bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter
der Nummer DSM 1594 hinterlegt.

Es wurde bestätigt, daß die von dem Stamm KC-7038 erzeugten Antibiotika keine in der Literatur beschriebenen Substanzen sind und daß sie eine antibakterielle Wirkung gegen grampositive Bakterien und gramnegative Bakterien haben. Die
antibiotische Substanz wurde als Substanz KA-7038 bezeichnet.

Weitere Untersuchungen haben ergeben, daß die Substanz KA-7038 in sieben Antibiotika, nämlich KA-7038I, KA-7038II,
KA-7038III, KA-7038IV, KA-7038V, KA-7038VI und KA-7038VII, aufgetrennt werden kann und daß diese leicht durch Behandlung mit Säuren in ihre Säureadditionssalze umgewandelt werden können.

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Aufgabe der Erfindung ist es, eine neue antibiotische Substanz KA-7038 und ihre Säureadditionssalze zur Verfügung zu stellen.

Durch die Erfindung soll weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Substanz KA-7038 zur Verfügung gestellt werder..

Durch die Erfindung soll weiterhin ein antibiotisches Mittel, das als Wirkstoff die Substanz KA-7038 enthält, zur Verfügung gestellt werden.

Durch die Erfindung soll weiterhin eine biologisch reine Kultur zur Verfügung gestellt werden, die dazu geeignet ist, die Substanz KA-7038 herzustellen.

Die erfindungsgemäße antibiotische Substanz KA-7038 kann durch die folgenden Strukturformeln I bis VTI angegeben werden.

Substanz KA-7O38I:

CH₂NHCH₃ NH₂

Die Substanz KA-7038I hat die folgenden chemischen und physikalischen Eigenschaften:

Molekularformel: 0..7H₃₅O₅N,-

spezifische Drehung: [aj^5 + 120,5° (c 1, H₉O)

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Schmelzpunkt: 83 bis 90⁰C IR-Spektrum: Figur 1

Substanz KA-7033II:

Forn.tl Ij

Die Substanz KA-703ÖII hat die folgenden chemischen und phy sikalischen Eigenschaften:

!•lolekularf ormel: C, ^KpgO/ K/ spezifische Drehung: iaJrp ^{+ 61}° (^{c 1}» ^H2⁰^ Schmelzpunkt: 85 bis 102 C IR-Spektrum: Figur 2

Substanz 1^-7038111:

CH₂NHCH₃

Formel

Die Substanz KA-7038III hat die folgenden chemischen und phy sikalischen Eigenschaften:

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Molekularformel: C^E spezifische Drehung: [a]p⁵ + 7&° (c 1, Schmelzpunkt: 74 bis 83⁰C IR-Spektrum: Figur 3

Substanz EA-7038IV:

CH₂NH₂

NH₅ OH

NH.

OCH-

NHCH

Formel IV

Die Substanz KA-7038IV hat die folgenden chemischen und plry sikalischen Eigenschaften:

Molekularformel: C^ zAn°5^N4 spezifische Drehung: [aJJp + 115° (c 0,1, H_£0)

Schmelzpunkt: 78 bis 82⁰C IR-Spektrum: Figur 4

Substanz KA-7038V:

OCH

NHCH₃

Formel V

Die Substanz KA-7038V hat die folgenden chemischen und physikalischen Eigenschaften:

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- 1,

Molekularformel: C₁4H₃₀O^K^

spezifische Drehung: [aJ^⁵ + 98° (c 0,5, H IR-Spektrum: Figur 5

Substanz KA-7038VI:

CH₂NHCH₃

OCH.

Formel VI

Die Substanz KA-7038VI hat die folgenden chemischen und physikalischen Eigenschaften:

Molekularformel: C₁ ,-E^ spezifische Drehung: [a IR-Spektrum: Figur 6

Substanz KA-7038VII:

+ 58° (c 1,

OCH.

NHCH.

Formel VII

Die Substanz KA-7038VII hat die folgenden chemischen und physikalischen Eigenschaften:

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Molekular formel: C-1ELz₀O. Ιϊ.

spezifische Drehung: [aJ^ + 59° (c 1, HpO) IR-Spektruin: Figur 7.

Die neue antibiotische Substanz gemäß der Erfindung kann hergestellt werden, indem man einen die antibiotische Substanz KA-703Ö erzeugenden Stamm der Gattung Streptomyces züchtet und die antibiotische Substanz KA-7038 aus der Kulturbrühe isoliert. Gewünschtenfalls können eine oder mehrere der antibiotischen Substanzen KA-703&I bis VII durch Auftrennung der resultierenden Substanz KA-7038 erhalten werden.

Nachfolgend werden die morphologischen und physiologischen Eigenschaften sowie die Wachstumseigenschaften des Stammes Streptomyces sp. KC-7038, welcher Stamm ein typisches Beispiel für einen die Substanz KA-7038 erzeugenden Stamm ist, angegeben. Wenn nichts anderes angegeben ist, dann wurden die Eigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien nach üblichen Methoden nach 21-tägiger Kultivierung bei 27°C beobachtet. Die Farben sind für die reife Kultur gemäß der Klassifizierung von "Color Harmony Manual" (Container Corp. Amer. 1958) angegeben.

I. Morphologische Eigenschaften:

Dieser Stamm erzeugt sowohl Substrathyphen als auch Lufthyphen. Das Luftmycelium ist in einfacher Weise verzweigt. Die Kette der reifen Sporen bildet kompakte Spiralen. Die Spiralen sind in zwei bis drei Umdrehungen ausgebildet. Es wird keine Bildung von Sporenträgern beobachtet. Die Sporen haben eine ovale bis zylindrische Gestalt mit den Abmessungen 0,5 bis 0,6 χ 0,8 bis 1,2 Mikron, wobei 20 oder mehr solcher Sporen auf jeder Sporenkette gebildet sind. Die Ober-

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fläche der Sporen ist leicht rauh, wird aber als glatt angesehen (weil kein klares skierotisches Körnchen gebildet ist).

II. Kultureigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien:

1. Saccharosenitratagar: Wachstum: gering, farblos

Luftmycelium: mäßig, pulverförmig, staubbraun (2. Ii) lösliches Pigment: keines

2. Glucose-Asparagin-Agar:

Wachstum: mäßig, cremefarben (1 1/2 ca) Luftmycelium: mäßig, pulverförmig, weiß (a) bis

staubbraun (2 Ii) lösliches Pigment: keines

3. Glycerin-Asparagin-Agar: Wachstum: gering, farblos Luftmycelium: gering, pulverförmig, weiß (a) losliches Pigment: keines

4. anorganisches Salz-Stärke-Agar: Wachstum: gut, perlförmig (3 ba) Luftmycelium: gut, pulverförmig, weiß (a) bis

silbergrau (3 fe) lösliches Pigment: keines

5. Tyrosin-Agar:

Wachstum: gut, elfenbeinfarben (2 db) Luftmycelium: mäßig, pulverförmig, weiß (a) lösliches Pigment: keines

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BAD ORIGINAL

6. Nähragar:

Wachstum: gut, lederfarben (2 fb) Luftmycelium: keines lösliches Pigment: keines

7. Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar: Wachstum: gut, hell-weizenfarben (2 ea) Luftmycelium: gering, pulverförmig, weiß (a) lösliches Pigment: keines

8. Hafermehlagar: Wachstum: mäßig, farblos

Luftmycelium: gut, pulverförmig, staubbraun (2 Ii) lösliches Pigment: keines

9 . Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar:

Wachstum: gut, cremefarben (1 1/2 ca)

Luftmycelium: keines

lösliches Pigment: schwach gelb

III. Physiologische Eigenschaften:

1. Wachstumstemperaturbereich: 17 bis 37°C

2. Gelatineverflüssigung: positiv

3. Stärkehydrolyse: positiv

4. Wirkung auf Milch: kein Wachstum

5. Bildung von Melanoidpigment: negativ

IV: Verwertung von Kohl ens to ff quellen:

Auf einem Pridham-Gottlieb-Agarmedium werden L-Arabinose, C-Xylose, D-Glucose, D-Fructose, Saccharose, Inosit, L-

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Rhamnose, Raffinose und D-Mannit nicht verwertet. Au Meditun, das durch Entfernen von Kupfersulfat von dem obigen Kulturmedium erhalten wird, werden D-Xylose und D-Glucose verwertet.

V. Zellwand:

LL-Diaminopimelinsäure wurde als Komponente der Zellwana gebildet.

Aufgrund der obigen Eigenschaften wird davon ausgegangen, daf. der Stamm KC-7038 zu der Gattung Streptomyces gehört. Arten, die Spiralsporenketten, weiße bis graue Luftmycelien und Sporen mit einer glatten Oberfläche enthalten und die kein lösliches Pigment erzeugen und weder Inosit noch Saccharose verwerten, wurden aus bekannten Stämmen, beschrieben in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage (1975), ISP-Stämmen von Shirling und Gottlieb und "The Actinomycetes" von Waksman, durch Screening ermittelt. Als Ergebnis wurden Streptomyces argenteolus (ISP 5226), Streptomyces griseolosuffucus (IMET JA 3708), Streptomyces griseofuscus (ISP und Streptomyces pyridomyceticus (ISP 5024) ermittelt.

Der Stamm KC-7038 unterscheidet sich jedoch eindeutig von Streptomyces argenteolus, Streptomyces griseolosuffucus und Streptomyces griseofuscus in der Verwertung von Kohlenstoff quellen mit Ausnahme von Inosit und Saccharose. Andererseits hat der Stamm KC-7038 mit Streptomyces pyridomyceticus die gemeinsame Eigenschaft, daß er auf dem Pridham-Gottlieb-Agarmedium nicht alle Kohlenstoffquellen verwertet. Die Stämme unterscheiden sich jedoch durch die folgenden Eigenschaften.

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Das Wachstum von Streptomyces pyridomyceticus auf verschiedenen Medien von ISP ist geringer als dasjenige des Stammes KC-7038 und es werden kaum Luftmycelien beobachtet. Der .Stamir. KC-7038 wächst nicht in einem Magermilchmedium und seine Gelatineverflüssigung ist positiv. Dagegen zeigt Streptonn^ces pyridomyceticus bei der Gelatineverflussigung ein negatives Ergebnis und der Stamm wächst in einem Magermilchmediuin. Die Stämme unterscheiden sich weiterhin hinsichtlich der Verwertung von Glucose und Saccharose in einem Pridham-Gottlieb-Medium, aus dem Kupfersulfat' entfernt worden ist. Auch die resultierenden Metaboliten unterscheiden sich voneinander.

Aus den obigen Versuchsergebnissen ist die Schlußfolgerung gezogen worden, daß der erfindungsgemäße Stamm in keine der bekannten Arten fällt und daß er eine neue Art ist. Er wurde von den Erfindern als Streptomyces sp. KC-7038 bezeichnet.

Der erfindungsgemäß verwendete Stamm kann durch künstliche Mutierungsmaßnahmen mutiert werden, beispielsweise mit Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen, verschiedenen Chemikalien, wie Nitrosoguanidinen, Nitrosoharnstoff oder Mitomycin etc. Alle solchen Mutanten, die die Fähigkeit haben, die antibiotische Substanz KA-7038 zu erzeugen, können erfindungsgemäß verwendet werden.

Durch die Erfindung wird weiterhin eine biologisch reine Kultur von Streptomyces sp. KC-7038 mit den Eigenschaften zur Verfügung gestellt, die als FERM-P Nr. 4388, ATCC Nr. 31530 oder DSM Nr. 1594 identifiziert sind, welche die Fähigkeit hat, die antibiotische Substanz KA-7038 durch Fermentation in einem Nährmedium zu erzeugen, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralien enthält.

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Geeignete Kulturmedien zur Züchtung des die Substanz KA-7036 erzeugenden Stammes der Gattung Streptomyces sind z.B. Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und als fakultative Bestandteile anorganische Salze (Mineralien), sehr kleine Mengen von Schwermetallen etc.

Verschiedene Kohlenstoffquellen können verwendet werden. Beispiele für bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Glucose, Stärke, Saccharose, Fructose, Dextrin, Molassen und Glycerin, die entweder allein oder als geeignete Gemische verwendet werden können, Kohlenwasserstoffe, Alkohole, organische Säuren und Pflanzenöle können gleichfalls verwendet werden, wenn der verwendete Stamm sie als Kohlenstoffquelle verwerten kann.

Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Peptone, Fleischextrakt, Maisquellflüssigkeit, Gasaminosäure, Distiller's lösliches Produkt, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff und Natriumnitrat, die entweder für sich oder als geeignete Gemische verwendet werden können. Beispiele für anorganische Salze sind Natriumchlorid, Nitrate, Calciumcarbonat, Kaliumchlorid, Kobaltchlorid und Eisen(II)-sulfat.

Anorganische Substanzen und organische Substanzen (z.B. Aminosäuren), die das Wachstum des Stammes fördern und die Bildung der Substanz KA-7038 fördern, können gleichfalls, wie erforderlich, zu dem Kulturmedium zugesetzt werden.

Bei Verwendung einer Belüftungskultivierungsmethode kann auch ein Antischaummittel, z.B. ein Fettsäureöl, Siliconöle, Baumwollsamenöl oder Paraffin, zu dem Kulturmedium zugesetzt werden.

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Die Kultivierung kann in einem festen Medium durchgeführt werden. Vorzugsweise wird jedoch, wie bei dem allgemeinen Herstellungsverfahren von Antibiotika, ein flüssiges Kultivierungsverfahren, insbesondere ein Tauchkultivierungsverfahren, angewendet. Die Kultivierung erfolgt unter aeroben Bedingungen, wobei die Kultivierungstemperatur vorzugsweise etwa 20 bis 35°C, mehr bevorzugt etwa 24 bis etwa 27⁰C, beträgt. Vorzugsweise wird während der Kultivierung der pH-Wert des Kulturmediums bei etwa 4 bis etwa 10 gehalten. Die Kultivierungszeit beträgt im allgemeinen etwa 2 Tage bis etwa 10 Tage.

Als Ergebnis der Kultivierung wird die Substanz KA-7038 erzeugt und sie sammelt sich in der Kulturbrühe an. Wenn die Menge der in der Kulturbrühe erzeugten Substanz KA-7038 ein Maximum erreicht, dann wird die Kultivierung abgebrochen. Die Substanz KA-7038 kann aus der Kulturbrühe gesammelt werden.

Da die Substanz KA-7038 eine wasserlösliche basische Substanz ist, die in Wasser löslich ist, jedoch in den üblichen organischen Lösungsmitteln nur schwer löslich ist, kann sie aus der Kulturbrühe durch Methoden abgetrennt werden, die üblicherweise zur Isolierung und Reinigung von in Wasser löslichen basischen Antibiotika angewendet werden. So kanr. z.B. ein Adsorptions-Desorptions-Verfahren unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes, von Aktivkohle etc., ein säulenchromatographisches Verfahren unter Verwendung von Cellulose, Silicagel, Aluminiumoxid etc., und ein Extraktionsverfahren unter Verwendung von Butanol, Amylalkohol etc., wobei eine höhere Fettsäure als Adjuvans verwendet wird, angewendet werden.

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Wenn beispielsweise das Filtrat der Rulturbrühe auf eine Säule eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes aufgegeben wird, dann wird die Substanz KA-7038 darauf adsorbiert. Die Substanz KA-7038 wird sodann durch Elution mit einen 0,1 bis 3,OH-Alkali oder Säure isoliert. Das resultierende aktive Eluat kann lyophilisiert werden, wodurch ein rohes Pulver der Substanz KA-7038 erhalten wird.

Beispiele für schwach saure Kationenaustauscherharze, die zur Gewinnung der Substanz KA-7038 geeignet sind, sind Amberlite IRC-50, IRC-84 und CG-50 (Röhm & Haas Co.) und Diaion WK-10 und WK-20 (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.). Beispiele für Alkalien, die zur Elution verwendet werden können, sind eine Ammoniumhydroxidlösung und eine wäßrige Natriurahydroxidlösung. Beispiele für geeignete Säuren sind Ameisensäure, Salzsäure und Schwefelsäure. Bei einem weiteren Beispiel für ein geeignetes Gewinnungsverfahren geht man so vor, daß man den pH-Wert des Filtrats der Kulturbrühe auf 7 bis 9 einstellt, das Filtrat mit Aktivkohle kontaktiert, um die Substanz KA-7038 an der Aktivkohle zu adsorbieren, und die Substanz mit saurem Wasser eluiert.

Die Substanz KA-7038, die nach den oben beschriebenen Verfahren isoliert werden kann, kann in die Substanzen KA-7038I, II, III, IV, V, VI und VII aufgetrennt werden, indem man sie in Wasser auflöst, auf eine Säule eines Adsorbens, wie eines schwach sauren Ionenaustauseherharzes des oben beschriebenen Typs oder eines schwach sauren Ionenaustauschers, wie CM-Sephadex oder CM-Cellulose, aufgibt, damit die Substanz an dem Adsorbens adsorbiert wird, und sodann mit einer wäßrigen Alkalilösung, wie z.B. verdünnter Ammoniumhydroxidlösung oder einer wäßrigen Lösung von Ammoniumcarbonat oder Ammoniumformiat, durch ein Gradientenverfahren

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oder ein stufenweise durchgeführtes Verfahren eluiert. Bei diesem Trennverfahren werden die Substanz KA-7038IV, die Substanz KA-7O38VII, die Substanz KA-7O3ÖI, die Substanz KA-7038II, die Substanz KA-7038VI, die Substanz KA-703S1II und die Substanz KA-7038V als freie Basen nacheinander abgetrennt,

Die aufgetrennten resultierenden Substanzen KA-7038I, II, III, IV, V, VI und VTI können durch Einengung des Eluats und Lyophilisierung des Kondensats in Pulverform überführt werden. Sie können durch Säulenchromatographie, beispielsweise auf Cellulose oder einem stark basischen Anionenaustauscherharz, gereinigt werden. So kann man z.B. in der Weise vorgehen, daß man das Pulver in Wasser löst, die Substanz auf einer Säule eines stark basischen Anionenaustauscherharzes, z.B. von Dowex 1x2 (Dow Chemical), adsorbieren läßt, sie mit entionisiertem Wasser eluiert, aktive Fraktionen sammelt und die gesammelten Fraktionen lyophilisiert. Diese Substanz KA-7038, die als freie Base erhalten wird, kann in ihre Säureadditionssalze durch Behandlung mit einer pharmazeutisch annehmbaren anorganischen oder organischen Säure umgewandelt werden. Beispiele für solche Säuren sind anorganische Säuren, wie Schwefelsäure, Salzsäure, Jodwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Kohlensäure, Salpetersäure etc., und organische Säuren, wie Essigsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Zitronensäure, Handelsäure und Bernsteinsäure.

Die Substanz KA-7038III hat die Strukturformel der Substanz KA-7038I, bei der die Glycylgruppe -COCH₂NH₂ abgespalten worden ist. Die Substanz KA-7038HI kann daher dadurch erhalten werden, daß man die Substanz KA-7038I mit Alkalien oder Säuren behandelt, um die Substanz KA-7038I zu zersetzen und sie in die Substanz KA-7038III umzuwandeln. Diese

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Umwandlung kann in der Weise bewirkt werden, daß man die Substanz KA-7038I mit einer 0,1 bis 4N-wäßrigen Lösung eines alkalischen Reagenses, z.B. von Natriumhydroxid oder Bariumhydroxid, oder mit einer 0,1 bis 1N-wäßrigen Lösung eines sauren Reagenses, wie Salzsäure oder Schwefelsäure, behandelt.

Bei Verwendung des alkalischen Reagenses kann ein stark basisches Anioner,aus taus cherharz [z.B. Amberlite IRA 400 (0H~- Form) oder Dowex 1x2 (OH"-Form)J zugesetzt werden und die Reaktion kann im suspendierten Zustand durchgeführt werden. Gleichermaßen kann bei Verwendung eines sauren Reagenses ein stark saures Kationenaustauscherharz, wie Amberlite 1R 120 (H⁺-Form) oder Dowex 50x8 (H⁺-Form), zugesetzt werden und die Reaktion kann im suspendierten Zustand durchgeführt werden. Die Reaktion kann gewöhnlich bei etwa 30 bis 100⁰C etwa 0,5 bis 3 h lang durchgeführt werden.

Nachstehend werden die physikalischen und chemischen Eigenschaften der neuen antibiotisehen Substanzen KA-7038I bis VII im Detail beschrieben.

Substanz KA-7058I (freie Base)

(D	Natur: weißes Pulver	5 5*	₅	9	H	N
(2)	Molekularformel: CL.^H,			8	,06	17,98
(3)	Elementaranalyse:	C			,71	17,64
		52	,42
	berechnet (%):	51	,98
	gefunden (%):

(4) Molekulargewicht: 389 (Massenspektrum)

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(5) Schmelzpunkt: 83 bis 90⁰C

(6) spezifische Drehung: [cc]²⁵ + 120,5° (c 1, H₂O)

(7) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Bei 220 bis 360 mm zeigt sich keine charakteristische Absorption. Es liegt nur eine terminale Absorption vor.

(8) Infrarotabsorptionsspektrum:

Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette ist als Figur 1 angegeben.

(9) Löslichkeit:

Sehr leicht löslich in Wasser. Leicht löslich in Methanol, wenig löslich in Äthanol, geringfügig löslich in Aceton. Unlöslich in Chloroform, Äthylacetat, Diäthyläther, Hexan und Petroläther.

(10) Farbre aktion:

Ninhydrinreaktion und Rydon-Smith-Reaktion: positiv; Sakaguchi-Reaktion, Eisen(III)-chlorid-Reaktion und Fehling-Reaktion: negativ.

(11) Stabilität: stabil bei einem pH-Wert von 2,0 bis 8,0.

(12) Kernmagnetisches Resonanz spektrum (&_{D Q}, ppm): 2,75 (3H, s, 6«- N-

3,12 (3H, s, 4- N-

3,45 (3H, s, OCH₃ )

4,06 (2H, s, COCH₂N)

5,32 (1H, d, Jr=3,5 Hz, anomerischer H)

(13) Massenspektrum (m/e):

390 (M⁺ + 1), 360, 276, 258, 230,

(14) Papierchromatographie: Rf-Wert: 0,86 Filterpapier: Whatman Nr.

909884/0906

!lösungsmittel: untere Schicht von Chloroform/Metha- nol/17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

(15) Dünnschichtchromatographie:

Es wurde eine TLC-Aluminiumplatte (Silicagel 60 R-₂54 0,2 mm) (Merck & Co., Inc.) verwendet.

Rf-Wert Lösungsmittel

0,61 Butanol/Äthanol/Chloroform/11% Ammoniumhydroxid (4:5:2:5)

0,60 Chloroform/Methtnol/1796 Ammoniumhydroxid (1:8:3)

0,16 untere Schicht von Chloroform/Methanol/17/ό Ammoniuir;-hydroxid (2:1 : 1)

0,87 obere Schicht von Chloroform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (2:1 : 1)

Substanz KA-7058II (freie Base)

(1) Natur: weißes Pulver

(2) Molekularformel: C, ,H^O^N^

(3) Elementaranalyse:

C H N

berechnet (#): 51,30 9,27 18,41 gefunden (#): 51,12 8,87 18,10

(4) Molekulargewicht: 304 (Massenspektrum)

(5) Schmelzpunkt: 8,5 bis 102°C

(6) spezifische Drehung: Ca]Jp + 61° (c 1, H₂O)

(7) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Bei 220 bis 360 nm zeigt sich keine charakteristische Absorption. Es liegt lediglich eine terminale Absorption vor.

²⁵ 2923373

(8) Infrarotabsorptionsspektrum:

Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette ist als Figur 2 dargestellt.

(9) Löslichkeit:

(10) Farbreaktion:

(11) Stabilität: stabil bei einem pH-Wert von 2,0 bis 9,0.

(12) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (6_{D Q}, ppm):

2.83 (3H, s, N-CH^)

5.84 (1H, d, J=3,5 Hz, anomerischer H)

(13) Massenspektrum (m/e):

305 (M⁺ +1), 214, 205, 177,

(14) PapierChromatographie: Rf-Wert: 0,18
Filterpapier: Whatman Nr. 1

Lösungsmittel: untere Schicht von Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

(15) Dünnschichtchromatographie:

Es wurde eine TLC-Aluminiumplatte (Silicagel 60 R054 0,2 mm) (Merck & Co., Inc.) verwendet.

909884/0906

Rf-Wert Lösungsmittel

0,43 Butanol/Äthanol/Chloroform/17% Ammoniumhydroxid (4:5:2:5)

0,44 Chloroform/Methanol/l7?o Ammoniumhydroxid (1:6:5)

0,06 untere Schicht von Chlorοform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

0,73 obere Schicht von Chloroform/Methanol/17?ü Ammoniumhydroxid (2:1 : 1)

Substanz KA-7038III (freie Base)

(1) Natur: weißes Pulver

(2) Molekularformel: C₁ ^H·^⁰^^

(3) Elementaranalyse:

CHN

berechnet (%): 54,19 9,70 16,85 gefunden (#): 53,84 9,38 16,50

(4) Molekulargewicht: 332 (Massenspektrum)

(5) Schmelzpunkt: 74 bis 83⁰C

(6) spezifische Drehung: [etJ^⁵ + 78° (c 0,5, H₂O)

(7 ) UltraviolettabsorptionsSpektrum:

Bei 220 bis 36Ο nm wird keine charakteristische Absorption gezeigt. Es liegt lediglich eine terminale Absorption vor.

(8) Infrarotabsorptionsspektrum:

Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette ist als Figur 3 dargestellt.

(9) Löslichkeit:

Sehr leicht löslich in Wasser. Leicht löslich in Hethanol, wenig löslich in Äthanol, geringfügig löslich in Aceton. Unlöslich in Chloroform, Äthylacetat, Diäthyläther, Hexan und Petroläther.

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(10) Farbreaktion:

Ninhydrin-Reaktion und Rydon-Smith-Reaktion: positiv; Sakaguchi-Reaktion, Eisen(III)-chlorid-Reaktion und Fehling-Reaktion: negativ.

(11) Stabilität: stabil bei einem pH-Wert von 2,0 bis 9,0

(12) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (<$_{D Q}, ppm): als HCl-SaIz ²

2,73 (3H, s, 6'- N-CH^)

2,83 (3H, s, 4- N-C

3,46 (3H, s, OCH,)"

5,43 (IH,. d, J=3,5 Hz, anomerischer H)

(13) Massenspektrum (m/e):

333 (M⁺ +1), 332, 283, 230, 219, 19i, 143

(14) Papierchromatographie: Rf-Wert: 0,92 Filterpapier: Whatman Nr. 1

Lösungsmittel: untere Schicht von Chloroform/Methanol/ 1790 Ammoniumhydroxid (2 : 1:1)

(15) Dünnschichtchromatographie:

Es wurde eine TLC-Aluminiumplatte (Silicagel 60 F054 0,2 mm) (Merck & Co., Inc.) verwendet.

Rf-Wert Lösungsmittel

0,65 Butanol/Äthanol/Chloroform/17% Ammoniumhydroxid (4:5: 2 : 5)

0,61 Chloroform/Methanol/i7# Ammoniumhydroxid (1 : 8 : 3)

0,35 untere Schicht von Chloroform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

0,84 obere Schicht von Chloroform/Methanol/17% Ammoniuinhydroxid (2 : 1 : 1)

Substanz'KA-7058IV (freie Basis)

(1) Natur: weißes Pulver

(2) Molekularformel: C₁ ^H₃₀O₅

(3) Elementaranalys e:

	(%):	C	28	9	H	N	75
berechnet	00:	50,	89	8	,04	16,	45
gefunden	49,		,91	16,

(4) Molekulargewicht: 334 (Massenspektrum)

(5) Schmelzpunkt: 78 bis 82°C

(6) spezifische Drehung: O]^⁵ + 115° (c 0,1, Η_£0)

(7) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

(8) Infrarotabsorptionsspektrum:

Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette ist als Figur 4 dargestellt.

(9) Löslichkeit:

(10) Farbreaktion:

Ninhydrinreaktion und Rydon-Smith-Reaktion: positiv; Sakaguchi-Reaktion, Eisen(III)-chlorid-Reaktion und Fehling-Reaktion: negativ

(11) Stabilität: stabil bei einem pH-Wert von 2,0 bis 8,0

(12) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (6_{D 0}, ppm):

909884/0906

(als freie Base)

2,47 (3H, s, H-CH₅) 3,43 (3H, s, O-CH,)

5,08 (1H, d, anomerischer H) (als HCl-SaIz)

2,72 (3H, s, N-CH^)

3,37 (3H, s, Q-CH₃)

5,44 (1H, d, anomerischer H) _:

(13) Massenspektrum (m/e):

335 (M⁺ + 1), 235, 207, 189,

(14) PapierChromatographie: Rf-Wert: 0,63 Filterpapier: Whatman Nr.

Lösungsmittel: untere Schicht von Chloroform/Methanol/

17% Ammoniumhydroxid (2 : 1 : 1)

(15) Dünnschichtchromatographie:

Es wurde eine TLC-Aluminiumplatte (Silicagel 60 Fp_cλ 0,2 mm) (Merck & Co., Ine.) verwendet.

Lösungsmittel

Butanol/Äthanol/Chloroform/17% Ammoniumhydroxid (4:5:2:5)

Chlorof orm/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (1 : 8 : 3) untere Schicht von Chloroform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (2 : 1 : 1)

0,85 obere Schicht von Chlorof orm/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (2 : 1 : 1)

Substanz KA-7038V (freie Base)

(1) Natur: weißes Pulver

(2) Molekularformel: C^H^qO^I^

Rf-Wert	,56
0	,62
0	,13
0

909884/0906

(3) Elementaranalyse:

C H N

berechnet (%): 52,81 9,50 17,60

gefunden (#): 52,70 9,33 17,41

(4) Molekulargewicht: 318 (Massenspektrum)

(5) spezifische Drehung: |>]p⁵ + 98° (c 0,5, H_£0)

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Bei 220 bis 360 nm wird keine charakteristische Absorption gezeigt. Es liegt lediglich eine terminale Absorption vor.

(7) Infrarotabsorptionsspektrum:

Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette ist als Figur 5 dargestellt.

(8) Löslichkeit:

Sehr leicht löslich in Wasser. Leicht löslich in Methanol, wenig löslich in Äthanol, geringfügig löslich in Aceton. Unlöslich in Chloroform, Äthylacetat, Diäthylather, Hexan und Petroläther.

(9) Farbreaktion:

(10) Stabilität: stabil bei einem pH-Wert von 2,0 bis 9,0

(11) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (l>y. q, ppm): (als freie Base)

2.35 (3H, s, N-CH₃)

3.36 (3H, s, O-CH3)

5,12 (1H, d, anomerischer H) (als HCl-SaIz) 2,78 (3H, s, N-CH,)

909884/0906

3,43 (3H, s, 0-CH_x) 5,76 (1H, d, anomerischer H)

(12) Massenspektrum (m/e):

319 (M⁺ + 1), 219, 191, 173,

(13) Papierchromatographie:

Rf-Wert: 0,82 >

Filterpapier: Whatman Nr. 1

Lösungsmittel: untere Schicht von Chloroform/Methanol/

17% Ammoniumhydroxid (2 : 1 : 1)

(14) Dünnschichtchromatographie:

Es wurde eine TLC-Aluminiumplatte (Silicagel 60 Fp,-, 0,2 mm) (Merck & Co., Inc.) verwendet.

Rf-Wert Lösungsmittel

0,57 Butanol/Äthanol/Chloroform/1796 Ammoniumhydroxid (4 : 5 : 2 : 5)

0,55 Chloroform/Methanol/179έ Ammoniumhydroxid (1:8:3)

0,25 untere Schicht von Chloroform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (2:1:1)

0,81 obere Schicht von Chloroform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (2:1 : 1)

Substanz KA-7038VI (freie Base )

(1) Natur: weißes Pulver

(2) Molekularformel: Oj,-H-Z₂ ⁰ZfN^

(3.) Elementaranalyse:

C H N

berechnet (%): 54,19 9,70 16,85

gefunden (%)i 53,83 9,87 16,59

(4) Molekulargewicht: 332 {Massenspektrum)

9 0a884/0906;

(5) spezifische Drehung: [α]ρ⁵ + 58° (c 1, K₂O)

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

(7) Infrarotabsorptionsspektrum:

Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette ist als Figur 6 dargestellt.

(8) Löslichkeit:

(9) Farbreaktion:

Ninhydrinreaktion und Rydon-Smith-Reaktion; positiv; Sakaguchi-Reaktion, Eisen (III )-chlorid-Reaktion und Fehling-Reaktion: negativ

(10) Stabilität: stabil bei einem pH-Wert von 2,0 bis 8,0

(11) Kernmagnetisches Resonanzspektrtun («f^ ₀, ppm): 2,87 (3H, s, 6'-N-CH,) ²

2,93 (3H, -β-, 4-N-CO

3,&7 (3H_t ε, 0-ChJT

5,57 (1H, d, anomerischer H)

(12) Massenspektrum (m/e):

333 (M⁺ + T), 332, 283, 230, 219, 19t, 143

(13) PapierChromatographie:
Rf-Wert: Q,91
Filterpapier: Whatman Nr, 1

Lösungsmittel; untere Schicht von Chloroform/Methanol/

AmmoniuTnhydroxid (2:1:1)

909884/0906

(14) Dünnschichtchromatographie:

Es wurde eine TLC-Aluminiumplatte (Silicagel 60 0,2 mm) (Merck & Co., Inc.) verwendet.

Rf-Wert Lösungsmittel

0,63 Butanol/Äthanol/Chloroform/17% Ammoniumhydroxid (4:5:2: 5)

0,60 Chloroform/Methanol/17% Ammoniumhydroxid (1 : 8 : 3)

0,29 untere Schicht von Chlorof orm/Methanol/17% Ammonrunihydroxid (2:1:1)

0,62 obere Schicht von Chloroform/Methanol/17%Ammoniumhydroxid (2:1:1)

Substanz KA-7038VII(freie Base)

(1) Hatur: weißes Pulver

(2) Molekularformel: C^H^qO^N^

(3) Elementaranalyse:

CHN

berechnet (%): 52,81 9,50 17,60 gefunden (#):'. 52,50 9,78 17,41

(4) Molekulargewicht: 318 (Massenspektrum)

(5) spezifische Drehung: [oc]ß⁵ + 59° (c 1, H₂O)

(6) Ultraviolettäbsorptionsspektrum:

(7) ■ Infrarotabsorptionsspektrum:

Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette ist als Figur 7 gezeigt.

9098 84/0906

(8) Löslichkeit:

(9) Farbreaktion:

Ninhydrinreaktion und Rydon-Smith-Reaktion: positiv; Sakaguchi-Reaktion, Eisen(III )-chlorid-Reaktion und Fehling-Reaktion: negativ.

(10) Stabilität: stabil bei einem pH-Wert von 2,0 bis 9,0

(11) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (&~ ~, ppm): 2,92 (3H, s, N-CH,)

3,93 (3H, s, Q-CH₅)

5,63 (1H, d. anomerischer H)

(12) Massenspektrum (m/e):

319 (M⁺ + 1), 219, 191, 173,

(13) Papierchromatographie: Rf-Wert: 0,65
Filterpapier: Whatman Nr. 1

Lösungsmittel: untere Schicht von Chloroform/l-Iethanol/ 1790 Ammoniumhydroxid (2:1:1)

(14) Dünnschichtchromatographie:

Es wurde eine TLC-Aluminiumplatte (Silicagel 60 ^23k 0,2 mm) (Merck & Co., Inc.) verwendet.

909884/0 906

Rf-Yi er t Lösungsmittel

0,62 tnitanol/Äthanol/Cl-iloroiorni/iTi. iunnonlunihydroxiG

(4:5:2:5) - ."

0,6.1 Chloroform/He thanol/17>oAmmoniuinhydroxid (1 : 6 : V 0,28 untere Schicht von Chloroiorn/Kethanol/17^" Anaaoniu: -

/hydroxid (2:1:1)

0,63 obere Schicht von Chloroform/Methanol/17/j Ammoniur._;-hydroxid (2:1:1)

Die Rf-Vi erte bei der Papier Chromatographie der neuen antibiotischen Substanzen KA-7038I bis VTI sind in tabelle I im Vergleich zu den entsprechenden Werten von bekannten Antibiotika zusammengestellt. Ähnliche Vierte, erhalten durch Dünnschichtchromatographie, sind in Tabelle II zusaniEengestellt.

Es hat sich gezeigt, daß die Substanz KA-705Ö sich hinsichtlich ihrer physikochemischen Eigenschaften stark_ von den IZanamycinen A, B und C, von Tobramycin, Paromomycin, Heomycinen A, B und C, von den Butirosinen A und B₁ von den Lividonycinen A und B, von Ribostamycin, Xylostatin, Apramj'-ein,
den Gentanieinen A und E und von Sorbistin und von der antibiotischen Substanz Kr. 460, weiche bekannte rechtsdrehende wasserlösliche basische antibiotische Substanzen sind, unterscheidet. Die Substanz KA-705S unterscheidet sich weiterhin von den in den Tabellen I und II angegebenen bekannten
Antibiotika hinsichtlich der Rf-Vierte bei der Papierchromatographie und der DünnschichtchromatGgraphie.

90988A/0906 BAD

Tabelle I

Rf-Werte der Substanzen KA-7038 und von bekannten Antibiotika Lösungsnilttelsystem: untere Schicht von Chloroforir/Hetha-

nol/17% Ammoniumhydroxid' (2 : 1 : 1) Filterpapier: Whatman Nr. 1

Antibiotikum

KA-7058I KA-7038II KA-7O3Ö-III KA-7036IV KA-7038V KA-7038VI KA-7038VII

KA-6606II KA-6606III KA-6606I:V KA-6606V KA-66O&YI Gentamicin C Gentami ein Gentamicin C

t 2 1a

Sisomicin Verdamicin G-52

Fortimicin A Fortimicin B Andere (*1)

(*1): Andere bedeutet Kanamycin A, B, und C, Paromomycin, neomycin A, B und C, die Butirosine A und E, Lividomycin A

Rf-Viert

0

Ο":

0

o,

-O₁

o.

O₁

o,

O₁

■o,

o,

o.c

,8t

,18

,92

,63

,82

,91

,65

,27

,91

,9-

CC
I ** —

I- -^ -

12

49

52

89

» - C,Oi

90988A/G906

und B, Ribostamycin, Xylostatin, Gentamicin A und B, Tobramycin, Apramycin, Sorbistin, die antibiötische Substanz 460, Hygromycin bzw. Destomycin.

Tabelle II -

Rf-Werte der Substanzen KA-7038 und von bekannten Antibiotike Lösungsmittelsvstem

Lösungsmittel a: Butanol/Äthanol/Chloroform/I7?ü Ammoniumhydroxid (4:5:2:5) Lösungsmittel b: Chloroform/Methanol/l7& Ammoniumhydroxid

(1:8:3)
Platte

TLC-^Aluminiumplatte (Silicagel 60 F₂₅^₊ °»2 mm) (Merck & Co., Inc.)

Antibiotikum Rf-Wert

Lösungs- Lösungsmittel a mittel b

KA-7038I KA-7038II KA-7038III KA-7038IV KA-7033V KA-7038VI KA-7038VII KA-6606I ' . ■' KA-6606II KA-6606III KA-66O6IV KA-6606V KA-6606VI Gentamicin C^

Gentamicin Co

0,61	0,60
0,43	0,44
0,65	0,61
0,56	0,62
0,57	■ 0,55
0,63	0,60
0,62	0,61
0,56	0,60
0,57	0,52
0,55	0,64
0,56	0,66
0,64	0,61
0,69	0,73
0,52	0,40
0,51	0,44

909884/09 0 6

Fortsetzung Tabelle II

0,43	0	,34
0,45	0	,32
0,53	0	,56
0,60	0	,70

Gentamicin C. Sagamicin
Fortimicin A Fortimicin B

Die antimikrobiellen Spektren der neuen antibiotischen Substanzen KA-7038I bis VII sind in Tabelle III zusammengestellt.

909884/0906

Staphylococcus, aureus Staphylococcus aureuö Smith ,Bacillus· subtil in ATGp, fo6,33 Bacillus cereus Bacillus anthracin Streptococcus feacalis , Escheriehia coli NIHJ Escherichia coli 111/141Ö Escherichia coli Mtl41QFUQI (gegenüber Kanamycin, Streptomycin Uji<3· Lividomycin resistant) Escherichia coli, ML141QR*82,, (gegenüber Kanamycin, Streptomycin Butirosin resistant)

Escherichia coli ML1i (gegenüber Gentamyciftj Kanamycin reslstent)

Proteus vulgaris 0X19 Klebsiella pneumoniae, Pseudoraonas aerüffinosa Proteus inconstans Serratia sp. , Mycobacterium smef^nati^ . kTO'C

602

Tabelle	III	in	IV	V	VI	VII	I	TSJ CD
I '	II	25	,25	50	25	50	I VjJ VO	CX)
1*5	50	6	12	25	6	,' ■ 25	I	-J U)
0,4	25,	12	„ 3	3	12	, 6.
0,2	6	100	50	50	100	50
■','■3	100		1,5	1,	5 6	3
0,4	3	>1Q0	>1Q0	>1Q0	MQO	MOO
>1OO	MOO	100	50	50	100	100
6	100	MOQ,	MOO	>100	yiQO	MOO
12	„noo	MOQ	>1OQ	MOO	MOO	MOQ
50	MOO	MQO	>100	MOO	>100	* 100
25.	MOO	>1Q0	MOO	MOO	>1OQ	>100
'12	MQO	100	50	50	100	100
6	100	MOO	100	>1Q0	100	100
6	100	>100	100	MQO	100	;>10Q
6	100	MOO	MOO	MOO	MOO	>1OO
12	MOO	50	>1O0	>1OO	MOO	MQO
6	MQQ	MQO	MQO	>100	>100	>1OO
VjJ	MOO

Die akuten Toxizitäten der erfindungsgemäßen Substanzen KA-7038I bis VII, bestimmt bei der Maus, sind wie folgt:

¹^₅O	I	II	III	IV	V	VI	VII
(mg/kg)
i.v.	>100	>300	>300	>300	>300	>300	>300
(mg/kg)
SC.	>400	>600	>600	>600	>600	>600	>600

Durch die Erfindung wird weiterhin ein antibiotischeε Mittel zur Verfügung gestellt, das aus (1) einer antibiotisch wirksamen Menge einer antibiotischen Substanz KA-7038, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Verbindungen mit den angegebenen Formeln I bis VII, Gemischen davon und pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzen davon und (2) einen pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger besteht.

Die Menge der Verbindung (1) beträgt beispielsweise etwa 0,01 bis etwa 99»5 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Mittels.

Das erfindungsgemäße antibiotische Mittel kann in jeder beliebigen, üblicherweise verwendeten Dosierungsform angewendet werden, wobei jedoch injizierbare Zubereitungen und Kapseln besonders bevorzugt werden.

Vorzugsweise wird ähnlich, wie bei bekannten wasserlöslichen basischen Antibiotika, eine injizierbare Zubereitung in der Weise hergestellt, daß man ein lyophilisiertes Pulver des Antibiotikums in ein Gläschen, vorzugsweise zusammen mit einem Stabilisator, einfüllt und daß man beim Gebrauch den Inhalt des Gläschens in einer Auflösungsflüssigkeit für die Verabreichung auflöst.

909884/0906

BAD

Geeignete Verdünnungsmittel oder Träger sind z.B. flüssige Verdünnungsmittel, wie destilliertes Wasser zur Injektion und eine physiologische isotonische Lösung, oder feste Träger/ wie Lactose, Stärke, weißer Zucker, Glucose, kristalline Cellulose, Calciumcarbonat, Kaolin, D-Mannit, Magnesiummetasilicataluminat, Calciumsulfat, Calciumphosphat und Bentonit. Die Zugabe von Stabilisatoren, wie z.B. von Natriumhydrogenbisulfit, wird gleichfalls bevorzugt.

Die Dosierung der erfindungsgemäßen antibiotischen Substanz kann in geeigneter Weise ausgewählt werden und beispielsweise etwa 0,01 bis etwa 100 mg/kg/Tag betragen.

Somit können erfindungsgemäß antibiotische Mittel für Tiere, wie Geflügel, Haustiere und gezüchtete Fische, und für den Menschen zur Verfügung gestellt werden. Diese Mittel sind als antibakterielle Mittel mit breitem antibakteriellen Spektrum geeignet.

Die erfindungsgemäße Substanz KA-7038 ist auch als Material für die Herstellung ihrer Derivate geeignet.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Beispiel 1

Der Stamm Streptomyces KC-7038 wurde in ein sterilisiertes Kulturmedium eingeimpft, das aus h% Stärke, 0,5% Sojabohnenmehl, 4% Maisquellflüssigkeit, O,O5?6 Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,3?oNatriumchlorid und 0,1% Calciumcarbonat bestand. (Der pH-Wert war vor der Sterilisierung auf 7,0 eingestellt worden.) Der Stamm wurde etwa 48 h bei 27⁰C vorkultiviert, um einen ersten Impfstamm zu bilden.

90 988 kl 0906

Ein 200-1-Tank wurde mit 100 1 eines Kulturmediums beschickt, das in der Weise erhalten worden war, daß 1% Baumwo 11 samen öl zu dem gleichen Kulturmedium, wie bei der Herstellung der Impfkultür verwendet, zugesetzt worden war. Sodann wurden 500 ml des ersten Impfmaterials eingeimpft und es wurde 4 Tage bei 27°C unter Belüften und Rühren (220 Upm, Fließgeschwindigkeit von Luft 50 l/min) kultiviert.

Nach der Fermentation wurde zu der Fermentationsbrühe verdünnte Schwefelsäure zugesetzt, um ihren pH-Wert auf 2,0 einzustellen. Dicalite (Dicalite Orient Co., Ltd.) wurde als Filterhilfsmittel zugesetzt und die Mycelien wurden durch Filtration entfernt. Eine verdünnte wäßrige Natriumhydroxidlösung wurde zu dem FiItrat zugegeben, um den pH-Wert auf 6,2 einzustellen. Das Filtrat wurde durch eine Säule von Amberlite IRC-50 (NK^⁺-Form), eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes, geleitet. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das adsorbierte Material mit 1N-Ammoniaklösung eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert, wodurch 9» 7 g eines rohen Pulvers der Substanz KA-7038 erhalten wurden.

9,7 g des rohen Pulvers wurden in 1 1 destillierten Wassers aufgelöst und die Lösung wurde mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Lösung wurde sodann durch eine Säule (3 x 150 cm) eines Kationenaustauscherharzes CH-Sephadex C-25 (NH/⁺-Form) hindurchgeleitet und sodann wurde mit Wasser gewaschen. Das adsorbierte Material wurde mit einer Geschwindigkeit von 60 ml/h eluiert, wobei eine Konzentrationsgradientenmethode zwischen 5 1 einer 0,05N-Ammoniaklösung und 5 1 einer 0,5N-Ammoniaklösung angewendet wurde. Die Eluate wurden zu Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 30 ml fraktioniert. Die Aktivität jeder

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Fraktion wurde durch eine Papierscheibenmethode unter Verwendung einer Agarplatte von Bacillus sutrtilis gemessen.

Aktive Fraktionen Nr. 96 bis 112 wurden lyophilisiert, wodurch 0,65 g eines rohen Pulvers, das die Substanz KA-7038 enthielt, erhalten wurden. Die Lyophilisierung der aktiven Fraktionen Nr. 113 bis 134 lieferte 0,4 g eines rohen Pulvers der Substanz KA-7038I und der Substanz KA-7038VII. Die Lyophilisierung der Fraktionen Nr. 135 bis 149 lieferte 0,36 g eines rohen Pulvers eines Gemisches aus der Substanz KA-7038I, der Substanz KA-7038II und der Substanz KA-7033VI. Weiterhin wurden 0,9 g der freien Base der Substanz KA-7038III aus den Fraktionen Nr. 150 bis 172 erhalten.

Sodann wurden 0,12 g eines rohen Pulvers der Substanz KA-7038V aus den aktiven Fraktionen Nr. 173 bis 212 erhalten.

Eine Probe der Substanz KA-7038 (0,65 g) wurde als gleichförmige Schicht auf eine Säule aufgefüllt, die mit 300 ml Cellulosepulver gepackt war. Es wurde mit einer unteren Schicht eines Chloroform/Methanol/17% Ammoniaklösung-Gemisch (2 ; 1 : 1) als KLuierungsmittel mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/h eluiert. Das Eluat wurde zu Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 10 ml fraktioniert und die Aktivität jeder Fraktion wurde in ähnlicher Weise, wie oben beschrieben, gemessen. Aktive Fraktionen wurden zur Trockene konzentriert und als gleichförmige Schicht auf eine Säule aufgebracht, die mit 160 ml Silicagel gepackt war. Unter Verwendung der unteren Schicht eines Gemisches aus Chlorof orm/Methanol/17% Ammoniaklösung (2 : 1 : 1) als KLuierungsmittel wurde mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/h eluiert. Das Eluat wurde zu Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 3 ml fraktioniert und die Aktivität je-

909884/0906

der Fraktion wurde in gleicher Weise, wie oben beschrieben, gemessen. Fraktionen, die die Substanz KA-7038IV enthielten, wurden nach der Elution von ein oder zwei geringfügigeren Komponenten gesammelt und das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in 20 nl Wasser aufgelöst und durch eine Säule geleitet, die mit 5 ml •eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes CK-Sephadex C-25 (NH^⁺) gepackt war. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das adsorbierte Material mit 0,5N-Ammoniaklösung eluiert und die aktiven Fraktionen wurden gesammelt. Die Lyophilisierung der aktiven Fraktionen lieferte 0,01 g der freien Base der Substanz KA-7038IV als farbloses amorphes Pulver.

Ein rohes Pulver (0,4 g) eines Gemisches aus der Substanz KA-7038I und der Substanz KA-7038VII wurde als gleichförmige Schicht auf eine Säule aufgebracht, die mit 200 ml Cellulose gepackt war, und es wurde chromatographiert, wobei die untere Schicht eines Chloroform/Methanol/17% Ammoniaklösung-(2 : 1 : 1)-Gemisches als Eluierungsmittel verwendet wurde. Dann wurde die Substanz KA-7Q38I und hierauf die Substanz KA-7038VII eluiert. Die Fraktion, die die Substanz KA-7038VII enthielt, wurde zur Trockene konzentriert und erneut in Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde auf einer Säule mit 15 ml eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes CM-Sephadex C-25 (NK^-Form) adsorbieren gelassen. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das adsorbierte Material nach der Konzentrationsgradientenmethode zwischen 300 ml von 0,04N-Ammoniaklösung und 300 ml von 0,4N-Ammoniaklösung eluiert. Fraktionen, die die Substanz KA-7038VII enthielten, wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 0,01 g der freien Base als farbloses Pulver erhalten wurden.

909884/0906

Als andererseits Fraktionen, die die Substanz KA-7038I enthielten, zur Trockene konzentriert wurden, wurden 0,31 g eines rohen Pulvers der Substanz KA-703ÖI erhalten. Das rohe Pulver wurde in destilliertem Wasser aufgelöst und auf einer Säule adsorbieren gelassen, die mit 1000 ml eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes CM-Sephadex C-25 (ΝΗλ^-^οππ) gepackt war. Dänach wurde mit Wasser gewaschen. Das adsorbierte Material wurde durch eine Konzentrationsgradientenmethode zwischen 2,25 1 Wasser und 2,25 1 0,5W-Ammoniaklösung eluiert. Die Aktivität jeder Fraktion wurde gemessen. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 0,21 g der freien Base der Substanz KA-7038I als farbloses amorphes Pulver erhalten wurden.

Ein Gemisch (0,26 g) der Substanz KA-7038I, Substanz KA-7038II und der Substanz KA-7038VI wurde als gleichförmige Schicht auf eine Säule aufgebracht, die mit 300 ml Cellulosepulver gepackt war. Es wurde unter Verwendung der unteren Schicht eines Gemisches aus Chloroform/Methanol/17% Ammoniaklösung (2 : 1 : 1) mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/h eluiert. Das Eluat wurde zu Fraktionen mit jeweils einem Volumen von 10 ml fraktioniert. Die Aktivität jeder Fraktion wurde nach der gleichen Methode wie oben gemessen. Als Ergebnis wurde die Substanz KA-7038VI als erste eluiert, worauf die Substanz KA-7038I und die Substanz KA-703&II nacheinander eluiert wurden.

Die aktiven Fraktionen der Substanz KA-703SII wurden gesammelt und das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde erneut in 20 ml Wasser aufgelöst und durch eine Säule geleitet, die mit 5 ml schwach saurem Kationenaustauscherharz CM-Sephadex C-25 (NH/^) gepackt war. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das adsor

4/0906

bierte Material mit O,5H-Ammoniaklösung eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 0,05 ρ der freien Base der Substanz KA-7033II als farbloses amorphes Pulver erhalten wurden.

Fraktionen, die die Substanz KA-703ÖVI enthielten, wurden gesammelt und das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde erneut in 100 ml Wasser aufgelöst und durch eine Säule geleitet, die mit 40 ml schwach saurem Kationenaustauscherharζ CM-Sephadex C-25 (NH^-Form) gepackt war. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das adsorbierte Material durch ein Konzentrationsgradientenverfahren zwischen 500 ml 0,1N-Ammoniaklösung und 500 ml einer 0,5N-Ammoniaklösung eluiert. Fraktionen, die die Substanz KA-703ÖVI enthielten, wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 0,07 g der freien Base der Substanz KA-703SVI erhalten wurden.

Das rohe Pulver (0,12 g) der Substanz KA-7038V wurde in destilliertem Wasser aufgelöst und auf einer Säule adsorbieren gelassen, die mit 1000 ml eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes CM-Sephadex C-25 (KH^⁺-Form) bepackt war. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das adsorbierte Material durch ein Konzentrationsgradientenverfahren zwischen 2,25 .1 Wasser und 2,25 1 0,5N-Ammoniaklösung eluiert.

Die Aktivität der einzelnen resultierenden Fraktionen wurde wie oben gemessen. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wodurch 0,02 g einer freien Base der Substanz KA-7028V als farbloses amorphes Pulver erhalten wurden.

Beispiel 2

Das lyophilisierte Pulver der Substanz KA-7038I, erhalten

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im Beispiel 1, (100-g-Einheiten) wurde in 500 ml Wasser aufgelöst, und mit verdünnter Schwefelsäure versetzt, um den pH-Wert auf 5,0 bis 7,0 einzustellen. Die Lyophilisierung der Lösung ergab 160 g eines Pulvers der Substanz KA-703oI, Sulfat.

Beispiel 3

Das lyophilisierte Pulver der Substanz KA-7038I, Sulfat (20-g-Einheiten) und 200 mg Natriumhydrogensulfit wurden gleichförmig miteinander vermischt und das Gemisch wurde in 100 Glaschen gegossen. Die einzelnen Gläschen enthielten 200 mg (Einheiten) der Substanz KA-7038I, Sulfat. Vor dem Gebrauch wurde die Lösung in einem Gläschen in 2 bis 5 ml destillierten Wassers zur Injektion aufgelöst. Die Lösung kann intramuskulär oder intravenös verabreicht werden oder sie kann intravenös als Gemisch mit einer Nährinfusion infundiert werden.

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-lit-

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Claims

KRAUS & WEI3ERT

PATENTANWÄLTE

DR. WALTER KRAUS D I PLO M C H EM I KER · D R.-l N G. AN N EKÄTE WEISERT DlPL-ING. FACHRICHTUNG CHEf.'It IRMGARDSTRASSE 15 · D,-BOOO MÜNCHEN 71 -TELEFON 089 797077-797O78 · TELEX O5-212156 kpet ei

TELEGRAMM KRAUSPATENT

2233 WK/rm

KOWA COMPAInIY, LTD. Nagoya / Japan

Antibiotische Substanz

Paten ta nsprüche

1. Antibiotische Substanz KA-703Ö, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Verbindungen mit den folgenden Formeln I bis VII, Gemischen davon und Säureadditionssalzen davon:

CH₀NHCH-. NH₀ ι 2 3 ι 2

Formel I

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NH,

^so

NH₂ NHCH₃

Formel II

CH₂NHCH₃

NH,

OCH. Formel III

NH₂ OH 'NHCH₃ Formel IV

NH,

OCH.

NHCH. Formel V

CH₂NHCH₃

NH,

QK H:

OCH.

H CH-

NH,

Formel VI

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OCH.

NHCH.

Formel VII

2. Antibiotisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es (1) aus einer antibiotisch wirksamen Menge einer antibiotischen Substanz KA-7038, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Verbindungen mit den folgenden Formeln I bis VII, Gemischen davon und Säureadditionssalzen davon:

CH₂NHCH₃

CH₀NH₀

COCH₂NH₂

OCH.

NH,

Formel I

Formel II

Formel III

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-A-

NH.

OH

OCH.

OH NHCH.

OCH.

NHCH.

Formel IV

Formel V

Formel VI

Formel VII

und (2) einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger besteht.

3. Antibiotisches Mittel nach Anspruch 2, dadurch g e

kennzeichnet, daß der Anteil der antibiotischen Substanz KA-7038 etwa 0,01 bis etwa 99,5 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Mittels, beträgt.

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-D-

4. Verfahren zur Herstellung einer antibiotischen Substanz KA-7038, dadurch gekennzeichnet , da." man einen die antibiotische Substanz KA-7038 erzeugenden Stamm der Gattung Streptomyces züchtet und die antibiotische Substanz KA-7038 aus der KuItürbrühe isoliert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der resultierenden antibiotischen Substanz KA-7038 mindestens ein Antibiotikum, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Verbindungen mit den folgenden Formeln I bis VII, abtrennt:

CK₂NHCH₃

COCH₂NH₂

Formel I

Formel II

Formel III

Formel IV

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-C-

OCH. NHCH.

Formel V

CH₂NHCH₃

r-\?^m3

Formel VI Formel VII

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß man das resultierende Antibiotikum mit einer pharmazeutisch annehmbaren anorganischen oder organischen Säure behandelt, um ein Antibiotikum in Form eines Säureadditxonssalzes zu erhalten.

Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als die antibiotische Substanz KA-7038 erzeugenden Stamm Streptomyces sp. KC-7038 verwendet.

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8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß man das Züchten unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von etwa 20 bis etwa 35°C durchführt.

9. Biologisch reine Kultur von Streptomyces sp. KC-7038 mit den Eigenschaften des Stammes FERM-P Nr. 4388, ATCC IJr. 31530 oder DSM Nr. 1594 und der Fähigkeit, eine antibiotische Substanz KA-7038 durch Fermentation in einem Nährkulturmedium, welches eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoff quelle und Mineralien enthält, zu erzeugen.

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