DE2423058C2

DE2423058C2 - Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxymethyl-cephalosporinen

Info

Publication number: DE2423058C2
Application number: DE2423058A
Authority: DE
Inventors: Stephen Arthur Orinda Calif. Goulden; Alan Ulverston Lancashire Smith
Original assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Current assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Priority date: 1973-05-14
Filing date: 1974-05-13
Publication date: 1982-06-24
Also published as: AU6885574A; ZA743023B; CA1021280A; GB1474519A; BE814937A; NL159716B; JPS5443598B2; NL7406418A; CH606002A5; FR2229701A1; ATA392874A; ES426272A1; DE2423058A1; JPS5035395A; AT335057B; FR2229701B1; US3912589A

Description

S oder S

besitzt, durch Hydrolyse der entsprechenden 3-Acetoxymethylcephalosporine mittels einer Esterase, dadurch gekennzeichnet, daß die Esterase aus einem Hefe-Mikroorganismus des Genus Rhodotorula stammt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Acetoxymethylcephalosporin mit einer Esterasequelle in Kontakt gebracht wird, die ganze Zellen enthält, die aus einer kultivierten Brühe des Hefemikroorganismus erhalten wurden.

3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-2. dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Rhodotorula rubra CBS 6469 verwendet wird.

4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Rhodotorula rubra CBS 17 verwendet wird.

5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-2. dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Rhodotorula glutinis CBS 20 verwendet wird.

6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 - 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Rhodotomla glutinis var. dairenensis CBS 4406 verwendet wird.

7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Rhodotorula graminis CBS 2826 verwendet wird.

Die Erfindung betrifft die enzymatisch katalysierte Hydrolyse von 3-Aeylöxymethylcephalosporinen.

Die in der vorliegenden Beschreibung erwähnten Cephalosporinverbindungen werden allgemein unter Bezugnahme auf »Cepham« (J. Am. Chetn. Soc. 1962,84, 3400) bezeichnet Der Ausdruck »Cephem« bezieht sich auf die Cephamstruklur mit einer Doppelbindung.

3-Hydroxymethyl-cephaIosporin*Verbindungen sind wertvolle Zwischenprodukte bei der Synthese einer Reihe von Cephalosporinantibiotika, die in der 3-Stellung substituierte Methylgruppen aufweisen, aufgrund der chemischen Reaktivität der Hydroxylgruppe und

■> der daraus folgenden leichten Umwandlungsmöglichkeit der Hydroxymethylgruppe in eine gewünschte 3-(substituierte Methyl)-Gruppe. Darüber hinaus besitzen 7-Acylamido-3-hydroxymethyIceph-3-em-4-carbon■ säuren antibiotische Eigenschaften. Die Herstellung von

to 3-Hydroxymeihyl-cephalosporin-Verbindungen durch Hydrolyse von 3-Aeyloxymethyl-cephalosporinen, insbesondere von natürlich vorkommenden, durch Fermer tation produzierten 3-Acetoxymethylcephalosporinverbindungen wie Cephalosporin C [(6R, 7R)-3-Acet-

oxymethyl-7-(D-5-amino-5 carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure] und Derivaten davon, z. B. N-geschüizten Derivaten und Verbindungen, worin die D-5-Amino-5-carboxypentanoylgmppe ii. anderer Weise umgewandelt wurde oder entfernt wurde und gegebenenfalls durch eine andere Acylgruppe ersetzt wurde, ist daher von bedeutendem !meres';?

Die Hydrolyse von S-Acyloxymethylceph-S-em-«*- carbonsäuren in ihre 3-Hydroxymethylanalogen durch chemische Methoden hat sich aL im allgemeinen nicht

2ϊ praktizierbar erwiesen, da solche Reaktionen mit einer raschen und im wesentlichen irreversiblen Lactonbil dung, die die Reaktion der 3-Hydroxymethyl- und 4-Carboxygruppen umfaßt und/oder mit der Zerstörung des /JLactamringsystems einhergehen.

Es wurde jedoch gefunden, daß es möglich ist, S-AcylovMTietnylceph-i-em^-carbonsäuren durch enzymatisen katalysierte Methoden unter Bedingungen zu hydrolysieren, unter denen die Lactonbildung und die 0-Lactamzersetzung im wesentlichen oder vollständig verhindert werden können. Wahrend F.sterasen. die sich von einer Reihe von Quellen, z. B. pflanzlichen Quellen, ableiten, bei diesen enzymatisch katalysierten Methoden Verwendung finden können, können sich praktische Schwierigkeiten bei der Isolierung von ausreichenden Esterasemengen aus einigen der Quellen ergeben. Daher sind Esterasen die man aus Mikroorganismen erhält, in der Praxis am zweckmäßigsten hinsichtlich der im Vergleich leichten Kultivierjngsmöglichkeit von Mikroorganismen in grobem Maßstab unter Verwen dung von Standard-Fermentationstechniken zur Bildung einer bequemen F.sterasdieferung.

Aus der DEOS 15 45915 ist zwar schon die en/ymatische Deacylierung bestimmter Cephalosporine mittels Weizenkeimesterase oder einer von dem Genus Rhizobium stammenden Esterase beschrieben. Jedoch besitzt das nachstehend beschriebene erfindungsgemäße Verfahren der enzymatischen Deacylierung mittels Enzymen aus einem Hefe-Mikroorganismus des Genus Rhodotorula demgegenüber verschiedene Vorteile. Es ist möglich, die Fermentation in industriellem Maßstab in guter Ausbeute und in kurzer Zeit durchzuführen. Außerdem ist die Menge an unnötigem Ballastmaterial in der Reaktionsmischung auf einem Minimum gehalten. Die hohe Aufbeute an Enzym in den Rhodotorula-Zellen ermöglicht eine leichte Extraktion und Reinigung bei Anwendung zellfreien Enzyms. Im Gegensatz dazu ist die Extraktion der Esterase aus Weizenkeimen langwierig und kompliziert Ein weilerer Vorteil der Anwendung der Esterase aus Rhodotorula besteht darin, daß die Esterase von Weizenkeimen vor der Verwendung extrahiert werden muß. Dies bedeutet, daß das Enzym nach jeder Hydrolysereaktion verloren ist und das Produkt muß aus der Eraiymmischung abgetrennt

werden oder aber das Enzym müßte in irgendeiner Weise immobilisiert werden, was sehr komplizierte Verfahren zur Unlöslichmachung erforderlich machen würde. Im Gegensatz dazu können die ganzen Zellen von Rhodotorula selbst direkt verwendet werden, nachdem sie aus der Fermentationsmischung einfach geerntet und gewaschen wurden. Die Hefezellen stellen außerdem ein gutes Vehikel für das Enzym in der Reaktion dar, wodurch das Enzym aus dem Reaktionsmediurn nach beendeter Hydrolyse leicht abgetrennt werden kann. Außerdem wurde festgestellt, daß die ganzen Zellen von Rhodotorula für die Reaktion mehrmals verwendet werden können, was eine beträchtliche Wirtschaftlichkeitssteigerung hinsichtlich der zu erzeugenden Enzymmenge bedeutet. Selbst bei siebenmaliger Wiederverwendung der Hefezellen konnten zufriedenstellende Ausbeuten erhalten werden. Die Verwendung von Rhodotorula-Zellen stellt demnach einen außerordentlichen Vorteil für die Erzeugung in großem Maßstab gegenüber der Verwendung von Weizenkeimen als Enzymquelle dar.

Weiterhin ist aus der DE-OS 14 45 639 die Desacetylierung von 7-Amino-cephalosporansäure durch Mikroorganismen verschiedener Typen, besonders Streptomyces und Bacillus subtilis bekannt Im Gegensatz dazu bietet das nachstehend beschriebene erfindungsgemäße Verfahren mit Rhodotorula ganz bedeutende Vorteile im Hinblick auf seine Flexibilität und es können eine große Zahl von 7-Subst:tuenten einschließlich Cephalosporin C diesem Verfahren unterworfen werden. Die Vortei'e des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber B. subtilis bestehen hauptsächlich darin, daß erfindungsgemäß die ganzen Ze..en erfolgreich mehrmals verwendet werden können, ohne daß ein Abfall der enzymatischen Aktivität eintritt. :n der genannten DE-OS ist ein Hinweis darauf, daß dies auch mit B. subtilis und Streptomayces der Fall ist, nicht gegeben. Schließlich ist im Falle von B. subtilis noch zu beachten, daß von den Bacilli ganz allgemein bekannt ist, daß sie eine Reihe von Enzymen einschließlich /?-Lactamasen erzeugen. Dies könnte spontan bei bestimmten Cepha-Iosporinsubstraten auftreten und zum Abbau der Zellen Cephalosporinverbindungen führen.

Gemäß der Erfindung wurde nun gefunden, daß Esterasen, die aus Hefemikroorganismen des Genus Rhodotorula und Mutanten hiervon erhalten wurden, vorteilhaft die Hydrolyse von S-Acetoxymethylceph-S-em-4-carbonsäuren in ihrer 3-HydroxymethylanaIogen fördern bzw. beschleunigen und wesentliche Vorteile im Vergleich mit bisher vorgeschlagenen, durch Mikroorganismen produzierte Esterasen besitzen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxymethylcephalosponnen der allgemeinen Formel

/-N V-CIl₂OII
COOH

R- ein WasserstolTatorr oder eine niedrig-Alkyl-, niedrig-Alkoxy-, niedrig-A^kylthio- oder niedrig-AIkanoylgruppe ist und B die Bedeutung von

oder

besitzt, durch Hydrolyse der entsprechenden 3-Acetoxymethylcephalosporine mittels einer Esterase ist dadurch gekennzeichnet, daß die Esterase aus einem Hefe-Mikroorganismus de. Genus Rhodotorula stammt. J-Acetoxymethylceph^-em^-carbonsäuren, die gemäß der vorliegenden Erfindung hydrolysiert werden können, umfassen Verbindungen, die durch die allgemeine Formel

CH₃O · COCH,

dargestellt werden, worin R' eine Aminogruppe oder blockierte (bzw. geschützte) Aminogruppe ist, beispielsweise eine Ci -20-Carbonsäure-acylamidogruppe; R² Wasserstoff oder eine niedrig-Alkyl-, niedrig-Alkoxy-, niedrig-Alkylthio- oder niedrig-Alkanoylgruppe ist (der hier verwendete Ausdruck »niedrig« bezeichnet Gruppen, die nicht meh' als 8, vorzugsweise nicht mehr als 6 Kohlenstoffatome enthalten): und B die Bedeutung von >S oder )S - 0(<x- oder ß-) hat.

Acylamidogmppen R¹. die in den Verbindungen der Formel I vorhanden sein köniitn, umfassen die D-S-Amino-S-carboxypentanamidogruppe, die in natürlich vorkommenden, durch Fermentation hergestellten Verbindungen wie Cephalosporin C gefunden wurde; N-geschützte Derivate der D-5-Amino-carboxypentanamidogruppe, z. B. worin die Aminogruppe substituiert ist durch die Schutzgruppe des in einer der britischen Patentschriften 1041985; 1302015 oder 13 13207 beschriebener, Typs, beispielsweise eine niedrig-Alkyl· gruppe, eine Aryl-oiedrig-alkylgruppe, eine Arylgruppe

■;o (z. B. 2,4-Dinitrophenyl) oder eine Acylgruppe, insbesondere eine niedrig-Alkanoylgruppe (z. B. Acetyl. Propionyl oder Butyryl), eine «-Halogen- oder «λ-Dihalogen-niedrig-alkanoylgruppe (z. B. Chloracetyl oder Dichloracetyl), eine Aroylgruppe (z. B. Benzoyl, Chlorbenzoyl, Nitrobenzoyl oder Tosyl), eine niedrig-Alkoxycarbonylgruppe (z. B. t-Butoxycarbonyl), eine Aryl-niedrig-alkoxycarbonyigruppe (z. B. Benzyloxycarbonyl) oder eine Diacylgruppe wie Phthaloyl; eine Acylamidogruppe, die durch Umwandlung der D-5-Amino-5-car-

boxypentanamidogruppe erhalten wurde, z. B. eine 4'Carboxybutamidogruppe, die daraus durch beispielsweise enzymatische Oxydation erhalten wurde; Formamidoj eine Gruppe der Formel

worin R¹ eine Aminogruppe oder eine in üblicher Weise blockierte bzw. geschützte Aminogruppe ist, R(CHj)_n-CONH-

worin R eine carbocyclische oder heterocyclische Arylgruppe (z. B. Phenyl, durch einen oder mehrere der

Reste Halogen, Hydroxy, niedrig-Alkyl, Nitro, Amino, niedrig-Alkanoyl, niedrig-AIkoxy oder niedrig-Alkylthio substituiertes Phenyl; Thienyl oder Fury!) oder eine Aryloxy-, Arylthio-, Aryl-niedrig-alkoxy- oder .Arylniedrig-alkylthiogruppe (z. B. Phenoxy, Phenylthio, 5-Methyl-l,3,4-thiadiazol-2-ylthio oder Benzylthio) und n eine ganze Zahl von 1 bis 4 bedeuten; eine Gruppe der Formel

R^J —CH- CONH-

worin R^a eine Arylgruppe (z. B eine monocyclische oder bicyclische carbocyclische Arylgruppe wie Phenyl, Naphthyl oder durch einen oder mehrere der Reste Halogen, Hydroxy, niedrig-Alkyl, Nitro, Amino, niedrig-Alkanolyl, niedrig-AIkoxy oder niedrig-Alkylthio substituiertes Phenyl) bedeutet und X Amino, geschütztes Amino (ζ. B. enthaltend die vorstehend in Verbindung mit der D-S-Amirtu-S-cafboxypeniananriciogruppc diskutierten N -Schutzgruppen, beispielsweise eine t-Butoxycarbonylgruppe), Carboxy, Carbalkoxy oder Hydroxy ist; und eine Gruppe der Formel

R^J — C — CONH-

\ OR"

worin R^a die vorstehend aufgeführten Bedeutungen besitzen, (z. B. worin R^a Phenyl, substituiertes Phenyl, Naphthyl, "Tiienyl, Furyl oder Pyridyl ist), und R^h Wasserstoff Acyl (ζ. B. niedrig-Alkanoyl), niedrig-Alkyl (z. B. Methyl, Äthyl, Propyl oder Butyl), Cycloalkyl (ζ. Β. enthaltend 5-7 Kohlenstoffatome wie Cyclopentyl oder Cyclohexyl), Aryl (ζ. B. carbocyclisches Aryl wie Phenyl) odi;r Aryl-niedrig-Alkyl (ζ. Β. Benzyl oder Phenyläthyl'i ist Beispiele für R'-Gruppen, die unter die vorstehendr; allgemeine Formel fallen, di° in Verbindun gen der Formel I vorhanden sein können, umfassen Pheny!acetamido, Thienylacetamido, 2-Hydroxy-2-phenylacetamido, 2-t-Butoxy-carbonylamino-2-pheny!acetamido und syn-2-Furyl-2-methoxy'mino-acetamido.

Die Gruppen R² und B in der Formel I stellen vorzugsweise Wasserstoff bzw. > S dar.

Die Hefemikroorganismen, aus denen die Esterase erhalten wird, können zweckmäßig durch Gefriertrocknen in einer Suspension von 2% Molke in versiegelten Glasampulle konserviert werden. Die gefriergetrocknete Kultur kann durch Zugabe von sterilem Wasser wieder eingesetzt werden. Die resuspendierten Organismen können beispielsweise durch Aufstreichen auf ein festes Nährmedium kultiviert werden, beispielsweise einem wäf-Srigem Medium, das 2% Glukose, 1% Hefeextraki, 1% Pepton und 0,5% Kaliumdihydrogenphosphat enthält, mit 2% Agar gefestigt wurde (alle Prozentangaben sind in GewA'ol. angegeben), bei einem pH-Wert von 5,6. Die Oberflächenkulturen werden z. B. bei 25° C aufgezogen, bis das Agar bedeckt ist und können anschließend mehrere Monate bei einer niedrigen Temperatur, z.B. 5⁰C konserviert werden. Der Organinmus kann in Tauchkulturen bzw. flüssigen Kulturen ;:weckmäßig bei 25° C gezüchtet werden, beispielsweise durc'» Inokulation eines flüssigen Nährmediums mit einer Probe der Oberflächenkultur ein Beispiel für ein geeignetes Nährmedium für diesen Zweck ist das vorstehend für die Oberflächep.kultur beschriebene, ohne Agar. Es ist häufig zweckmäßig, eine flüssige Kultur des Organismus zu erhalten, die als Inokulat für spätere flüssige Kulturen verwendet werden kann, z. B. zur Herstellung von Schalenkuhuren, da hierdurch der Nachteil einer großen Oberfläche für flüssig-Inokulationen vermieden wird und es möglich

ίο wird, ein größeres Inokulum zu verwenden. Die nach der Inkubation einer solchen anschließenden flüssigen Kultur während einer geeigneten Zeit, z. B. während 3 Tagen, zweckmäßig bei 25⁰C erhaltene Hetesuspension kann anschließend als Quelle für die zur Deacylierung des S-oxymethylceph-S-em^-carbonsäure-Ausgangsmaterials verwendete Esterase verwendet werden.

Die Bildung der Esterase kann in gewissen Fällen durch Zugabe eines Induktionsrr.ittels zu dem flüssigen Kulturmedium vergrößert werden. Geeignete Induktionsm'ttel umfassen Cephalosporin C, Cefalotin [(6R, 7R)-3-Acetoxymethyl-7-(thien-2 l)-acetamidoceph-3-ern 4 carbonsäure] und ihre Salze (z. B. A.lkaümeiaüsalze wie das Kaliumsalz), wobei sich Induktionsmittel wie das Kaliumcephaiosporin C als in Mengen weniger als 0,1% Gew/Vol. wirksam erwiesen haben. Las Induktiorsmittel wird zweckmäßig nach der Sterilisation zu dem flüssigen Kulturmedium gefügt Das Induktionsmittel kann durch Hindurchleiten durch ein steriles Filter sterilisiert werden, wohingegen das Kulturmedium durch beispielsweise Behandlung im Autoklaven bei etwa 12TC und 10 500 kg/m², z. B. während 15 Minuten sterilisiert werden kann.

Die Esterase kann in mehreren verschiedenen Formen zur Hydrolyse des 3-oxymethylceph-3-em-4-carbonsäure-Ausgangsmaterials verwendet werden. So kann beispielsweise eine Probe des flüssigen, kultivierten Mediums selbst als Quelle für die Esterase verwende" werden, gegebenenfalls nach dem Brechen der Hefezellen, beispielsweise durch f'blich^ Methode wie Ultraschallbehandlung oder Behandlung mit auflösenden (lytischen) Enzymen. Ein wäßriger Extrakt der von einem derartigen Aufbrechen der Zellen resultierenden Suspension kann ebenfalls verwendet werden. Alternativ können ganze Zellen, die vcn dem flüssigen Kulturmedium abfiltriert wurden, wie da.» entsprechende Filtrat. verwendet werden; wird es gewünscht, das Filtrat zu verwenden, so können die Zellen erneut vor der Filtration gebrochen werden, z. B. wie vorstehend beschrieben.

Die Verwendung ganzer Zellen, die leicht beispielsweise als Zellensuspension aus dem flüssigen kultivierte Medium abgetrennt werden können, ist besonders vorteilhaft, da diese leicht konserviert werden können, 7. B. als getrocknete oder tiefgefrorene Paste, die direkt der Hydrolysereaktionsmischung zugefügt werden kann und leicht abtrennbar ist. z. B. durch F-ltratioii aus der Reaktionsmischung, nachdem die Hydrolyse beende· ist. Die so abgetrennten Zellen können z. B. nach dein Waschen mit Wasser erneut zur Hydrolyse weiterer Proben von 3· \cetoxymethylceph-3-em-4-carbonsäure-Ausgargsmaterial verwendet werden. Es wurde gefunden, daß eine ausreichende Esteraseaktivität zur Hydrolyse eines CephalosporinprodufUes mit zufriedenstellender Qualität in gleichmäßiger Ausbeute während sogar 7 erneuten Einsätzen der Zellen beibehalten Werden kann, i'odurch diese Ausführungsforrn des Verfahrens von besonderem wirtschaftlichen Vorteil ist.

Falls gewünscht, können die gesamten Zellen in oder

an einer inerten Matrix (ζ. B. einem Polymeren oder einer Membran) immobilisiert werden, beispielsweise durch kovalente Bindung an ein anorganisches oder organisches Polymerisat oder durch Einschluß bzw. F.infangen in oder an eine Faser (z. B. Zeliuloselriacetat) oder in eine Umhüllung wie eine Perle, vor ihrem Zusatz /ti einem Hydrolysereaktionssystem, um die Zellen zu schützen und Verluste während ihrer Recyclisierung bzw. ihrer erneuten Verwendung auf ein Minimum herabzusetzen. Eine bevorzugte Matrix zur Verwendung zur Immobilisierung der Zellen ist Polyacrylamidgcl

Die l.stcrese kann auch in zellfreier Form verwendet werden, beispielsweise erhalten durch Ausfällung aus einem Filtrat oder zellulären Extrakt, der sich von dem flüssigen kultivierten Medium wie vorstehend beschrieben ableitet, unter Verwendung eines geeigneten Proteinausfällungsmittels. beispielsweise eines Salzes oder eines Lösungsmittels Die ausgefällte, zellfreie Esterase kann beispielsweise direkt zu einem Hydrolysereaktionssystem zugesetzt werden oder kann in Wasser gelöst werden und als wäßrige Lösung zugefügt werden.

Alternativ kann die Esterase in immobilisierter Form verwendet werden, ι. B. durch Unlöslichmachung oder Umhüllung bzw Einfangen an oder in einer inerten Matrix, wobei geeignete immobilisierte Formen die in der britischen Patentschrift 12 24 947 und der belgischen Patentschrift 7 82 646 beschriebenen einschließen. So kann beispielsweise eine aus einem Extrakt des flüssigen Kulturmediums oder durch Wiederauflösen von ausgefül'ter Esterase erhaltene Esterase covalent an ein sonst inertes, anorganisches oder organisches Polymeres gebunden werden, in oder an einer Faser eingefangen werden (z. B. einem faserartigen Polymeren wie Zellulosetriacetat) oder an oder in einer Membrane oder einem Polymeren wie Potyacrylamidgel. adsorbiert werden an einem Ionenaustauschharz oder eingeschlossen werden in eine Umhüllung wie eine Perle Immobilisierte Esterasen diesen Typs können vorteilhaft in Ansatzverfahren verwendet werden, worin die Esterase erneut verwendet werden soll und bei der Hydrolyse eines kontinuierlichen Flusses von S-AcetoxymethylcephO-em^-carbonsäure durch beispielsweise Hindurchleiten durch eine Säule, die die immobilisierte Esterase enthält.

Die Hydrolysereaktion wird zweckmäßig durch Kontaktieren der Esterase mit einem wäßrigen Medium initiiert, das die S-Acetoxymethylceph-S-em^-carbonsäure oder ein Salz davon (z. B. ein Alkalimetallsalz wie das Natrium- oder Kaliumsalz) enthält, wobei das Medium zweckmäßig 0.5 bis 10 Gew/Vol.% der Cephalosporinverbindung enthält Das Medium kann, fails gewünscht, vor der Hydrolyse sterilisiert werden, es hat sich jedoch gezeigt daß die Reaktion die Aufrechterhaltung steriler Bedingungen nicht erfordert und dementsprechend kann die Hydrolyse vorteilhaft unter nicht sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

Ist die S-Acetoxymethylceph-S-em^carbonsäure ein durch Fermentation produziertes Cephalosporin wie im Falle von Cephalosporin C so kann die Fermentationsbrühe, die aus der Kultur des Cephalosporin erzeugenden Organismus (z. B. eines Organismus des Genus Cephaiosponum wie Cephalosporium acremonium Brotzu) selbst mit der Esterase behandelt werden, wobei die Notwendigkeit der Z-A'ischcnprodukiabtrcnnung der Cephalosporinverbindung vermieden wird. Mycelium kann, falls gewünscht aus der Brühe vor der Behandlung entfernt werden, jedoch ist es häufig zweckmäßiger, die gesamte Brühe direkt zu verwenden.

Im allgemeinen wird die Hydrolyse vorteilhaft bei

einem pH-Wert von 4 bis 8 durchgeführt. Der pH-Wert kann während der Reaktion unter Verwendung eines Puffers z. B. Phosphatpuffers, beispielsweise auf pH-Wert 6,0 gehalten werden. Die Hydrolyse wird zweckmäßig bei Raumtemperatur, d.h. etwa 25°C, vorteilhaft unter Rühren und/oder Belüften der

ίο Reaktionsmischung durchgeführt.

Die Menge an Esterase oder Esterase enthaltendem Material, die in einer gegebenen Reaktion erforderlich ist. kann leicht durch vorausgehende Versuchsansätze im kleinen Maßstab bestimmt werden, da sich gezeigt Η hat. daß das Verfahren gut maßstäblich vergrößert werden kann.

Die zur vollständigen Entacetylierung der 3-Acetoxymethylceph-S-em^carbonsäure erforderliche Zeit hantrl von der Natur des AiistrnnnsmnterinU und Ηργ Esterase und den verwendeten Reaktionsbedingungen ab, beträgt jedoch im typischen Falle nicht mehr als 70 Stunden. Der Verlauf der Reaktion kann zweckmäßig durch Trennen des Produkts durch Dünnschicht- oder Papierchromatographie unter Verwendung einer geeig· neten Träger-Lösungsmittel-System-Kombination und densilometrische Untersuchung verfolgt werden.

Besitzt das 3-Acetoxymethylceph-3-em-4-carbonsäure-Ausir'ngsmatcria! eine D-S-Amino-S-carboxypentan-amidogruppe in der 7-Stellung. wie im Falle von Cephalosporin C. so kann das hydrolytische Entacylierungsverfahren der Erfindung kombiniert werden mit der durch Enzymkatalysierten osidativen Desaminierung der Gruppe in der 7-Stellung. beispielsweise in eine 4-Carboxybutanamidogruppe durch Behandeln mit einer fungalen Oxidase. insbesondere einer Oxidase, die sich von der Hefe Trigonopsis variabilis ableitet, wie in der britischen Patentschrift 12 72 769 und der belgischen Patentschrift 7 82 393 beschrieben, kombiniert werden. Die enzymatische Umwandlung der Gruppen in den 3- und 7-StelIungen kann entweder nacheinander oder gleichzeitig durchgeführt werden.

Die zur Isolierung des 3-Hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäureproduktes verwendete Methode hängt von der Natur des Produkts und des Reaktionssystems ab.

wird jedoch im allgemeinen unter Anwendung üblicher Techniken durchgeführt. So können beispielsweise, falls ganze Zellen als Quelle für die Esterase verwendet werden, diese durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt werden (und falls gewünscht erneut verwendet werden) und die Lösung kann weiter durch Filtrieren, z. B. durch ein Kieselgurbett geklärt werden. FC. den Fall, daß die S-Hydroxymethylceph-S-em^-carbonsäure das Desacetylcephalosporin C ist. kann dieses beispielsweise dadurch isoliert werden, daß die Lösung durch Adsorption auf Kohle» gefolgt von Eluieren mit Aceton und Wasser, entsalzt wird, worauf das Eluat durch Adsorption auf ein Anionenaustauscherharz (beispielsweise Amberlite® IRA-68 in der Acetatform) und Eluieren des Desacetylcephalosporins von dem Harz mit Kaliumacetatlösung und Ausfällen des Produkts mit Aceton gereinigt werden. Andere Techniken, die zur Isolierung von verschiedenen Cephalosporinprodukten angewendet werden können, umfassen die Lösungsmittelextraktion. Säureausfällung und Ausfällung beim isoelktrischen Punkt (im Falle von zwitterionischen Produkten wie {6RJR}-7-Amino-3-h>^rox}-fneuiyieepii-3-em-4-carbonsäure).
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Vortei-

len und praktischen Annehmlichkeilen, die die Verwendung von ganzen Zellen als Esterasequelle gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens mit sich bringen können, ist das erfindungsgemäße Verfahren aufgrund der leichten Kullivierbarkeil der Mikroorganismen des Genus Rhodotorula zur Schaffung einer Esterasequelle, die Reproduzierbarkeit der Hydrolysereaktion unter Verwendung von Rhodotorula-auf.eleiteter Esterase und die Leichtigkeit, mit der die erforderliche Esterasemenge bestimmt werden kann, allgemein besonders gut durchführbar bzw. geeignet.

Es haben sich zahlreiche Spezies innerhalb des Genus Rhodotorula als wirksam erwiesen, bevorzugt verwendet werden jedoch die Organismen der Spezies Rhodotorula rubra. Rhodotorula glutinis. Rhodotorula glutinis var. dairenensis und Rhodotorula graminis hinsichtlich der besonders wirksamen Hydrolyse von 3-Acetoxymethylceph-3-em-4-carbonsäuren, die durch die durch diese Organismen produzierten Esterasen gefordert bzw. beschieunigi werden. Das Verfahren wird zweckmäßig unter Verwendung von Spezieskulturtypen dieser Organismen (erhalten vom Cetraalbureau voor Schimmelcultures. Baarn. Delft, Niederlande), d. h. unter Verwendung der Stämme Rnodotorula rubra CBS 17. Rhodoiorula glutinis CBS 20. Rhodotorula glutinis var. dairenensis CBS 4406 und Rhodotorula graminis CBS 2826 durchgeführt.

Ein weiterer Rhodotorula nibra - Stamm, der sich als besonders wirksam beim erfindungsgemäßen Verfahren erwiesen hat, ist der beim Centraalbureau voor Schimmelcultures unter der Nummer CBS 6469 hinterlegte. Dieser Stamm hat die folgenden Charakteristika:

Nach 24stündiger und 72stündiger Aufzucht auf Malz-Hefe-Glukose-Pepton-Flüssigmedium waren die Zellen kurz und oval, 2 bis 43 μ * 2,5 bis 5,5 μ und traten einzeln oder in Paaren auf. Nach einmonatigem Wachstum lag eine nicht flockenförmige Abscheidung vor. Es hat sich kein Film oder Ring von Zellen an der Oberfläche der Flüssigkeit gebildet und an der Wand des Rohres war nur ein leichtes aufsteigendes Wachstum zu erkennen. Nach 72-slündigem Wachstum auf Malz- Hefe-Glukose -Pepton-Agar waren die Zellen sphärisch bis oval. 2 bis 5 μ χ 2.5 bis 7 μ. und traten einzeln oder in Paaren auf. Nach einem Monat zeigte eine Streck- bzw. Streifenkultur strahlend rosa, sehr glänzende und sehr glatte Zellen.

Nach 4 Wochen trat keine Pseudomycelentwicklung auf Oberflächenkulturen unter Verwendung von Kartoffeldextrose-Agar oder Maismehl-Agar und keine Sporenbildung nach 3 oder 4' h Wochen auf Karotten. Natriumacetat-Agar oder Gorodkowa-Agar auf.

Nach 3 Wochen wurde keine Gasbildung nach der Durham-Rohrmethode während der Zuckerfermentation unter Verwendung von Dextrose. Fructose, Galactose. Maltose. Sucrose, Lactose, Melibiose, Raffinose. Trehalose oder löslicher Stärke auf.

Das Wachstum wurde nach 1. 2 und 3 Wochen im flüssigen Medium unter der Verwendung der folgenden einzigen Kohlenstoffqueilen beobachtet: Glucose. Galactose, Sucrose, Maltose, L-Sorbose (latentes Wachstum, das nach zwei Wochen auftrat), Cellobiose, Trehalose, RafFinose, Melezitose. D-Xylose, L-Arabinose, D-Arabinose. D-Ribose. L-Rhamnose (latentes Wachstum trat nach 1 Woche auf). Äthanol Glycerin, Bernsteinsäure, AdonitoL D-Mannit D-Sorbit und Salicin. Unter Verwendung von Lactose. Melibiose, löslicher Stärke, Inulin, Milchsäure, Erythrit Dulcit, /vMethylglucosid und Inosit wurde unter den gleichen Bedingungen kein Wachstum beobachtet.

Ein Wachstum wurde nach I. 2 und 3 Wochen in flüssigem Medium unter Verwendung von Ammonium- > sulfat und Äthylaminhydrochlorid als einzige Stickstoff quelle beobachtet. Es trat jedoch keine Nitrat-Assimilation auf.

Der Test auf die Hydrolyse von Fett und die

Stärkeproduktion verlief negativ; die Spaltung von

in Arbutin war positiv. Es trat kein Wachstum in einem Medium mit 60% osmotischem Druck auf und in einem vitaminfreien flüssigen Medium trat lediglich nach 16 Tagen ein leichtes Wachstum auf. Im flüssigen Medium trat ein Wachstum in Anwesenheit von 100 ppm Actidion^eauf.

Unter Verwendung eines Kalk enthaltenden Gorodkowa-Mediums erfolgte keine Klärung des Mediums während des Wachstums des Organismus, was anzeigt, daß keine Säure produziert wurde.

Dieser Stamm wurde in den Beispieien i bis iüunri i3 bis 16 verwendet.

Speziestyp-Kulturen der Spezies des Genus Rhodotorula, die in den Beispielen 11 und 12 verwendet wurden, wurden vom Centraalbureau voor Schimmelcultures erhalten.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Alle Temperaturen sind in Grad C angegeben.

B e i s ρ i e I I

(6R.7R)-7-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido)-S-hydroxymethylceph-S-em^l-carbonsäure

500 g(etwa 70% Reinheit) Kalium-(6R.7R)-3-acetoxymethyl-7-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)-ceph-3- em-4-carboxylat wurden in Wasser gelöst und durch Hindurchleiten durch einen sterilen Asbestbausch sterilisiert Die Lösung wurde zu 2 Liter sterilem Phosphatpuffer (400 m-molar, pH 6) in einer 10-Literflasehe gefüllt, wozu anschließend etwa 2 Liter einer Suspension von Rhodotorula rubra gefügt wurden. d^:? drei Tage auf einem mit 1% Gew/Vol. (6R.7R)-3-acet-

oxymethyl-7-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure versetzten Nährmedium gezüchtet wurde. Das Endvolumen betrug etwa 8 Liter und die Mischung wurde unter Verwendung eines Magnetrührers gerührt und durch Einsprühen von steriler Luft mit einer Geschwindigkeit von 2 Litern pro Minute belüftet.

Nach 60stundiger Inkubation bei Raumtemperatur zeigte es sich durch Chromatographie, daß mehr als 90% des Cephalosporins als (6R.7R)-7-(D-5-Amino-5-

carboxypentanamidoJ-S-hydroxymethylcephO-enM-carbonsäure vorlagen. Die Brühe wurde durch Zentrifugieren geklärt und der pH-Wert vor dem Beladen auf eine mit Kohle gepackte Säule auf 43 eingestellt Nach dem Beladen wurde die Kohle mit gekühltem mineralisiertem Wasser (4 Bettvolumen), gewaschen und mit 40%igem. wäßrigem Aceton (4-SäulenvoIumen) eluiert Das Eluat wurde an eine Säule von Amberlit® IRA-68 Anionenaustauscherharz in der Acetatform absorbiert und mit gekühltem demineralisiertem Wasser (2-SäuIenvoiumen) gewaschen. Die Säule wurde anschließend mit 0.1 m-Kaliumacetat eluiert und das Eluat wurde mit Aceton (5.75 Volumenteile) behandelt Die resultierende Ausfällung wurde abgetrennt und an der Luft bei 35° getrocknet, wobei man 68% der Titelverbindung (68%ige Reinheit) erhielt deren physi-

c'I

kaiische Charakteristika denen einer authentischen Probe gleich waren.

Beispiel 2

(6R,7R)-7-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido)-S-hydroxymethylceph^-em^-carbonsäure

Es wurde eine Brühe von einer Cephalosporin C Fermentation (Cephalosporium acremonium Brotzu) aseptisch gesammelt. 4 Liter der gesamten Brühe würden in ein steriles 5-l-Fermentiergefäß überführt. Der pH-Wert der Brühe wurde mit 5n-Phosphorsäure «uf 5,0 eingestellt und die Brühe wurde mit 800 U/Min, gerührt. Sterile Luft wurde in das Fermentiergefäß in einer Geschwindigkeit von 3 Liter/Minute eingeblasen. (Jm die Autolyse des Cephalosporiumorganismus zu verhindern, wurde eine 50%ige (Gew/Vol.) Glukoselösung mit einer Geschwindigkeit von 7,0 ml/Std. eingeführt. Der pH-Wert wurde durch Zusatz von 5 n-rhuspfiorsäurc je nach Eifuidcifns ii'ii BcFctOh vuii 5,0 bis 5,5 gehalten.

Die Kultur wurde mit 400 ml Rhodotorula rubra Brühe inoculiert, die durch Aufzucht des Organismus bei 25" während 36 Stunden auf einem Aufzuchtmedium hergestellt wurde, das 2,2% (Gew/Vol.) Glukose. 0.25% (Gew/Vol.) Stickstoff als Mais-Einweichflüssigkeit. 0,5% (Gew/Vol.) Kaliumdihydrogenphosphat und 0,1% (GewyVol.) einer 1 :1 Mischung von Propylenglycol und von weißem Mineralöl enthielt (der pH-Wert wurde vor der Sterilisation auf 5,8 eingestellt). Nach der Sterilisation wurde eine Lösung von KaIium-(6R,7R)-3 acetoxymethyl-7-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carboxylat zu dem Aufzuchtmedium zur Bildung einer Konzentration von 0.1 % (Gew./Vol.) gefügt.

Proben der gemischten Kultur wurden /ur Untersuchung entnommen. Die Brühe wurde 15 Minuten bei 3000 U/Min, zentrifugiert und die überstehenden Flüssigkeiten wurden durch Dünnschichtchromatographie analysiert. Nach 12 Stunden war kein Cephalosporin C in der Probe mehr vorhanden, und eine neue Verbindung war entstanden, die als (6R.7R)-7-(D-5-Ami-

no-5-carboxypentanamido_r3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure identifiziert wurde Die Konzentration dieser Verbindung betrug 6.2 mg/ml.

4 Liter der gemischten Kultur wurden anschließend durch ein Bett einer Filterhilfe nach Einstellung des pH-Wertes auf 4.5 filtriert und es wurde (6R.7R)-7-D-5-Amino-S-carboxypentanamidoJ-S-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure aus dem Filtrat in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 abgetrennt. Das Produkt wurde an der Luft bei 35°C, unter Bildung von 17,1 g der Titelverbindung, mit einer Reinheit von 76.8% ausgedrückt als freie Säure getrocknet.

Beispiel 3

(6RJR)-3-Hydroxymethyl-7-(thien-2-ylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure

210 g (97,7% als NaSaIz) (6R,7R)-3-AcetoxymethyI-7-(thien-2-ylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure wurden in 2 Litern entmineralisiertem Wasser gelöst und durch Leiten durch ein steriles Asbestfilter sterilisiert. Die Lösung wurde zu 4 Litern 0.5-m- Phosphatpuffer (pH 6,0) gefügt die in einer 10-LiterfIasche während 30 Minuten bei 1400 kg/m² einer Autoklaven Behandlung unterzogen worden waren. Die gepufferte Lösung von (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(thien-2-yIacetamido)-

ceph-3em-4-carbonsäure wurde mit 2 Litern einer Kultur von Rhodot^rula rubra inoculiert, die 3 Tage bei 25° auf einem Rotationsschüttler in Anwesenheil von 1% (Gew/Vol.) (6R,7R)-3-AcetoxymethyI-7-(thien-2-s ylacet-amido)-ceph-3-em-4-carbonsäure aufgezogen worden war.

Die Kultur wurde mit 3 Litern pro Minute belüftet und unter Verwendung eines Magnetrührers gerührt. Die Umgebungstemperatur betrug 25° und der

in pH-Wert der Kultur betrug durchwegs 6,0-6.4. Intervallweise wurden Proben zur Dünnschichtchromatographie gegen Standardlösungen von (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(thien-2-ylacetamido)-ceph-3-em-4-carbon- säure und die Titelverbindung entnommen. Eine komplette Umwandlung war nach 67 Stunden erzielt. Die endgültige Potenz betrug ~ 25OOOμg/ml und das Volumen 6630 ml.

Bevorzugte Systeme zur Prüfung der Ausgangs- und Endverbindungen waren die folgenden:

Vuriicicfnvhicic Ccliuluscpmticii würden im 0,1 -i'ii-Acetatpuffer (pH 5.0) getaucht und langsam getrocknet. Das Lösungsmittelsystem wurde durch Schütteln von 8 Volumenteilen Äthylacetat, einem Volumenteil n-Butanol und 8 Volumenteilen Acetatpuffer während 2 Stunden hergestellt. Die wäßrige Phase wurde verworfen und die organische Phase wurde zur Befeuchtung der Platten verwendet. UiLiter einer geeignet verdünnten Probe wurde als Fleck am Ursprung aufgebracht und ein μί^εΓ Standardlosung, die 5000 μg/l enthielten.

wurde zum Vergleich verwendet. Die Platten wurden in etwa 45 Minuten entwickelt, getrocknet und mit UV-Licht während 10 Minuten (X_mlx 253 nm) bestrahlt und die getrennten Cephalosporine wurden densitometrisch quantitativ bestimmt.

Die nichtpolare Na:ur der Thienylacetamidogruppe in der 7-Stellung erlaubt die Lösungsmittelextraktion der 3-Hydro\ymet'iylvcrbindung beispielsweise wie folgt:

Zu den 6630 ml Brühe wurden 130 ml Formalin zur Tötung der Hefe gefügt. Nach dem Stehen wurde die überstehende Lösung dekantict und in 1000 ml Ansätzen wie folgt extrahiert: Der pH-Wert der Lösung wurde auf 2.2 bis 25 eingestellt und 2 Liter Butylacetat wurden zugefügt. Die wäßrige Phase wurde erneut mit 200 ml Butylacetat extrahiert. Die Butylacetatfraktionen wurden vereint (2000 ml) und eine t2.5%ige Kaliumacetatlösung in Brennspiritus (vergällter Alkohol) wurde tropfenweise zugesetzt bis keine weitere Ausfällung mehr erfolgte. Das Produkt wurde filtriert und mit Aceton gewaschen. Die Wirksamkeit der Extraktion aus der Brühe für das Kaliumsalz betrug >70% und die Reinheit des Produkts war groß. Der Zersetzungs-Schmelzpunkt von 194 bis 198° ist der gleiche wie der für eine authentische reine Titelverbindung veröffentlichte.

Beispiel 4

(6R,7R)-3-Hydroxymethyl-7-(thien-2-ylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure

a) I kg einer Rhodotorula rubra Suspension, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, und durch Gefrieren konserviert, wurde zu 10 Litern destilliertem Wasser gefügt und unter Rühren wurden 500 g Natrium-(6R,7R)-3-acetoxymethyl-7-(thien-2-yIacet-amido)-ceph-3-em-4-carboxylat 250 g Kaliumdihydrogenorthophosphat und 28,5 g Dinatriumhydrogenorthophosphat zugefügt. Die Mi-

schutii; (pH 5.8) wurde heilig gerührt, während ein rascher Luftstrom eingeleitet wurde. Das Tort schreiten der Reaktion wurde durch Dtinn- !•chicfilchromatographie auf Siliciumdioxydgelplatten. entwickelt in 0.5-m-Natriumchlorid'ösung und durch UV-Licht sichtbar gemacht, vci folgt. Nach 34 Stunden war das gesamte Ausgangsmaterial verschwunden. Die Hefe wurde durch Zentrifugieren entfernt und zurückgehalten, und die überstehende Flüssigkeit wurde durch Filtieren durch ein Kieselgurbett geklärt.

Das Filtrat wurde rasch mit 10% Orthophosphorsäurelösung auf den pH-Wert 2.1 angesäuert, während bei Raumtemperatur gerührt wurde und der feste Niederschlag wurde so rasch wie möglich abfi.triert und sorgfältig mit destilliertem Wasser gewaschen bis die Waschlösungen frei von Säure waren. Die (6R.7R)-3-Hydroxymethyl-7-(thien-2-ylacetamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure wurde im Vakuum hei 40" getrocknet und man erhielt 364 a (86% der Theorie). Sie ergab eine klare Lösung in fo!>jQH und 5% Natriumbicarboiiatlösung und wies ein f>]n+135° (c 1%. MeOH) auf. Das Ultraviolett-, Infrarot- und NMR-Spektrum waren den für die authentische Titelverbindung veröffentlichten gleich.

b) Erneute Verwendung von Rhodotorula rubra. Die wie in vorstehend a) wiedergewonnene Rhodotorula rubra wurde in 10 Liter Wasser suspendiert, und 500 g Natrium (6R,rR)-3-Acetoxymethyl-7-(thien-2-ylacetamido)-ceph-3-eiTi-4-carboxylat, 250 KaIiumdihydrogenorthophosphat und 28,5 g Dinatriumhydrogenorthophosphat wurden zugefügt, und es wurde wie vorstehend in a) belüftet und gerührt. Die Dünnschichtchromatographie zeigte, daß die Reaktion nach 22 Stunden vollständig abgelaufen war, worauf das Produkt wie vorstehend in a) isoliert wurde, wobei man 367 g (86,5% der Theorie) erhielt. Lösungen in Methanol und Natriumbicarbonatlösung waren klar; [λ]ο= 136°. Das UV-, IR- und NMR-Spektrum waren gleich den für die authentische Titelverbindung veröffentlichten. Die Hefe wurde weitere 6mal unter Bildung eines Produkts mit zufriedenstellender Qualität und bei gleichen Ausbeuten wiederverwendet.

Beispiel 5

(6R,7R)-7-[2-(Flur-2-yl)-2-methoxyiminoacetamido]-3-hydroxymethyIceph-3-em-4-

carbonsäure (syn-Isomeres)

5,0 g (11,0 mMol) des syn-Isomeren von Natrium-(6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-[2-(fur-2-yl)-2-methoxykninoacetamido]ceph-3-em-4-carboxyIats wurden in einer gerührten Pufferlösung gelöst, die 13 g KaIiumdihydrogenorthophosphat und 0,144 g Dinatriumhydrogenorthophosphat in 100 ml destilliertem Wasser enthielt Eine gefrorene Suspension von Rhodotorula rubra (10 g) wurde zu der Mischung gefügt, es wurde mechanise Ii gerührt und während 32 Stunden kontinuierlich be Raumtemperatur belüftet Durch Dünnschichtchromatographie an Siliciumdioxydgel, bei Entwicklung in 0,5-m-NatriumchIorid und Sichtbarmachen durch Ultraviolettlicht ergab sich, daß die Hydrolyse vollständig war. Die Hefezellen wurden durch Zentrifugieren entfernt und die klare überstehende Flüssigkeit wurde auf 2" gekühlt und mit 100 ml 4-Methy*pentan-2-on behandelt Zu der gerührten Mischung wurde bis

zum pH-Wert 2.0 eine 20%ige wäßrige l.ösu g von Orthophosphorsäure /ugesetzi. Es wurde weitere 3 Minuten gerührt und das Produkt wurde anschließend rasch durch Filtrieren isoliert, mit 2 χ 10 ml 4-Methylpentan-2-on. 1 χ 10 ml Salzlösung, 2 χ 10 ml Wasser bei O¹" gewaschen und im Vakuum bei 40° getrocknet, wobei man 3.25 g (77,5% der Theorie) der Titelverbindung erhielt. Das Produkt wurde in der Atmosphäre equilibriert und zeigte ein A_mat (pH 6) von 27*5 nm (f 17050); das Infrarotspektrum und das NMR j_h ^sektrum. sowie die Elementaranalyse stimmten mit der zugeordneten Struktur überein: die Reinheit erwies sich durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) als 98.2%.

Beispiel 6

(6R,7R)-7-Amino-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure

5_;0 g ifiR7R)-1-Arptnxympthv|.7-arninocpnh-3-em-4-carbonsäure-toluol-p-sulfonatdihydrat wurden in 100 ml destil'jertem Wasser bei Raumtemperatur suspendiert. Ammoniumhydroxydlösung (S. G. 0,880) wurde bis zur völligen Auflösung zugesetzt (pH 7,6). Die Lösung wurde mit 10 g einer tiefgefrorenen Suspension von Rhodotorula rubra behandelt. Die Suspension wurde mechanisch gerührt und kontinuierlich 30 Stunden bei Raumtemperatur belüftet, wobei während dieser Zeit die Hydrolyse zu 95% vollständig war (überwacht durch Dünnschicht-Siliciumdioxydplatten. Entwicklung in 0,5-m-Natriumchlorid, Sichtbarmachen unter Ultraviolettlicht).

Die Hefezellen wurden durch Zentrifugieren entfernt und die klare überstehende Flüssigkeit wurde nach dem Dekantieren auf 10° gekühlt. Der pH-Wert wurde mit 20% Orthophosphorsäure auf 3,6 eingestellt und das Produkt wurde durch Filtrieren isoliert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 40° getrocknet, wobei man 1,23 g (52,0% der Theorie) der Titelverbindung erhielt: A₁₇₁₃₁ (pH 6) 264,5 nm (ε 7000); Reinheit durch HPLC 94%. Die Infrarot- und NMR-Spektren stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

Beispiel 7

(6R,7R,2'R)-7-(2'-tert-ButoxycarbonyIamino-

2'-phenylacetamido)-3-hydroxymethylceph-

3-em-4-carbonsäure

Eine Suspension von 14,67 g (6R,7R,2'R)-3-Acetoxymethyl-7-(2'-tert-butoxycarbonylamino-2'-phenylacet- amido-ceph-3-em-4-carbonsäure in 100 ml Wasser wde mit 2 n-Natriumhydroxyd auf den pH-Wert 6 gebracht. Die resultierende Lösung wurde mit 100 ml 0,4-m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 6 verdünnt und eine gefrorene Paste von ganzen Zellen, die aus einer Kultur von Rhodotorula rubra (60 g) erhalten wurde, wurde zugefügt Die Suspension wurde heftig gerührt wobei Luft durch die Mischung während 28 Stunden geblasen wurde. Die Mischung wurde zentrifugiert und die überstehende Lösung dekantiert und mit 35 g Natriumchlorid behandelt Die Lösung (die etwas gelatineartiges Material enthielt) wurde mit Kieselgur geklärt Das Filtrat wurde mit 50OmI Äthylacetat behandelt und auf 5° gekühlt worauf es mit 25% Phosphorsäure unter heftigem Rühren auf den pH-Wert 2 gebracht wurde. Die resultierende Emulsion wurde durch einen Trichter aus gesintertem Glas filtriert, und die organische Phase wurde abgetrennt und mit

Salzlösung gewaschen und getrocknet. Das vorstehend erhaltene Kieselgur wurde mit 200 ml Wasser gewaschen und das Filtrat mn Natriumchlorid gesättigt und wie vorstehend beschrieben, unter Äthylacetat auf den pH-Wert 2 gebracht. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Salzlösung gewaschen und getrocknet. Die vereinten Äthylacetatlösungen wurden im Vakuum auf etwa 80 ml konzentriert und die Lösung auskristallisieren gelassen. Filtration ergab 5.93 g der Titelsäure in Form von feinen Nadeln vom F= 180 bis 188° (Zersetzung); [x] +19.1 c= 1.1 Dioxan); λ™, (pH 6-Phosphatpuffer) 259 nm (t 7200)

Beispiel 8

(bR,7R,2'RV^-Hydroxymethyl-7-(2'-hydroxy-2'-pheny lacetamido)-ceph-3em-4-carbonsäure

Fine Suspension von 2 g (6R, 7R, 2'R)-3-Acetoxymetrr,i-7-(2 -nydroxy^-phenyiacetamidoj-cepho-ern-'tcarbonsaure-ÄthanoIsolvat in 30 ml Wasser wurde mit 2 n-Natriumhydroxyd auf den pH-Wert 6 gebracht und die resultierende Lösung wurde mit 30 ml 0,4-m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 6 und einer gefrorenen Paste von ganzen Zellen, die aus einer Kultur von Rhodotorula rubra (10 g) erhalten wurden, versetzt Die Suspension wurde heftig während 16 Stunden in einem Becher gerührt. Die Mischung wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit dekantiert und mit Natriumchlorid gesättigt. Die Lösung wurde mit Kiesv'eur geklärt und das Filtrat mit Äthylacetat behandelt. F.s wurde anschließend auf 5° gekühlt und mit 25% Phosphorsäure unter heftigem Rühren auf den pH-Wert 2 gebracht. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit Salzlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum auf ein geringes Volumen verdampft. Die Mischung wurde filtriert, wobei man 1.05 g der Tuelsäure in Form von kleinen Plättchen vom F= 225 bis 230" (Zersetzung) erhielt: I*] +98° (c=1.1, 0.1 -m-NaHCO,). A_n,.,, (pH 6-Phosphatpuffer) 260 nm (f 8200).

Beispiel 9

Fntacylierung von (6R.7R)-3-Acetoxymethyl-7 formamido-ceph-3-em-4-carbonsäure

Fine Suspension von 12,0 g (6R,7R)-3-Acetoxymethyl 7 formamid(jeeph-3-em-4-carbonsäure in 150 ml Wasser wurde mit Im-Natriumhydroxyd auf den pH Wert 6 gebracht. Die resultierende Lösung wurde mit 90 ml 0,4-mPhosphatpuffer vom pH-Wert 6 verdünnt und es wurde eine gefrorene Paste aus ganzen Zellen, erhalten aus einer Kultur von Rhodotorula rubra (61.¹Jg) zugesetzt. Die Suspension wurde 19 Stunden heftig gerührt. Nach dem Zentrifugieren der Mischung. Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit und Klären der Lösung mit Kieselgur wurde das Produkt durch Reaktion mit Diphenyldiazomethan charakterisiert, was 8.44 g Diphenylmethyl*(6R,7R)*7-forfnamido-3'hydroxymethylceph-3-em-4-carboxyIat in Form von kleinen Nadeln vom /^r=I58° (Zersetzung) ergab; [<x]£ + 16,2° (c=\,\ Aceton); A_ma._r (Äthanol) 258 nm (e 7300). Das Infrarot-Spektrum und das NMR-Spektrum sowie die Elementaranalyse stimmten mit der zugeordneten Struktur überein.

Beispiel 10

Entacylierung von (6R.7R) 3-Acetoxymethyl-7-(D-5-benzoyiamino-5-carboxypentanamido)-ceph-

3-em-4-carbonsäure ■>

1 g (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(D-5-benzoyl-

amino-S-carboxypentanamidoJ-ceph-S-em^-carbonsäure wurde in 100 ml 0,1-m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 gelöst. Teile von 10 ml dieser Lösung wurden in

ίο jeweils in zehn 100 ml konische Glaskolben gefügt.

Zellen von Rhodotorula rubra, die in einem Nährmedium wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgezogen wurden, wurden in 0.1-m-Phosphatpuffer durch Zentrifugieren gewaschen und erneut in einem gleichen

π Volumen des gleichen Puffers suspendiert. Teile von 2,0 ml dieser Suspension wurden anschließend in jeden der 10 Kolben gefüllt, die (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-

(D-5-benzoylamino-5-carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure enthielten. Die Kolben wurden anschließend bei 25° in einem Rotationsschüttler mit einer Schüiteiweite von 5 cm, der bei 245 Ü/Min. arbeitete, inkubiert. Die Proben wurden durch Dünnschichtchromatographie auf mit Cellulose beschichteten Platten, unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus 70%igem (VoL/Vol.) wäßrigem n-Propanol analysiert. Eine Probe des Ausgangsmaterials wurde als Markierung Chromatographien. Die Ausgangsverbindung hatte einen Pf-Wert von 0,69, der während der Inkubation verschwand. Nach 72stündiger Inkubation war keine feststellbare (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(D-5-benzoylamino-5-carboxypentanamido)-ceph-3-em-4- carbonsäure vorhanden, und es wurde eine neue Verbindung mit einem Rf-Wert von 0,59 beobachtet. Diese Verbindung wurde durch Reaktion mit Diphenyldiazomethan charakterisiert, was 0,70 g Diphenylmethyl-(6R,7R)-7-(D-5-benzoylamino-5-diphenylmethoxy- carbonylpentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carboxylat ergab, das (durch Infrarot-Spektrographie) mit einer authentischen Probe identisch war.

Beispiel 11

(6R.7R)-7-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4 -carbonsäure

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, wobei jedoch eine Brühe von Rhodotorula graminis CBS 2826 anstelle der Rhodotorula rubra Brühe verwendet wurde. Die Aufzuchtsarbeitswcise für Rhodotorula graminis war die gleiche wie die in Beispiel 2 für Rhodotorula rubra beschriebene.

Durch chromatographische Analyse (Dünnschichtchromatographie wie in Beispiel 2) zeigte sich, daß die Entacetylierung innerhalb 18 Stunden vollständig war und die Konzentration an (6R.7R)-7-(D-5-Amirio-5-carboxypentanamido)-3hydroxymethylceph-3-em-4 carbonsäure betrug 6.45 mg/ml. Die Brühe (4 Liter) wurde wie in Beispiel I beschrieben, extrahiert, wobei man 16.5 g der Titelverbindung mit einer Reinheit von 7 }J% ausgedrückt als freie Säure erhielt

Beispiel 12

(6R,7R)-7-(El-5'Amino*5-carboxypentanamido)-S-hydroxymethylcephO-em^-carbonsäure unter Verwendung verschiedener Spezies des Genus Rhodotorula

Proben jedes Organismus wurden auf Agar-Schräg· kulturen eines Hefeextfakt/Peptön-Aufzüchtmedhinis

230 225/15

subkultiviert und bei 25° inkubiert, bis die Oberfläche bedeckt war. Primäre flüssige Kulturen, die von den Schrägkulturen inoculiert waren, wurden unter Schütteln 48 Stunden kultiviert und anschließend zum Inoculieren von sekundären flüssigen Kulturen des gleichen Mediums mit 0,1% (GewVVol.) (6R,7R)-3-AcetoxymetthyI-7-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure, die zur Induktion der Enzymaktivität zugesetzt wurden, verwendet. Nach 72stündiger Inkubation wurden die sekundären Kulturen zur Entacylierung von (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-

7-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure verwendet.

Proben von 83 ml O.lm-Phosphatpuffer vom pH-Wert 6 und 1,0 ml einer 10%igen (GewVVol.) wäßrigen Lösung von (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)-ceph 3-em-4-carbonsäure wurden mit 0,5 ml-Teilen von Hefebrühen, die wie vorstehend hergestellt wurden, inkubiert. Jede Probe wurde durch Dünnschichtchromatographie auf Celluloseplatten, unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus 70% (VoIyVoI.) wäßrigem n-Propanol untersucht, wobei auf jeder Platte BezugsproDen von (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure und (6R,7R)-7-(D-

5Amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxy-methylceph-3-em-4-carbonsäure auf jeder Platte mitliefen.

Die Ergebnisse der Untersuchungen von (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)-cepn-3-em-4-carbonsäure(Ceph. C) und (6R,7 R)-7-(D-5-Ammo-S-carboxypentanamidoJ^-hydruxymethyl-ceph-3-em-4-carbonsäure (DAC") nach 24stündiger bzw. 72stündiger Inkubation waren gefolgt:

Rhodotorula Species	Stamm	Konzentration von	und DA*	φι: mil	nach 7;	Stunden	14
		leph (	Stunden	C cph (	OU
		nach :4	n\i		6IS(I
		C L-ph (	61)60	340(1	2100
R. mhru	CBS 17	530	113(1		6X4(1
R. aurantiacu	CBS 311	6X20	6100		7060
R. gliitinis Viir. daircncnsis	C BS 440(i	746	73(1(1	*32o	1740
R. glntinis	CBS 20		1130	612	4>X(I
R lactosa	CBS 5K26	6730	1130	4360	270(1
R marin.i	C BS 2365	7000	15^l)(t	4260	2'2O
R minui.i	C BS 31^l>	5460	I I3(i	175(1	4520
R palhda	C BS 320	6320	2"2(i	512t»	12X0
R pihmanae	C BS 5X04	4"7(1O	^l)"6	Beispiel
kontrolle keine Hefe		6.S 20
Beispiel 13

(6R.7R)-7-(4-Carboxybutanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure

14 mg (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure in 33 ml Wasser wurden mit 03 ml lm-Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 und 0,5 ml Wasser vermischt und mit 03 ml Rhodotorula rubra Brühe inoculiert. Kontrollproben, die keine Hefebrühe enthielten, wurden auch aufgesetzt.

Nach Inkubation über Nacht bei 25° in einem Rotationsschüttler, wurden die Proben durch Dünnschichtchromatographie auf Celluloseplatten analysiert. Das Lösungsmittelsystem war 70%iges (Vol/Vol.) wäßriges n-Propannl und die Zonen wurden unter Verwendung eines Densitometers ermittelt. In Proben, ■«•u denen die Hefebrühe zugesetzt war, war das Ausgangsmaterial (Rf 0.62) verschwunden und durch eine neue Verbindung mit einem Rf-Wert von 0.47 ersetzt. Die Behandlung mit verdünnter Säure zeigte keine Wirkung auf die Kontrollproben, die mit Hilfe behandelten Proben wurden jedoch in eine Verbindung mit einer erhöhten Mobilität (Rf = 0.50) auf der ghromatographischen Platte umgewandelt. Dieses Ver halten spricht dafür, daß das Produkt der Hefebehand* lung die Titelverbindung ist.

Das Produkt war auch mit dem durch Behandlung von

(6R,7R)-7-(D-5-Amino*5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure mit D'Aminosäureoxidase aus Trigonopsis variabilis in Anwesenheit νοη Nairiumazid erhaltenen Produkt identisch.

(6R.7R)-7-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure unter Verwendung von in Polyacrylamidgel eingeschlossenen Rhodotorula rubra Zellen

Eine Kultur von Rhodotorula rubra wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. 10 ml der Brühe wurden durch Zentrifugieren gewaschen und in einem gleichen Volumen von 0.1 m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 6.0 erneut suspendiert. Die Suspension wurde mit 40% (Gew./Vol.) Acrylamidmonomeren in 10 ml Puffer. 2,3% (Gew/Vol.) N.N-Methylenbisacrylamid in 6 ml Puffer. 0.0375 g Ammoniumpersulfat, 0,048 ml N.N,N.N-Tetramethyläthylendiamin und 34 ml 0.1 m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 6 vermischt. Durch diese Suspension wurde Stickstoff geblasen, und es wurde bis zur vollständigen Polymerisation in ein Eisbad getaucht.

Ein Teil des resultierenden Gels wurde durch ein Sieb (lichte Maschenweite 0,84 mm) zur Herstellung kleiner Teilchen extrudiert. Das gesiebte Gel wurde extensiv mit Puffer gewaschen, bis in den Waschlösungen keine Hefezellen mehr vorhanden waren.

so Teile von 4.0 ml der Geisiispension wurden jeweils mit 5,0 ml O.lm-Phosphatpuffer vom pH-Wert 6 in Glaskolben vermischt und mit 10% (Gew./Vol.) (6R.7 R)-3-Acetoxymethyl-7-(D'S-amino^carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-cärbofisäufe (1,0 ml) inoculiert.

Nach 42stündiger Inkubation bei 25 g auf einem Rotationsschüttler wurde durch dünnschichtchromatographische Analyse sichtbar gemacht, daß die Konzentration an

do)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure
5,86 mg/ml betrug, wohingegen die Konzentration an (öRJRJ-S-Acetoxymethyl^-iD-S-amino-S-carboxypentanamido) ceph-3-em-4-carbonsäure auf 0,78 mg/ml gefallen war. Kontrollen mit Polya^rylamidgel ohne eingeschlossene Hefezellen wiesen lediglich Konzentrationen von (6R,7R)-7-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure von 1,2 mg/ml und restliche Konzentrationen von (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure von 5,48 mg/ml auf.

Beispiel 15

(6R.7R)-7-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido)-

i-hydroxymethylceph^-em^-carbonsäure unter

Verwendung von Rhodotorula rubra Zellen, die in

Cellulosetriacetatfasern eingeschlossen waren

Rhodotorula rubra wurde unter Schütteln bei 25° C während 72 Stunden in Anwesenheit von 0,1% (Gew./VoL) (bR,7R)-3-Ace!ovymethyl-7-(D-'i-amino-5-carboxypentanamidoJ-ceph-S-em^-carbonsäure kultiviert Die Zellen von 40 ml der gesamten Brühe wurden gewonnen, durch Zentrifugieren gewaschen und erneut in 7 ml Wasser suspendiert. Aus dieser Suspension wurde durch Zugabe von 2 ml der Suspension zu 10 ml einer 5%igen (Gew./VoI.) Lösung von Cellulosetriacetat in Methylenchlorid und rasches Rühren der Mischung während 2 Minuten, unter Verwendung eines mechanischen Rührers, eine Emulsion hergestellt. Die resultierende Emulsion v/urde durch eine Injektionsnadel aus rostfreiem Stahl in einen Wirbel extrudiert, der durch heftiges Rühren von Toldol. un.^r Verwendung eines Magnetrührers, erzeugt wuide. Es wurde ein kontinuierlicher Faden herausgezogen un um den Rührer gesammelt. Der Faden wurde aufgenommen, in Wasser gewaschen und in Wasser bei * gelagert. Das Gesamtgewicht der gewonnenen feuchttrockenen Faserbetrug I^ g.

Proben von 0,4 g der Faser wurden auf einem Filterpapier trockengepreßt und anschließend in eine Mischung von 9 ml 0,1 in-Phosphatpuffer vom pH Wert 6 und 10% (GewVVol.) (6R,7R)-3-Acetoxymethy!-7-(D-5-amino-5carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure (1,0 ml) gefügt. Nach dem Inkubieren auf einem ■> Rotationsschüttler bei 25° wurden zur chromatographischen Untersuchung Proben entnommen. Es zeigte sich, daß (6R,7R)-7-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph-J-em^-carbonsäure in einer Geschwindigkeit von 2.75 mg/g Faser/Stunde gebildet

in wurde.

Die Faser wurde aus dem Inkubationssystem wiedergewonnen und in Wasser gewaschen. Die gleiche Faser wurde erneut zur Entacylierung von (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)-

ii reph-3-em-4-carbonsäure verwendet. Man erhielt eine Produktionsgeschwindigkeit von (6R,7R)-(D-5-Amino-S-carboxypentanamidoJ-S-hydroxymtthvicephO-em^- carbonsäure von 4,15 mg/g Faser/Stunde mit der neuerlich verwendeten Faser.

Beispiel io

7/J-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido)-7oc-methoxy-S-hydroxymeihylceph-S-em^-carbonsäure

Eine gefrorene Suspension von Rhodotorula rubra CBS 6469 (30 mg Naßgewicht) wurde mit 50 mg 7j?-(D-5-Amino-5-carboxypentanamido-7a-methoxy-3-acetoxymethylceph-S-em^-carbonsäure in 0,12 ml Phosphatpuffer (0,1 m Kaliumphosphat pH 6,0) auf einem Orbital-Inkubator bei 20⁰C inkubiert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Flüssigkeit auf 0,2 ml unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden

i·; 1,15 ml Aceton zugegeben und die Mischung 3 Stunden bei 4'· C gehalten. Man sammelte 32 mg Kristalle der Titelverbindung durch Filtrieren. Die Identität des Produkts wurde durch Vergleich mit einer authentischen Probe durch Dünnschicht-Cb'-omatographiefMit-

4ri laufen auf Cellulose-Platten in n-Propanol/Essigsäure/ Wasser, 5 :1 : 2) bestätigt.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxymethylcephalosporinen der allgemeinen Formel

CH₂OH

COOH

worin R¹ eine Aminogruppe oder eine in üblicher Weise blockierte, bzw. geschützte Aminogruppe ist, R^: ein Wasserstofiatom oder eine niedrig-Alkyl-, niedrig-Alkoxy-, medrig-Alkylthio- oder niedrig-Alkanoylgruppe ist und B die Bedeutung von