DE2219454A1

DE2219454A1 - Cephalosporinderivate

Info

Publication number: DE2219454A1
Application number: DE19722219454
Authority: DE
Inventors: Robert Anthony Bouth Ulverston Lancashire; Potts James Rowland Marlow Buckinghamshire; Farthing John Eaton Southall Middlesex; Fildes (Großbritannien)
Original assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Current assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Priority date: 1971-04-21
Filing date: 1972-04-20
Publication date: 1972-11-02
Also published as: US3801458A; GB1385685A; BE782393A; CH593336A5; FR2133927A1; NL7205314A; NL177130B; NL177130C; AT324547B; FR2133927B1

Description

Dr. R. Koenigsberger - Dipl. p_hys. R. Hotabauer

Patentanwälte 22T9454

β M 0 η € h β η 2, fträuheuwtroO· 4/HI

Cephalosporin 147
12/10/ka

G-LAXO LABORATORIES LIMITED, Greenf ord, Middlesex, England

Cephalosporinderivate

Die Erfindung betrifft ein enzymatisches Oxidationsverfahren zur Herstellung von Derivaten des Antibiotikums Cephalosporin C.

In der vorliegenden Beschreibung aufgeführte Cephalosporinverbindüngen werden allgemein unter Bezug auf Cepham bezeichnet (vergl. J.Am.ChenuSoc. 1962, 84, 3400). Der Ausdruck "Cephem" bezieht sich auf die Cepham-G-rundstruktur mit einer einzelnen Doppelbindung,

Cephalosporin C [3-Acetoxymethyl-7ß-(D<-5-amino-5~carboxypentanamido)-ceph~3-em-4-carbonsäure] kann in 3-Acetoxymethyl~7ß~aniinoceph-3-em-4-carbonsäure (7-Aminocephalosporansäure oder kurz 7-ACA) und von dieser aus in 7ß-Acylamidoanaloge von Cephalosporin C, mit modifizierter antibakterieller Wirksamkeit umgewandelt werden. Jedoch hat die K-Entacylierung von Cephalosporin C viele Schwierigkeiten mit sich gebracht. Obwohl 7-ACA aus Cephalospo-

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rin C durch verschiedene Verfahren in guter Ausbeute hergestellt werden kann, besteht ein Bedürfnis nach alternativen Methoden,, die Vorteile mit sich bringen.

In der belgischen Patentschrift 736 934 der gleichen Anmelderin wird ein Verfahren zur enzymatisehen Oxidation der Seitenkette an der 7ß-Aminogruppe im Cephalosporin C beschrieben, wonach Derivate erhalten werden, die leicht zur 7-AOA F-entacyliert werden können. Nach dieser vorstehend genannten Patentbeschreibung wurde eine aus Pilzen stammende D-Aminosäureoxidase verwendet, wobei das Enzym aus den Punguszellen vor der Verwendung durch eine der vielen Methoden, die die Zerstörung bzw. Lyse der Zellen bewirken, freigesetzt wurde. Das Enzym wurde anschließend, falls dies gewünscht wurde, gereinigt, z.B. durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat. Eine derartige Lyse der Funguszellen wurde als notwendig erachtet, da gefunden wurde, daß intakte Zellen die gewünschte Reaktion nicht ergeben.

Es wurde nun gefunden, daß die Seitenkette an der 7ß-Aminogruppe von Cephalosporin C in Gegenwart von aktivierten Zellen der Hefe Trigonopsis variabilis oxidiert wird. "Aktiviert" bedeutet, daß die Hefezellen einem physikalischen und/oder chemischen Verfahren unterzogen wurden, das die darin enthaltene D-Aminosäurenoxidase zur Katalyse der Oxidation von Cephalosporin C zugänglich macht, das jedoch nicht zur substanziellen Freisetzung des Enzyms führt, d.h., daß die Zellen ρ ersieabilisiert wurden.

Dementsprechend ist ein Merkmal der vorliegenden Erfindung die Schaffung von aktivierten Zellen von Trigonopsis variabilis.

Im folgenden werden verschiedene Aktivierungsmethoden beschrieben.

Die Erfindung wird in der vorliegenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Oxidation von Cephalosporin C und seinen Derivaten beschrieben, worin die Acetatgruppe in der Seitenkette in der 3-Stellung durch den Rest eines Fucleophils oder durch eine Hydroxylgruppe oder ein Wasserstoffatom ersetzt wurde, es ist jedoch

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selbstverständlich, daß die aktivierten Seilen auch zur Oxidation anderer D-lminosäure-Substrate verwendet werden können, vorausgesetzt, daß diese durch das isolierte Enzym oxidierbar sind*

Ein weiteres Merkmal der Erfindung besteht daher in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von Cephalosporinverbindungen der allgemeinen Formel:

R. (CH₂)-₃CONH

(D

COOH

oder Salzen davon, worin X eine Acetatgruppe, den Rest eines Nucleophils, eine Hydroxylgruppe oder ein Wasserstoffatom darstellt und R die Gruppe -CO.GOOH oder -COOH bedeutet, welches darin besteht, eine Verbindung der allgemeinen Formel:

ooc

CH(CH₉KCO.NH

(II)

COOH

oder ein Salz davon, worin X wie vorstehen definiert ist, der Einwirkung von aktivierten Zellen von Trigonopsis variabilis unter aeroben Bedingungen zu unterziehen, wobei in diesen Zellen eine Katalase-Aktivität vorhanden ist, wenn die Gruppe R in dem ge~ wünschten Produkt die Gruppe -CO„COOK ist.

Beispiele für Salze der Verbindungen I und II sind natrium- und Kaliumsalze.

Ein geeigneter Stamm von Trigonopsis variabilis ist der unter der Kultur-Hummer CBS 4095 von dem Centraal Bureau voor Schimmelcultur, Baarn, Holland erhältliche Stamm,

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Die Verwendung von aktivierten Zellen von Trigonopsis variabilis anstelle eines mehr oder weniger hochgereinigten Präparats der D-Aminosäurenoxidase "besitzt mehrere praktische Vorteile» Erstens wird der zeitraubende und komplizierte Reinigungsvorgang ausge*- schaltet und durch einen einfachen Aktivierungsprozess ersetzt#

Zweitens wurde gefunden, daß das D-Aminosäurenoxidase-Enzym in aktivierten Zellen von irigonopsis variabilis weniger leicht inhibiert oder desaktiviert wird, als das isolierte Enzym, wenn es in Brühen, die bei der Fermentation von Cephalsoporium acremonium Brotzu erhalten \-/erden, verwendet wird. Dies ist ein Punkt von großer praktischer Bedeutung, da es zur Arbeitserleiohterung oft erwünsoht ist, Cephalosporin G zu oxidieren, ohne es aus der Fermentations*- brühe zu isolieren. Es ist bekannt, daß eine derartige Isolierung schwierig ist, wegen der amphoteren Natur der Verbindung und die Weiterverarbeitung des Cephalosporins C ohne Isolierung ist in der Praxis sehr vorteilhaft. Es wurde gefunden, daß die Fennentationsbrühe selbst nach teilweiser Reinigung, wie durch Entfernung des Myceliums und Ausfällung von Eiweiß, Faktoren enthielt * die die Tendenz zeigten, D-Aminosäurenoxidasen auf Pilzbasis zu inhibieren. Aus diesem Grund war ein großer Überschuß von Enzya notwendig, um eine befriedigende Reaktion sicherzustellen.

Im Gegensatz dazu scheint" das Enzym in einem großen Ausmaß vor der Inhibierung geschützt zu sein und es ist in wesentlich ge« ringerer Menge wirksam, wenn aktivierte Zellen von Srigonopsis variabilis anstelle des rohen oder gereinigten Enzyms verwendet werden»

Schließlich ist die Verwendung von aktivierten Hellen da sie ein unlösliches Enzymsystem sohaffen, da§ wiedergewönnen und wieder verwendet werden kann, wohingegen die Reinigung und Wiederverwendung des löslichen Enzyme nur btaehyfekt dttronftthr· ist«

E@ i&t alge ersiehtliah, daß die Verwendung von aktivierten lea jsu* Oxidation von Cephalosporin 0 _&i_mu veßeattiohea

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_ 5 —

schritt in der Praxis der Cephalosporinchemie darstellt.

Das Verfahren zur Aktivierung der Zellen von Trigonopsis variabilis kann auf verschiedenen Wegen durchgeführt werden, z.B. wie hierin beschrieben. Es ist nicht bekannt, welcher Mechanismus zugrunde liegt, jedoch besteht die Wirkung darin, daß das erforderliche Enzym für die Oxidation von Cephalosporin 0 zugänglich gemacht wird, während nicht aktivierte, intakte Zellen .bei dieser Reaktion keine Wirksamkeit besitzen. Es muß betont werden, daß es nicht den Anschein hat, daß die D-Aminosäurenoxidase durch den Aktivierungsprozeß in die extrazelluläre Flüssigkeit freigesetzt wird: die Aktivität ist eher an die Zellen gebunden, als an die überstehende Flüssigkeit, die ersetzt werden kann, ohne die Aktivität zu beeinflussen. Die überstehende Flüssigkeit besitzt keine bestimmbare D-Aminosäurenoxidase-Aktivitat.

Weiter wurde gefunden, daß die Aktivität von aktivierten Zellen im wesentlichen der von D-Aminosäurenoxidase äquivalent ist, die aus diesen durch Zerstörung freigesetzt wurde, z.B. durch Ultrabeschallung. In der Gegenwart von Inhibitoren, die in Cephalosporin C-Fermentationsbrühen gefunden wurden, überwiegt die Aktivität der aktivierten Zellen.

Das Aktivierungsverfahren wird so durchgeführt, daß die Zellen gewissen, in milder Weise schädigenden Bedingungen unterzogen werden, die jedoch nicht extrem genug sind, um eine Lyse bzw. Auflösung zu bewirken. Beispiele für solche Behandlungen sind:

a) Einfrieren, gefolgt von Auftauen bei saurem pH, z.B. etwa

pH 3 - 4; das Frieren kann bei einer temperatur unter -10°, z.B. etwa -20⁰C durchgeführt werden. Es sollte genügend lange gefroren werden, um die Wirkung hervorzurufen, z.B. zumindest 1 Stunde bei -20°.

b) Behandlung der Zellen in einer wäßrigen Phase.mit einem;oder ,,.. mehreren organischen Lösungsmitteln. Geeignete Lösungsmittel um-

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fassen niedrige alipliatische Ketone, z.B. Aceton; aliphatische und araliphatisch^ ein-und mehrwertige Alkohole, z.B. 2-Phenyläthanol oder niedrige Alkohole, wie n-Butanol; und aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffe, z.B. öyclohexan, Benzol oder Toluol. Toluol ist das bevorzugte Lösungsmittel. Die Behandlung "bei einer !Temperatur unter 60⁰C, z.B. bei etwa 37⁰C während etwa 30 Minuten führt häufig zu einer Aktivierung ohne v/esentliche Iiyse.

c) Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel. Das Mittel kann als wäßrige lösung verwendet werden, in einer Konzentration von z.B. 0,01 - 20 #, vorzugsweise 0,1 - 10 $ und vorteilhaft 1 io - 10 fo (alle Prozentangaben betreffen das Gewicht oder das Volumen je nach Eignung). Die Zeit und Temperatur der Behandlung können wie unter b) beschrieben sein. Geeignete kationische oberflächenaktive Mittel umfassen quaternäre Ammoniumverbindungen, z.B. Cetyltrimethylammonium-, Cetylpyridinium- und Cetyldimethylbenzy!ammoniumhalogenide.■'

Als geeignete anionische oberflächenaktive Mittel können höhere Alkylsulfate mit z.B. 10 - 18 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Dodecylsulfat, genannt werden. Solche Verbindungen werden im allgemeinen in Form ihrer Salze mit anorganischen oder organischen Basen verwendet, z.B. als Alkalimetall- oder Äthanolammoniumsalz. Andere anionische oberflächenv/irksame Mittel, die als wertvoll befunden wurden, können umfassen Alkalimetall- z.B. Natrium-Salze von Alkylaryl-sulfonaten oder von sulfoniertem Rizinusöl und . ' Alkalimetallsalze von Gallensäuren, wie ÜTatrium-desoxycholat.

Nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, z.B. Sorbitan-monolaurat, Triton X100 (ein Kondensationsprodukt von iso-Octylphenoxypolyäthoxyäthanol .und Äthylenoxid, hergestellt von der Rohm und Haas Company, Philadephia, USA) oder Digitonin können verwendet werden. -..,■;, .;-. -.-,...,

d) Behandlung mit Alkali. Es wurde gefunden, daß die Zellen durch Erhöhen des pH-Werts des Mediums, worin die Hefe suspendiert ist,

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zufriedenstellend aktiviert v/erden, Ein geeignetes Alkali ist ein wäßriges Alkalimetallhydroxid, z.B. Natrium- oder Kaliumhydroxid und eine wirksame Konzentration liegt "bei etwa n/100* Es können auch quaternäre Ammoniumhydroxide oder Alkalimetallcarbonate verwendet werden. Die Zeit und !Temperatur der Behandlung können wie unter b) beschrieben sein.

e) Osmotischer Schock. Die Aktivierung kann erreicht werden, wenn man die Trigonopsiszellen extremen osmotisehen Drücken aussetzt. Die Zellen können beispielsweise in einer Lösung von h(?- hem osmotischem Druck, z.B. einer 2m-Saecharoselösung (sucrose solution), gepuffert auf pH 8, während eines kurzen Zeitraums, z,B, 30 Minuten, suspendiert werden, worauf die Suspension rasch mit Vfasser verdünnt wird.

Es kann auch notwendig sein, die optimalen Aktivierungsbedingungen für die gewählte Aktivierungsmethode durch Versuchs- und Fehlversuchs-Experimentation zu bestimmen* Es sollte bedacht werden, daß die Aktivierung von verschiedenen Faktoren einschließlich Temperatur, Dauer der Behandlung, pH der Umgebung und Konzentration des Reagens beeinflußt v/erden kann. Unabhängig von der gewählten Aktivierungsmethode, sollten die Zellen während und nach dem Behandlung^schritt in Kontakt mit Wasser gehalten werden.

Ein Vergleich durch elektronenmikroskopisehe Prüfung von unbehandelten Trigonopsiszellen mit Zellen nach Aktivierung mit Toluol .zeigte, daß die mit Toluol aktivierten Zellen im wesentlichen intakt geblieben waren, jedoch einen völligen Zusammenbruch der Organisation des Cytoplasmas erlitten hatten, wobei keine erkennbaren internen Strukturen erhalten blieben*

Die Hefe kann nach bekannten Techniken kultiviert weiden. Es wurde gefunden, daß eine -überragende Aktivität der D^AmInOSäüreoxidase erhalten wird, wenn das Kulturmedium D^Codfr D'ft)-Methionin enthält; möglicherweise wirkt diese Verbindung die Enzymbildung» Das Ausmaß der D-hängt merklich von den lulturbeäingungen

Die D-Aminosäure-oxidase-Aktivität kann am zufriedenstellendsten durch. Bestimmung der Bildungsgeschwindigkeit spektrophotometrisoh. von Wasserstoffperoxid "berechnet werden, wobei man den Wasserst of fdonator o-Phenylendiamin als Indikator benutzt.

In der Anwesenheit von Peroxidase, wird o-Phenylendiamin durch Wasserstoffperoxid unter bildung eines braunen Farbstoffs oxidiert.

Verbindungen der Porrnel I, worin R die Gruppe -CO.CüOII ist, werden duroli Umsetzung- der geeignet en Verbindung der Formel II mit D-Aminosäurenoxidase in /mwoscnhb.it von Katalane hergestellt? Das, letztgenannte Enzym ist normal orwei se in den aktiviert on He*- fezellen vorhanden, falls erforderlich, kann jedoch zusätzlich Kataiase zugefügt v/erden. Die Menge der zusätzlichen Kataiase, die erforderlich ist, kann bequem durch vorausgehende Proben und Experimente bestimmt werden. Die Punktion der Kataiase liegt da«; rin, die oxidative Decarboxylierung bu verhindern, die zur BiIt dung von Verbindungen der Formel I, worin Il die Gruppe -COOH ist, anstelle der gewünschten Verbindungen führt (worin Ii die Gruppe -OQ.COQII ist); die Verbindungen der Formel I, worin R die Gruppe -GHQ ist, sind Zwischenprodukte bei dieser oxidativen Docarboxy«- · lierung.

Verbindungen der Formel I, worin R die Gruppe -ÖOOII ist, worden durch Inhibierung jeglicher in den Hefezellen anwesender Kaiala-r* se hergestellt. Selbst wenn die Kataiase inhibiert wurde, ent* hält das Produkt im allgemeinen Linen geringeren Anteil von a-Ketosäure (R = -00,COOH), Die Ijihibierung kann auf chemiqphcm oder physikalischem V/ege erfolgen.

Geeignete Katalase-Inhibitoren sind Ascorbinsäure, 3-Amino-i,2,3« triauol und anorganische Aside, /ilkalimetallaside, busondur;· Jja-? triumasid, sind bevorzugt. Der Inhibitor kann in der Reakilonsr? raiBchung v/ährend der Umwandlung des Ct-phalo^porinauspangnpai.eri*- als in die gewünschte Verbindung vorhanden gein, odor kann dazu verv/endet werden, die, tPrigonopsis i'-ariabiJis-Zellen vor ihrem Uin»

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satz bei der Umwandlung vorzubehandeln.

Das Natriumazid kann zu der Reaktionsmischung in einer Menge "von beispielsweise 1 mMol bis 100 mMol zugesetzt werden, oder, falls man wünscht, die Anwesenheit von relativ großen Azidmengen in der Reaktionsmischung zu vermeiden, kann das Natriumoder andere Alkalimetallazide zu einer Suspension der aktivierten Trigonopsiszellen zugesetzt werden und so lange mit diesen in Kontakt bleiben, bis keine wesentliche Katalaseaktivität mehr bestimmt werden kann. Es wurde gefunden, daß es zweckmäßig ist, Hatriumazid bis zu molaren Konzentrationen, z.B. 500 mMol zu einer Zellsuspension in Pufferlösung zuzusetzen und 15 Stunden bei einer Temperatur zwischen O⁰C und 4O⁰C, z.B. 4⁰C, zu belassen.

Alternativ kann die Katalase in den Hefezellen durch Hitzebehandlung desaktiviert werden, bevor die Zellen in dem Umwandlungsverfahren verwendet werden. Es wurde gefunden, daß die D-Aminosäurenoxidase und die Katalase, die in den Zellen vorhanden sind, unterschiedliche Hitzebeständigkeiten aufweisen und dieses Unterscheidungsmerkmal die vorwiegende Inaktivierung der Katalase möglich macht. Wenn so die Zellen bei 40 - 60°, vorzugsweise bei etwa 50° für zumindest 3 Stunden incubiert v/erden, so wird ihre Katalase-Aktivität merklich reduziert, .wohingegen die D-Aminosäurenoxidase-Aktivität erhalten bleibt. Obwohl die Hitzebehandlung der Zellen in einer einfachen wäßrigen oder gepufferten Suspension durchgeführt werden kann, ist es besonders zweckmäßig, die · Zellen .unter gleichzeitiger Behandlung mit einem "Aktivierungs"-Reagens zu behandeln. Beispielsweise kann die Aktivierungsbehandlung mit einem Lösungsmittel, wie Toluol, 4 Stunden bei 50⁰C durchgeführt werden, um gleichzeitig, eine Inhibierung der Katalase und . eine .Zellaktivierung zu erzielen.-.

Die Umsetzung des Enzymsystems der aktivierten Zellen mit der- Verbindung der-. Formel II kann bei einem pH von 4 bis 9 und z-.B. '6 bis 8 durchgeführt, werden.. Temperaturen zwischen Raumtemperatur"- und etwa 65⁰C, z.B. 3O°-4O°C, können verwendet werden. Jedoch

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sollten sowohl die pH- als auch die Temperaturbedingungen nicht so gewählt werden, daß sie zur Entaktivierung des Enzyms führen. Eine Enzymmenge von nicht weniger als 5 Einheiten/mg (wie nachstehend definiert) des isolierten Cephalosporin-Ausgangsmaterials sollte vorzugsweise verv/endet werden. Bei dieser Menge kann eine Reaktionszeit von zumindest 3 Stunden notwendig sein. Mit höheren Enzymniveaus, z.B. 6-500, vorzugsweise etwa 100 Einheiten/mg, sind kürzere Reaktionszeiten, z.B. 1/2 Stunde, möglich. Bei Cephalosporin-Fermentationsbrühen (entweder roh oder teilweise gereinigt) sollte im allgemeinen ein Enzymspiegel von nicht weniger als 10 Einheiten/mg verwendet v/erden.

Es ist erforderlich zu Rühren unter Belüftung entweder mit Luft oder Sauerstoff. Das Ausmaß des Rührens und der Belüftung hängt vom Maßstab der Arbeitsweise ab.

Die Verbindungen der Formel I, worin R eine -CO.COOH-Gruppe ist, sind nicht sebr stabil und die Reaktionsbedingungen und besonders die Reaktionszeit (die kurz sein sollte, z.B. 1/2 - 2 Stunden) müssen sorgfältig gewählt werden.

Wie bereits erwähnt wurde, ist es schwierig, Cephalosporin C aus den Fermentationsbrühen zu isolieren, wegen seiner amphoteren Struktur und hydrophilen Ifatur. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in situ (vor oder nach. Entfernung des Myceliums) in einer Cephalosporin C-Fermentationsbrühe unter geeigneten Bedingungen durchgeführt werden und die erhaltenen Verbindungen der Formel (X = Acetoxy) gewonnen werden. Das Verfahren wird normalerweise nach Ansäuern und Filtration der Brühe durchgeführt. Danach können die erhaltenen Verbindungen der Formel I durch Lösungsmittelextraktion oder durch Adsorption an einer Ionenaustauschersäule gewonnen werden, ,

Die Verbindungen der Formel I, worin X eine Acetatgruppe ist, können zweckmäßig aus der wäßrigen Lösung, in der sie hergestellt wurden, beispielsweise durch Ansäuern,auf einen pH von 2,5 oder

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weniger und Extraktion mit einem geeigneten organischen !lösungsmittel, z.B, Äthyiaeetat oder n-Butanol, extrahiert werden» Mehr-» fache Extraktionen mit Athylacetat ergeben eine im wegentliehen vollständige Extraktion, jedoch kann die Wirksamkeit verbessert werden, wenn man die wäßrige Phase mit einem wasserloslichon inerten organischen Salz, z,B, Natriumchlorid, sättigt oder im wesentlichen sättigt* ■

Bei dor Isolierung der Produkte sowohl aus Fermentationsbrühen als auch "aus einfachen wäßrigen Lösungen, wurde gefunden, QaR . ein System unter Verwendung einer Kombination eines lonenaustau^· scherß und einer "lösungsmittelextraktion gute ErgebnisBO Liefert,, Geeignete Ionenaustauscher sind die von Rohm und Haas Oq, unter den Namen Amberlite LA1, 1A2 und LA3 (LA1 und LA 2 sind sekundäre Amine; LA3 ist ein primäres Amin) vertriebenen höchmolekularon flüssig-Amin-'Anionenaustauseher, Geeignete Lösungsmittel zur Tor*· Wendung in Verbindung mit den flüssig en -Aiii on- Austausohern sind n*-Butanol und Butylacetat»

Ein System das mit besonderem Vorteil bei Extraktionen von ent*- proteinisierten Öephalosporin-Permentationsbrulien verv/ondtit wurde ist Amberlite LAI in n-Butanol, gefolgt von einer Hüokextrnktion mit liatriumbicarbonatlösung und anschlioßendpr Extraktion in Äthylacetat, Der pH der Brühe wird vor der Extraktion vorKugör-Wüise unter 6 und besonders bevorzugt auf 3 - f> gesenkt«.

Das feste Harz Anberlite }L4.D2_f das ein makrorctiküiäres^ Tüi'iiPtB-tes Polystj^rolpolymerisat ist, kann auch zur Extraktion νPU Verbindungen der jTorrael I, -worin X eine Acetaigruppß ist, aus £qhon oder cntproteinisierten Cephalpsporin-Eermentationsbriihen yerv/ε-η^ det vmrden. Ein geeignetes Lösungsmittel zuv Elution der adpprbierten Verbindung aus dem Harz, kann durph yorliergehentle Versuche bestimmt werden* Im Falle von S^AcetoxymDthylr-YS^i^^arbpxyfer butanamido)--ceph-3^em--4^ca3?bonsäure ist Aceton ein geeigneten Lösungsmittel,

Die Verbindungen der Formel I, woriii X der Rest eines Ifucleophils

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oder eine Hydroxylgruppe oder ein Wasserstoffatom ist, können aus dem wäßrigen Medium, in dem sie hergestellt wurden, in gleicher bzw. ähnlicher Weise wie oben beschrieben, gewonnen v/erden. Diese hängt von der Natur der X-G-ruppe ab und Änderungen der Extraktionsbedinungen können notwendig sein. Diese können einfach durch vorausgehendes Probieren bestimmt werden.

Verbindungen der Formel I, worin R gleich -COOH ist, können in die entsprechenden 7ß-Aminoverbindungen umgewandelt v/erden, "durch Reaktion des entsprechenden 4-Esters mit einer Imidhalogenid-bildenden Komponente, und Überführen des so erhaltenen Imidhalogenids in den Iminoäther mit Zersetzung des letzteren. Gegebenenfalls kann die Estergruppe durch Hydrolyse oder Hydrogenolyse (falls geeignet) unter Bildung der 4-Carbonsäure abgespalten werden. Geeignete Imidhalogenid-bildende Verbindungen umfassen Säurehalogenide, die sich von Phosphorsäuren ableiten, wobei die bevorzugten Verbindungen die Chloride sind, wie beispielsweise Phosphoroxychlorid oder Phosphorpentachlorid.

Die Methode zur N-Entacylierung wird genauer in den britischen Patentschriften 1 041 985 und 1 119 806, in der belgischen Patentschrift 719 712 und in den südafrikanischen Patentbeschreibungen 68/5048 und 68/5327 beschrieben.

Verbindungen der Formel I, worin R eine -CO.COOH-Gruppe ist, v/erden vorzugsweise, beispielsweise unter Verwendung eines Alkalimetallborhydrids zu den entsprechenden Verbindungen reduziert, worin R eine -CH(OH)COOH-Gruppe ist, bevor die modifizierte Seitenkette nach der in der belgischen Patentschrift 719 712 beschriebenen Methode entfernt wird.

Infolgedessen sind wichtige Verbindungen der Formel I solche, worin (A) R gleich -CO.COOH und X eine Acetatgruppe sind, nämlich 3-Acetoxymethyl-7ß-(5-carboxy-5-oxopentanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure und (B) R gleich -COOH und X eine Acetatgruppe sind, nämlich 3-Acetoxymethyl-7ß-(4-carboxybutanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure. Diese Verbindungen sind Schlüsselzwischenpro-

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dukte "bei der Herstellung von 7-ACA, aus dem natürlich vorkommenden Cephalosporin C. Die Verbindung (B) (R = -COOH) ist in dieser Hinsicht besonders wichtig.

Die Ausgangsverbindungen des erfindungsgemäßen Verfahrens, worin X den Rest eines ifucleophils bedeutet, können durch Umsetzung von Cephalosporin C mit einem Hucleophil hergestellt werden, beispielsweise mit Pyridin oder einem anderen tertiären Amin, wie in der britischen Patentschrift 912 541 beschrieben; einem Schwefel-bindenden, Stickstoff-bindenden oder anorganischen Fucleophil, wie in der britischen Patentschrift 1 012 943 beschrieben; einem Schwefel-bindenden Nucleophil, wie in der britischen Patentschrift 1 059 562 beschrieben; einem Stickstoff-bindenden ITucleophil, wie in den britischen Patentschriften 1 030 630, 1 082 943 und 1 082 962 beschrieben; einem Schwefel-bindendem Hucleophil, wie in der britischen Patentschrift 1 101 423 beschrieben. Diese Aufzählung dient nur der Veranschaulichung und soll keine Einschränkung darstellen. Wenn X eine Hydroxylgruppe darstellt, kann die Verbindung nach den in der britischen Patentschrift 1 101 308 beschriebenen Methoden hergestellt v/erden; wenn X ein Wasserstoffatom ist, kann die Verbindung nach der in der britischen Patentschrift 957 569 beschriebenen Methode hergestellt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Vorbereitende Maßnahmen.

Die Kulturen wurden zuerst in geschüttelten Kolben und anschliessend in gerührten Fermentiergefäßen herangezogen, die das von Sentheshanmuganathan und Kickerson (1962) J. Gen. Microbiol. 27, 465 beschriebene Medium mit entweder Methionin oder Alanin als Stickstoffquelle enthielten.

Abschätzung der D-Aminosäurenoxiaase-Aktivität.

Die Aktivität der Aminosäurenoxidase (AAÖ) wurde spektrophotome-

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trisch durch. Verfolgung der Bildungsgeschwindigkeit von Wasser stoffperoxid (H₂O₂) bestimmt.

Die Methode basiert auf den gekoppelten Reaktionen, die durch die Gleichungen 1 und 2 veranschaulicht werden.

(1) Aminosäure + H₂O + O₂[AAOl a-Ket ο säure + HlL, + H₂O₂

(2) H₂O₂ + DH₂ [POJD]^. 2H₂O + D

Wasserstoffperoxid oxidiert in der Anwesenheit von Peroxidase (POD) den Wasserstoffdonator o-Phenylendiamin (DHp) zu einem braunen Farbstoff (D).

Die Probe wurde bei 37° in einer Glasküvette mit 1 cm Mchtweg durchgeführt und die Bildung des braunen Farbstoffs wurde bei 4-20 mn verfolgt. Die Reaktionsmischung bestand aus 1,0 ml 0,1 m-Katriuinpyrophosphatpuffer, pH 8,1, 0,5 ml o-Phenylendiaminlösung (0,02 ⁰Jo o-Phenylendiamin in Wasser), 0,3 ml Substrat (1 $6 Kalium-Cehalosporin 0 oder 2 fo D-Alanin in Natriumpyrophosphatpuffer, pH 8,1), 0,01 ml Peroxidase (10 mg/ml wäßrige lösung) und ausreichend Wasser, um das Endvolumen auf 2,8 ml einzustellen.

Die Reaktion wurde durch, den Zusatz von 0,2 ml Enzymlösung zu der Reaktionsmischung gestartet. Die Blindprobe wurde unter identischen Bedingungen, unter Verwendung von Wasser anstelle des Substrats, durchgeführt.

Das lineare Anwachsen der optischen Dichte bei 420 nm während der ersten 5 Minuten wurde zur Messung der AAO-Aktivität verwendet.

Eine Einheit der Enzymaktivität ist als die Menge des Enzyms definiert, die bei 37° und pH 8,1, einen Viechsei der optischen Dichte von 0,001/Min bewirkt.

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Aktivierung von Trigonopsis variabilis

10 ml-Proben der gesamten Trigonopsis variabilis-Fermentationsbrühe wurden. 5 Minuten zentrifugiert (HOO g) und die überstehenden Flüssigkeiten verworfen. Die so gebildeten feuchten Kügelchen von sedimentierten Zellen wurden, wie folgt, verschiedenen Behandlungen unterzogen:

a) "bei 4⁰C gelagert und anschließend in 10 ml Wasser suspendiert.

b) in 10 ml 0,01 m-lTatriumpyrophosphatpuffer, pH 8,1, suspendiert "und 30 Minuten bei 20 kHz in einem M.S.E. (Modell 60W)-Ultraschall-Generator mit Schall behandelt, anschließend durch Zentrifugieren geklärt. _e

c) bei -20⁰O für nicht weniger als 1 Stunde gefroren, dann durch Stehen bei Raumtemperatur aufgetaut und in 10 ml Wasser suspendiert.

d) in den folgenden Reagent!en (10 ml) bei 4⁰C 24 Stunden lang suspendiert, 5 Minuten zentrifugiert bei 1400 g und die Zellen in 10 ml Wasser erneut suspendiert:

Digitonin (1 <fo Gew./Vol.)

Span 20 (1 $ Vol./Vol) (oberflächenwirksames Mittel, nämlich Sorbitan-monolaurat)

NaOH (n/100)

Cyclohexan (95 % Vol./Vol., d.h. 9,5 ml Cyclohexan und 0,5 ml Wasser)

Aceton

Benzol (2 $ Vol./Vol) und n-Butanol (4 $ Vol./Vol.) n-Butanol (2,5 # Vol./Vol) und Toluol (1 <fo Vol./Vol.)

Alle diese Proben wurden auf die D-Aminosäurenoxidaseaktivität untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgezeigt.

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Tabelle I

.Behandlung D-Aminosäurenoxidase-Aktivität.

Einheiten/ml (Durchschnitt)

gelagert bei 4⁰C O

mit Schall behandelt 735

gefroren und aufgetaut 782

Digitonin 516

Span 20 640

NaOH 765

Cyclohexan 290

Aceton 420

Benzol/n-Butanol 390

n-Butanol/Toluol 832

Weitere Arbeiten über die Aktivierung von Trigonopsis variabilis wurden unter Verwendung von Kulturen mit höherer D-Aminosäurenoxidase-Aktivität durchgeführt. Die aktivierenden Mittel waren a) oberflächenaktive Mittel, b) organische Lösungsmittel und c) osmotischer Schock.

a) Oberflächenaktive Mittel:

10 ml Proben einer Kulturbouillon von Trigonopsis variabilis (gelagert bei 4⁰C) wurden 5 Minuten zentrifugiert (1400 g ) und die überstehende Schicht entfernt. Der Zellrückstand

wurde erneut in einer 0,1 $ Lösung des geeigneten oberflächenaktiven Mittels in 0,1 m-liatriumpyrophosphatpuff er, pH 8,1, suspendiert und bei konstanter Temperatur während einer bestimmten Zeitdauer incubiert. Die Zellsuspension wurde zu Beginn der Incubationsperiode 30 Sekunden gerührt und dann in Abständen von 5 Minuten im Verlauf der Incubation. In allen Fällen wurden folgende Inaubationsbedinungen eingehalten:

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5	Minuten	: 4⁰C
30	Minuten	: 4⁰C
5	Minuten	: 37⁰C
30	Minuten	: 37⁰C

Anschließend an die Incubation wurde die Zellsuspension (falls dies zweckmäßig war) auf 4°C gekühlt, 5 Minuten zentrifugiert (1400 g ) und die überstehende Schicht abdekantiert und verworfen. Der Zellriickstand wurde anschließend durch erneutes Suspendieren in destilliertem Wasser gewaschen, weitere 5 Minuten zentrifugiert und die überstehende Schicht abdekantiert. Der endgültige Zellrückstand wurde in 0,01 m-Hatriumpyrophosphatpuffer, pH 8,1, erneut suspendiert und so verdünnt, daß sich eine Aktivität von 50 - 100 Einheiten/ml ergab. Alle Bestimmungen der D-Aminosäurenoxidase-Aktivität wurden unter Verwendung der vorausgehend beschriebenen spektrophotometrischen Probe durchgeführt .

Alle Behandlungen wurden doppelt durchgeführt und das endgültige Ergebnis als Mittelwert ausgedrückt.

Die endgültige Suspension wurde mikroskopisch untersucht und in allen Fällen schienen die Zellen intakt geblieben zu sein und waren bei einer Vergößerung von 900 χ von unbehandelten Zellen nicht zu unterscheiden; jedoch konnte eine gewisse Veränderung der internen Struktur im Elektronenmikroskop festgestellt werden.

Die D-Aminosäurenoxidase-Aktivitäten, die sich aus verschiedenen Behandlungsmethoden ergaben, wurden mit der Aktivität von unbehandelten Zellen und mit der Aktivität von einem rohen zellfreien Enzympräparat verglichen. Im letzteren Pail wurde das Enzym aus den Zellen durch Ultrabeschallung während 30 Minuten bei 4⁰C in der Anwesenheit von 0,01 m-Natriumpyrophosphatpuffer, pH 8,1, freigesetzt. Dieser durch Schall behandelte Extrakt wurde

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durch Zentrifugieren bei 3>8 000 g während 15 Hinuten "bei 4⁰G., vor Durchführung der Probe, geklärt. Es ergaben sich folgende ' Ergebnisse:

[Tabelle II (a)

Oberflächen aktives Mittel	D-Aminosäurenoxidase-Aktivität Einheiten/ml und Behandlungszeit/Iemp	30 min/ 4°C	5 min/ 37⁰C	30 min/ 37?C
Cetyltrimethyl- ammonium - bromid	5 min/ 4⁰C	3,120	2,380	2,590
Cetyl - pyridinium - chlorid	2,070	2,250	2,520	2,260
CetyIdimethy1- benzylammonium- chlorid	2,380	2,350	2,130	2,520
Natrium- desoxycholaf	2,320	1,080	1,010	1,260
Digitonin	1,200	1,410	1,970	2,260
tTatrium-dode- oylsulfat	1,100	1,870	2,090	2,160
1,980

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(Tabelle II (Tj)

2219A54

Kontroll versuche	mittlere D-Aminosäurenpxidase~ Aktivität, Einheiten/ml
unbehandelte Zellen	keine bestimmbare Aktivität
.zellfreies Enzym präparat	1,920

Weitere Aktivitätstests wurden unter Verwendung einer Lösung von Triton X100 durchgeführt.

5 ml-Proben von T. variabilis—3?ermentationsbrühe wurden bei 1400 g während 5 Minuten zentrifugiert und die überstehenden Schichten verworfen. Die so gebildeten nasse Zellmasse wurden in 10 ml 0,1 m-lTatriumpyrophosphatpuffer, pH 8,1, die Triton X100 enthielten, suspendiert. Die Aktivierungsbedingungen und Behandlung der Zellen vor der Probe, wurden wie unmittelbar vorstehend beschrieben, durchgeführt, wobei jedoch die Incubationen nur bei 4° und 37° während 30 Minuten durchgeführt .wurden. Es ergaben sich folgende Ergebnisse:

Tabelle III(a)

Triton X100 Konzentration ($)	D-Aminosäureoxidase-Aktivität Einheiten/ml
1,0 10,0 20,0	Aktivierung bei 4° Aktivierung 37°
1 680 15 600 4 200 20 800 4 600 22 000

0 9845/123 2

!Tabelle III (Tj)

Eontrollversuche	D-Aminosäurenoxidase-Aktivität (Einheiten/ml)
unbehandelte Zellen	keine bestimmbare Aktivität
zellfreies Enzym präparat	22 800

b) Organische Lösungsmittel;

Proben einer Kulturbrühe wurden wie in Abschnitt a) vorstehend beschrieben hergestellt, wobei jedoch die Incubation in der Anwesenheit von verschiedenen organischen Lösungsmitteln bei zwei verschiedenen Konzentrationen durchgeführt wurde. Yor der Incubation wurde die gewaschene Zellmasse in 0,1 m-Hatriumpyrophosphatpuffer, pH 8,1, erneut suspendiert und zu dieser Suspension wurde das geeignete Lösungsmittel (1 $ oder 10 ^) zugefügt (ungeachtet des*sen, ob die Mischung mischbar war oder nicht).

Es ergaben sich folgende Ergebnisse; "n.d." bedeutet: keine bestimmbare Aktivität:

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!Tabelle IV (a)

Lösungs mittel	D-Aminoäsurenoxidase-Aktivität, Einheiten/ml und Behandlungs-Zeit/Temp.	5 min/ 4⁰C	30 min/ 4°C	5 min/ 37°C	30 min/ 37°C
Äthanol n-Propanol n-Butanol Benzol Toluol	[ionz.	n.d. 485 2,770 4,480 3,900 4,400 4,388	250 380 2,300 4,600 5,080 4,060 4,490	210 490 4,060 4,500 4,160 4,145	325 620 4,080 3,780 4,525 3,840
10% 10%. 10% 1% 10% 1% 10%

!Tabelle IY (b)

Kontrollversuche	mittlere D-Aminosäurenoxidase- Aktivität, (Einheiten/ml)
unbehandelte Zellen	n.d.
zellfreies Enzympräparat	3 730

In gleicher Weise wurden feuchte Zellrückstände, die aus 5 ml-Proben von I.variabilis-Fermentationsbrühen von höherem D-Aminosäurenoxidase-Iiter erhalten wurden, mit 1 $-igen und 10 $-igen Lösungen von 2-Phenyläthanol unter Anwendung der gleichen, wie oben beschriebenen Verfahrensweise behandelt, wobei die Incubation in 30 Minuten bei 4⁰C und 37⁰C durchgeführt wurden. Es ergaben sich folgende Ergebnisse:

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Tabelle V(a)

Behandlung	D~Aminosäurenoxidase-Aktivität (Einheiten/ml)
2-Phenyläthanol 1 # 2-Phenyläthanol 10 fo	Aktivierung bei Aktivierung bei 4° 37°
2 000 5 800 9 200 9 600

!Tabelle

Kontrollversuche	. — . j _t D-Aminosäurenoxidase-Aktivität (Einheiten/ml)
unbehandelte Zellen zellfreies Enzympräparat	keine bestimmbare Aktivität ^ 12 000

c) Osmotischer Schock;

Es wurden die folgenden Pufferlösungen verwendet; tris-HCl bedeutet 1,1~Di-(hydroxymethyl)-2-hydroxyäthylamin-hydrochlorid und EDTA bedeutet Äthylendiamintetraessigsäure. Die Puffer (2) und (4) hatten einen hohen osmotischen Druck, da sie 2m-Saccharose (sucrose) enthielten.

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Tabelle VI(a)

Puffer	O.OIM Tris- HCL pH 8.0	2m Saccha rose (Sucrose)	"θ. 01 MgSO₄	1" mMol EDTA
(D	+		+	-
(2)	+	+	+	-
(3)	+	-	+	+
" W	+	+	+	+

5 ml-Proben von T. variabilis-Fermentationsbrühen wurden 5 Minuten bei 1400 g zentrifugiert und die überstehenden Schichten verworfen. Die nassen so gebildeten Rückstände wurden erneut in Pufferlösungen (1) oder (3) (10 ml) suspendiert und nochmals zentrifugiert. Dieser Vfeschvofgang wurde wiederholt und der Zellrückstand schließlich in Puffern (1), (2), (3) oder (4) (10 ml) erneut suspendiert und 30 Minuten bei 37⁰C incubiert.

Jede Suspension wurde darauf auf 100 ml mit kaltem Puffer (1) oder (3) verdünnt und 10 ml-Proben entnommen. Nach Zentrifugieren bei 1400 g wurde der Zellrückstand wieder in 0,01 m-Katriumpyrophosphatpuffer, pH 8,1, suspendiert und vor der Probe mit Puffer verdünnt.

Es ergaben sich die folgenden Ergebnisse. Zum Vergleich wurde eine 5 ml-Probe der Permentationsbrühe in ein zellfreies Enzympräparat übergeführt.

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2219Λ54

Tabelle VI(b)

Bei der Incubation verwendeter Puffer	D-Aminosäurenoxidase-Alctivität (Einheiten/ml)
(D (2) (3) (4)	n.d. 5 600 n.d. 6 050
zellfreies Enzympräparat unbehandelte Zellen	23 600 n.d.

Oxidation von Cephalosporin 0 Beispiel 1

a) Trigonopsis variabilis (CB.S. 4095) wurde in einem syntetischen Medium, das Methionin enthielt, gezüchtet, wie in den vorbereitenden Maßnahmen vor den Beispielen beschrieben. Die Zellsuspension wurde durch Zentrifugieren gewonnen und die nasse Zellinasse zurückbehalten.

Die nassen Zellen wurden in 4 gleiche Teile geteilt und durch Einfrieren auf -2O⁰C, gefolgt von Auftauen bei Raumtemperatur, "aktiviert". Fach dem Verdünnen mit Wasser ergab sich eine Suspension von Zellen von 61,7 % Naßgew/Vol. Wenn diese Suspension unter Anwendung der vorhergehend beschriebenen spektrophotometrischen Prüfung untersucht wurde, so wurde gefunden, daß sie 32 200 En- ' zym-Aktivitätseinheiten/ml besitzt.

40 g eines Kalium-Cephalosporin C-Präparats mit einer Reinheit von 68 io (d.h. 27,2 g Kalium-Cephalosporin C) wurden in 2 Litern 0,2 m~Hatriumpyrophosphatpuffer, pH 8,1, der 260 mg Natriumazid enhielt, gelöst, und mit Wasser auf 3990 ml verdünnt. Die Lösung

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. -22-1945A-

die sich in einem gerührten Gefäß befand, wurde in einem Wasserbad 30 Minuten lang der Temperatur τοη 33⁰C angeglichen. Die Umwandlung wurde durch Zusatz von 10 ml der vorstehend beschriebenen Zellsuspension begonnen und wurde 3 Stunden bei einer Luft- . strömungsgeschwindigkeit von 3 l/Min, und einer Rührgeschwindig-■keit von 550 ü/Min.(rpm) fortgeführt. Die Umwandlung wurde durch Zentrifugieren des Gefäßinhalts bei 2100 g während 1 Stunde beendet.

Analyse durch quantitative (Ultraviolettabsorption) Dünnschichtchromatographie von Proben, die in gewissen Zeitabständen aus dem Reaktionsgefäß entnommen wurden, zeigte, daß die Umsetzung in etwa 1,5 Stunden vollständig war,und daß 68 $ des Cephalosporins C in 3-Acetoxymethyl-7ß-(4-carboxybutanamido)-ceph-3-em-4-,carbonsäure umgewandelt worden waren. Das verwendete Enzym-Blveau entsprach 12,8 Einheiten/mg Cephalosporin C (freie Säure).

Das vorstehende Produkt wurde aus der geklärten Reaktionsmischung wie folgt extrahiert:

2 Liter der Reaktionsmischung wurden auf den pH 1,5 unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure eingestellt und in 8 χ 1,6 1 Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetatextrakte wurden im Vakuum auf etwa 800 ml eingedampft und über Nacht unter Verwendung von wasserfreiem natriumsulfat getrocknet. Der getrocknete Äthylacetatextrakt wurde weiter im Vakuum auf 50 ml eingedampft und anschließend langsam zu 700 ml Leichtpetroläther (60 - 80°) unter heftigem Rühren gefügt.

Die erhaltene Ausfällung wurde abfiltriert und im Vakuum über Aluminiumoxid getrocknet, wobei sich 9,83 g 3-Aeetoxymethyl-7ß-(4-carboxybutanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure in P.orm eines blass-^

gelben Peststoffes mit einer Reinheit von 84 # [i;]'⁰ = 201 _ ι cm

(260 nm)J erhalten wurden. Durch dünnschichtchromatographische Analyse dieses Peststoffes konnten keine weiteren UV.(254 nm)-Absorptionszonen festgestellt werden. Dies entspricht einer gesamt umwandlung von Kaliumcephalosporin C zu dem vorstehenden Pro-

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dukt von 72 #.
Beispiel 2

Zellen von T. variabilis aus einer 1 Liter-Probe der Fermentationsbrühe wurden durch Zentrifugation bei 2100 g während 30 Minuten bei 4⁰C gewonnen. Die überstehende Schicht wurde verworfen und die Zellmasse wieder in 1 1 ITatriumpyrophoshatpuffer, pH 8,1, suspendiert. Gleiche Teile von 100 ml dieser Zellsuspension wurden zu 10 ml Toluol in 250 ml-Kolben gefügt. Die nicht mischbaren Mischungen von Toluol und der wäßrigen Zellsuspension wurden 2 Stunden bei 37⁰C auf einer Rotations-Schüttelvorrichtung (300 U/Min.) incubiert. Der Inhalt der Kolben wurde anschließend auf 4⁰C gekühlt, 30 Minuten bei 2100 g zentrifugiert und die überstehenden Schichten entnommen und verworfen. Die Zellmasse wurde anschließend in 100 ml destilliertem Wasser erneut suspendiert, wieder zentrifugiert und die überstehende Schicht entfernt und verworfen. Die so behandelten Zellmassen all dieser Kolben wurden anschließend vereinigt und mit 0,1 m-Eatriumpyrophosphatpuffer, pH 8,1, auf ein Gesamtvolumen von 200 ml gebracht. Diese Suspension wurde untersucht ; es wurde gefunden, daß sie 22 880 Enzymaktivitätseinheiten/ml enthielt.

Eine Umwandlung von Cephalosporin C wurde unter gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei die Reaktion durch Zusatz von 10,5 ml der vorstehend beschriebenen Zellsuspension begonnen wurde.

Die quantitative dünnschichtchromatische Analyse von Proben, die in gewissen Zeitabständen aus dem Reaktionsgefäß entnommen wurden, ergab, daß die Umsetzung in etwa 2 Stunden beendet war, und daß 68 fo des Cephalosporins C in 3-Acetoxymethyl-7ß-(4-carboxybutanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure umgewandelt worden waren. Das verwendete Enzymniveau entsprach 9,6 Einheiten/mg Cephalosporin C (freie Säure).

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Beispiel 3

4,8 1 Kulturbrühe aus einer Fermentation von Cephalosporium acremonium (Brotzu) wurden bei 2100 g 1 Stunde bei 4⁰O zentrifugiert und die überstehende Schicht gewonnen. Der pH der überstehenden Schicht wurde auf pH 4,5 mittels Schwefelsäure eingestellt und es wurde durch Zentrifugieren bei 2100 g während 1 Stunde bei 4⁰C geklärt. Die überstehende Schicht wurde gewonnen, mit Schwefelsäure der pH 2,8 eingestellt und wie vorstehend beschrieben, durch Zentrifugieren geklärte Die erhaltene überstehende Schicht wurde mit HaOH auf pH 8,1 gebracht und nochmals durch Zentrifugieren geklärt. Dieses "Proteinfiltrat" (3,23 l) zeigte durch mikrobiologische Untersuchung einen Gehalt von 22,3g Kalium-Cephalosporin C. Das "Proteinfiltrat" wurde durch Zusatz von 0,2 m-Hatriumpjrophosphatpuffer, pH 8,1, der insgesamt 260 mg Natriumazid enthielt, auf 3,975 1 verdünnt.

Die vorstehende Mischung vjurde unter den gleichen Bedingungen wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben oxidiert, wobei die Reaktion durch Zusatz.von 23 ml der Kalisuspension von loluol-behandelten Zellen, beschrieben in Beispiel 2, eingeleitet wurde«

Die quantitative dünnschichtehromatographisehe .Analyse von Proben, die in gewissen Abständen aus dem Reaktionsgefäß entnommen wurden, zeigte, daß die Umsetzung nach etwa 2,5 Stunden vollständig war, und daß 73 fi des Cephalosporins 0 in 5-Acetoxymethyl-7ß-^-carboxybutanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure umgewandelt worden waren.

Das verwendete Enzymniveau entsprach 25,6 Einheiten/mg Cephalosporin C (freie Säure).

Beispiel 4

Eine Cephalosporin C-enthaltende Fermentationsbrühe wurde durch Abfiltration des Myceliums und Proteins (nach Ausfällung) gereinigt. Das Filtrat, das 4,8mg/ml Cephalosporin C enthielt, wurde mit In-NaOH auf den pH 8,0 gebracht und durch Zentrifugieren ge-

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klärt (18 000 g ).

5 ml des geklärten Filtrats wurden mit 3 ml 0,2 m-Natriumpyrophosphatpuffer, pH 8,0, 1 ml 0,01 m-Natriumazid und 1 ml eingefrorener und aufgetauter Zellsuspension (224 Einheiten D-Aminooxidasen-Aktivität) vermischt, "belüftet und 4 Stunden bei 33⁰C incubiert. Die Untersuchung der erhaltenen Mischung durch Dünnschicht Chromatographie auf mit Siliciumdioxid beschichteten Platten, entwickelt mit 80 °/o wäßrigem Aceton, zeigte, daß 90 fi des Cephalosporins C verbraucht waren ,und daß der größte Anteil davon in 3-Acetoxymethyl-7ß-(5-carboxy-5-oxopentanamido)-ceph—3-em-4" carbonsäure und 3-Acetoxymethyl-7ß-(4-carboxybutanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure umgewandelt worden war.

Beispiel 5

40 g eines Kalium-Cephalosporin-C-Präparats mit einer Reinheit von 68 io (d.h. 27,2 g Kalium-Cephalosporin C) wurden in 1,5 1 0,2 m-Batriumphosphatpuffer, pH 8,1, gelöst. 1 ml Katalaselösung, mit einer Enzymaktivität von 20 000 Einheiten,wurde zugesetzt. (1 Katalaseenzym-Aktivität-Einheit zersetzt definitionsgemäß 1 uMol Viasserstoffperoxid/Min. bei pH 7,0 bei 25°).

Die in einem gerührten Gefäß enthaltene Lösung wurde mit Wasser auf 3980 ml verdünnt und· in einem Wasserbad 30 Minuten auf 33°Ci angeglichen. Die Umsetzung wurde durch Zusatz von 20 ml einer Zellsuspension, die der in Beispiel 1 beschriebenen gleich v/ar, eingeleitet. Wenn diese Suspension unter Yerwendung der spektrophotometrischen Probe, die vorstehend beschrieben wurde, untersucht wurde, so zeigte sie einen Gehalt von 12 100 Einheiten. Enzymaktivität/ml. Die Umsetzung wurde 2,5 Stunden unter Anwendung einer LuftStromgeschwindigkeit von 3 l/Min, bei einer Rührgeschwindigkeit von 550 U/Min, fortgeführt. Die Umsetzung wurde durch Zentrifugieren des Inhalts des Gefäßes während 1 Stunde bei 2100 g beendet.

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Das Produkt wurde wie folgt extrahiert: 3900 ml der Reaktionsmischung wurden unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure auf den pH 1,5 gebracht und in 2 gleiche Teile aufgeteilt. Jeder aliquote Teil wurde unter Verwendung von 7 x 800 ml Äthylaeetat extrahiert und die vereinigten Äthylacetatextrakte der "beiden Teile wurden im Vakuum auf etwa 2 1 eingedampft und über Uacht unter Verwendung von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Der getrocknete Ithylacetatextrakt wurde weiter im Vakuum auf 100 ml eingedampft und anschließend langsam zu 600 ml Leichtpetroläther (60 "bis 80°) unter heftigem Rühren gefügt.

Die erhaltene Ausfällung wurde in zwei Ansätzen abfiltriert und im Vakuum über Aluminiumoxid getrocknet, es ergab sich 3-Acetoxymethyl-7ß-(5-earboxy-5-oxopentanamido)-ceph-3-em-4--carbonsäure in Form eines "blass-gelben Peststoffs. Die 2 erhaltenen Feststoffproben (6,89 g und 4,96 g) besaßen eine Reinheit von 56 fo ^jc 124 (260 um)] bzw. 50 <f> [eJ5_ =112 (260 mn)]. Dies entspricht

I CHI

einer Gesamtumwandlung von Kalium-Cephalosporin C in das obige Produkt von 25 5&.

Beispiel 6

Herstellung von 3-Acetoxymethyl-7ß-(4-carboxybutanamido)-ce'ph-3-em-4-carbonsäure

1. Verwendung von llatriumazid als Katalaseinhibitor

Die Zellen von T. variabilis aus 2,7 Litern Fermentationsbrühe wurden durch Zentrifugieren bei 2100 g während 30 Minuten bei 4⁰C gewonnen. Die überstehende Schicht wurde verworfen und die Zellen erneut in 2,7 Litern 0,1 m-Hatriumpyrophosphatpuffer, pH 8,1, suspendiert. Diese Suspension wurde in einem gerührten Gefäß bei 37° incubiert und 300 ml Toluol wurden zugesetzt. Die Incubation wurde 4 Stunden fortgeführt, wonach der Inhalt des Gefäßes bei 2100 g während 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert wurde und die überstehenden Schichten entfernt und verworfen wurden.

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Die Zellmasse wurde in einem Gesamtvolumen von 3 Litern destilliertem Wasser erneut suspendiert, das Zentrifugieren wiederholt und die überstehende Schicht entfernt und verworfen. Die Zellen wurden schließlich erneut in 500 ml 0,1 m-Natriiimpyrophosphatpuffer, pH 8,1, suspendiert. Bei Untersuchung dieser Zellsuspension ergab sich ein Gehalt von 24 000 Einheiten Enzymaktivität/ml.

20 g eines Kalium-Cephalosporin C-Präparats mit einer Reinheit von 70 io wurden in 2 Litern 0,1 m-Natriumpyrophosphatpuffer, pH 8,1, gelöst, die 1,3 g Natriumazid enthielten. Die Lösung, die sich in einem gerührten Gefäß befand, wurde in einem Wasserbad 30 Minuten auf 33° angeglichen. Die Umsetzung wurde durch Zusatz von 28 ml der vorstehend beschriebenen Zellsuspension eingeleitet und 2 Stunden unter Anwendung einer Luftströmungsgeschwindigkeit von 6 Litern/Minute zusammen mit einer Rührgeschwindigkeit von 550 U/Min, v/eitergeführt. Die Umsetzung wurde durch Zentrifugieren des Inhalts des Reaktionsgefäßes bei 2100 g über Nacht, beendet. Das Enzymniveau, das verv/endet wurde, entsprach 53 Einheiten/mg Cephalosporin C-Säure.

150 g Natriumchlorid wurden in 500 ml der erhaltenen Lösung gelöst, der pH wurde auf 1,5 unter Verwendung von konzentrierter Schwefelsäure eingestellt und die Lösung 4 x mit 200 ml-Portionen Ithylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über Nacht bei 4⁰C unter Verwendung von Magnesiumsulfat getrocknet. Das Magnesiumsulfat wurde durch Filtration entfernt und der getrocknete ithylacetatextrakt im Vakuum auf etwa 20 ml eingedampft. Fach dem Stehen bei Raumtemperatur wurde der kristalline Niederschlag, der sich gebildet hatte, durch Filtration entfernt und im Vakuum getrocknet; es ergaben sich 2,10 g der Titelverbindung in Form eines weißen Feststoffs mit einer Reinheit von 92 $ [^\° = 220

I Olli

(260 mn)]. Dies entspricht einem Gesamtumsatz von Kalium-Cephalosporin C zu dem vorstehenden Produkt von 65 $.

2.' Anwendung einer Vorbehandlung mit Natriumazid, um die Katalase zu inhibieren.

Zellen von T, variabilis wurden wie in Beispiel 6 (1) beschrieben,

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aktiviert. Yor der Anwendung zur Umsetzung, wurden 6,5 g Natriumazid zu 200 ml der Zellsuspension gefügt und diese über Nacht "bei 4⁰C gelagert. Die Zellsuspension wurde anschließend "bei 2100 g während 30 Minuten "bei 4⁰C zentrifugiert und die überstehende Schicht entfernt. Die Zellen wurden in 200 ml 0,1 m-Natriumpyrophosphatpuffer, pH 8,1, erneut suspendiert und nochmals zentrifugiert. Die überstehende Schicht wurde wieder verworfen und die Zellen in 200 ml~Puffer suspendiert. Diese Suspension wurde untersucht und es ergab sich ein Gehalt von 17 600 Einheiten Enzymaktivität/ml.

20 g eines Kalium-Cephalosporin C-Präparats mit einer Reinheit von 70$ wurden in 2 Litern 0,1 m-Natriumpyrophosphatpuffer, pH 8,1, gelöst. Die Umsetzung wurde wie in Beispiel 6 (1) beschrieben, unter Verwendung von 38 ml der Zellsuspension durchgeführt. Das angewendete Enzymniveau entsprach 52 Einheiten/mg. Cephalosporin C-Säure.

Die erhaltene Lösung wurde wie vorstehend beschrieben extrahiert, wobei sich 2,05 g der Titelverbindung in Form eines weißen Feststoffs mit einer Reinheit von 91 $ [e!J = 217 (260 nm)] ergaben.

I Olli

Dies entsprach einem Gesamtumsatz von Kalium-Cephalosporin C zu dem vorstehenden Produkt von 63 ^. .

3. Anwendung einer Hitzebehandlung zur Inhibition der Katalase

Zellen von T. variabilis vmrden wie vorstehend in Beispiel 6 (1) beschrieben, aktiviert, unter Anwendung einer Temperatur von .5O⁰C anstelle von 37⁰C. Die erhaltene Zellsuspension wurde untersucht und es ergab sich ein Gehalt von 17 600 Einheiten Enzymaktivität/

20 g eines Kalium-Cephalosporin C-Präparats mit einer Reinheit von 70° wurden in 2 Litern 0,1 m-Watriumpyrophosphatpuffer, pH 8,1, gelöst. Die Umsetzung wurde wie in Beispiel 6 (i) beschrieben, unter Verwendung von 38 ml der Zellsuspension, durchgeführt. Das Enzymniveau, das verwendet wurde, entsprach52 Einheiten/mg

20 9ÖA5/T2 3 2 - ; ~ ·

Cephalosporin C-Säure.

Die erhaltene Lösung wurde wie vorstehend "beschrieben extrahiert, wobei sich 1,85 g der Titelverbindung in Form eines weißen Feststoffs mit einer Reinheit von 92 $ [E^_n, = 220 (260 um)].extrahiert. Dies entsprach einem Gesamtumsatz von Kalium-Cephalosporin G zu dem vorstehenden Produkt von 57 $.

12 32

Claims

Patentansprüche

\ 1/ Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin-Verbindungen der allgemeinen Pormel:

R.(CH₉)„C0NH

COOH

oder deren Salzen, worin X eine Acetatgruppe, der Rest eines ihicleophils, eine Hydroxy lgruppe oder ein Wasserst off atom ist und R die Gruppe -00.GOOH oder -GOOH bedeutet, dadurch gekenn« zeichnet, daß man auf eine Verbindung der Formel:

0OC

CH (CH₉)„CO.NH

H₃H

(II)

oder ein Salz davon, worin X wie vorstehend definiert ist, aktivierte Zellen von Trigonopsis variaMlis unter aeroben Bedingungen einwirken läßt, wobei in den Zellen eine Katalase-Aktivität vorhanden ist, wenn die Gruppe R in dem gewünschten Produkt die -CO.COOH-Gruppe ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen durch Behandlung mit einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln in einer wäßrigen Phase aktiviert wurden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Lösungsmittel niedrige aliphatisch^ Kebone, alipha-

2 0 9 8 A 5 / I 2 3 2

tische und araliphatisch^ einwertige und mehrwerte Alkohole, aliphatische Kohlenwasserstoffe und aromatische Kohlenwasserstoffe verwendet werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Lösungsmittel Toluol verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen durch Behandlung mit einer wäßrigen lösung eines oberflächenaktiven Mittel aktiviert wurden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige Lösung eines oberflächenaktiven Mittelsmit einer Konzentration von 0,1 - 10 $ verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen durch Ausfrieren gefolgt von Auftauen bei saurem pH aktiviert wurden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen durch Ausfrieren bei einer Temperatur unter -10°, gefolgt von Auftauen bei pH 3 - 4 aktiviert wurden.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen durch Behandlung mit Alkali aktiviert wurden.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die aktivierten Zellen durch osmotischen Schock aktiviert wurden.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen vor der Aktivierung in Anwesenheit von D- oder DL-MethionLn kultiviert wurden.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung (II) der Einwirkung der aktivierten Zellen bei einem pH zwischen 4 und 9 unterzogen werden.

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13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung (II) der Einwirkung der aktivierten Zellen bei einem pH von 6 bis 8 unter einer Temperatur von 30 - 4O⁰C ausgesetzt wird.
14· Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nicht weniger als 5 Einheiten des Enzyms pro mg isolierter Cephalosporin-Verbindung verwendet werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß nicht weniger als 10 Einheiten des Enzyms pro mg der Cephalosporin-Verbindung in einer Fermentationsbrühe verwendet v/erden.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß vor Behandlung der Verbindung der Formel (II) mit den aktivierten Zellen, die Fermentationsbrühe angesäuert und filtriert wird.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Cephalosporin-Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin X eine Acetatgruppe ist, aus 'der wäßrigen Lösung, in der sie hergestellt wurden, extrahiert werden durch Ansäuern auf einen pH von 2,5 oder weniger, gefolgt von einer Extraktion in Äthylacetat.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung mit einem wasserlöslichen inerten anorganischen Salz gesättigt oder im wesentlichen, gesättigt wird.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gokennze5cb.net, daß dio Katalase in den aktivierton ZeHlon inhibiert oder inaktiviert wird, wobei ein Produkt der allgemeine:! Formel (I) erhalten wird, worin H dio Gruppe -COOH ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Katalase durch Zusatz von ITatriuinazid zu dom Keaktionsgomisch bei einer Konzentration von 1 mliol bis 100 nil-lol inhibiert wird.

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21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die aktivierten Zellen, bevor sie mit der Verbindung (II) in Kontakt gebracht v/erden, mit einer wäßrigen Lösung eines Alkalimetallazids behandelt wurden, um die Katalase zu inhibieren.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß als wäßrige Lösung eines Alkalimetallazids eine wäßrige Lösung von Natriumazid bis zu molarer Konzentration bei einer Temperatur von 0 - 40° verwendet wird.
23. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die aktivierten Zellen zur Inaktivierung der Katalase durch Hitze behandelt wurden, ohne wesentliche Lesaktivierung von D-Aminosäurenoxidase,bevor sie mit der Verbindung (II) in Kontakt gebracht werden.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Wärmebehandlung bei 40 - 60° während zumindest 3 Stunden durchgeführt wurde.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 19, 23 und 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen gleichzeitig aktiviert und zur Inhibierung oder Desaktivierung der Katalase behandelt wurden.
26. Abwandlung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennaeichnet, daß eine Cephalosporin-Verbindung der allgemeinen Formel (i) mit einer 7ß-(4-Carboxybutanamido)-Gruppe durch Umsetzung mit einer Imidhalogenid-bildenden Verbindung, Umwandlung des so erhaltenen Imidhalogenide in einen Iminoäther und Zersetzung des letzteren in die entsprechende 7ß-Amino-Verbindung umgewandelt wird.
27. Abwandlung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 - 18, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cephalosporin-Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit einer 7ß-(5-Carboxy-5-oxopentanamido)-Gruppe durch Reduktion der 7-Acylamido-Gruppe zu einer 7ß-(5-Carb-

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oxy-5-hydroxypentanamido)-Gruppe, Umsetzung der reduzierten Verbindung mit einer Imidhalogenid-biläg^eja^iFß^jindung, Umwandlung des so erhaltenen Imidhalogenide ineinen■Inrinoätiier und Zersetzung des letzteren, in die entsprechende 7ß-Aminoverbindung umgewandelt wird.
28. 3-Acetoxymethyl-7ß-(4-car'boxy'butanamido)-ceph-3-em-4--carbonsäure.
29. Aktivierte Zellen von Trigonopsis variabilis.
30. Aktivierte Zellen von Trigonopsis variabilis, die zur Inhibition oder Desaktivierung der Katalase behandelt wurden.

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