DE2657599A1 - 7-methoxycephalosporine und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

PR. WALTER NlELSCH

2 Hamburg 70 ■ Postfach 10914 μ „

Femruf: 695 58 JQ * O

7-Methoxycephalosporine' und Verfahren zu ihrer Herstellung

Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd., Nr. 5-1, Nihonbashi-Honcho 2-chome, Chuo-ku, Tokio / Japan

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Cephalosporine mit einer Methoxygruppe in der 7-Position und auf ein Verfahren zum Herstellen der Cephalosporine. Genauerbezeichnet betrifft die Erfindung Cephalosporine, von denen jedes eine Methoxygruppe und eine 5~Amino~5-carboxyvaleramidgruppe oder eine 4-Carboxybutyramidgruppe in der 7~Position und eine heterocyclische Thiomethyl gruppe in der 3-Position aufweist und auf ein Verfahren zur Herstellung der Cephalosporine durch Fermentation. Die herzustellenden Verbindungen dieser Erfindung werden durch die folgende allgemeine Formel (A) dargestellt

CH₂-S-R²

COOM

worin R eine XH-Gruppe oder HOOC-Gruppe bedeutet, R eine HOOC

stickstoffhaltige heterocyclische Gruppe ist und M ein Wasserstoff atom oder ein kationischer Rest, der ein Salz bildet, darstellt.

2 Als die stickstoffhaltige heterocyclische Gruppe, die durch R in der vorstehenden allgemeinen Formel angezeigt wird, werden zur Verdeutlichung genannt: eine 5~Carboxymethylthio-l,3>ⁱt~thiadiazol-2-yl-Gruppe, eine l-Methyl-lH-tetrazol-5-yl-Gruppe, eine 5-Methyl-l,3,i|-thiadiazol-2-yl-Gruppe, eine l,3,4-Thiadiazol-2-yl-Gruppe etc.

Der durch M dargestellte kationische Rest, der das Salz des Cephalosporins bildet, bedeutet einen anorganischen Rest oder einen organischen Rest. Beispiele für den anorganischen Rest sind ein Alkalimetall, wie Natrium, Kalium etc.; ein Alkalierdmetall, wie Calcium, Magnesium, Barium etc.; sowie ein Schwermetall, wie

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R¹-(CH₂).CONH

Eisen, Kupfer, Zink etc.; Beispiele für den organischen Rest sind basenbildende quaternäre Salze, Aminsalze etc., zum Beispiel Triäthylamin, Diäthanolamin, Piperidin, Morpholin etc.

Praktische Beispiele für Verbi ungen dieser Erfindung sind 7-(5~Amino-5~carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3>4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-A³-cephem-4-carbonsäure, 7~(5~Amino-5~carboxyvaleramido)-3-(1-methyl-IH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-7~methoxy-A³-cephem-4-carbonsäure, 7-(5~Amino-5~ carböxyvaleramido)-7~methoxy-3~(5~methy1-1,3 >4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure, 7~(5~Amino-5~carboxyvaleramido)-7~methoxy-3~(lj3j4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure,

7-(4-Carboxybutyramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7~methoxy-A³-cephem-4-carbonsäure, 7-(4-Carboxybutyramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5~yl)~thiomethyl-7-methoxy-A³-cephem-4-carbonsäure,

7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3«(5-methyl-l,3,4-fchiadiazol- -2-yl)thio methyl-Δ³ -cephem-4-carbonsäure,

7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(i,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethy 1-A³ - cephem-4-carbonsäure sowie die Salze dieser Verbindungen.

Einige 7-Methoxy-3-heterocyclothiomethylcephalosporine sind in der GB-PS 1 321 412 (1970) als durch chemische Synthese erhältliche Verbindungen beschrieben, jedoch sind in dieser britischen Patentschrift keine praktischen physikalischen und chemischen Eigenschaften dieser Verbindungen angegeben.

Aufgabe dieser Erfindung ist es, neue 7-Methoxycephalosporinderivate und ein Verfahren zur Herstellung dieser Derivate durch Fermentation zur Verfügung zu stellen.

Cephalophorine besitzen ausgezeichnete antimikrobielle Aktivitäten gegen gram-positive und gram-negative Bakterien, und unter diesen Verbindungen besitzen die Cephalosporinderivate mit einer Methoxygruppe in der 7-Position und einer heterocyclischen Thiomethylgruppe in der 3-Position ganz ausgezeichnete Wirkung bei der Behandlung von ernsthaften Erkrankungen, die durch die Infektion mit Bakterien, wie Pseudomonas und Proteus hervorgerufen werden, gegen die gewöhnliche Antibiotica nicht wirksam sind, oder die

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durch die Infektion mit den Bakterien hervorgerufen werden, die nicht empfindlich sind gegen gewöhnliche Cephalosporine, welche keine Methoxygruppe in der 7~IOsition aufweisen.

Diese Verbindungen werden gewöhnlich hergestellt, indem zuerst die entsprechenden Verbindungen, die eine Acetoxymethylgruppe oder eine Carbamoyloxymethylgruppe in der 3-Position aufweisen, hergestellt werden, und zwar durch ein Fermentationsverfahren, und dann werden diese Verbindungen mit einer heterocyclischen Thiolverbindung umgesetzt.

Einerseits hat die vorliegende Erfindung auch einen solchen Vorteil, daß die Verbindung mit einer heterocyclischen Thiomethylgruppe in der 3~Position direkt durch eine einzige Fermentationsstufe erhalten werden kann. Die so erhaltene Verbindung ist die

-1

Verbindung mit der allgemeinen Formel (A), worin R die

2 ^CH-Gruppe bedeutet (später nur noch mit Aa bezeichnet), HOOCT

Die Verbindungen der Formel A (R = Aa) besitzen selbst ausgezeichnete antimikrobielle Aktivitäten, und weiterhin können die antimikrobiellen Eigenschaften und die antimikrobiellen Spektren der Verbindungen erhöht oder gewechselt werden, indem die Acylgruppen-Seitenkette in der 7~Position, dargestellt durch

2 "^,CH-(CHp),-CO- mit einer anderen Acylgruppe, wie z.B. HOOC ■ ; . .

a-Aminophenylacetylgrup.pe, a-Carboxyphenylacetylgruppe, a-Sulfophenylacetylgruppe, a-Hydroxyphenylacetylgruppe, Pyridylthioacetylgruppe,.Thiadiazolylthioacetylgruppe, Triazolylaeetylgruppe, Cyanomethylthioacetylgruppe, Trifluormethylthioacetylgruppe etc., gewechselt oder ausgetauscht werden. So sind die Verbindungen mit

1
der Formel A_;(R = Aa) ebenfalls als Zwischenprodukte verwendbar, um diese Derivate mit diesen Acylgruppen herzustellen. Zum Beispiel: 78-Cyanomethylthioacetamido-7a-methoxy-3-(l-methyltetrazol-5-ylthiomethyl)-A³-cephem-4-carbonsäure .und 7a-Methoxy-3-(lmethyltetrazol)-5-ylthiomethyl)-73-(trifluormethylthioacetamido)-Δ³-cephem-4-carbonsäure.

1'
Die Verbindungen der Formel A (R = Aa) besitzen die Eigenschaften wie ein amphoteres Material,- denn die Verbindungen haben eine

709827/1078-

Aminogruppe und zwei Carboxygruppen im Molekül, und dadurch ist die Isolierung und Reinigung der hergestellten Verbindungen mühsam. Wenn jedoch die Gruppe R der Verbindungen von Aa in eine HOOC-Gruppe (nachfolgend nur noch mit Ab bezeichnet) umgewandelt wird, besitzen die Verbindungen mit der Formel A (R = Ab) deutlich saure Eigenschaften, die die Isolierung und Reinigung der Verbindungen erleichtert, zumal die Verbindungen in organischen Lösungsmitteln löslich sind, wodurch sich Vorteile für die nachfolgende Reaktion ergeben. Daher sind die Verbindungen ebenfalls als Zwischenprodukte zur Herstellung der Derivate geeignet_s die die vorstehend genannten Acylgruppen aufweisen. Als Beispiel für den Mikroorganismus, der zur Herstellung der 7-Methoxycephalosporin-Antibiotica Verwendung finden kann und der zu den Streptomyceten gehört, wird in dieser Erfindung ein neuer Stamm benutzt, nämlich Streptomyces oganonensis Y-G19Z, der zuvor von den Erfindern aus dem Erdboden bei der Stadt Ogano, Chichibugun, Bezirk Saitama (Japan) isoliert worden ist. Dieser Stamm ist in dem Institut für Mikrobielle Industrie, Zweigstelle für Industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für Internationalen Handel und Industrie, Japan, unter einer Hinter-Iegungs-Nummer PERM-P 2725 und auch in der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Marryland 20852 (USA) unter ATCC No. 3116? hinterlegt worden. Die mykologischen Eigenschaften des Stammes sind die folgenden:

I. Morphologische Charakteristiken von Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm :

Der Stamm wächst sowohl auf natürlichen wie auch auf synthetischen Medien unter Bildung eines gut verzweigten Substratmycels, während die Bildung von atmosphärischem Myeel nicht ausreichend ist, da die Sporenbildung zu gering ist. Die Sporenketten sind gerade, .gehören zum R- (rectus) oder RP- (Rectiflexibles) Typ und tragen 10 bis 50 Sporen in jeder Kette. Die Sporen sind elliptisch, sphärisch oder zylindrisch geformt und weisen eine Größe von 0,45 bis 0,60 χ 0,55 bis 0,90 y auf. Die Sporenoberfläche ist glatt. Es werden weder Plagellaten-Sporen noch Sporangium beobachtet.

II. Kultur-Charakteristika des Stammes" S'.Oganonerisls Y-G19Z :

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	Wachstum	gut	Atmosphäris ches My eel	Lösliches Pigment	nein	sehr schwach	kein
·. Medium	sehr gering	schwach gelb lich-braun	spärlich	nein	s chwach	bis
Czapek's Agar	weiß	gut	weiß		schwach gelblich grau	bräunlich-grau bis
	gut cremegeIb	schwach gelblich -braun	leidlich gelblich-grau	nein sehr gering	sehr gering hell bräunlich grau	dunkel gelblich- braun
Glukose Czapek1s Agar	gut weiß	mäßig	gering weiß	nein	s chwach	gelblich-grau bis dunkel rötlich braun
Glukose Aspa- ragin-Agar	gut weiß bis gelblich	cremefarbig		gering nein weiß bis gelblich	schwach orange gelblich-braun bis schwach braun	kein
Glycerin Aspa- ragin-Agar	weiß	J gut	weiß	gut
	gut gelblich grau bis schwach gelblich braun	schwach gelb lich-braun	gering gelblich grau	bräunlieh-grau, schwach orange schwach rosa
Anorganis eher Salz-Stärke- Agar	gut	gut olive-grau bis dunkel olive grau '	gering	kein
Tyrosin-Agar	schwach gelb	gut	gelblich grau
	Eisen und Hefe- gut extrakt—Tyrosin- . . . Aear bis gelblich braun		gut bräunlich weiß bis gelblich grau	gut
	Nährboden-Agar	gut, pulverig	ge Ib Ii ch- grau bis schwach bräunlich grau
		kein
Bennett's Agar	kein ..
Calciummalat-
Agar
Kartoffelstücke
Blut-Agar
Loeffer's Serum Medium

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III. Physiologische Eigenschaften von "SY oganonensis Y-G19Z -Stamm:

Tyrosin-Formation negativ

Nitrat-Reduktion positiv

Magermilch-Koagulation positiv, schwach

Magermilch-Peptonisation positiv, schwach

Hydrolyse von Stärke positiv

Verflüssigung von Gelatine positiv, schwach

Cellulose-Abbau negativ

Hämolyse positiv Löslichmachung von Calciummalat positiv

Ausnutzung von Kohlenstoffverbindungen durch S. oganonensis Y-G19Z

Kohlenstoffquelle Ausnutzung

Glukose +

Arabinose +

Sukrose

Xylose +

Inositol

Mannitol +

Fruktose ■ +

Rhamnose - -

Raffinose

Charakteristische Merkmale für Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm : kann wie folgt zusammengefaßt werden :

1. Es gehört zu dem nicht-ehromogenen Streptomyces Stamm;

2. Sein atmosphärisches Myeel ist gerade ohne Verzweigung (R oder RF Typ);

3. Sporen sind sphärisch oder elliptisch;

4. Sporenoberfläche ist glatt;

5. Es gibt schwach gelblich graue bis schwach gelblich braune Gewächse auf verschiedenen Medien;

6. Die Farbe des sphärischen Mycels ist bräunlich-weiß, gelblichweiß und geIblieh-grau;

7. Die erzeugte antibiotische Substanz Y-G19Z-P3 gehört zur 7-Methoxycephalosporingruppe.

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Bei der Durchforschung bekannter Stämme, die die vorstehenden Eigenschaften aufweisen, können als am nächsten kommende Streptomyceten die folgenden angesehen werden :

Streptomyces globisporus, beschrieben in S.A. Waksman: "The Actinomycetes" _2, 218 (1961) und International Journal of Systematic Bacteriology, jl8, (4) 324 - 325 (1968).

Wenn man jedoch den bekannten S. globisporus, der in der vorstehenden Literatur beschrieben ist, mit dem Stamm Y-G19Z vergleicht, weicht dieser in den folgenden Eigenschaften, die in der Tabelle angegeben sind, ab :

Tabelle

Eigenschaften:	Y-G19Z	S. globisporus
Größe der Spore (u)	0,45-0,60 χ 0,55-0,90	.1,2-1,4 χ 8 - 2,0 oder
		0,9-1,4 kugelförmig
Flüssiges Pigment oder Glycerin-Asparagin- Medium	kein	gelblich bis grünlich gelb
Rhamnose-Verwertung	negativ	positiv
Stärke-Hydrolyse	stark	schwach
Magermilch-Koagulation	positiv	negativ
Magermilch-Peptonisation	s chwach	stark
Produktion von Cephalo-	positiv	negativ

sporin-Antibiotica

Aus den in der vorstehenden Tabelle angegebenen Differenzen ergibt sich, daß der in dieser Erfindung benutzte Stamm ein neuer Stamm ist, der sich von den vorstehend genannten bekannten Stämmen unterscheidet.

Da der Y-G19Z-Stamm als ein neuer Stamm durch die vorstehenden Beobachtungsergebnisse bestätigt worden ist, ist er als "Streptomyces oganonensis" bezeichnet worden.

Wie schon bei den Ausführungen über den Streptomyces oganonensis Y-19Z-Stamm ausgeführt wurde, handelt es sich um einen 7-Methoxy cephalosporin-Antibiotikum erzeugenden Stamm. Als ähnliche Stämme, die zu den Streptomyceten gehören, sind als Erzeuger von 7-Methoxycephalosporin-Antibiotika die folgenden bekannt :

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Streptomyces griseus, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces fimbriatus, Streptomyces halstedii, Streptomyces rochei, Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces chartreusis und Streptomyces lactamdurans (vergl. Japanische Patent-Offenlegungsschrift 3286/'71 und Belgische Patentschrift 764 l60) sowie Streptomyces lipmanii (US-PS 3 719 563)j Streptomyces clavuligerus (Japanisches Patent 45,594/'74), Streptomyces wadayamensis (Japanische Offenlegungsschrift 26488/'74), Streptomyces jumonjinensis (Japanische Offenlegungsschrift 42893/^!74), Streptomyces heteromorphus und Streptomyces panayensis (Japanische Offenlegungsschrift 53594/'75), und Streptomyces chartreusis SP-1623 (Japanische Offenlegungsschriften 82291/'75 und 121 488/'75).

Jedoch sind die Stämme, die bei dieser Erfindung benutzt werden, nicht auf die vorstehend genannten Stämme begrenzt. Jegliche Stämme, die zum Genus Streptomyces gehören und 7~Methoxycephalosporin-Antibiotica erzeugen, können in dieser Erfindung Verwendung finden.

Die Herstellung der besprochenen Verbindung A (R = Aa) wird ausgeführt, indem man den erwähnten 7~Methoxycephalosporin-Antibiotika produzierenden Stamm kultiviert in einem üblichen Kulturmedium, dem ein Zusatz an heterocyclischer Thiolverbindung zugegeben wurde entsprechend der heterocyclischen Thiogruppe, die in die 3-Position eingeführt werden soll. Beispiele für die heterocyclischen Thiole, die dem Kulturmedium in dieser Erfindung hinzugefügt werden, sind : Pyrrolthiol, Imidazolthiol, Dihydroimidazolthiol, Pyrazolthiol, Triazolthiol, Tetrazolthiol, Methyltetrazolthiol, Pyridinthiol, Diazinthiol, Thiophenthiol, Thiazolthiol, Dihydrothiazolthiol, Thiadiazolthiol, Thiatriazolthiol, Puranthiol, Pyranthiol, Oxazolthiol, Isoxazolthiol, Oxadiazolthiol, Indolthiol, Benzimidazolthiol, Benzoxazolthiol, Benzothiazolthiol, Triazolpyridinthiol, Thianthrenthiol, Purinthiol etc. Diese heterocyclischen Ringe können einen oder mehrere Substituenten aufweisen, wie ein Halogenatom, eine Amino-, .Nitro-, Alkyl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Aryl-, Aralkyl-, Puryl-, Thienyl-, Oxazolyl-, Carboxy-, Carboxymethyl-, Carboxyalkylthio-, Carboxyalkyloxy-Gruppe etc.

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Diese heterocyclischen Thiole können als ihre Salze verwendet werden. Diese Salze sind anorganische Salze, wie Alkalimetallsalze, Alkalierdmetallsalze, Ammoniumsalze etc., und die Salze mit organischen Basen, wie Triäthylamin, Triäthanolamin, Dicyclohexylamin, Lysin, Arginin, Histidin, basische wasserlösliche Antibiotika, z.B. Kanamycin, Alkaloide, basische Proteine etc. Die Salze mit hoher Wasserlöslichkeit können selektiv verwendet werden, falls erforderlich, und ferner, wenn die heterocyclischen Thiole eine starke Toxizität zu den Antibiotika erzeugenden Stämmen aufweisen, können die nur spärlich in Wasser löslichen Salze selektiv verwendet werden.

Weiterhin können als Verbindungen, die während der Kultur in die genannten heterocyclischen Thiole überführt werden können, zur Verdeutlichung solche Verbindungen genannt werden, die eine organische oder anorganische SH-Verbindung mit S-S-Bindung sind. Solche S-S-Verbindungen bilden das vorgenannte heterocyclische Thiol in einem Kulturmedium oder in dem Mycel im Kulturmedium durch eine chemische Umsetzung oder/und durch die enzymatische Aktivität des Mycelsj oder die Verbindung kann in einigen Fällen als eine Vorstufe Verwendung finden. Beispiele für diese

ρ ρ

S-S-Verbindungen sind die folgenden : R S-SCH₃, R S-SC₂H₅,

R²S-SCH₂CH₂OH, R²S-SCH₂CHCOOH, R²S-SG (worin G einen Gluta-

NH₂

thion-Rest darstellt und nachfolgend die gleiche Bedeutung hat), R²S-SCH₂CH₂NH₂, R²S-SCoA (worin CoA einen Coenzym Α-Rest darstellt), R²S-SCHCONHCH₂COOh,

^CH3

HOOC-CH-CH₀CH₀Ch₀CONH-CH-CH₀S-SR²

I d. ά ά ld _rVr

NH₀ ^C-NHCHCH^T ^D und

² <r 1 ^cH,

' · COOH ^D

HOOC-CH-CH₀CH₀Ch₀CONH-CH-CHS-SR

I "2 2 2 !j _CH

NH₀ ^C- N-CHCHC

² <r 1 ^CH,

COOH ^D

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Auch können zwei Moleküle der gleichen heterocyclischen Thiolverbindung, die durch die S-S-Bindung verbunden sind, Verwendung finden, wie z.B. R²S-SR².

Ferner können, wenn die Antibiotika herstellenden Stämme fähig

2 2 2 sind, Schwefelsäure zu reduzieren, R-SO_xH, R-SO₉H, R -SOH

2 5 d oder deren Salze anstelle von R SH verwendet werden.

Die Herstellung der gemäß dieser Erfindung erhältlichen neuen Antibiotika wird durch Kultivierung der 7-Methoxycephalosporin-Antibiotika herstellenden Stämme der Art Streptomyces in einem Kulturmedium unter Zugabe der vorstehend schon beschriebenen heterocyclischen Thiolverbindung oder des Salzes oder ihres Derivates durchgeführt. Die Kultivierung wird nach den üblichen herkömmlichen Methoden zur Züchtung von Mikroorganismen durchgeführt, jedoch wird die submerse Kultur in einem flüssigen Kulturmedium bevorzugt. Jedes Kulturmedium, welches Nährstoffe für die 7-Methoxycephalosporin-Antibiotika herstellenden Stämme der Art Streptomyces enthält, kann verwendet werden. Es können synthetische Kulturmedien, halb-synthetische Kulturmedien und natürliche Kulturmedien, die die vorstehend genannten Nährstoffe enthalten, in dieser Erfindung Verwendung finden. Für die Zusammenstellung des Kulturmediums können Glukose, Sukrose, Mannitol, Glycerin, Dextrin, Stärke, vegetabile öle etc. als Kohlenstoffquellen Verwendung finden, und Fleischextrakt, Peptone, Klebermehl, Baumwollsaatmehi, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Fischmehl, Kornschlempe, Trockenhefe, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff und andere organische und anorganische Stickstoffquellen können als Stickstoffspender Verwendung finden. Ebenso können, falls erforderlich, Metallsalze, wie Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate, Phosphate etc. von Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Zink und Eisen zu dem Kulturmedium hinzugefügt werden. Weiterhin können, falls erforderlich, Materialien, die die Bildung der Antibiotika begünstigen, oder Entschäumungsmittel, wie Methionin, Cystein, Cystin, Methyloleat, Lardöl, Siliconöl, oberflächenaktive Mittel etc. , in geeigneter Weise zu dem Kulturmedium hinzugefügt werden.

Das vorstehend genannte heterocyclische Thiol, dessen Salz oder dessen Derivat wird gewöhnlich in einer Konzentration von

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0,1 - 5 mg/ml, vorzugsweise 0,5 ~ 2 mg/ml als heterocyclisches Thiol hinzugefügt. Es kann zu dem Kulturmedium als eine sturzartige Zugabe vor der Kultivierung oder auch in verschiedenen unterteilten Portionen in den Eingangsstufen der Kultivierung zugefügt werden. Es ist im allgemeinen günstig, die Kultivierung unter aeroben Bedingungen durchzuführen. Die Kultivierungstemperatur liegt gewöhnlich zwischen etwa l8°C bis etwa 35°C, vorzugsweise um 30°C. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn das pH des' Kulturmediums auf etwa 5 ~ 10, vorzugsweise etwa 6-8 gehalten wird. Der Kultivationszeitablauf hängt von der Zusammensetzung und der Temperatur des verwendeten Kulturmediums ab, aber im allgemeinen werden etwa 3 Tage bis etwa 10 Tage benötigt. Das hergestellte Material wird selektiv in dem Medium angereichert, nachdem die Kultivierung beendet ist. Das hergestellte Material dieser Erfindung kann isoliert und aus der Kulturbrühe nach den üblichen Methoden gewonnen werden, die für das Isolieren von Antibiotika aus dem kultivierten Mycel-Nährboden üblich sind. Das hergestellte Antibiotikum dieser Erfindung ist hauptsächlich in der Kulturbrühe anwesend. Nach der Abtrennung des Mycels von der Nährbodenlösung durch Zentrifugieren oder Filtrieren wird das hergestellte effektive Material aus dem Filtrat extrahiert; das heißt, das hergestellte Material wird abgetrennt, wieder ausgezogen und gereinigt vom Filtrat. Hierbei werden Vorrichtungen und Verfahren verwendet, die ganz allgemein für die Herstellung von Antibiotika Verwendung finden, wie Methoden, die die Unterschiede der Löslichkeit in einem geeigneten Lösungsmittel ausnutzen, die die Unterschiede der adsorptiven Affinität zu verschiedenen Adsorbentien ausnutzen oder die auf Unterschieden der Trennmethoden in zwei flüssigen Phasen beruhen.

Diese Methoden können, falls erforderlich, in einer geeigneten Kombination oder auch wiederholt angewandt werden. Einige praktische Beispiele der neuen 7-Methoxycephalosporin-Verbindungen dieser Erfindung werden nachfolgend genannt:

I· 7~(5-Amino-5-cärboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,¹*- thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-A³-cephem-4-carbonsäure;

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HOOC-CH-CH₁Ch₂CH₂ CONH

COOH

Additionsverbindung:

5-Mercapto-l,3,4-thiadiazol-2-thioessigsäure;

HS -IL J— S-CHpCOOH

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten

1 2 Verbindung I mit der allgemeinen Formel A (R = Aa, R =

■ π η sind die folgenden :

/^ S^SCH₂COOH, M = H)

(1.) weißes Pulver;

(2.) Schmelzbeginn bei 156 - l60°C. Hierbei tritt Braunfärbung ein, und die Zersetzung beginnt ab etwa 170 C;

(3.) leicht löslich in Wasser, spärlich löslich in Methanol, und sehr spärlich löslich in anderen organischen Lösungsmitteln;

(4.) amphoteres Material mit positiver Ninhydrin-Reaktion; (5· ) es besitzt das ultraviolette Absorptionsspektrum gemäß Fig. 1 der beigefügten Zeichnung, wenn es in einer 1/100 M Phosphat-Pufferlösung mit einem pH von 6,4 gemessen wird, wobei das Absorptionsmaximum bei 287 mu liegt;

(6.) es besitzt das Infrarot-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 2, wenn es in der Kaliumbromid-Tablette gemessen wird. Es er-

"1 —1 geben sich Absorptionen bei 3413 cm , 2920 cm ,

1763 cm"¹, 1620 cm"¹, 1515 cm"¹ und I38O cm"¹; (7·) Bei der Bestimmung des kernmagnetischen Resonanzspektrums unter Verwendung von TMS als äußerem Standard in schwerem Wasser werden folgende Signale erhalten : δ Wert (ppm):

2,35 (4H, Multiplett), 2,96 (2H, Multiplett), 4,00 (3H, Singlett), 3,73 ~ 4,33 (2H, Quartett, J = 18 Hz),

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4,25 (IH, Multiplett), 4,44 (2H, Singlett), 4,42 - 4,91 (2H,- Quartett, J = l4 Hz), 5,63 (IH, Singlett);

(8.) Das im derzeitig reinsten Zustand hergestellte Produkt besitzt die folgenden elementar-analytischen Werte: C: 35,95 %> H: 3,87 %, N: 10,85 %, Si 18,33 %i

(9·) es ergibt α-Aminoadipinsäure bei der Hydrolyse mit 6 η Chlorwasserstoff säure ;

(10. ) das Massenspektrum dieser Verbindung ergibt nach einer N-Chloracetylierung der Verbindung und Überführung des Produktes in den Methylester das folgende Fragment mit m/e 392, das heißt

H^TN.

COOCH₃

Unter Berücksichtigung aller vorstehenden Ergebnisse ist es ersichtlich, daß diese Verbindung eine 7-Methoxycephalosporin-Verbindung ist, denn die Verbindung ergibt eine Absorption bei 1763 cm (cyclisches Lactam) im Infrarot-Absorptionsspektrum, und die Gegenwart der Signale bei 4,00 ppm (3H, Singlett, 7-OCH₃), 5,63 ppm (IH, Singlett, 6-CH), 3,73 - 4,33 (2H, Quartett, J = 18 Hz, 2-CH₂) und 4,42 - 4,91 (2H, Quartett, J = 14 Hz, 3-Seitenkette CHp) in dem kernmagnetischen Resonanzspektrum. Die Verbindung ergibt a-Aminoadipinsäure bei der Säurehydrolyse, ferner ergibt die Verbindung Absorptionen bei 4,44 ppm (2H, singlett, CHp von -S-CHp-COOH) im nukleramagnetischen Resonanzspektrum und außerdem das Fragment von m/e 392 im Massenspektrum des Derivates; aus diesen Gründen ist entschieden worden, daß die Verbindung die vorstehend genannte Struktur hat, in die das heterocyclische Thiol eingeführt worden ist.

II· 7~(5~Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-7-methoxy-A³-cephem-4-carbonsäure :

7098^771078

- vr-

HOOC-CH-CH₂Ch₂CH₂CONH

NH₂ //

0 I

Additionsverbindung :

5-Mercapto-l-methyl-lH-tetrazol;

H N

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CH

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten

Verbindung II der Formel A (R = Aa,

N N

CH,

M = H)

sind die folgenden :

(1.) weißes Pulver;

(2.) ergibt braune Verfärbung und Zersetzung bei l60 - 170 C; (3·) leicht löslich in Wasser, gering löslich in Methanol und

spärlich löslich in anderen organischen Lösungsmitteln; (4.) amphoteres Material mit positiver Ninhydrinreaktion; (5·) es wird das in Fig. 3 dargestellte Ultraviolett-Absorptionsspektrum bei Messung in 1/100 M Phosphat-Pufferlösung mit einem pH von 6,4 erhalten. Das Absorptionsmaximum liegt bei

273 mu;

es wird das in Fig. 4 dargestellte Infrarot-Absorptions-

Spektrum bei Messung der Kaliumbromidtablette erhalten. Es

-1

wurden Absorptionen bei 3413 cm 1620 cm"¹, "-^ΛΓ~ "—^-1

-1

2920 cm"¹,

1765 cm"¹,

1515 cm und 1390 cm festgestellt; das kernmagnetische Resonanzspektrum, gemessen unter Verwendung von TMS als externer Standard in schwerem Wasser ergab die folgenden Signale:
δ Wert (ppm) :

2,36 (IJH, Multiplett), 2,96 (2H, Multiplett), 3,98 (3H, Singlett), 4,38 (IH, Multiplett), 4,50 (3H, Singlett), 5,59 (IH, Singlett);

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(8.) das bis jetzt in reinstem Zustand erhaltene Material ergab die folgenden elementar-analytischen Werte : C; 37,48 JC, H: 4,25 %, N: 16,74 % und S: 10,90 %;

(9· ) es wird a-Aminoadipinsäure erhalten, wenn mit 6 η Chlorwasserst offsäure hydrolysiert wurde. Es wird 5~Mercapto-lmethyl-lH-tetrazol durch Hydrolyse in Methanol durch Dowex 50 W (Η-Typ) erhalten;

Berücksichtigt man die vorstehenden gesamten Ergebnisse, so ergibt sich, daß die Verbindung eine 7~Methoxycephalosporin-Verbindung ist, denn die Verbindungergibt Signale bei 3,98 ρ ρ m (3H, Singlett, 7-OCH₃) und 5,59 ppm (IH, Singlett, 6-CH) bei den kernmagnetischen Resonanzspektren und Absorption bei 1765 cm (cyclisches Lactam) im Infrarot-Absorptionsspektrum. Ferner wird a-Aminoadipinsäure durch Säurehydrolyse erhalten. Ferner ergibt sich aus der Tatsache der Absorption bei 450 ppm (3H, Singlett, Tetrazol-N-methyl) im kernmagnetischen Resonanzspektrum und auch aus der Tatsache, daß 5~Mercapto-l-methyl-lH-tetrazol durch milde Hydrolyse erhalten wird, daß der Verbindung die vorstehend erläuterte Struktur zuerkannt wurde, in die das heterocyclische Thiol eingeführt wurde.

III. 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(5~methyI-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure.

OCH:

HOOC-CH-CK₂CHiCH₂COIiH

KH₂

Additionsverbindung :

2-Mercapto-5-methyl-l,3,4-thiadiazol :·

N N

HS-^

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung III mit der Formel A (R¹ = Aa, R² = ψ Jf , M = H)

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sind die folgenden : '

(1.) leicht gelb-weißes Pulver;

(2.) zeigt keinen bestimmten Schmelzpunkt, ergibt braune Verfärbung und Zersetzung bei etwa 170 C;

(3·) leicht löslich in Wasser, schwach löslich in Methanol, aber unlöslich in anderen organischen Lösungsmitteln;

(4.) amphoteres Material mit positiver Ninhydrinreaktion;

(5·) ergibt das in Fig. 5 dargestellte Ultraviolett-Absorptionsspektrum, wenn in einer 1/100 M Phosphat-Pufferlösung mit einem pH von 6,4 gemessen wird, wobei das Absorptionsmaximum bei 272 my liegt;

(6.) es wird das in Fig. 6 dargestellte Infrarot-Absorptionsspektrum erhalten, wenn als Kaliumbromid-Tablette gemessen wurde, mit Absorptionen bei 3420 cm , 2930 cm , 1765 cm"¹, 1610 cm"¹, 1515 cm"¹ und I385 cm"¹;

(7·) das kernmagnetische Resonanzspektrum, gemessen unter Verwendung von TMS als externer Standard in schwerem Wasser, ergibt die folgende Signale :
6 Wert (ppm):

2,34 (4h, Multiplett), 2,95 (2H, Multiplett), 3,19 (3H, Singlett), 3,72 - 4,31 (2H, Quartett, J = 18 Hz), 3,99 (3H, Singlett), 4,26 (IH, Multiplett), 4,40 - 4,95 (2H, Quartett, J = 14 Hz), 5,63 (IH, Singlett);

(8.) die gegenwärtig "am reinsten hergestellte Verbindung weist die folgenden elementaranalytischen Werte auf : C: 37,82 %, H: 4,01 %_} N: 12,90 %, S: 14,97 %',

(9·) es wird a-Aminoadipinsäure erhalten, wenn mit 6 η Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert wird. Es wird auch 2-Mereapto-5-methyl-l,3,4-thiadiazol erhalten, wenn in Methanol mit Dowex 50 W (Η-Typ) hydrolysiert wird.

Wenn man alle vorstehenden Ergebnisse berücksichtigt, ist es ersichtlich, daß die Verbindung eine 7-Methoxycephalosporin-Verbindung ist, denn die Verbindung weist die Absorption bei

— 1
cm (cyclisches Lactam) im Infrarot-Absorptionsspektrum auf.

Ferner werden die Signale bei 3,99 P P m (3H, Singlett, 7-OCH,), 5,63 ppm (IH, Singlett, 6-CH), 3,72 - 4,31 ppm (2H, Quartett, J = 18 Hz, 2-CH₂), 4,40 - 4,95 (2H, Quartett, J = 14 Hz,

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3-Seitenkette CH₂) erhalten. Es wird α-Aminoadipinsäure bei der Säurehydrolyse erhalten; und weiter auf Grund der Tatsache, daß die Absorption bei 3,19 ppm (3H, Singlett, Thiadiazol C-CH,) in dem kernmagnetischen Resonanzspektrum erhalten wird und auch 2-Mercapto-5-methyl-l_i3,4-thiadiazol durch milde Hydrolyse erhalten wird, wird der Verbindung die vorstehend erläuterte Struktur zuerkannt, in die das heterocyclische Thiol eingeführt wurde.

IV. 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl~A³-cephem-4-carbonsäure.

HOOC-CH-CH₂CH₂CH₂COHh-J—ρ γ ^—ν

Additionsverbindung :

2-Mercapto-1,3,4-thiadiazol;

N K

HS

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung IV der Formel A (R¹ = Aa, R= » U _M J₁ \ sind die folgenden :

(1.) leicht gelb-weißes Pulver;

(2.) sie zeigt keinen bestimmten Schmelzpunkt, jedoch erfolgen Braunverfärbung und Zersetzung bei etwa 175 ~ l80 C;

(3·) leicht löslich in Wasser, schwach löslich in Methanol, jedoch in anderen organischen Lösungsmittel!unlöslich;

(4.) amphoteres Material mit positiver Ninhydrin-Reaktion;

(5·) ergibt das in Fig. 7 dargestellte Ultraviolett-Absorptionsspektrum bei Messung in einer 1:100 M Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,4, Absorptionsmaximum bei 274 my;

(6.) es wird das in Fig. 8 dargestellte Infrarot-Absorptionsspektrum erhalten, wenn mit der Kaliumbromid-Tablette gemessen wurde, wobei die Absorptionen bei 3400 cm , 2925 cm"¹, 1765 cm"¹, 1610 cm"¹, 1515 cm"¹ und 1365 cm"¹

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liegen;

(7·) das kernmagnetische Resonanzspektrum, geraessen unter Verwendung von TMS als externer Standard in schwerem Wasser, ergibt die folgenden Signale : δ Wert (ppm):

2,30 (4H, Multiplett), 2,93 (2H, Multiplett), 3,69 - 4,29 (2H, Quartett, J = 18 Hz), 3,97 (3H, Singlett), 4,26 (IH Multiplett), 4,45 - 4,99 (2H, Quartett, J = 14 Hz), 5,56 (IH, Singlett), 9,85 (IH, Singlett);

(8.) das derzeit im reinsten Zustand erhaltene Produkt besitzt die folgenden elementar-analytischen Werte : C: 37,53 %, H: 4,36 %, N: 12,77 %, S: 16,42 %\

(9·) es wird a-Aminoadipinsäure bei der Hydrolyse mit 6 η Chlorwasserstoffsäure erhalten. Es wird auch 2-Mercapto-l,3,4-thiadiazol bei der Hydrolyse in. Methanol mit Dowex 50 W (Η-Typ) erhalten.

Berücksichtigt man alle Ergebnisse, so ergibt sich, daß die Verbindung eine 7-Methoxycephalosporin-Verbindung ist, denn die Verbindung ergibt im Infrarot-Absorptionsspektrum eine Absorption bei 1765 cm , und es werden die Signale bei 3,97 P P m (3H, Singlett, 7-OCH₃), 5,56 ppm (IH, Singlett, 6-CH), 3,69 - 4,29 ppm (2H, Quartett, J = l8 Hz, 2-CH₃), 4,45 - 4,99 (2H, Quartett, J = 14 Hz,3-Seitenkette CH₂), erhalten. a-Aminoadipinsäure wird durch Säurehydrolyse erhalten. Aus den Tatsachen, daß die Absorption bei 9,85 ρ ρ m (IH, Singlett, Thiazol CH) im kernmagnetischen Resonanzspektrum vorhanden ist und 2-Mercapto-l,3,4-thiadiazol bei milder Hydrolyse erhalten wird, ist der Verbindung die zuvor genannte Struktur zugeordnet worden, in die das heterocyclische Thiol eingeführt worden ist.

Nachfolgend werden die Ergebnisse von verschiedenen chromatographischen Analysen und Papierelektrophoretischen Untersuchungen der hergestellten Verbindungen I, II, III und IV dieser Erfindung angegeben.

Die erhaltenen Rf-Werte dieser Verbindungen in der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel SF) sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben :

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	- 2/ξ	I	C	-23-	2	2657599
		II		1	0,37	3
Hergestellte Verbindung	III		0,39	0,34	0,32
hergestellte Verbindung	IV		0,39	0,43	0,31
hergestellte Verbindung		0,43	0,38	0,40
hergestellte Verbindung	0,39	0,36	0,33
Cephalosporin C	0,37	0,36	0,31
7-Methoxy cephalosporin	0,41	0,36	0,32
Cephamycin C	0,37	0,26	0,31
Y-G19Z-D3	0,26	0,32	0,22
Y-G19Z-D2	0,39	0,26

Verwendetes Entwicklungslösemittelsystem (Volumenverhältnis):

1. Isopropanol ; n-Butanol : Essigsäure : Wasser ' (21 : 3 : 7 : 9).

2. n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4:1: 2).

3. n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1,5 : 2,5).

Die Kontrollprobe, Cephamycin C ist 7-(5-Amino-5'·carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-A³-cephem-4-carbonsäure.

Die Verbindungen Y-G19Z-D3 und Y-G19Z-D2, die in den vorstehenden Vergleichsuntersuchungen verwendet wurden, sind neue 7-Methoxycephalosporin-Verbindungen, die zuvor aus der Kulturflüssigkeit des Streptomyces oganonensis durch die gleichen Erfinder (vergl. Japanische Patentanmeldungen Nr. 109 753/'74 und 146 593/'75) isoliert worden sind.

Die Rf-Werte, die bei der PapierverteilungsChromatographie unter Verwendung vonWattman Nr. 1 Filterpapier und einem Entwicklungslösungmittelsystem aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) bestimmt wurden, lauten :

	I	Rf-Wert
Hergestellte Verbindung	II	0,40
hergestellte Verbindung		0,39
Cephalosporin C	C	0,36
7-Methoxy-cephalosporin		0,40
Cephamycin C		0,35
Y-G19Z-D3		0,24
Y-G19Z-D2	0,25

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Dann wurden die Verbindungen unter Verwendung einer Hitachi Hochgeschviindigkeits-Flüssigkeitschromatographie-Apparatur analysiert und dadurch folgende Resultate erzielt :

Säule: 3 χ 500 mm Säule aus rostfreiem Stahl Kunstharz: Hitachi 2610 (kationisches Austauschharz) Entwicklungslösungsmittelsystem: 0,2 M Citratpufferlösung (pH 3,6)· Fließgeschwindigkeit : 0,6 ml/min.
Schreibträgergeschwindigkeit: 1,0 cm/min.

Retentions zeit

Hergestellte Verbindung I 5 min 33

hergestellte Verbindung II 6 min 00 see

hergestellte Verbindung III 9 min 35 see

Cephalosporin C 5 min 18 see

7-Methoxy-cephalosporin C 5 min 09 see

Cephamycin C 5 min 18 see

Y-G19Z-D3 ' 3 min k2 see

Y-G19Z-D2 3 min \\2 see

Nachstehend werden weitere Ergebnisse von Analysen unter Verwendung der vorstehend erläuterten Apparatur, die unter folgenden Bedignungen erhalten wurden, in der Tabelle angegeben :

Säule: μ Bondapa C.g (Hersteller: Waters Ltd.) 4 χ 300 mm.

Entwicklungslösungsmittel-System: Acetonitril : 0,1 % Essigsäurelösung (pH 3,3) (1 : 9 im Volumenverhältnis).

Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min.
Sehreibträgergeschwindigkeit: 1,0 cm/min.

Retentionszeit

hergestellte Verbindung I 3 min Ik see hergestellte Verbindung II 1 min 52 see hergestellte Verbindung III 2 min 55 see hergestellte Verbindung IV 1 min 56 see

Die durch Hochspannungs-Papierelektrophorese erhaltenen Ergebnisse sind die folgenden :

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Filterpapier: Wattman Nr. 1

Entwicklungslösemittel:. 10 #ige Essigsäure (pH 2,2).
Spannung: 42 Volt/cm.
Laufzeit: 1 Stunde.

' Migrationsentfernung

Hergestellte Verbindung	I	- 3,6	cm
hergestellte Verbindung	II	- 3,3	cm
hergestellte Verbindung	III	- 3,6	cm
hergestellte Verbindung	JV	- 3,9	cm
Cephalosporin C		- 3,5	cm
7-Methoxy-cephalosporin	C	- 3,4	cm
Cephamycin C		- 3,5	cm
Y-G19Z-D3		- 6,1	cm
Y-G19Z-D2		- 6,1	cm
Cysteinsäure		- 7,5	cm
Glutathion		- 1.2	cm

Dann wurde die antibakterielle Aktivität der hergestellten Verbindungen I, II, III und IV dieser Erfindung bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammen mit jenen von Cephalosporin C als Vergleichssubstanz angegeben.

Herzinfusions-Agar Plattenmethode (verwendete

500 γ/ml-Lösung).

Die Zahlenwerte in der Tabelle geben den Durchmesser (mm) der
Inhibitionszone an.

I II III IV C

Sarcina lutea ATCC 9341 0 0 0 0 14,0

Staphylococcus aureus 209 P 0 0 0 0 12,8

Bacillus subtilis ATCC 6633 0 0 0 0 23,1

Escherichia coli NIHJ 19,2 18,7 14,2 13,0 10,4

Klebsieila pneumoniae 21,8 23,5 23,0 23,0 13,0

Salmonella gallinarum 24,0 25,2 23,5 25,1 23,5

Proteus vulgaris OX 19 22,6 20,2 20,0 21,0 17,5

Proteus mirabilis IMP OM-9 22,2 19,8 19,5 23,0 23,0

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Bemerkung : I: Verbindung I dieser Erfindung

II: Verbindung II dieser Erfindung III: Verbindung III dieser Erfindung IV: Verbindung IV dieser Erfindung C: Cephalosporin C (Vergleich)

Jede der Verbindungen I, II, III und IV dieser Erfindung kann in verschiedenen Formen, einzeln oder in Kombination mit anderen Medikamenten, verwendet werden. Dies bedeutet, daß die Verbindungen dieser Erfindung oral, durch intramuskuläre Injektion, durch intravenöse Injektion etc. in der Form von Kapseln, Tabletten, Pulver, Granulaten, Lösungen und Suspensionen verabreicht werden können. Verschiedene Träger werden den Zubereitungen hinzugefügt, zum Beispiel Mannitol, Sukrose, Glukose, sterilisiertes destilliertes Wasser, Salzlösung . und ein vegetabiles öl, wie Ernußöl, Sesamöl. Weiterhin können andere Ingredientien, wie Stabilisatoren, Bindemittel, Antioxidantien, Konservierungsmittel, ein Gleitmittel bei der Herstellung von Tabletten, Suspendiermittel, Viskositätsmittel, Duftstoff etc., hinzugefügt werden.

Als Salze der Verbindungen der Formel A (R = Aa) werden die Salze der anorganischen oder,organischen Basen, die pharmakologisch nichttoxisch oder brauchbar sind, verwendet. Die Dosierung der Medikamente hängt-hauptsächlich von dem Zustand und dem Gewicht des Wirtes ab. Sie hängt auch von der Verabreichungsart ab, z.B. orale oder parenterale Verabreichung. Im allgemeinen werden 50 mg/kg in einer Dosis oder in einigen aufgeteilten Dosen pro Tag verabreicht.

Die Verbindungen A (R = Aa) dieser Erfindung besitzen ausgezeichnete antimikrobielle Aktivitätenj diese werden für die Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen bei Mensch und Tier verwendet. Ferner können sie auch in geeigneter Weise als Zwischenprodukte zur Herstellung anderer effektiver 7-Methoxycephalosporin-Derivate Verwendung finden. In solchen Fällen wird es bevorzugt, die Verbindung der Formel A (R = Aa) als reines Produkt oder als ein hochkonzentriertes Rohprodukt zu isolieren.

^H2^N\ Besonders wenn die Substituentengruppe tt_OOC.- CH-(CH₂ K-CONH- in

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der 7-Position der Verbindung der Formel A (R = Aa) durch eine andere Acylamidgruppe ersetzt wird, verschwinden die amphoteren Eigenschaften und das so modifizierte saure Produkt wird zur Isolierung gut geeignet, und es wird in organischen Lösungsmitteln löslich. Die nachfolgende Reaktion kann ohne Schwierigkeiten durchgeführt werden. Daher wird die Modifikation der Verbindung

11

der Formel A (R = Aa) in A (R = Ab) wie vorstehend schon erläutert für die Anwendung in der industriellen Praxis bevorzugt.

Als Ergebnis von weiteren fortgesetzten Untersuchungen des vorstehend erläuterten Themas haben die Erfinder weiter gefunden, daß die Verbindung der Formel A (R = Aa) in die Verbindung der Formel A (R = Ab) überführt werden kann durch Wirkung des Mycels des D-Aminosäure oxydierenden Enzym herstellenden Stammes, der zum Genus Trigonopsis oder des behandelten Mycels mit der Verbindung der Formel A (R = Aa) oder deren Salz gehört oder weiter der fermentierten Gärbrühe, die diese enthält, und da die Verbindung der Formel A (R = Ab) leicht in organischem Lösungsmittel aufgelöst werden kann, welches die Trennungs- und Reinigungsstufe erheblich vereinfacht.

Die so hergestellten Verbindungen der Formel A (R = Ab) besitzen ausgezeichnete antimikrobielle Aktivitäten. Sie sind auch zusätzlich als Zwischenprodukte zur Herstellung von 7~Methoxycephalosporin-Derivaten zu gebrauchen, denen in die 7-Position.. andere Acylgruppen eingeführt worden sind, denn diese Verbindungen sind in organischen Lösungsmitteln löslich.

In dieser Ausfuhrungsform der Erfindung wird der D-Aminosäure oxidierende Enzym herstellende Stamm, der zum Genus Trigonopsis gehört, passend verwendet. Ein derartiger Stamm kann aus der Typkultur ausgesucht werden, die in Stämme-Aufbewahrungsinstituten aufgehoben werden,oder er kann aus Erde isoliert werden. Auch können zur Erholung der Bildungsaktivität des herzustellenden Materials der Formel A (R = Ab) Mutanten verwendet werden, die aus den vorerwähnten Stämmen durch übliche Vorrichtungen hergestellt werden. Die Verwendung solcher Mutanten ist kostengünstig. Als der Mikroorganismus, der die vorerwähnte D-Aminosäure oxidierende Enzym-Aktivität besitzt, wird zur Verdeutlichung

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Trigonopsis variabilis genannt. Dieser Stamm ist vom Institut für Fermentation, Osaka (Japan) unter der Stamm-Nr. IFO 0755 (ATCC IO679) und Stamm-Nr. IFO O67I erhältlich.

Zur Herstellung der Verbindungen der Formel A (R = Ab) unter Verwendung des Mikroorganismus, der eine solche D-Aminosäure. oxydierende Enzym-Aktivität aufweist, wird es gewöhnlich bevorzugt, daß der Mikroorganismus erst kultiviert wird und das so erhaltene Mycel oder das so behandelte Mycel zu der Cephalosporin-Verbindung der allgemeinen Formel A (R = Aa) unter geeigneten Bedingungen gebracht wird.

Als Kultivationsmethode zur Herstellung des Mycels wird es jedoch gewöhnlich bevorzugt, die aerobe Kultivation zu verwenden. In einer bevorzugteren Ausführungsform wird eine flüssige Kultivation unter Rühren und Belüftung verwendet. Herkömmliche Kulturmedien können für dieses Verfahren Verwendung finden.

So können synthetische Kulturmedien, halb-synthetische Kulturmedien oder natürliche Kulturmedien als Zubereitung für das Kulturmedium verwendet werden, wie Glukose, Sukrose, Mannitol, Glycerin, Dextrin, Stärke, vegetabiles öl als Kohlenstoffquelle und Fleischextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsaatmehl, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Fischmehl, Kornschlempe, Trockenhefe, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff und andere organische und anorganische Stickstoffverbindungenals Stickstoffquelle.

Ebenso werden,falls erforderlich, Metallsalze, wie SuIfate, Nitrate, Chloride, Carbonate, Phosphate etc. von Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Zink, Eisen.etc. zu dem Kulturmedium hinzugefügt. Weiterhin werden, falls erforderlich, Methionin, Cystein, Cystin, Methyloleat, Lardöl^ilikonöl, oberflächenaktive Mittel etc. dem Kulturmedium als ein Bildungs- oder Entschäumungsmittel zugesetzt. Die gewünschten Resultate werden durch Aufrechterhalten des pH des Kulturmediums bei etwa 4-10, vorzugsweise 5 - 6, erhalten.

Besonders wenn das Kulturmedium D-(oder DL-)Aminosäure, wie beispielsweise D-(oder DL-)Methionin, D-(oder DL-)Alanin, D-(oder DL-) Valin etc. enthält, wird eine ausgezeichnete D-Aminosäure oxydierende Enzym-Aktivität erhalten. Die Kultivationstemperatur

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beträgt gewöhnlich 18 - 37°C, vorzugsweise etwa 30⁰C. Der Zeitraum der Kultivation ist unterschiedlich gemäß den Kultivationsbedingungen, insbesondere in Abhängigkeit von der Kultivationsapparatur, der Zusammensetzung des Kultivationsmediums, der Temperatur etc. Es'wird jedoch bevorzugt, die Kultivation zu vervollständigen, wenn die D-Aminosäure oxydierende Enzym-Aktivität ein Maximum besitzt. Gewöhnlich werden 2-10 Tage für die Kultivation benötigt. Das so erhaltene Mycel oder das behandelte Mycel wird für die D-Aminosäure-Oxydationsreaktion des Ausgangsmaterials der Formel A (R = Aa) verwendet. In diesem Falle wird unter behandeltem Mycel das Mycel verstanden, welches in eine brauchbare Form zur Herstellung des gewünschten Materials A (R = Ab) überführt wurde, indem die D-Aminosäure oxydierende Enzym-Aktivität durch die Anwendung einer geeigneten Behandlung gesteigert wurde. Beispielsweise ist die D-Aminosäure oxydierende Enzym-Aktivität, die in dieser Erfindung benutzt wird, gewöhnlich im Mycel vorhanden, und deshalb bedeutet das behandelte Myeel den zellfreien Extrakt, der gewonnen wurde durch Anwendung physikalischer und/oder chemischer Einwirkungen auf das Mycel, das aus dem Kultivationsprodukt der D-Aminosäure oxydierenden Enzym-Aktivität herstellenden Stämme gesammelt wurde, gewaschen wurde, oder teilweise oder vollständig gereinigtes D-Aminosäure oxydierendes Enzym, das aus dem zellfreien Extrakt durch Anwendung bekannter Enzymabtrennungs- und Reinigungsmethoden gewonnen wurde, oder weiterhin kann das aktivierte Mycel, das durch Kombinieren des partiell oder ganz gereinigten D-Aminosäure oxydierenden Enzyms mit einem wasserunlöslichen Polymer oder einem anorganischen Träger durch physikalische oder chemische Mittel erhalten worden ist, einen festen D-Aminosäure oxydierenden Enzym-Aktivator oder Mycel ergeben, und dann wird der Aktivator oder das Mycel einer Aktivationsbehandlung unterworfen.

In dieser Erfindung ist die Herstellung und die Rückführung des vorstehend erläuterten löslichen Enzyms auf den praktischen Gebrauch beschränkt, aber die Verwendung des unlöslichen Enzyms, wie das aktivierte Mycel, ist besonders wirtschaftlich für den industriellen Gebrauch, wobei sie leicht abgetrennt und wiederverwendet werden können.

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Die Aktivierungsbehandlung des Mycels, die vorstehend beschrieben ist, kann dadurch bewirkt werden, daß das Myeel eine gewisse milde Schädigung in einem solchen Ausmaß erleidet, daß keine Zerstörung erfolgt.

Als Beispiele für eine solche Aktivationsbehandlung wird zur Verdeutlichung ein Verfahren genannt, bei dem das Myeel auf eine Temperatur unterhalb -10⁰C bei einem pH von etwa 3-4 eingefroren wird, dann aufgetaut und mit einem Lösungsmittel behandelt wird, wobei das Mycel in einem Bad von einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, n-Butanol, 2-Phenyläthanol, Diäthylather, Cyclohexan, Benzol, Toluol etc., behandelt wird, ein Verfahren, wobei das Mycel mit 0,1 - 10 % oberflächenaktivem Mittel behandelt wird, beispielsweise einem kationischen oberflächenaktiven Mittel, wie Cetyltrimethylammonium, Cetylpyridinium cetyldimethylbenzyl-Ammoniumhalid etc., einem anionischen oberflächenaktiven Mittel, wie Dodecylsulfat, einem Alkalimetalialkylarylsulfonat, Natriumdesoxycholat etc., und einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel, wie Sorbitanmonolaurat, Triton X-100 etc., in ihrer wässerigen Lösung, ein Verfahren, bei dem das Mycel mit einer verdünnten wässerigen Lösung von Kaliumhydroxid oder Natriumhydroxid behandelt wird, oder ein Verfahren, bei dem das Mycel in einer.Lösungssuspendiert wird bei einem hohen osmotischen Druck, beispielsweise 2 M Zuckerlösung, worauf die Lösung dann schnell mit Wasser verdünnt wird. Diese Aktivierungsbehandlungen sind durch verschiedene Paktoren beeinflußt, wie Temperatur, Zeitdauer der Bearbeitung, pH-Wert, der Konzentration des Reagenzes etc. Daher ist es erforderlich, die Aktivierungsbedingungen auszuwählen.

Auch wenn die Wirkung der Katalase, die gewöhnlich in einem Mycel vorhanden ist, nicht inhibiert wird, wird die oxydative Decarboxylierung zu dem gewünschten Material A (R = Ab) nicht vollständig, um gemeinsam das 7-(5-Carboxy-5-oxovaleramido)-7-methoxycephalosporin-Derivat mit der allgemeinen Formel B

HOOC-CO-(CHp) .CONH -f^ ^ (B)

zu bilden. COOH

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Daher ist es erwünscht, um selektiv das gewünschte Material A (R = Ab) zu erhalten, die Katalaseaktivität zu inhibieren. Beispiele für geeignete Katalase-Inhibitoren sind Ascorbinsäure, 3-Amino-l_s2,4-triazol, Alkalimetallazide etc., und Natriumazid wird besonders bevorzugt. Der Inhibitor kann zu dem Reaktions-

1 gemisch während der Umwandlung des Ausgangsmaterials A (R = Aa) in das herzustellende Material A (R = Ab) hinzugefügt werden. Auch das Mycel kann mit dem Inhibitor vorbehandelt werden bevor das Mycel für die vorstehend erläuterte Umwandlung Verwendung findet. Die Menge an Natriumazid, die für den angegebenen Zweck gebraucht wird, beträgt 1 - 100 mM. Weiterhin kann die Katalase in dem angegebenen Mycel inaktiviert werden, indem das Mycel einer Wärmebehandlung unterworfen wird, bevor es in der vorhin erwähnten Umwandlungsstufe verwendet wird. So kann das vorgenannte Mycel bei 40 - 60 C, vorzugsweise bei 50 C, für mindestens 3 Stunden vorbehandelt werden, wodurch die Katalaseaktivität erheblich abfällt, jedoch die D-Aminosäureoxidase-Aktivität bleibt unverändert. Die Wärmebehandlung des Mycels kann einfach durchgeführt werden, indem das Mycel in einer wässerigen Lösung oder einer Puffersuspensionjbehandelt wird. Besonders wirksam ist es, das Mycel gleichzeitig der vorstehend erläuterten- Wärmebehandlung und der "Aktivierungs"-Reagenzbehandlung zu unterwerfen. Beispielsweise kann durch Aktivationsbehandlung des Mycels bei 50 C für 4 Stunden unter Verwendung eines Lösungsmittels (Toluol) der Inhibitor der Katalaseaktivität und die Aktivierung des Mycels gleichzeitig durchgeführt werden.

Die Reaktion des Enzymsystems auf das vorstehend genannte aktivierte Mycel und das Ausgangsmaterial A (R = Aa) wird gewöhnlich bei einem pH von 6-8 durchgeführt. Es ist wünschenswert, die Reaktion bei 30 - 40°C auszuführen. Der Zeitraum der Reaktion ist vor allem von der Potenz des Enzyms abhängig, gewöhnlich sind 1-5 Stunden erforderlich.

Da die vorstehend genannte Enzymreaktion unter aeroben Bedingungen ausgeführt wird, wird sie vorzugsweise unter Belüftung mit Luft oder Sauerstoff durchgeführt.

Wie schon erläutert, ist es schwierig, das Ausgangsmaterial der

1 '
Formel A (R = Aa) aus der fermentierten Brühe auf Grund der amphoteren Struktur zu extrahieren. Jedoch kann gemäß der

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bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Abtrennung des hergestellten Produktes der Formel A (R = Ab) unter einer geeigneten Bedingung aus der fermentierten Gärbrühe des Ausgangsmaterials der Formel A (R = Aa) nach der Entfernung des Mycels durchgeführt werden. Dies bedeutet, daß das hergestellte Mate-

1
rial A (R = Ab) leicht durch Lösungsmittelextraktion oder durch Adsorption mittels Ionenaustauscherharz abgetrennt werden kann.

Beispielsweise wird das Reaktionsproduktgemisch angesäuert unterhalb von pH 2,5» und dann wird das hergestellte Material aus dem Reaktionsgemisch mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat, n-Butanol etc., extrahiert. In diesem Falle liefert die Kombination eines Ionenaustauscherharzes und einer Lösungsmittelextraktion die besseren Ergebnisse. Geeignetes Ionenaustauscherharz ist ein flüssiges Amin-anionisches Austauscherharz. Beispiele für das bevorzugte Lösungsmittel sind Äthylacetat, Butylacetat, n-Butanol etc. Auch kann das hergestellte Produkt unter Verwendung von einem festen Ionenaustauscherharz vorgenommen werden. In diesem Falle kann ein geeignetes Lösungsmittel leicht durch eine geeignete Voruntersuchung gefunden werden.

Um das reine Produkt zu erhalten, werden gewöhnlich die üblichen Reinigungsmethoden für Antibiotika verwendet. Das hergestellte Material der Formel A (R = Ab) kann nur im freien sauren Zustand abgetrennt werden, aber auch als dessen gewöhnliches Alkalimetallsalz, Erdalkalimetallsalz, organisches Aminsalz etc.

Einige neue y-Methoxycephalosporin-Derivate der Formel A (R = Ab) dieser Erfindung werden nachfolgend zusammen mit ihren Eigenschaften aufgezeichnet.

V. 7~(¹i-Carboxybutyramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3_J4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-A³-cephem-¹l-carbonsäure :

HOOC-

SCH₂COOH

COOH

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Ausgangsmaterial I :

7~(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-A³-cephem-4-carbonsäure;

HOOC-CK-(CH₂),-CONH

SCH₂COOH

COOH

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung V der Formel A (R¹ = Ab, R² = Jf~jL SCH₂COOH, M = H).

sind die folgenden:

(1.) weißes Pulver;

(2.) Schmelzpunkt 75 - 78⁰C;

(3·) leicht löslich in Methanol und Äthanol, löslich in Wasser, Äthylacetat, Butylacetat und Butanol, jedoch kaum löslich in anderen organischen Lösungsmitteln;

(4.) saures Material besitzt negative Ninhydrinreaktion; (5·) es zeigt das in Fig. 9 dargestellte Ultraviolett-Absorptionsspektrum, gemessen in einer 1/100 M Phosphat-Pufferlösung mit einem pH von 6,5, und das Absorptions-• maximum liegt bei 278 my;

(6.) Fig. 10 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum aus der

Messung mit der Kaliumbromid-Tablette und besitzt Absorptionen bei 3250 cm"¹, 2925 cm"¹, 1770 cm"¹, 1715 cm"¹, 1520 cm"¹, 138O cm"¹;

(7.) das kernmagnetische Resonanzspektrum unter Verwendung von . TMS als innerer _ Standard in schwerem Methanol ist in Fig. 11 dargestellt und besitzt die folgenden Signale: δ Wert (ppm): 1,93 (2H, Multiplett), 2,4l (4H, Multiplett), 3,51 (3H, Singlett), 3,37 - 3,8l (2H, Quartett, J = 18 Hz), 4,11 (2H, Singlett), 4,15 - 4,63 (>2H, Quartett, J = 14 Hz), 5,05 (IH,.Singlett);

(8.) die folgenden elementar-analytischen Werte für

^Cl8^H2O^N4°9^S4*^2H2° ^werden erhalten :

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• _C_ · ■ J3_ · · N

Berechnet: 35,99 % 4,03 % 9,33 %

gefunden : 35,77 % 3,8l % 9,42 %

(9· ) das Massenspektrum des hergestellten Materials V, gemessen nach der Hydrolyse des Materials in 6 η Chlorwasserstoffsäure für 2,5 Stunden bei 100⁰C, Extraktion des hydrolysierten Produktes mit Ä'thy lather, Trocknen des Produktes durch Abdampfen, und dann Silylieren mit BSA (Bistrimethylsily!acetamid) ergibt das Fragment von m/e 276 (CH,),Si-0OC-CH₂-CH₂-CH₂-COO-Si(CH,),.

Wenn man die vollständigen Gesamtergebnisse berücksichtigt, so ist ersichtlich, daß die hergestellte Verbindung eine 7-Methoxycephalosporin-Verbindung ist. Dies ergibt sich aus der Gegenwart insbesondere der Absorption bei 1770 cm (cyclisches Lactam) in dem Infrarot-Absorptionsspektrum, und der Signale bei 3,51 P P m (3H, Singlett, 7-OCH₃), 5,05 P P m (IH, Singlett, 6-CH), 3,37 - 3,81 ppm (2H, Quartett, J = l8 Hz, 2-CH₂), 4,15 - 4,6 ppm (2H, Quartett, J = 14 Hz, 3-Seitenketten CH₃), und weiter 4,11 ρ ρ m (2H, Singlett, CH₂ von -S-CH₂-COOH) und weiter aus den Tatsachen, daß 1,93 P P m (2H, Multiplett, 3-CH₂) und 2,4l ppm (4H, Multiplett, α,γ-CHp)+) wodurch die Anwesenheit von 4-Carb oxybutyramido in dem kernmagnetischen Resonanzspektrum angezeigt wird, und das Massenspektrum des Derivates des hergestellten Materials, das mit Chlorwasserstoff hydrolysiert und silyliert wurde, das Fragment von m/e 276 ergibt; die hergestellte Verbindung V dieser Erfindung besitzt die vorstehend angegebene Struktur, wobei die 5-Amino-5~carboxyvaleramido-Gruppe in der 7-Position des Ausgangsmaterials oxydativ deaminiert worden ist zur 4-Carboxybutyramido-Gruppe. -+) anwesend sind,

VI. 7-(4-Carb oxybutyramido )-7-methoxy-3-(1-methyl-lH-te tr azol-5~yl)thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure :

HOOC- (CH₂) ₃-CONH

709827/1078

Ausgangsmaterial II :

7-(5-Aminb-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure.

■CH-(CH₂)₃-(

HOOC-CH-(CH₀),-CONH

COOH

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung VI der Formel A (R¹ = Ab, R² = N-—N , M = H) sind die folgenden :

^N CH

(1. ) weißes Pulver; (2.) Schmelzpunkt 80 - 83°C;

(3·) leicht löslich in Methanol und Äthanol, löslich in Wasser, A'thylacetat, Butylacetat und Butanol, jedoch kaum löslich in anderen organischen Lösungsmitteln. Das Natriumsalz ist in Wasser leicht löslich;

(4.) saures Material zeigt negative Ninhydrinreaktion;

(5·) das erhaltene Ultraviolett-Absorptionsspektrum ist in Fig. 12 dargestellt; es wurde in 1/100 M Phosphat-Pufferlösung mit einem pH von 6,5 gemessen; das Absorpti.onsmaximum liegt bei 269 my;

(6.) das erhaltene Infrarot-Absorptionsspektrum ist in Fig. 13 dargestellt, gemessen mit der Kaliumbromid-Tablette, und

— 1 —1

besitzt die Absorptionen bei 3420 cm , 2940 cm ,

1765 cm"¹, 1680 cm"¹, l6lO cm"¹, 1525 cm"¹, 1390 cm"¹; (7·) das kernmagnetische Resonanzspektrum, gemessen unter

- Verwendung von TMS als innerer Standard in schwerem Methanol gibt die in Fig. 14 dargestellten Signale :

δ Wert (ρ ρ m): 1,9¹I (2H, Multiplett), 2,40 (i|H, Multiplett), 3,51 (3H, Singlett), 3,40 - 3,83 (2H, Quartett, J = 18 Hz), 3,99 (3H, Singlett), 4,17 - 4,50 (2H, Quartett, J = 14 Hz), 5,02 (IH, Singlett);

(8.) es werden die folgenden elementar-analytischen Werte für C₁₆H₂₀NgO₇S₂·2Η₂0 erhalten :

709827/1078

	-	C_	%	4,76 %	■ ' TJ «■■HM	2657599
		,79	%	4,75 %	16,
Berechnet:	37	,78			16,	53 %
Gefunden :	37			41 %

(9· ) das Massenspektrum des hergestellten Materials VI, gemessen nach der Hydrolyse des Materials in 6 η Chlorwasserstoffsäure für 2,5 Stunden bei 100⁰C, Extrahieren des hydrolysierten Produktes mit Äthyläther, Trocknen und Abdampfen und Silylierung mit BSA (Bistrimethylsilylacetamid) ergibt das Fragment von m/2 276 (CH,) -,Si-OOC-CH₂-CH₂-CH₂-COOSi(CH₃),.

Berücksichtigt man die vorstehenden Gesamtergebnisse, so ergibt sich, daß die hergestellte Verbindung eine 7~Methoxycephalosporin-Verbindung ist, insbesondere die Existenz der Absorption bei 1765 cm (cyclisches Lactam) in dem Infrarot-Absorptionsspektrum und die Signale bei 3,51 ρ ρ m (3H, Singlett, 7"OCH,), 5,02 ppm (IH, Singlett, 6-CH), 3,99 ppm (3H, Singlett, N-CH, von Tetrazol), 3,40 - 3,83 P P m (2H, Quartett, J = l8 Hz, 2-CH₂), 4,17 " 4,50 ppm (2H, Quartett, J = 14 Hz, 3-Seitenketten CH₂) und weiter aus den Tatsachen, daß anwesend sind 1,94 ppm (2H, Multiplett, 3"CH₂) und 2,40 ρ ρ m (4H, Multiplett, a,Y-CH₂) beweist die Existenz von 4-Carboxybutyramidoin dem kernmagnetischen Resonanzspektrum und weiter das Massenspektrum des Derivates des hergestellten Materials, hydrolysiert mit Chlorwasserstoffsäure und silyliert, ergibt das Fragment von m/e 276; die hergestellte Verbindung VI dieser Erfindung hat ergeben, daß sie die vorstehend angegebene Struktur besitzt und die 5-Amino-5-carboxyvaleramid-Gruppe in der 7-Position des Ausgangsmaterials oxydativ deaminiert wurde in die 4-Carboxybutyramid-Gruppe.

VII. 7-(4-Carboxybutyramido)-7~methoxy-3-(5-methy1-1,3 >4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-ij-cephem-4-carbonsäure:

OCH.

H00C-(CH₂)₃-C0NH

COOH

709827/1078

Ausgangsmaterial III:

OCH-

HOOC-CH-(CH₂)₃C0NH■

COOH

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung VII dieser Erfindung mit der Formel A (R = Ab,

R = J] y—_CH μ = H) ^s^^{nd d}^-^e folgenden

= J] yμ = H)

(1.) weißes Pulver;

(2.) Schmelzpunkt 95 - 99°C;

(3.) leicht löslich in Methanol und Äthanol, löslich in Wasser, Äthylacetat, Butylacetat und Butanol, aber kaum löslich in anderen organischen Lösungsmitteln;

(4. ) saures Material ergibt negative Ninhydrinreaktion; (5.) es wurde das Ultraviolett-Absorptionsspektrum, wie in Fig. 15 dargestellt, erhalten, wenn in a 1/100 M Phosphat-Pufferlösung mit pH 6,5 gemessen wurde. Das Absorptionsmaximum liegt bei 273 my;

(6.) es wird das Infrarot-Absorptionsspektrum gemessen als

Kaliumbromid-Tablette erhalten und zeigt die Absorptionen bei 3260 cm"¹, 2925 cm"¹, 1773 cm"¹, 1515 cm"¹ und . 1375 cm"¹;

(7·) das kernmagnetische Resonanzspektrum, gemessen unter Verwendung von TMS als innerer Standard in schwerem Methanol, ergibt die in Fig. 17 dargestellten Werte und besitzt die folgenden Signale :

δ Wert (ppm) : 1,92 (2H, Multiplett), 2,40 (4H, Multiplett), 2,71 (3H, Singlett), 3,38 - 3,80 (2H, Quartett, J = 18 Hz), 3,51 (3H, Singlett), 4,17 - 4,64 (2H, Quartett, J = 14 Hz), 5,03 (IH, Singlett); (8.) es werden die folgenden elementar-analytischen Werte für ^C17^H2O^N4°7^S3 ^{ernalten :}

709827/1078

	41	c_	4	H_	JL	2657599
	41	,79 %	4	,13 %	11,
Berechnet:		,89 %		,27 %	11,	47 %
gefunden :			17 %

(9·) Das Massenspektrum des hergestellten Materials VII, gemessen nach der Hydrolyse des Materials in 6 η Chlorwasserstoffsäure in 2,5 Stunden bei 100⁰C, Extrahieren des Produktes mit Äthyläther, Trocknen des Extraktes durch Abdampfen, Silylieren mit BSA (Bistrimethylsilylacetamid) ergibt das Fragment von m/e 276 (CH₃USi-OOC-CH₂-CH₂-CH₂-CO-OSi(CH₃) .

Berücksichtigt man die vorstehend genannten Ergebnisse, so ist ersichtlich, daß die hergestellte Verbindung eine 7~Methoxycephalosporin-Verbindung ist, insbesondere durch die Existenz der Absorption bei 1773 cm (cyclisches Lactam) in dem Infrarot-Absorptionsspektrum und die Signale bei 3,51 ppm (3H, Singlett, 7-OCH₃), 5,03 ppm (IH, Singlett, 6-CH), 2,71 ppm (3H, Singlett, C-CH₃ von Thiadiazol), 3,38 - 3,80 ρ ρ m (2H, Quartett, J = 18 Hz, 2-CH₂) und 4,17 - 4,64 ppm (2H, Quartett, J = 14 Hz, 3-Seitenketten CH₂) und weiter aus den Tatsachen, daß 1,92 ppm (2H, Multiplett, 3"CH₂) und 2,40 ρ ρ m (4H, Multiplett, a,Y-CH₂) anwesend sind, zeigen die Existenz von 4-Carboxybutyramid im kernmagnetischen Resonanzspektrum, und weiterhin ergibt das Massenspektrum des Derivates, hergestellt durch Hydrolyse der hergestellten Verbindung mit Chlorwasserstoffsäure und Silylieren des Produktes das Fragment von m/e 276. Der hergestellten Verbindung der Formel VII wurde die vorstehend angegebene Struktur zugesprochen, wobei die 5-Amino-5-carboxyvaleramido-Gruppe in der 7-Position des Ausgangsmaterials oxydativ deaminiert wurde in die 4-Carboxybutyramido-Gruppe.

VIII. 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure :

HOOC-C CH₂ K-CONH

COOH

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- 3T-

Ausgangsmaterial IV :

7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(1,3,4-thiadia zol-2-yl)thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure :

HOOC-CH-(CH₂)₃CONH NH₂

COOH

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten

Verbindung VII der Formel A (R¹ = Ab, R² =· IJ |J , M = H) sind

die folgenden : "*^S

(1.) weißes Pulver;

(2.) Schmelzpunkt 88 - 92°C;

(3.) leicht löslich in Methanol und Äthanol, löslich in Wasser, Äthylacetat, Butylacetat und Butanol, jedoch kaum löslich in anderen organischen Lösungsmitteln;

(4.) Saures Material besitzt negative Ninhydrin-Reaktion; (5·) es wrid das Ultraviolett-Absorptionsspektrum, wie in Fig. 18 dargestellt, erhalten, xrenn in 1/100 M Phosphat-Pufferlösung mit pH 6,5,gemessen wurde; das Absorptionsmaximum liegt bei 274 my;

(6.) es wird das Infrarot-Absorptionsspektrum, wie in Fig. 19 dargestellt, erhalten, wenn an einer Kaliumbromid-Tablette gemessen wurde; die Absorptionen liegen bei 3250 cm , 2925 cm"¹, 1770 cm"¹, 1515 cm"¹ und 1365 cm"¹;

(7. ) das kernmagnetische Resonanzspektrum, gemessen unter TMS als innerer Standard in schwerem Methanol, ergibt, wie in Fig. 20 dargestellt, die folgenden Signale :

δ Wert (ρ ρ m) : 1,92 (2H, Multiplett), 2,40 (4H, Multiplett), 3,39 - 3,83 (2H, Quartett, J = l8 Hz),_; 3,51 (3H, Singlett), 4,24 - 4,73 (2H, Quartett, J = 14 Hz), 5,03 (IH, Singlett) und 9,35 (IH, Singlett);

(8.) es werden die folgenden elementar-analytischen Werte für - C₁₆H₁₈N₁₁O S *l/2H₂0 erhalten :

709827/1078

2657593

Berechnet: 39,74 % 3,96 % 11,59 % gefunden : 39,69 % 3,87 % 11,32 %

(9·) Das Massenspektrum der hergestellten Verbindung VIII, gemessen durch Hydrolyse der Verbindung in 6 η Chlorwasserstoff säure für 2,5 Stunden bei 100⁰C, Extrahieren des Produktes mit Äthyläther, Trocknen des Extraktes durch Abdampfen und Silylieren mit BAS (Bistrimethylsilylacetamid) ergibt das Fragment von m/e 276 (CH₃KSi-OOC-CH₂-CH₂-CH₂-CO-OSi(CH₃)_.

Berücksichtigt man die vorstehenden Gesamtergebnisse, so ergibt sich, daß die Verbindung dieser Erfindung eine 7-Methoxycephalosporin-Verbindung ist. Dies wird abgestützt durch die Existenz der Absorption bei 1770 cm (cyclisches Lactam) in dem Infrarot-Absorptionsspektrum und den Signalen bei 3,51 ppm (3H, Singlett, 7-OCH₃), 5,03 ppm (IH, Singlett, 6-CH), 9,35 P P m (IH, Singlett, CH von Thiadiazol), 3,39 - 3,83 ppm (2H, Quartett, J = 18 Hz, 2-CH₃) und 4,24 - 4,73 ppm (2H, Quartett, J = 14 Hz, 3"Seitenketten CHp) und weiter durch die Tatsachen, daß die Signale 1,92 ρ ρ m (2H, Multiplett, -CH₂) und 2,40 ρ ρ m (4H, Multiplett, -CH₂) anwesend sind, die die Existenz von 4-Carboxybutyramidoin dem kernmagnetischen Resonanzspektrum anzeigen, und weiterhin ergibt das Massenspektrum des Derivates, welches durch Hydrolyse der hergestellten Verbindung mit Chlorwasserst off säure und Silylierung des Produktes gewonnen wurde, das Fragment von m/e 276. Der hergestellten Verbindung VIII wurde die vorstehend angegebene Struktur zuerkannt, wobei die 5-Amino-5-carboxyvaleramido-Gruppe in der 7~Position des Ausgangsmaterials oxydativ deaminiert wurde in die 4-Carboxybutyramido-Gruppe.

Weiterhin zeigen die Analysenergebnisse der DünnschichtChromatographie-Untersuchungen der Verbindungen V - VII dieser, Erfindung und Hochgeschwindigkeits-FlüssigkeitsChromatographie, die in der folgenden Tabelle wiedergegeben sind, auch die Resultate, uie für die Ausgangsmaterialien I - IV erhaltenen Werte. Die Rf-Werte für die DünnschichtChromatographie unter Verwendung von mikrokristalliner Cellulose (Avicel) waren die folgenden :

709827/1078

tr -

Talbelle 1

	V	JjO sung smit	telsystem	Ninhydrin
		1	2	Anfärbung
Ausgangsmaterial I	VI	0,44	0,37	+
hergestellte Verbindung		0,79	0,72
Ausgangsmaterial II	0,44	0,34	+
hergestellte Verbindung	0,81	0,64	—
Ausgangsmaterial III	0,42	0,44	+

hergestellte Verbindung "VII 0,82

Ausgangsmaterial IV " 0,42

hergestellte Verbindung VIII 0,81

7-(J5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-£C.3-p-hydroxyphenyl-2-methQxyprgpenoyljGxymethylJ-7-methoxy-Δ 3_cephem-4-carbonsäure 0,66

7-(4-Carboxybutyramido5-3-L(3-p-hydroxyphenyl-2-methoxypropenoyl)bxymethylj -7-niethoxy-4 ^-cephem-4-carbonsäure 0,67

Entwicklungslösungsmittelsystem: 1 ♦ Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure (21 : 3 : 7 : 9 Volumenverhältnis)

0,77 0,36 0,65

0,67

0,67

Wasser

2, n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1. : 2 Volumenverhältnis)

Nachweis: Ninhydrinreaktion oder Ultraviolettabsorption (Manasulu Light, 2536 A) oder Bioautographie(unter Verwendung von Proteus mirabilis).

Die vollständigen Verbindungen geben positive Ergebmisse-in den letzten beiden !Besten. ;

Die Ergebnisse der Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.

709827/1078

tabelle 2

Retentionszeili

Ausgangsmaterial I . 3 Min. 14 Sek.

hergestellte Verbindung V 13 Min. 24 Sek.

Ausgangsmaterial II 1 Min. 53 Sek.

hergestellte Verbindung YI 4 Min. 54 Sek.

Ausgangsmaterial III 2 Hin, 55 Sek.

hergestellte Verbindung YII 11 Min. 18 Sek.

Ausgangsmaterial IV " 1 Min, 56 Sek.

hergestellte Verbindung VIII 5 Min. 28 Sek.

benutzte Säule: "Wateis LTD pi Bondapak C₁Q Lösungsmittelsystem : Acetonitril : O,17<> Essigsäure (pH 3,3)

(1 : 9 im Volumenverhältnis)

Die Retentionszeiten der beiden Cephalosporinverbindungen bei der Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie waren die folgenden:

Retentionszeit

7-(5-Amino-5-carboxyvaleramidο)-3-£(3-p-hydroxyphenyl-2-methoxypropenoyl]-oxymethyl]-7-methoxy- A *-cephem-4-carbonsäure 5 Min. 18 Sek.

7-(4-Carboxybutyramido),-3-£(3-

p-hydroxyphenyl-2-methoxypropenoyl)-

oxymethylJ-7-methoxy- 4 5-cephem-4-

carbonsäure 5 Min, 55 Sek.

benutzte Säule: WatersLtd. μ Bondapak C 18 Lösungsmittelsystem: Acetonitril : 0,1$ Essigsäure (pH 3,3)

(2:8 Volumenverhältnis).

Die in vivo Effekte der Verbindungen II, IH₁VI und VII sind nachstehend angegeben:

An 5 gesunde, männliche Mäuse des ddY Stammes wurden 10 Zellen von E, coli NIHJ intraperitoneal injiziert. Kach 2 Stunden wurde jede Probe subkutan verabreicht. Die Überlebensprozentangaben nach 5 Tagen werden in der folgenden -Tabelle angegeben. Ähnliche Untersuchungen wurden mit 10 Zellen von Proteus mirabilis 1287 ausgeführt.

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Die JLontrolIgruppe bestand jedesmal aus 10 Mäusen

	E	3	coli	NIHJ	0	Proteus	1	mirabilis 1287	0
____JDosis (mg/Maus)		1	0,5		3		0,5
ProbeT~ " — —.	100			0		20		O
II	100	100	100	0	40	20	0	0
"VI	80	100	0	0	60	20	0	0
IH	80	80	40	0	100	20	20	0
VII	60	0	40	20

Nachstehend werden die Beispiele dieser Erfindung im einzelnen verdeutlicht.

Beispiel 1

Herstellung von 7-(5-Amino-5-car'boxyvaleraiQido)-3«(5-carboxymethylthio>-1,3-_>4-thiadiaaol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy- A '-cephera-4-carbonsäure I:

Ein Kulturmedium, welches 1^6 Stärke, 1ft Glukose, 1,5$ Sojabohnenmehl, 0,5$ Hefeextrakt, 0„1?b Dikaliumhydrogenphosphat, 0_f05^ Magnesiumsulfat und O₁₅J^ Natriumchlorid enthielt, wurde in eine 500 ml S alcagu chi flasche mit je 100 ml eingefüllt und bei 120° C für 20 Minuten sterilisiert· Jede Flasche wurde mit Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm beimpft und 48 Stunden bei 30° 0 kultiviert»

In weiteren Ansätzen, wurde das gleiche Kulturmedium in 2000 ml Sakaguchiflaschen mit je 400ml gefüllt und bei 120° C für 20 Minuten sterilisiert« Es wurde mit dem gleichen! Stamm in einer Konzentration von 2 - 3# beimpft und 24 Stunden bei 30° C kultiviert, um eine Kultur zu erhalten.

Weiterhin wurden 60 Liter, eines Kulturmediums, welches 1i» Stärke, 2# Glutenmehl, 2# Sojabohnenmehl, 0,8^ Glycerin, O,1£ C as amino säure, 0_r01# Perrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt:, jeweils in zwei 100 Liter,- Permentoren zusammen, mit 10 ml Adecanol als Entschäumungemittel eingefüllt« Es wurde 30 Minuten bei 120° C sterilisiert« Jedes Medium wurde mit 800 ml

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der Züchtungskultur "beimpft, und dann wurde 24 Stunden bei 30°° C kultiviert. In wässeriger Natriumhydroxidlösung wurde 5-Mercapto-1,3,4-thiadiazol-2-thioessigeäure aufgelöst, und die gebildete Lösung wurde bei hohem Druck sterilisiert und zu federn Permentor bis zu O_fO59& des Impfmaterials zugegeben und dann wurde 90 Stunden kultiviert.

Naoh vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrtihe auf pH 2,0 eingestellt und dann mit Radiolite (als Filterhilfsmittel) vermischt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filter*· presse filtriert. Die Filtrate wurden miteinander vereinigt, und es wurden 100 Liter Filtratgemisch erhalten. Die Filtrate wurden auf pH 3»0 mit wässeriger Natriumhydroxidlösung ein· gestellt und durch eine 12 Liter Amberlite XAD-2 Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter, wässerigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde gesammelt und eingeengt auf 5»5 Liter. Nach Entfernung der sich gebildeten Verunreinigungen wurde Wasser zu dem Rückstand hinzugefügt, um 10 Liter Lösung zu erhalten. Die so erhaltene; Lösung wurde auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoff säurelö sung eingestellt und dann durch eine 3 Liter. Amberlite IRA-68 (Cl-Typ)-Säule gegeben. Nach Waschen der Säule* mit 6 Liter Wasser wurde mit wässeriger Lösung (pH 7,2;, die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurden etwa 5 Liter Lösung mit antimikrobiellem aktivem Material erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, durch eine ein Liter Amberlite. XAD-2-Säule gegebeiL,und nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde die Säule mit wässerigem 50#igem Aceton gewaschen. Es wurde etwa 400 ml wässerige Lösung mit antimikrobiellem aktivem Material erhalten. Durch Lyopholisierung der. Lösung wurde etwa 18g Rohprodukt der hergestellten Verbindung I erhalten.

Dann wurde 18 g des rohen Pulvers einer Säulenchromatographie unter Verwendung von etwa 800 ml DEAE-Sephadex A-25 (Essigsäure-Iyp) unterworfen. Die Säule war mit einer kleinen Menge

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Hi

0,5 M Ammoniumbromid-Essigsäurepufferlösung gefüllt. Es wurde in die effektiven Komponenten fraktioniert. Die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt, durch eine⁴ Amberiite XAD-2-Säule gegeben,und nach dem Waschen der Säule mit: Wasser wurde die Säule mit einer wässerigen 25%igen Acetonlösung eluiert. Die erhaltenen Eluate wurden zum Trocknen eingedampft.
^500 ml

Dann wurde ein Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol : Wasser-(7:3 Volumenverhältnis) verwendet, um den erhaltenen Rückstand des Produktes einer Säulenchromatographie unter.- Verwendung von mikrokristalliner Cellulose (Avicel), präpariert mi-fe einem Lösungsmittelgemisch. der gleichen, vorstehend angegebenen zusammensetzung, zu unterwerfen. Die. erhaltene antimikrobiell aktive Fraktion wurde tropfenförmig auf eijie Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen, und mit einem Gemisch aus Isopropanol : n>»Butanol : Essigsaures :. Wasser (£1 : 3 : 7 : 9 Volumenverhältnis) entwickelt· Dann wurde Pyridinlösung von 0,25% Ninhydrin aufgesprüht und anschließend erwärmt, um dies Färbung zu entwickeln« Dann wurden die Fraktionen mit einem Rf-Wert von 0,39 gesammelt, die Fraktion im Vakuum bei etwa 45-5Ο^σ 0 zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde einer Säulenchromatographie: mit mikrokristalliner- Cellulose CAvicel) unterworfen. Die Füllung war mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol : n»Butanol : Essigsäure : Wasser (21 : 3 : 7 : 9 Volumenverhältnis) präpariert« Die soo erhaltene antimikrobiell aktive Fraktion wurder dann einer; Dünnschichtchromatographie mit Avicel SF unter Verwendung des vorstehend genannten Lösungsmittelgemisches unterworfen und unter gleicher Nachbehandlung weiterverarbeitet· Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 wurden gesammelt- und im Vakuum zur Trockne eingedampft« Der Produktrückstand wurde mit mikrokristalliner CelluloseSäulenchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser. (6 : 1,5 : 2,5 im Volumenverhältnis)weitergereinigt«Die gereinigte aktive Fraktion wurde zur Trockne eingedampft und dann in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgenommen« Die Lösung wurde

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-Hfc '

in. einer Säule Sephadex G-10 unter verwendung von Wasser entwickelt. Die Fraktionen mit antimikrobieller Aktivität wurden gesammelt, und einer Dünnschichtchromatographie, wie schon vor· stehend erläutert, unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aue n-Butanal : Essigsäure : Wasser (6 : 1,5 : 2,5 im Volumenverhältnis) unterworfen. Die Fraktionen mit Rf-Werten 0,32 wurden, gesammelt, eingeengt und dann einer Lyophilisation, unterworfen Es wurden etwa 80 mg weiße 7-(5-Aminc*-5-earboxyvaleraraido)-3-l5-*carboxymethyl-1 _f 3-, 4-thiadiazol-2-yl) thiomethyl-7-methoxy-A ^-cephem-4-cart)onßäure erhalten.

Beispiel 2

Herstellung von 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(t-methyl-1H-tetrazol-5-yl)thiomethyl-7-methoxy- ^ 5._cepi_iem.4._carT_3On. säure II:

Ein Kulturmedium, welches 1% Stärke, 1% Glukose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,5$ Hefeextrakt, 0,1% Dikaliumhydrogenphasphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde im 500 ml Sakaguchi-JFlaschen mit jeweils 100 ml gefüllt und 20 Minuten, bei 120° C sterilisiert. Dann wurde jedes Medium mit Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stama beimpft. Anschliessend wurde 48 Stunden bei 30° C kultiviert. Dann wurde das schon genannte. Kulturmedium in zwei Liter Sakaguchiflaschen mit jeweils 400 ml eingefüllt. Nach dem Sterilisieren für 20 Minuten bei 120° C wurde jedes Medium mit 2-3$ der vorstehend erhaltenen Kulturbrühe beimpft und anschließend weitere 24 Stunden bei 30^σ C kultiviert, um einen Impfansatz zu erhalten.

60 Liter eines Kulturmediums, welches 7^ Stärke, 2$ Glutenmehl, Zi» Sojabohnenö'l, 0,8% Glycerin, 0,1% Gasaminosäure, 0,0t% Perrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, wurde ia zwei Liter Fennentoren mit jeweils 10 ml Adecanol als Entschalungsmittel gefüllt. Nach, dem Sterilisieren für 30 Minuten bei 120°Ό wurde jedes Medium mit 800 ml des vorstehend hergestellten Impfansatzes versetzt, und anschließend wurde 24 Stunden bei 30° C kultiviert. Dann wurde i-Methyl-5-mercapto-IH-tetrazol in wässeriger Natriumhydroxidlösung aufgelöst. Die Lösung wur>-

709827/107«

de bei hohem Druck sterilisiert und zu der Kulturbrühe hinzugefügt, um deren Konzentration auf 0,05# einzustellen. Das Gemisch wurde 90 Stunden weiter kultiviert.

Nach vollständiger Kultivierung wurde die so gebildete KuI-turbrtihe au* pH 2,0 eingestellt- und dann, mit Eadiolite ala Hilfsmittel zum filtrieren unter Rühren versetzt^ das Geraisch unter Verwendung einer !Filterpresse filtriert. Die erhaltenen Filtrate wurden vereinigt, und es wurden, etwa 100 Liter FiI-tratgemisch erhalten.

Das Filtrat vmrde auf pH 3,0 mit wässeriger Natriumhydroxidlösung eingestellt, durch eine 12 Liter Amberlite XAD-2~Säule gegeben,und nach dem Waschen der Säule mit 30 Liter Wasservmrde die Säule mit 30 Liter einer was serigen 50#igen Acetonlösung eluiert. Das Eluat wurde auf 5,5 Liter eingeengt, und das Konzentrat wurde auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und durch eine Dreiliter Amberlite IRA-68 (Cl-Iyp)-Säule geleitet. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen und mit einer wässerigen. Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, fraktioniert. Es wurden, etwa 5 Liter einer Lösung, die ein antimikrobiell aktives Material enthielt, erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, durch eine Einliter Amberlite XAD-2—Säule gegeben, mit Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung von 50#igem Aceton, eluiert. Es wurde etwa 400 ml wässerige Lösung, die das antimikrobiell aktive Material enuhielt, gewonnen. Durch Lyophilisierung der Lösung wurde etwa 54 g des rohen Pulvers der hergestellten Verbindung II erhalten. Das rohe Pulver wurde einer Säulenchromatographie mit etwa 800 ml DEAJS Sephadex A-25 (Essigsäure-3!yp),gefüllt mit einer kleinen Menge 0,5 M Ammoniumbromid-Eseigsäurepufferlösung, unterworfen, um die: aktiven Komponenten zu fraktionieren« Die antimikrobiell aktiven „ J"rak.tionen wurden gesammelt, durch eine 500 ml Amberlite XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung von 25 #igem Aceton eluiert· Die antimikro-

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-Vg . ' ■

biell aktiven Fraktionen wurden gesammelt und dann, im Vakuum zur Trockne eingedampft.

Der gebildete Rückstand wurde der Säulenchromatographie unter Verwendung von mikrokristalliner Cellulose (Avicel) unterwor?- f en, gefüllt mit einem lösungsmittelgemisch aus Isopropanol r Wasser (T : 3 Volumenverhältnis) unter Verwendung des Lösungsmittelgemisches mit der vorstehend angegebenen Zusammensetzung« Die erhaltene antimikrobiell..aktive Fraktion wurde gesammelt, tropfenförmig auf eine Uünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen, mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1,5 : 2,5 Volumenverhältnis) entwickelt und eine Lösung von 0,25$ lTinhydrin in Pyridin wurde aufgesprüht, und anschließend wurde durch Erwärmen die Anfärbung entwickelt» Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,31 gesammelt. Die Fraktionen wurden unter vermindertem Druck eingeengt und getrocknet· Der gebildete Rückstand wurde einer Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel) .unterworfen« Die Füllung war mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser (21 : 3 : 7 ί 9 Volumenverhältnis), präpariert. Die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel SF mit. dem Lösungsmittelgemisch mi"t der zuvor genannten gleichen Zusammensetzung unterworfen, wobei die. gleiche Prozedur, wie vorstehend angegeben* angewendet wurde. Die Fraktionen mit, dem Rf-Wert 0,39 wurden gesammelt und im Vakuum zur. Trockne eingedampft.

Der so gebildete Rückstand wurde einer mikrokristallinen Cellulose Säulenchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol ; Essigsäure : Wasser (6:1,5 : 2,5 Valumenverhältnis)/ unterworfen, um die effektive Komponente zu reinigen« Die so gereinigte aktive Fraktion wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft, in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Sephedex G 10-Säule unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt« Die

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-MV

Fraktionen mit antimikrobieller Aktivität wurden gesammelt und einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol : Essigsäure :: Wasser (6 : 1_r5 : 2,5 Volumenverhältnis), wie vorstehend angegeben, unterworfen. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-V/ert 0,31 gesammelt-, konzentriert und dann lyophilisiert. Es wurde etwa 60 mg weißes 7-(5-Amina*5-carboxyvaleramido).-3-(1-methyl-1H-"fcetrazol-5-yl) thiomethyl-7-methoxy- -^ -eephem-4-carbonsäure erhalten«

Beispiel "p

Herstellung von 7-t5-Amino>-5-car"boxyvaleramido)-7-methoxy-3« ( 5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl),thiomethyl- A^-cephem-4-carbonsäure III:

Ein Kulturmedium, welches 1% Stärke* 1% Glukose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,5% Hefeextrakt, 0,1$ Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0„3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakaguchiflasches, mit. je 100 ml gefüllt und 20 ten bei 120° C sterilisiert« Jedes Medium mirde dann mit Strep· ,tomyces oganonensis 1-Qt¹XSZ Stsünia_b*impft und 48 Stunden bei 30° C kultiviert» Ein weitere» Kulturmedium, wie vorstehend beschrieben, wurde in Zweiliter Sakaguchiflaschen mit 3e 400 ml gefüllt und 20 Minuten- bei 120° C sterilisiert. Jedes Medium wurde mit der vorstehend kultivierten Brühe mit einer 2-3^igen Konzentration beimpft und dann. 24 Stunden bei 30° C kultiviert, wodurch eine Animpfkultur erhalten wurde.

Separat wurden je 60 Liter des Kulturmediums, das 7# Stärke, Zf> (rlutenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0,8% Glycerin, 0,1% Oasaminsäure, 0,01^ Perrctsulfat und 55· g Natriumhydroxid enthielt, in zwei 100 Liter Jermentorext zusammen mit 10 ml Adecanol als Entschäumungsmittel gefüllt. Es wurde 30 Minuten bei 120° C sterilisiert und mit 800 ml der Animpf ungskultur beimpft« Ea wurde 24 Stunden bei 30° 0 kultiviert. Dann wurde.2-Mercapto-5-methyl-1,3,4-thiadiazol in wässeriger Hatriumhydroxidlösung gelöst und unter hohem Druck sterilisiert und zu der Kultur-

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"brühe hinzugegeben, so daß die Konzentration davon O_tO5% in der Brühe betrug, worauf 90 Stunden weiter kultiviert wurde.

Nach "beendeter- Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit Radiolite als Filterhilfsmittel unteir Rühren vermischt. Das Gemisch wurde unter verwendung einer Filterpresse filtriert und die Filtrate, wurden vereinigt und ergeben etwa 100 Liter Filtratgeaisch.

JDas Filtrat wurde auf pH 3,0 eingestellt durch Zugabe von wässeriger Natriumhydroxidlösung und dann durch eine 12 Liter Amberlite XAD-2-Säule gegeben· Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen. Bs wurde mit 30 Liter wässerigem 50^igem Aceton eluiert. Das Eluat wurde auf 5,5 Liter eingeengt, und das Konzentrat wurde auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und durch eine 3 Idter Amberlitö IKA-68 (Cl-Eyp)Säule gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter ϊ/asser gev/aschen. Es wurde mit einer wässrigen Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Matriumacetat enthielt, eluiert. Es wurde etwa 5 Liter eines antimikrobiell aktiven Materials erhalten. Die Lösung mirder; auf pH 3,0 eingestellt und durch eine Einliter-Amberlite XAD-2-Säule gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde die Säule mit einer wässerigen Lösung von 5o$6igem Aceton eluiert. Es wurde etwa 400 ml wässerige Lösung, die das antimikrobiell aktive Material enthielt, gewonnen. Das Produkt wurde lyophilisiert.

Unter Verwendung eines Lösungsaittelgemisches aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4:1:2 Volumenverhältnis) wurde der gebildete Rückstand einer Säulenchroiaatographie unterworfen unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel), gefüllt mit dem Lösungsmittelgemisch der vorstehend angegebenen gleichen Zusammensetzung. Dann wurden die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen fraktioniert und tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte von Avicel SF aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure :.Wasser 3:7:9,1m Volumenverhältnis) entwickelt* Eine Pyridinlösung

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von 0,25$ Ninhydrin wurde übergesprüht und unter Erwärmen die Anfärbung entwickelt. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 wurden gesammelt und im Vakuum, zur Trockne bei 4-5-50° 0 gebracht. Der erhaltene Rückstand wurde der Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avieel)unterworfen. Die Säule war präpariert mit einem Lösungsmittelgemisch aus Acetonitril : Wasser (7 : 3 Valumenverhältnis). Die erhaltene antimikrobiell aktive Fraktion wurde einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel Stf_f wie bei der vorstehenden Prozedur unterworfen. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 gesammelt und zur Trockne eingedampft. Es wurde 0,78 g roheia Pulver, erhalten.

Das Pulver wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Säule aus Sephadex G- 10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen; wurden fraktioniert und einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 2 Volumenverhältnis J, wie vorstehend angegeben^ unterworfen. Die Fraktionen mit: dem Rf-Wert 0,43 wurden gesammelt, eingeengt, und lyaphilisiert. Es wurden 82 mg weiße 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-Tf-methoxy-3-(.5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl- Λ 3-cephem-4-carbonsäure erhalten»

Beispiel 4

Durch Anwendung des gleichen Verfahrens, wie im Beispiel 1 angegebea, jedoch unter Verwendung einer Lösung von bisC5-C^a*koxvmethylthiö~1,3y4-thiadiazol-2-yl)disulfid, hergestellt durch Auflösen des Disulfide in wasserhaltigem Methanol und Sterilisation, durch Filtration mittels Milliporefilter- in diesem Beispiel anstelle, der. Lösung von 5-Mercapto-1,3,.4-thiadiazol-2-thioessigsäure, hergestellt in Wasser unter Verwendung wässeriger NatriumhydroxidlösuÄg und Sterilisation bei hohem Druck,wurde 23 g Rohpulver der hergestellten Verbindung I erhalten. Durch Reinigen des Produktes, wie im Beispiel 1 angegebeiL, wurde etwa 45 mg 7-C5-A^mi^nO)-5-carboxyvaleramido)-3-15-carboxymethylthio-i,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-

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-Sl'

methoxy- Λ -eephem-4-carbonsäure (hergestellte Verbindung I) erhalten,

Beispiel 5

Durch Anwendung des gleichen Verfahrens,wie im Beispiel 2 angegeben, jedoch unter Verwendung einer Lösung von bis(1-Methyl-1H-tetrazol-5-yl)disulfid, hergestellt durch Auflösen des Disulfide in Wasser enthaltendem Methanol und Sterilisation durch Filtration mittels Milliporefilter in diesem Beispiel anstelle einer Lösung von i-Methyl-5-mercapto-IH-tetrazol, hergestellt durch Auflösen des Tetrazole in Wasser unter Verwendung einer wässerigen Natriumhydroxidlösung und Sterilisation bei hohem Druck, wurde etwa 26 g des rohen Pulvers der hergestellten Verbindung II erhalten· Durch Reinigen des Produktes, wie im Beispiel 2 angegeben, wurde etwa 37 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(ti-methyl-1H-tetrazol-5-yl)'- thiomethyl-7-methoxy-Λ ·-cephem-4-carbonsäure (hergestellte Verbindung II) erhalten.

Beispiel β

Durch Anwenden des gleichen Verfahrens wie im Beispiel 3 angegeben, wurde durch Einsetzen einer Lösung von bis(5-Methyl» 1>3*4-thiadiazol-2-yl>disulfid, hergestellt durch Auflösen des Disulfide in wasserhaltigem Methanol, und Sterilisation durch Filtration, mittels Milliporfilter in diesem Beispiel anstelle der Lösung von 2-Mercapto-5-methyl-1,3,4-thiadiazol, hergestellt in Wasser unter Verwendung einer wässerigen. Natriumhydroxidlösung und Sterilisation, bei hohem Druck, etwa 19 g rohes Pulver der. hergestellten Verbindung III erhalten· Durch Reinigen des Produktes, wie im Beispiel 3 angegeben, wurde etwa 50 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl).thiomethyl-Λ^-cephem-4-carbonsäure (hergestellte Verbindung III) erhalten·

Beispiel Ί
Herstellung von 7-(5-Amino*-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-

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3-U,3_r4-thiadia2ol-2-yl)thiomethyl-^ ^-cephem-4-carbonsäure IV,

Ein Kulturmedium, welch.es 1^ Stärke, Vh Glukose, 1,5?ü> Sojabohnenmehl, 0,5$ Hefeextrakt, 0,I56 Dikaliumhydrogenphosphat, 0_r05% Magnesiumsulfat und 0,3$ Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakaguchiflaschen mit je 100 ml gefüllt, 20 Minuten "bei 120° C sterilisiert und mit dem Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm beimpft. Anschließend wurde 48 Stunden bei 30° C kultiviert. Ein weiteres vorstehendes Kulturmedium wurde in Zweiliter Sakaguchiflaschen mit jeweils 400 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120° C sterilisiert· Dann wurde mit 2-3% der Kulturbrühe, die gemäß dem vorstehenden Verfahren hergestellt wurde, angeimpft· Es wurde 24 Stunden bei 30° C kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten·

Separat wurden 60 liter eines Kulturmediums, das 7$ Stärke, 2% Glutenmehl, 2f> Sojabohnenmehl, 0,8$ Glycerin, 0,1$ Casaminosäure, 0,01$ Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid in zwei 100 Liter Fermentoren, zusammen mit 10 ml Adecanol als Entschäumungsmittel gefüllt und 30 Minuten bei 120° C sterilisiert. Dann wurde mit 800 ml der Animpfkultur beimpft· Es wurde 24 Stunden bei 30° 0 kultiviert· Dann wurde eine Lösung von 2-Mercapto-1,3,4-thiadiazol, hergestellt durch Auflösen des Thiadiazole in Wasser unter Verwendung einer wässerigen Natriumhydroxidlösung und sterilisation unter hohem Druck, zu der Kulturbrühe hinzugefügt, so daß die Konzentration des Ihiadiazols 0,05$ betrug· Der Ansatz wurde dann 90 Stunden weiter kultiviert·

Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf / pH 2,0 eingestellt und unter Rühren mit. Radiolite als Filterhilfsmittel versetzt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert und die Filtrate wurden vereinigt, wodurch etwa 100 Liter des FiItratgemische erhalten wurden·

Das Filtrat wurde auf pH 3,0 eingestellt, durch eine 12 Liter

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Amberlite XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mi-fc 30 Liter Wasser gewaschen· Es wurde mit. 30 liter wässeriger 50%iger Acetonlösung eluiert. Die Eluate wurden "bis auf 5,5 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 3,5 eingestellt und durch, eine J. Liter Amberlite IRA-68 (Cl-Syp)-Säule gegeben. Die Säule wurde mit. 6 Liter Wasser gewaschen. Eluiert wurde mit einer wässerigen Lösung^von pH 7>2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt. Es wurden etwa 5 Liter einer Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthielt, erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, durch eine Einliter-Amberlite XAD-2-Säule gegeben und mit Wasser, gewaschen. Es wurde mit. einer wässerigen 50$igen Acetonlösung gewaschen. Es wurden etwa 400 ml wässerige Lösung, die das antimikrobiell aktive Material enthielt, gewonnen. Die Lösung wurde lyophilisiert.» Unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisehes aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4:1:2 Volumenverhältnis) wurde der gebildete Rückstand einer Säulenchromatographie unterworfen unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avieel) und mit dem Lösungsmittelgemisch der gleichen vorstehenden Zusammensetzung präpariert. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden fraktioniert, tropfenförmig auf eine Dtinnschiehtplatte aus Avicel gebracht, entwickelt unter Verwendung eines Lösungsmittelgeraiseha aus Ioopropanol : n-Buta« nol : Essigsäure : V/asser (21. : 3 : 7 : 9) im VolumenverhältniB. Dann wurde eine Pyridinlösung von 0,25$ Uinhydrin aufgesprüht und durch Erwärmen die Anfärbung entwickelt. Hierauf wurden die Fraktionen mit dem Rf-wert 0,39 gesammelt und im Vakuum bei 45-50° C zur Trockne eingedampft. Der Produktrückstand wurde einer Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel) unterworfen und mit einem Lösungsmittelgemisch, aus Acetonitril : Wasser (7 : 3 Volumenverhältnis) präpariert. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden ebenfalls einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel SF wie in dem vorstehenden Verfahren unterworfen. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 wurden gesammelt, im Vakuum zur Trockne eingedampft. Es wurde 0,92 g rohes Pulver erhalten.

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Das rohe Pulver wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und dann einer Söulenchromatographie unter Verwendung von Amberlite CG-50 (Η-Typ) mit destilliertem Wasser unterworfen, und die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und lyophilisiert. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Säule aus Sephedex G 10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobiell Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die effektiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Gemisches aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4:1:2 Volumenverhältnis), wie vorstehend beschrieben, unterzogen. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,38 gesammelt, konzentriert und . lyophilisiert. Eb wurden weiße 7-{5-Amino-5-carboxyvalerataidoJ-7-methoxy-3-(i,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl»4 ^-cephem-4-carbonsäure erhalten,

Beispiel 8

a) Ein Kulturmedium mit pH 6,0, bestehend aus 20 g Glukose, 4g -Kaliumdihydrogenphosphat, 1 g Magnesiumsulfat, 2 g Ammoniumsulfat, 0,5 g Calciumchlorid, 0,1 g Borsäure, 0,04 g Ammoniummolybdat, 0,04 g Hangansulfat, 0_f04 g Zinksulfat, 0,045 g Kupfersulfat, 0,025 g Ferarosulfat, 20 meg Biotin, 2 mg Thiaminhydrochlorid, 1 g SL-Methionin und 1000 ml Wasser wurde in 500 ml Erlenneyerkolben gefüllt und mit jeweils 100 ml Abfüllung versehen;, dann in üblicher Weise sterilisiert. Jedes Medium wurde mit Trigonopsis variabilis IFO 0755-Stamm beimpft mit anschlies· sender Schüttelkultur für 72 Stunden bei 30° C·

Nach Abschluß der Kultivierung wurden etwa 1000 ml der Kulturbrühe gesammelt. Die Brühe wurde bei 2000 Umdrehungen/Minute für 50 Minuten bei 4° C zentrifugiert. Das Mycel wurde gesammelt und in; 500 ml einer 0,1 M Pyraphosphatpufferlösung mit pH 8,1 suspendiert, um eine Mycelsuspension zu erhalten. Zu der Mycelsuspension wurden. 5 ml Triton X-100 hinzugefügt, und das Gemisch wurde 20-40 Minuten bei 37⁰C geschüttelt, um das Mycel

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zu aktivieren. Dann wurde das geschüttelte Gemisch bei 2000 Umdrehungen/Minute 30 Minuten "bei 4° C zentrifugiert. Das aktivierte Mycel wurde gesammelt, zweimal mit einer Pyrophosphatpufferlösung mit pH 7-8 gewaschen. Dann wurde 100-200 ml einer 0,1 H Pyrophosphatpufferlösung mit pH 8,1 suspendiert, um eine Suspension des aktivierten Mycels zu erhalten«

b) In 10 ml einer 0,1 M Pyrophosphatpufferlösung mit pH 8,1., die 0,026$ Natriumazid enthielt, wurde 54,5 mg 7~(.5-Amino-5-c arboxyvaleramido ) -7-me thoxy-3- (.1 -methyl-1 H-te trazol-5-yl) thiomethyl-^ -cephem-4-carbonsäure aufgelöst. Dann wurde 0,5 ml der aktivierten Mycelsuspension hinzugefügt. Das Gemisch wurde unter Belüftung in einem Wasserbad "bei 33° C durchgerührt. Das Reaktionssystem wurde alle 30 Minuten mit einer Hitachi Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung vonaßondapak G^g,Hersteller: Waters Co·, Lösungsmittelsystem: Acetonitril : Essigsäure (.1 ί 9 Volumenverhältnis) geprüft, um das Ende der Reaktion zu bestimmen. Die Retentionszeit des Ausgangsmaterials 7-(5-Amino-5-car"boxyvaleramido).-7-methoxy-3-(.1-iQethyl-1H-tetrazol-5-yl)thiomethyl-xd'-cephem-4-carbonsäure beträgt 1 Minute 53 Sekunden, während die Rifcentionsseit von 7-C4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(i-methyl-IH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-Δ -cephem-4-carbonsäure, die durch die .D-Amixiosäur-e-Oxidatiom erhalten wurde, 4 Minuten 54 Sekunden.beträgt»

fcach beendeter Reaktion wurde das Mycel durch Zentrifugieren entfernt. Das Überstehende wurde abgetrennt und wiedergewonnen, auf pH 1,5-2,0 mit verdünnter wässeriger Hydrochlorwasserstoff-Bäurelösung eingestellt,, und dann wurde viermal mit ;}e einem gleichen Volumen Äthylacetat, extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden gewonnen und mit Phosphatpufferlösung pH 6,0 reextrahiert. Die Phosphatpufferlösung wurde dann auf pH t,5>-2,0 mit verdünnter Uhlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und weiter viermal mit jeweils dem gleichen Volumen an Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden kombiniert, ⁺apparatur

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mit, wasserfreiem Natriumsulfat entwässert und zur Trockne verdampft. Das Produkt wurde einer Säulenchromatographie mit einer Füllung aus mikrokristalliner Cellulose (Avicel) mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4: 1 : 2 im Volumenverhältnis) unterworfen. Entwickelt und fraktioniert wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch· Sie antimikrobiell β Aktivität, jeder .Fraktion gegen Proteus mirabilis wurde geprüft- und die Fraktionen^ mit der antimikrobiellen Aktivität wurden ausgesucht, tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF gebracht, und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser· (21 : 3 ί ! : 9 im Volumenverhältnis) und einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol ;. Essigsäure : Wasser (.4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) entwickelt· Dann wurden die Fraktionen, die die Ultraviolettabsorption mit Manasululicht 2536 A (Hersteller: Manasulu/Kagaku Kogyo Κ·Κ.·} zeigten und einen Rf-Wert 0,81 und beziehungsweise Rf-Wert 0_r64 besitzen, gesammelt, konzentriert und lyophilisiert· Es wurden 35 mg reine 7-(4-Carboxybutyramido ).-7-methoxy-3-(i-methyl-IH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-Δ -cephem-4-carbonsäure erhalten« Dieses Material besitzt, antimikrobiell Aktivität gegen Proteus mirabilis, Salmonella gallinarum und Escheria coli,

Beispiel 9

In 10 ml einer 0,1 M Pyrophosphatlösung von pH 8,1, die O,O265& Natriumazid enthielt, wurde 50 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido ).-7 ««rethoxy-3- (5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl) thiomethyl-Δ -cephem-4-carbonsäure aufgelöst. Zu der Lösung wurde 0,5 ml der aktivierten j&ycelsuspension von Trigonopsis variabilis IFO 0755,in der gleichen Weise wie im Beispiel 8 beschrieben,zugefügt· Das Gemisch wurde unter Belüftung in einem Wasserbad bei 33° 0 gehalten, um die D-Aminosäure-Oxydation durchzuführen. Die Beendigung der Reaktion wurde mit der gleichen Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie-Apparatur, wie im Beispiel 8 beschrieben, durchgeführt. Die Retentionszeiti des Ausgangsmaterials, 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-

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-1j 3i4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl- A '-cephcm-4-carbonsäure betrug 2 Minuten 55 Sekunden und die Retentionszeit der 7-(4-Garboxybutyramido)-7-methoxy-3-(5-iaethyl-1»3, 4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl- Λ -cephem^-carbonsäure _t die durch die D-/sminosäure-Oxidation erhalten wurde, betrug 11 Minuten 18 Sekunden.

Nach beendeter Reaktion wurde da3 Mycel bei 4° G entfernt, und das Überstehende wurde gewonnen, auf pH 1,5-2,0 mit verdünntem Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt, und es wurde viermal mit jeweils dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt, und mit einer Phosphatpufferlösung von pH 6 extrahiert· Die Phosphatlösung wurde auf pH 1,5 bis 2,0 eingestellt und erneut viermal mit jeweils gleichem Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte' wurden gesammelt, mit entwässertem natriumsulfat getrocknet, im Vakuum zur¹ Trockne eingedampft. Das Produkt wurde unter Verwendung einer Säule, gefüllt mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel) und einem lösungsinittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 s 1 : 2 im Volumenverhältnis) gereinigt. Der Rückstand wurde unter Verwendung des gleichen, vorstehend angegebenen Lösungsiaittelgemisehes entwickelt. Die Fraktionen mit antimikrobieller Aktivität gegen Proteus mirabilis wurden gesammelt, tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen und mit einem iösungsmittelgemisch aus Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : V/asser (21 : 3 : 7 : 9 im Volumenverhältnis und beziehungsweise einem LSsungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) entwickelt. Dann wurden die Fraktionen, die die Ultraviolettabsorption im Manasululicht 2536 A (Hersteller: Manasulu Kagaku Kogyo K.K«) aufwiesen und auch einen Rf-Viert 0,82 beziehungsweise RF-Wert 0,77 besaßen, gesammelt, konzentriert und lyophilisiert. £s wurden 32 mg reines 7-(4-Carboxy» butyramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-Ä -cephem-4-carbonsänre erhalten. Dieses Material besitzt antimikrobiell« Aktivität gegen Proteus mirabilis, Salmo-

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nella Gallinarum und Escheria coil»

Beispiel 10

In 10 ml einer 0,1 M Pyrophosphatpufferlösung von pH 8,1, die O,.O26#liatriuniazid enthielt, wurde in 50 mg 7-(5-Amino-5-earboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-i,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-T-methOKy-A-'-.cephem-^car'bonaäure aufgelöst. Nach Zugabe von 0,5 ml der aktivierten Myeelsuspension, hergestellt- in der gleichen V/eise wie im Beispiel 8a angegeben, wurdOL das Gemisch unter Rühren und Belüftung auf dem Wasserbad bei 33° C gehalten, um die D-Aminosäure-Oxydation durchzuführen. Das Ende der Reaktion wurde alle 30 Minuten, mit der Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie-Apparatur, wie im Beispiel 8 angegeben, geprüft. Die Retentionszeit des Ausgangsmaterials 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-1,3_r4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy~ Λ -eephem-4-carbonsäure betrug 3 Minuten 14 Sekunden, und die Retentionszeit von 7-(4-Carboxybutyramido)-3-(5-carböxymethylthio-i,3 _r4-thiadiazol-2-y1)thiomethyl-7-methoxy- -Δ -cephem-4-carbonsäure, gebildet durch die Wirkung des D-Aminosäure oxidierenden Enzyms ,betrug 13 Minuten. 24 Sekunden·

Nach "beendeter Umsetzung wurde das Mycel durch Zentrifugieren bei 4° C entfernt» Das Überstehende wurde wiedergewonnen und danni auf pH 1,,5-2,0 mit verdünnte» wässeriger- Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt» Es wurde viermal mit je gleichem Volumen, A'thylacet&t. extrahiert· Die A'thylacetatextrakte wurden gewonnen und vereinigt» Der Extrakt wurde mit einer Phosphatpufferlösung bei pH 6,0 reextrahiert· Die: Phosphatpufferlösung wurde auf pH 1i_r5-2,O mit verdünnter Chlorwasserstoff lösung eingestellt und erneut viermal mit einem gleichen Volumen A'thylaeetat extrahiert.

Die A'thylacetatextrakte wurden gesammelt und mit entwässertem Natriumsulfat getrocknet und danach im Vakuum zur Trockne eingedampft»

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jVer Rückstand wurde mit einem Lösungsmittelgemisch entwickelt .a.usL'n-Butanoi : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) unterVerwendung einer Säule mitdeiner Füllung aus mikrokristalliner Cellulose (Ävicel) und des Lösungsmittelgeaisches mit der gleichen vorstehenden Zusammensetzung. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die Fraktionen mit antimikrobieller Aktivität gegen Proteus mirabilis wurden gesaauuelt, tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol : n-Butanol :- Essigsäure : Wasser (21 : 3 t 7 : 9 im Volumenverhältnis),beziehungsweise einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser C4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis )ehtwiekelt. Dann wurden die Fraktionen, die die Ultraviolettabsorption im Manasululicht 2536 %. (Hersteller: Manasulu Kagaku Kogyo K»K·)aufweisen und den Rf-Wert 0,79 bzw. 0,72 besitzen, gesammelt, eingeengt und lyophllisiert. Es werden 30 ing reine. 7-(4-Carboxy"butyramido)-3-(5-carboxymethylthib-1,3,4-thiadiazol-2-ylJIthiomethyl-7-methoxy-4 -cephem«-4-carbonsäure erhalten· Dieses Material besitzt antimikrobielle Aktivität gegen Proteue mirabilis, Salmonella Gailinarum und Escheria coli,

Beispiel 11

a) Ein Kulturmedium, welches - 1$ Stärke, \i> Glukose, 1,5^ Sojabohnenmehl, 0,5^ Hefeextrakt, 0,1?ö Dikäliumhydrogenphosphat, O_r05/^ Magnesiumsulfat und 0,3$ Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakaguchiflaschen in einer Menge von je 100 ml gefüllt Jede Flasche wurde 20 Minuten bei 120° C sterilisiert. Jedes Medium wurde mit Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm beimpft und 48 Stünden bei 30° C kultiviert.

Das Kulturmedium wurde außerdem in Zweiliter Sakaguchiflaschen in einer Menge von jeweils 400 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120° C sterilisiert. Der Ansata wurde mit 2-3^ der Kulturbrühe, die wie vorstehend hergestellt wurde, beimpft und 24 Stunden bei 30°* C kultiviert. Es wurde so eine Animpfkultür erhalten«

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Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7$ Stärke, Zfb Glutenmehl, 2$ Sojabohnenmehl, 0,8$ Glycerin, 0,1$ Gasaminosäure,, 0,01$ Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid in zwei Liter Permentoren zusammen mit je 10 ml Adecanol als Antischaummittel versetzt, sterilisiert während 30 Minuten bei 120° C· Es wurde mit 800 ml der Animpfkultur, die gemäß der vorstehenden Vorschrift hergestellt worden war, "beimpft. Es wurde 24 Stunden "bei 30° C kultiviert. Dann wurde eine Lösung von 5-Mercapto-i-methyl-IH-tetrazol, hergestellt aus einer wässerigen Natriumhydroxidlösung und Sterilisation bei hohem Druck, zu der Kulturbrühe so hinzugegeben, daß die Konzentration des Tetrazole 0,05$ betrug. Die Kultivierung wurde noch 90 Stunden ausgeführt,

Nachdem die Kultivierung vollständig war, wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit, Radiolite ale Filterhilfsmittel unter Rühren vermischt. Das Gemisch wurde mit einer PiIterpresse filtriert und die erhaltenen Filtrate wurden vereinigt. Es wurden 100 Liter Piltratgemisch mit einem Gehalt an 100 meg/ ml an 7-(5-Araina-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)thiomethyl~Ä -cephem-4-carbonsaure erhalten*

b)} Das FiItrat wurde auf pH 3,0 eingestellt und durch eine 12 Liter Amberlite XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter wässerigem 50$igeni Aceton eluiert. Das Eluat wurde bis auf 5,5 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 7,5 unter Verwendung wässeriger Natriumhydroxidlösung eingestellt. Nach Entfernen der gebildeten unlöslichen Anteile wurde 320 ml der aktivierten Mycelsuspension des Trigonopsis variabilis IPO 0755-StammeB,präpariert nach den Angaben; im Beispiel 8a, zu der Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde unter Belüften 4 Stunden durchgerührt, auf pH 1,5-2,0 mit-wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt;· Die Lösung wurde viermal unter Verwendung gleicher Volumenteile Äthylacetat extrahiert. Die Ätbylacetatextrakte wurden gesammelt, 20 Liter des so erhaltenen Äthylacetatex-

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traktes wurae dann mit 2 Liter Phosphatpufferlösung pH 6,0 raextrahiert. Die Phosphatlösung wurde auf pH 1_r5-2,0 mit wässeriger Chlorwasserstoffeäurelösung eingestellt und erneut viermal mit dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatfiltrate wurden vereinigt, 8 Liter des so erhaltenen Extraktes wurden im Vakuum zur Sroekne eingedampft. Es wurden etwa 15 g Rohmaterial erhalten. Dieses Rohmaterial wurde der Säulenchromatographie unter Verwendung von Cellulosepulver in der gleichen Weise, wie im Beispiel 8"b angegeben^ unterworfen. Es wurde 6,1 g weiße 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)thiomethyl-<Ä ^-cephem-4—carbonsäure erhalten,

Beispiel 12

Ein Kulturmedium, welches 50 g Glukose, 10 g Pepton, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat,10 g Malzextrakt, 1 g DL-Methionin und 1000 ml Wasser mit pH 6,0 enthielt, vrurde mit dem Irigonopsis variabilis IEO 0755-Stamm beimpft. Anschließend wurde kultiviert, wie im Beispiel 8a angegeben. 1000 ml der so gebildeten Kulturbrühe wurden gesammelt. Es wurdem 1000 ml der Kulturbrühe bei 2000 Umdrehungen/Minute bei 4° C zentrifugiert. Das gebildete Hycel wurde gesammelt. Das Mycel wurde in 200 ml einer 0,1 M Pyrophosphatpufferlösung pH 8,1 suspendiert. Die Suspension des Myeels wurde in 500 ml Erlenmeyerkolben in 50 ml Portionen eingefüllt. Dann wurde nach der Zugabe- von 5 ml loluol zu der Suspension die Aktivierung eine Stunde bei 37° C durchgeführt. Danach wurde das aktivierte Mycel durch Zentrifugieren während 30 Minuten bei 2000 Umdrehungen/Minuten aktiviert.

Dann wurde unter Zentrifugieren mit 200 ml einer 0,1i M Pyrophosphatpuff erlö sung pH 8,1 gewaschen. Das aktivierte Mycel wurde erneut in 200 ml O₁₆I M Pyrophosphatpuff erlö sung pH 8,1 suspendiert. Die Suspension wurde auf dem Wasserbad bei 50° C durchgerührt, um die Katalaseaktivität zu inaktivieren. Dann wurden 5 ml der aktivierten piycelsuspension zu einer Lösung von 100 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(1-methyl-

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1 fl-tetrazol-5-yl)thiomethyl- ■& -cephem-4-carbonsäuro in 20 ml 0 _r1 M^yro^hösphatpufierlösting pH β,1 gegeben,und nac3i dem ν tmter Belüftung für 5 Stunden, bei 33°^ G wurde das wie inr Beispiel Bb angegeben, behandelt. Es wurde d adiir ca ■ t-( 4-Garbö±ybutyramido)—T-methoxy-3- (1-methyl- iH-*te-tra-zol-25--yi|tnio*aetnyl-4 ⁵-öepHem-4-carbonsäure hergestellt.

se* z;-zi>\. ^Γί· r Beispiel ί3 ^; -■ ' ■■■-' ■''■ - ■ ^r — · "' Das¹ »Myeel^ erhalten von Trigönopsis variabilis durch die gleiche Arbeitsweise ί wie Jim Beispiel 8a beschrieben, wurde bei einer ^temperatur unter· -20^ G für mehr als eine Stunde eingeXrör en·- Bann "wurde bei. Zinmertemperatur zum Auftauen stehen gelassen. Es wurde in 200 ml 0,1 M Pyrophosphatlösung pH 8,1 suspendiert· Danach wurde 5 ml der Suepension zu einer Lösung von 100 mg 7-(5-Amino^5-carboxyvaleramido)-7«methoxy-3-(1-methyl-1H-tetirazol-5-yl)thiomethyl-4^-cephem-4-carbonsäure in-20 inl (X^lm iyrophosphatpufferlömtng pH 8,1, die O_rO26# Natriumazid ^r enthielt, hinzugefügt·" Nach dem Durchrühren des Gemisches unter Belüftung während 5 Stunden bei ^33° 0 wurde data Gemisch in der gleichen Weise, wie im-Beispiel 8b angegeben, behandelt* Es wurde 7-(4-Garbo^butyraiaido^-7-i^1^oxy-5-Ci-m%thyl-1H^ zol«5-*yl)thiomethyl-^d ^-cephem-4-cärbonsäure erhalten,

- ^; -· '--· ---·'--·"·"" ■ :- - · Beispiel 14V ^; -■ -'-■ ■'-'>'■■ ' ■.-■:■.;...-- ._:::-,,v;/ Zu einer Iiösurig Von 50 mg T^CS-Amino-S-carboiicyvaleramido)-5^( 3i-p«liydroxypheiiyl-2-me thoxypropencyl) Gxymethyl-7-methoxy-A ^ceph«m-4-carbonsäure> in 10 ml 0,1 M Pyrophosphatpüfferlösung pH 8,1> diei0_r026^ Hatriumaz~id enthält, wurde 0,5 ml der aktivierten Mycelsuspension, erhalten von Trigönopsis variabilis, gemäß dem im Beispiel 8a angegebenen Verfahren, hinzugefügt. Das Gemisch wurde, wie im Beispiel 8b angegeben, behandelt, ils wurde 7^(4.-Garbozybutyramido)-3-(3-p-hydroxyphenyl-2-methoxypropenoyl) oxymethyl-7-methoxy- 4 -cephem*4- * carbonsäure -

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Die erhaltenen Fraktionen wurden einer DünnschichtChromatographie mit Avicel unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser (21 : 3 : 7 : 9 im Volumenverhältnis) beziehungsweise einem Lösungsmittelgemisch n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4:1:2 im Volumenverhältnis) unterworfen. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,67 und Rf-Wert 0,67 wurden gesammelt. Die Fraktion besaß die Retentionszeit 5 Minuten und 55 Sekunden in einer Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie-Apparatur unter Verwendung von μ Bondapak C₁Q , (Hersteller: Waters Co., Ltd.) und einem Lösungsmittelgemisch aus Acetonitril : 0,1$ wässeriger Essigsäure (2 : 8 im Volumenverhältnis). Das Produkt *b es aß negative Ninhydrinreaktion.

Beispiel 15

a) Herstellung von 7~ (5~ Amino- 5~ carboxy valeramido) -3- (-1-me thy llH-teträzol-5-yl)thiomethyi-7-methoxy-Δ- -cephem-4-carbon- · säure. ^:

Ein Kulturmedium, welches 1% Stärke, 1 % Glucose, 1,5$ Sojabohnenmehl, 0,5$ Hefeextrakt, 0,1$ Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05 % Magnesiumsulfat und 0,3$ Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakaguchiflaschen in jeweils einer Menge von 100 ml eingefüllt. Jedes Medium wurde 20 Minuten bei 120° C sterilisiert. Das sterile Kulturmedium wurde mit dem Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm beimpft. Es wurde 48 Stunden bei 30° C kultiviert. Das vorstehend hergestellte Kulturmedium wurde auch in zwei Liter Sakaguchiflaschen in einer Menge von jeweils 400 ml eingefüllt. Nach dem Sterilisieren des Mediums für 20 Minuten bei 120° C wurde das Kulturmedium mit der im vorstehenden Verfahren erhaltenen Kulturbrühe in einer Menge von 2-3 % beimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert, um eine Animpfkultür zu erhalten.

Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7 % Stärke, 2 % Glutenmehl, 2 % Sojabohnenmehl, 0,8 % Glycerin, 0,1 % Casaminosäure, 0,01 % Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, in zweihundert Liter Fermentoren . zusammen mit je 10 ml Adecanol als Entschäumungsmittel eingefüllt. Jedes Kulturmedium wurde für 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Es wurde mit 800 ml der nach der vorstehenden

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;. Dann wurde

Arbeitsweise hergestellten Animpfkultur beimpft. Dann wurde zu jedem Fermentor eine Lösung von l-Methyl-5-mercapto-lH-tetrazol hergestellt durch Auflösen in wässeriger Natriumhydroxidlösung und Sterilisieren unter hohem Druck, .so daß der Gehalt 0,05$ betrug. Dann wurde die Kulturbrühe 90 Stunden weiter kultiviert. Nach beendeter Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit Radiolite als Filterhilfsmittel unter Rühren vermischt. Das Gemisch wurde durch eine Filterpresse filtriertj und die Filtrate wurden zu etwa 100 Liter Filtratgemisch vereinigt.

Das Gemisch wurde auf pH 3,0 durch die Zugabe von wässeriger Natriumhydroxidlösung eingestellt. Dann wurde durch eine 12 Liter-Amberlite XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen. Es wurde mit 30 Liter wässerigem 50$igem Aceton eluiert. Das Eluat wurde bis auf 5,5 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und durch eine 3 Liter Amberlite IRA-68 (Cl-Typ) Säule gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen und mit wässeriger Lösung (pH 7,2), die 1 η Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurden etwa 5 Liter Lösung, die ein antimicrobiell aktives Material enthielt, gewonnen. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt und sie wurde durch eine 1 Liter Amberlite XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen.. Es wurde mit wässerigem 50%igem Aceton eluiert.

Es wurde etwa *100 ml wässerige Lösung mit antimicrobiell. aktivem Material erhalten, welches lyophilisiert wurde. Es wurden etwa 54 g rohes Pulver erhalten. Das rohe Pulver wurde einer Säulenchromatographie unterworfen. Es wurden hierzu 800 ml DEAE Sephadex A-25 (Essigsäure-Typ) verwendet und mit einer kleinen Menge 0,5 M Ammoniumbromid-Essigsäurepufferlösung;gefüllt. Es wurden die effektiven Fraktionen isoliert. Die so gesammelten antimicrobiell aktiven Fraktionen wurden durch eine 500 ml Amberlite XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit wässerigem 25#igem Aceton eluiert. Das Eluat wurde dann im Vakuum zur Trockene eingedampft. Das getrocknete Produkt wurde einer Säulenchromatographie mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol : Wasser (7 : 3 im Volumenverhältnis) mittels mikrokristalliner Cellulose (Avicel) unterworfen. Die

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Säule war mit dem Lösungsmittelgemisch der vorstehend angegebenen Zusammensetzung gefüllt. Die Fraktionen mit antimikrobieller Aktivität wurden tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SP aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol :.Essigsäure': Wasser (6 : 1,5 : 2,5 im Volumenverhältnis) entwickelt.

Eine Pyridinlösung von.0,25? Ninhydrin wurde aufgesprüht und die Anfärbung wurde durch Erwärmen entwickelt. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,31 wurden gesammelt, im Vakuum bei 45-50° C zur Trockene eingedampft und einer SäulenChromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel) unterworfen. Die Säule enthielt ein Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser (21 : 3 : 7 : 9 im Volumenverhältnis). Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden dann ausgewählt und einer DünnschichtChromatographie mit Avicel SF unterworfen. Hierbei wurde das gleiche vorstehende Verfahren angewendet. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockene eingedampft.

Das getrocknete Produkt wurde in eine Chromatographiesäule mit mikrokristalliner Cellulose gegeben.

Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1,5 : 2,5 im Volumenverhältnis) verwendet, um eine Reinigung der effektiven Komponente zu erzielen. Die gereinigten aktiven Fraktionen wurden durch Konzentration getrocknet in einer kleinen Menge destilliertem Wasser gelöst und in einer Säule mit Sephadex G 10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft, und die effektiven Fraktionen wurden ausgewählt und einer DünnschichtChromatographie unterworfen, wie dies vorstehend erläutert wurde.

Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1,5 : 2,5 im Volumenverhältnis)verwendet. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,31 wurden gesammelt, konzentriert und lyophilisiert. Es wurde etwa 60 mg weiße 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(1-methy1-IH-tetrazol-5-y1)-thiomethyI-7-methoxy-Δ^-cephem-4-carbonsäure erhalten.

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b.) Herstellung von 7~(4-Carboxybutyramido)-7~methoxy-3-(1-raethy1-lH-tetrazOi-5-yl)thibinethyl-ij'-cephem-4-carbonsäure- :

In 10 ml einer 0,1 M Pyrophosphatpufferlösung pH 8,1, die 0,02$ Natriumazid enthielt, wurde 54,5 mg 7-(5~Amino-5-carboxy-väleraraido)-7-methoxy-3-(l-methyl~lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure, hergestellt in Stufe a, aufgelöst. Nach Zugabe von 0,5^ ml der aktivierten Mycelsuspension, die in der gleichen Weise,wie im Beispiel 8a angegeben, hergestellt worden war, wurde das Gemisch unter Belüftung auf dem Wasserbad bei 33°C durchgerührt. Der vollständige Ablauf der Reaktion wurde durch Prüfung des Reaktionsansatzes in 30 Minuten Abständen mit Hilfe einer Hitachi Hochgeschwindigkeitsflüssigkeits-Chromatographieapparatur bestimmt (unter Verwendung von u Bändapak C₁Q, Hersteller: Waters Ltd., Lösungsmittelsystem Acetonitril : 0,1$ Essigsäurelösung i : 9 im Volumenverhältnis). Die Retentionszeit des Ausgangsmateriäls 7~(5~Amino-5~carboxyvaleramido)-7-methoxy-3~(l~methyl-lH-tetrazol-5~yl)thiomethyl-Δ³-cephem-4-carbonsäure betrug 1 Minute 53 Sekunden, und die Retentionszeit der 7~(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(imethyl-lH-tetrazol-5~yl)thiomethyl-A³-cephem-^-carbonsäure, hergestellt durch D-Aminosäure-Oxidation, betrug 4. Minuten 54 Sekunden. Nach beendeter Umsetzung wurde das Mycel durch Abzehtrifügierefl bei 4°C entfernt." Das überstehende wurde gesammelt, auf pH 1,5 - 2,0 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäure eingestellt. Darin wurde die Lösung viermal mit je einem gleichen Volumen an Äthylacetat extrahiert und dann ■ mit einer Phosphätpufferlösung von pH 6,0 reextrahiert. Die Phosphatpufferlösung wurde dann eingestellt auf pH 1,5 - 2,0 mit verdünnter Ghlorwasserstoffsäureiösung und erneut, viermal jeweils mit dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt und durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat, getrocknet, im Vakuum zur Trockene eingedampft. Das Trockenprodukt, wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus.n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1:2 im Volumerxyerhältnis.) unter Verwendung einer Säule mit einer Füllung aus mikrokristalliner Cellulose (Avicel) entwickelt, wobei das Lösungsmittelgemisch mit der gleichen vorstehenden Zusammensetzung verwendet wurde. Die antimikrobielle Aktivität jeder

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Fraktion wurde gegen Proteus mirabilis geprüft. Die Fraktionen, die die antimikrobiell Aktivität enthielten, wurden ausgewählt und tropfenweise auf eine Dünnschichtplatte Avicel SF aufgetragen. Es wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser (21 : 3 : 7 : 9 im Volumenverhältnis) und einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis)entwickelt. Die Fraktionen, die eine Ultraviolett-Absorption im Manasululicht 2536 S (Hersteller: Manasulu Kagaku Kogyo K.K. ) aufwiesen und den Rf-Wert 0,8l bzw. Rf-Wert 0,64 besassen, wurden gesammelt. Diese Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert und lyophilisiert. Es wurden 35 mg reines 7~(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(1-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethy1-Δ **-cephem-4-carbonsäure erhalten. Dieses so hergestellte Material besaß antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis, Salmonella gallinarum und Escherichia coli. Zusätzlich wurde die Methylesterverbindung, die sich von dem in diesem Beispiel erhaltenen Produkt ableitet, durch,das im folgenden Referenzbeispiel A angewendete Verfahren hergestellt. Dieser so erhaltene Methylester stimmte in seiner Struktur vollständig mit der entsprechenden Verbindung überein, die durch das synthetische Verfahren, welches nachstehend im Referenzbeispiel B angegeben wird, hergestellt wurde.

Referenz-Beispiel A:

In 10 ml Chloroform wurde 100 mg 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3~(1-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-Δ ^-cephem-^- carbonsäure suspendiert. Nach Zugabe von H ml einer l^igen Diazomethan-Ätherlösung zu der Suspension wurde das Gemisch 30 Minuten bei Zimmertemperatur durchgerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde mit verdünnter Essigsäure und Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung einer Silikagelsäule unterworfen. Es wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus Benzol : Äthylacetat (1 : 3 im Volumenverhältnis) eluiert. Die die Verbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt.

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Es wurde 80 mg Methyl·-7-methoxy-7-(4-me^vthoxycarbonylbutyramido) -3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-A -cephem-4-carboxylat erhalten.

Infrarot-Absorptionsspektrum : .

• ^KBr -1 J-

^V max ^{cm : 178}° lactam θ' )

1725 (Ester, Carbonyl).
Kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl₅):

δ: 2,03 (2H, -CO-CH₂-CH₂-CH₂-CO-), '
;' ... ;·2,39 (4H,' -CO-CH₂-CH₂-CH^-CO-) I "

3,51 (3Η, 7-position, -OCH,),
,;.. ^:3,64(3H, CH^-O-CO-(CH₂)₃- ), .':·■
' '3,87/ 3H₁'

• ;-r 3,92 3H₁

...··- CH. COOCIK

- 5;04 (IH, 6-;rbsition, -H). .;."'.;

Referenzbeispiel B:

a.) In ein Gemisch aus 30 ml Äthylacetat und 50 ml Methanol

wurden 1,0 g Diphenylmethyl 7ß-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxybenzylidenamino)-7a-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-Ä-^-cephem-4-carboxylat und 1,8 g Gilardreagenz
aufgelöst. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Zimmertemperatur durchgerührt. Nach beendeter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingeengt^und der gebildete Rückstand wurde in 50 ml Äthylacetat aufgelöst und dreimal mit je 20 ml Wasser gewaschen. Die gebildete organische Lösungsmittelschicht wurde abgetrennt mit wasserfreiem Magnesiumsulfat. Dann wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Es wurde etwa 0,6 g rohes Diphenylmethyl- 73-amino-7a-methoxy-3-(1-methyI-IH-tetrazol-5-yl)~thiomethyl-A^-cephem-4-carboxylat erhalten. Das Produkt wurde in 10 ml Chloroform aufgelöst und nach dem Abkühlen
der Lösung auf eine Temperatur von -20° C bis -30⁰ C wurde

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ORIGINAL INSPECTED

0,6 Methyl-4-chlor-formylbutyrat tropfenweise zu der Lösung unter Rühren hinzugefügt. Das Gemisch wurde dann noch eine Stunde bei der gleichen Temperatur durchgerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 20 ml Chloroform gemischt. Das Gemisch wurde mit 10 ml 1 η Chlorwasserstoffsäure gewaschen,und dann wurde mit 10 ml Wasser nachgewaschen. Die gebildete organische Lösungsmittelschicht wurde abgetrennt und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert. Der gebildete Rückstand wurde einer Silxkagelsäulenchromatographie unterworfen. Die Säule wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus Benzol: Äthylacetat (3 : 1 im Volumenverhältnis) und danach mit einem Lösungsmittelgemisch aus Benzol : Äthylacetat (1:3 Volumenverhältnis) eluiert. Es wurde 500 mg reines 7a~Methoxy-7ß-(ⁱi-methoxycarbonylbutyrariido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-A^:5-cephem-4-carboxylat mit den folgenden Eigenschaften erhalten. Kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl.,) :

2,00 (2H₁ -CO-CH₂-CJ^-CH₂-CO-),. 2j 36 (4H₁ ^--COCHOTCO) 3,50 (3H, 7-position, -

3,63 (3H, CJr₃-O-CO-(CH₂)₃-),

. - -, Ν-—Ν

Λ^{78 (3Hf}. Λτ* ^)f '■*■■/

:~ C

4,19, .4,44 <2H, J_n X _{CH s}_ ), 5jO4 (IH, 6-Position, H),

ν Cr Hc . ..-

6,91 (IH, -CH< ^{6 5} ), ; ·;: ^

7.32 (10H, -CHC ~2 ),

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b.) In 4 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Trifluoressigsäure : Anisol (4 : 1 im Volumenverhältnis) wurde 400 mg
Diphenylmethyl 7a-methoxy-7ß-(4-methoxycarbonylbutyramido)-3~ (l~methyl-IH-1 etrazol-5~yl) thiome thy 1-Δ·⁵-cephem-4-c arboxylat bei Temperaturen von -10⁰C bis -20° C aufgelöst. Das
Gemisch wurde 30 Minuten bei der gleichen Temperatur gerührt. Nach beendeter Umsetzung wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Dann wurde Äther zu dem
Rückstand hinzugegeben, wodurch rohe Ja-Methoxy-7ß-(4-methoxy carbonyl-butyr amido )-3-(l-me thy 1- IH- te tr azol-5~y D thiomethyl-A^-cephem-4-carbonsäure ausfiel, die durch Filtration abgetrennt und in 10 ml Chloroform suspendiert wurde.' Die Suspension wurde mit 0,4 ml einer l^igen Diazomethan-Ätherlösung bei 10-20° C vermischt. Das Gemisch wurde
30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Das gebildete Reaktionsgemisch wurde mit verdünnter Essigsäurelösung gewaschen, mit Wasser nachgewaschen. Es wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert. Der gebildete Rückstand wurde einer Sxlikagelsäulenchromatographie unterworfen. Die Säule wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus Benzol : Äthylacetat (1 : 3 im Volumenverhältnis) eluiert. Die die
Verbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt. Es wurden 150 mg Methyl-7a-methoxy-73-(4-methoxycarbonylbutyramido)-3-(1-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-A -cephem-4-earboxylat mit den
folgenden Eigenschaften erhalten:
Infrarot-Absorptionsspektrum:

.v J?^r cnf^;: 1750 (Lactam

I725 (Ester, Carbonyl)."

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Kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl-) :

δ: 2,03 (2H, -CO-CH₂-CK₂-CH₂-CO-),

2.39 (4H₁-CO-CH₉-CH₉-CHp-CO-),

3,51 (3H-, 7-Position -OCH₃),

^! ' 3j64 (3H, CH^OCO(CH₂)₃·

3,87 /3H, Iff', I' VQ9 \ ^M. 1

3,92 ^3η; ι

^} C

CH. . COOCH.

4_;23, 4,53 (2Η, ^ ■ 5;04 (IH,'6-Position H).

Beispiel 16

a). Herstellung von 7"(5"Amino-5-carboxyvaleramido)-7~methoxy-3-(5-methyl-l_i3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-A^-cephem-4 carbonsäure.

Ein Kulturmedium, welches 1% Stärke, 1% Glukose, 1,5$ Sojabohne nmehl, 0,5$ Hefeextrakt, 0,1$ Dikaliumhydrοgenphosphat, 0,05$ Magnesiumsulfat und 0,3$ Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakaguchiflaschen in einer Menge von jeweils 100 ml eingefüllt. Jedes Medium wurde 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Das Kulturmedium wurde dann mit dem Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm beimpft· Anschließend wurde 48 Stunden bei 30° C kultiviert.

Das vorstehende Kulturmedium wurde in 2 Liter Sakaguchiflaschen in einer Menge von jeweils 400 ml eingefüllt und 20 Minuten bei 120° C sterilisiert.

Dann wurde mit 2-3$ Kulturbrühe, gemäß dem vorstehenden Verfahren erhalten, angeimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30 C kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten. Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7% Stärke, 2% Glutenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0,8$ Glycerin, 0,1$ Casaminosäure, 0,01 $ Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, in 200 Liter Permentoren zusammen mit

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10 ml Adecanol gefüllt und 30 Minuten bei 120° C sterilisiert. Dann wurde mit 800 ml Animpfkultur, hergestellt nach dem vorstehenden Verfahren, geimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30° C kultiviert. In jeden Permentor wurde eine Lösung von 2-Mercapto-5-methyl-l,3,ⁱl-thiadiazol_J hergestellt mit wässeriger Natriumhydroxidlösung und Sterilisieren bei hohem Druck, hinzugegeben, so daß ihr Gehalt 0,05 % der Kulturbrühe betrug. Die Kultivierung wurde 90 Stunden fortgesetzt.

Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrühe, aufpH 2,0 eingestellt. Radiolite wurde als Filterhilfsmittel unter Rühren zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt und ergaben etwa 100 Liter Filtratgemisch.

Das Filtrat wurde auf pH 3,0 durch die Zugabe von wässeriger Natriumhydroxidlösung eingestellt. Die Lösung wurde durch eine 12 Liter Amberlite XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter wässerigem 50#igem Aceton eluiert. Das Eluat wird konzentriert bis zu 5»5 Liter, auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und in eine 3 Liter Amberlite IRA-68 (Cl-Typ) Säule gefüllt. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung (pH 7,2), die IM Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurden etwa 5 Liter einer Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthielt, gewonnen. Die so erhaltene Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt und in eine 1 Liter Amberlite XAD-2-Säule eingefüllt. Die Säule wurde mit 50#igem wässerigen Aceton eluiert. Es wurden etwa ¹IOO ml wässerige Lösung, die das antimikrobielle Material enthielt, gewonnen. Die Lösung wurde lyophilisiert. Das Produkt wurde einer Säulenchromatographie mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) unter Verwendung von mikrokristalliner Cellulose (Avicel) und einer Füllung mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch, wie vorstehend angegeben, unterworfen. Die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen, und es wurde mit einem Lösungsmittelgemisch Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser (21 : 3 : : 9 im Volumenverhältnis) entwickelt. Mit einer Pyridinlösung

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von 0,25 % Ninhydrin wurde besprüht, um durch Erwärmen anzufärben. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 gesammelt und zur Trockene unter vermindertem Druck bei 45-50° C eingedampft. Das erhaltene Produkt wurde der Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel), gefüllt mit einem Lösungsmittelgemisch aus Acetonitril : Wasser (7 : 3 im Volumenverhältnis) unterworfen. Die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden einer DünnschichtChromatographie auf Avicel SF, wie bei der vorstehenden Arbeitsweise, unterworfen. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 wurden gesammelt und zur Trockene unter vermindertem Druck eingedampft. Es wurden 0_} 78 g eines rohen Pulvers erhalten.

Das Produkt wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Säule aus Sephadex G 10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die effektiven Fraktionen wurden einer DünnschichtChromatographie, wie vorstehend angegeben, unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) unterworfen. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 gesammelt, eingeengt und lyophilisiert. Es wurde 8i2 mg weiße 7-(5~Amino-5~ carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(5~methyI-1,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-A -cephem-4-carbonsäure erhalten.

b.) Herstellung von 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-A^j5-cephem-4-carbonsäure : In 10 ml einer 0,1 M Pyrophosphatpufferlosung pH 8,1, die 0,026$ Natriumazid enthielt, wurde 50 mg 7~(5~Amino-5-carboxyvaleramido) -7-methoxy-3-(5-methyl-l,3_J4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-A³-cephem-4~carbonsäure aufgelöst. Nach Zugabe von 0,5 ml der aktivierten Mycelsuspension, hergestellt unter Verwendung des Trigonopsis variabilis IFO O755~Stammes_; wie im Beispiel 8a angegeben, wurde das Gemisch unter Belüftung auf einem Wasserbad bei 33° C durchgerührt, um die D-Aminosäure-Oxidation durchzuführen. Der vollständige Ablauf der Reaktion wurde durch Hochgeschindigkeitsflüssigkeits-ChromatograpTiie, wie im Beispiel 8b beschrieben, festgestellt. Die Retentionszeit des Ausgangsmaterials 7~(5~Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3₉4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-A-⁵-cephem-4-carbonsäure betrug 2 Minuten 55 Sekun-

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den und jene von 7-(4-Carboxybutyramido)-7-inethoxy-3- (5-methyl-1,3, 4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-A^-cephein-ⁱl-carbonsäure, hergestellt durch die D-Aminosäure-Oxidation,betrug 11 Minuten 18 Sekunden.

Nach beendeter Reaktion wurde das Myeel bei 4° C entfernt, und das überstehende wurde abgetrennt, auf pH 1,5-2,0 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und viermal mit jeweils dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert.Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt, und mit einer Phosphatpufferlösung pH 6,0 reextrahiert. Die Phosphatlösung wurde dann auf pH l,5~2,O eingestellt und dann viermal jeweils mit dem gleichen Volumen. Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt mit wasserfreiem Natriumsulfat extrahiert und zur Trockene eingedampft. Das Produkt wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4:1:2 im Volumenverhältnis) unter Verwendung einer Säule mit einer Füllung aus mikrokristalliner Cellulose (Avicel) unter Verwendung des Losungsmittelgemisches mit der gleichen vorstehenden Zusammensetzung entwickelt. Dann wurden die Fraktionen, die antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis besitzen, ausgewählt, tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen, und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser (21 : 3 : 7 : 9 im Volumenverhältnis) und einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4:1: 2 im Volumenverhältnis) entwickelt, um die Fraktionen auszuwählen, die die Ultraviolett-Absorption im Manasululicht 2536 2 (Hersteller Manasulu Kagaku Kogyo K. K.) aufweisen und den Rf-Wert 0,82 bzw. Rf-Wert 0,77 besitzen. Die so ausgewählten Fraktionen wurden konzentriert und dann lyophilisiert. Es wurden 32 mg reine 7~(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3_i4-thiadiazol-2-yl)-thiomethy1-δ -cephem-4-carbonsäure erhalten. Dieses Material besitzt antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis, Salmonella gallinarum und Escherichia coli.

Beispiel 17

a.) Herstellung von 7-(5~Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5~car- * boxymethylthio-l,3j4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-7-methoxy-Δ-⁵-cephem-4-carbonsäure :
Ein Kulturmedium, welches 1 % Stärke, 1 % Glukose, 1,5 %

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Sojabohnenmehl, 0,5$ Hefeextrakt, 0,1$ Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05$ Magnesiumsulfat und 0,3 % Natriumchlorid enthielt, wurde in eine 500 ml Sakaguchiflasche mit jeweils 100 ml gefüllt und 20 Mimten bei 120° C sterilisiert. Jedes Kulturmedium wurde dann mit dem Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm beimpft. Es wurde anschließend 48 Stunden bei 30° C kultiviert. Ein weiteres vorstehendes Kulturmedium wurde in 2000 ml Sakaguchiflaschen jeweils mit 400 ml gefüllt und jedes Kulturmedium wurde 20 Minuten bei 120° C sterilisiert. Dann wurde mit 2-3$ der Kulturbrühe, hergestellt nach dem vorstehenden Verfahren, beimpft und anschließend 24 Stunden bei 30° C kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten.

Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7 % Stärke, 2% Glutenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0,8$ Glycerin, 0,1 % Casaminosäure, 0,01 % Perrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, in 200 Liter Fermentoren zusammen mit 10 ml Adecanol als Entschaumungsmittel gefüllt. Jedes Medium wurde 30 Minuten bei 120° C sterilisiert und mit 800 ml der Animpfkultur hergestellt nach dem vorstehenden Verfahren, geimpft. Anschließend wurde 24 Stunden bei 30° C kultiviert. Dann wurde in jeden Fermentator eine Lösung von bis(5~Carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-disulfid, hergestellt durch Auflösen des Disulfids in wasserhaltigem Methanol, und Sterilisieren durch Filtration unter Verwendung eines Millipore-FiIters, in einer solchen Menge zugefügt, daß der Gehalt 0,05$ in der Kulturbrühe betrug. Die Kultivierung wurde 90 Stunden durchgeführt. Nach beendeter Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit Radiolite als Filteihilfsmittel unter Rühren versetzt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt. Es wurden etwa 100 Liter eines Filtratgemisches erhalten. Das Filtrat wurde auf pH 3,0 durch die Zugabe einer wässerigen Natrxumhydroxidlösung eingestellt. Es wurde die Lösung in eine 12 Liter Amberlite XAD-2-Säule eingefüllt. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter wässerigem 50#igem Aceton eluiert. Das Eluat wurde bis auf 5_S5 Liter eingeengt. Nach Entfernung der gebildeten unlöslichen Anteile wurde Wasser zu dem Konzentrat hinzugefügt, um 10 Liter Lösung

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zu erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3,5 niit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt, durch eine 3 Liter Amberlite IRA-68 (Cl-Typ)-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurde etwa 5 Liter Lösung erhalten, die antimikrobiell aktives Material enthielt. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, in eine 1 Liter Amberlite XAD-2-Säule gefüllt. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit wässerigem 50$igen Aceton eluiert. Es wurde etwa 400 ml wässerige Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthielt, erhalten. Durch Lyophilisieren der wässerigen Lösung wurde etwa 23 g rohes Pulver erhalten. Dann wurde 23 g des rohen Pulvers einer Säulenchromatographie unter Verwendung von 800 ml DEAE-Sephadex A-25 (Essigsäure-Typ), gefüllt mit einer kleinen Menge 0,5 M Ammoniumbromid-Essigsäurepufferlösung, unterworfen, um die effektiven Komponenten abzutrennen. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt und in eine 500 ml Amberlite XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen. Es wurde mit wässerigem 25$igen Aceton eluiert. Das Eluat wurde zur Trockene im Vakuum eingedampft. Das Produkt wurde einer Säulenchromatographie mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol : Wasser (7 : 3 im Volumenverhältnis) unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel) unterworfen, wobei das·Lösungsmittelgemisch verwendet wurde, das die gleiche Zusammensetzung wie bei der vorstehenden Fraktionierung der antimikrobiell aktiven Fraktionen hatte. Die so erhaltenen Fraktionen wurden tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser (21 : 3 '· 7 : 9 im Volumenverhältnis) entwickelt. Dann wurde eine Pyridinlösung von 0,25$ Ninhydrin aufgesprüht und die Anfärbung durch Erhitzen entwickelt. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 gesammelt, zur Trockene unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde einer Säulenchromatographie,mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel) gefüllt, unterworfen. Es wurde ein Lösungsmittejgemisch aus Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser(21 : 3 : 7 : 9 im Volumenverhältnis) verwendet. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt und einer DünnschichtChromatographie auf einer Avicel SF Platte unterworfen. Das LösungsmitteHgemisch

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hatte die gleiche Zusammensetzung wie das vorstehende Gemisch. Es wurde hierbei, wie vorstehend schon beschrieben, verfahren. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockene eingedampft.

Das Konzentrat wurde mittels Säulenchromatographie unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose und eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1,5 : 2,5 im Volumenverhältnis) gereinigt. Die gereinigten aktiven Fraktionen wurden im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgenommen und mit einer Säule aus Sephadex G-IO unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die effektiven Fraktionen wurden einer DünnschichtChromatographie, wie vorstehend angegeben, unterworfen. Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1,5 : 2,5 im Volumenverhältnis) verwendet. Die Fraktionen mit einem Rf-Wert 0,32 wurden gesammelt, konzentriert und lyophilisiert. Es wurden etwa 45 mg weiße 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7~methoxy-A ^-cephem- 4-carbonsäure erhalten.

b.) Herstellung von 7-(4-Carboxybutyramido)-3-(5-carboxymethylthio-1,3,4-thiadiazol-2-yl) thiome thy 1- 7-methoxy-A^- cephem- 4-carbonsäure;

In 5 ml einer 0,1 M PyrophosphatpuffeSrösung von pH 8,1, die 0,026$ Natriumazid enthielt, wurde 25 mg 7~(5~Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-1,3,4-thiadiazol-2-y 1)«thiomethyl-7-methoxy-A^-cephem-4-carbonsäure, die im vorstehenden Verfahren a) erhalten worden ist, aufgelöst. Zu der Lösung wurde O',5 ml der aktivierten Mycelsuspension,hergestellt gemäß den Angaben im Beispiel 8 a, hinzugefügt. Das Gemisch wurde unter Belüftung und Rühren bei 33° C auf dem Wasserbad gehalten, um die D-Aminosäure-Oxidation auszuführen. Zur Feststellung des Reaktionsendes wurde alle 30 Minuten unter Verwendung der Hitachi Hochgeschwindigkeitschromatographieapparatur in der gleichen Weise, wie im Beispiel 8 a beschrieben, die Prüfung ausgeführt. Die Retentionszeit des Ausgangsmaterials 7"(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(!>carboxymethylthio-l,3,4-thiadia~

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zol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-A^-cephem-4-carbonsäure "betrug 3 Minuten 14 Sekunden und jene von 7-(4-Carboxybutyramido)-3-(5-carboxymethy1^x0-1,3,^-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy~ A^-cephem-4-carbonsäure₉ hergestellt durch die D-Aminosäure-Oxidation betrug 13 Minuten 24 Sekunden.

Nach beendeter Reaktion wurde das Mycel durch Zentrifugieren bei 4° C entfernt.Das überstehende wurde abgetrennt auf pH 1,5" 2,0 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt. Dann wurde viermal jeweils mit dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt und mit einer Phosphatpufferlösung bei pH 6,0 reextrahiert. Die Phosphatlösung wurde auf pH 1,5 - 2,0 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und viermal jeweils mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden gesammelt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Das Konzentrat wurde mittels Säulenchromatographie gereinigt. Es wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) unter Verwendung einer Säule mit einer Füllung aus mikrokristalliner Cellulose (Avicel) entwickelt.

Die antimikrobielieAktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die Fraktionen, die die antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis besitzen, wurden tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser (21 : 3 : 7 : 9 im Volumenverhältnis) bzw. einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) entwickelt. Es wurden die Fraktionen gesammelt₄ die eine Ultraviolettabsorption im Manasululicht 2536 S. (Hersteller: Manasulu Kagaku Kogyo K.K.) besitzen und den Rf-Wert 0,79 oder Rf-Wert 0,72 aufweisen. Die Fraktionen wurden konzentriert und lyophilisiert. Es wurde 16 mg reine 7-(4-Carboxybutyramido)-3-(5"carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-A-⁵-cephem-4-carbonsäure erhalten. Dieses Material besitz antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis, Salmonella gallinarum und Escherichia coli.

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Beispiel l8

In 10 ml 0,1 M Pyrophosphatpufferlösung von pH 8,1, die 0,026 % Natriumazid enthielt, wurde 50 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido) -7-methoxy- 3~ (l,3*^-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-A-⁵-cephem-4- carbonsäure aufgelöst. Dann wurde 0,5 ml der aktivierten Mycelsuspension, hergestellt unter Verwendung von Trigonopsis variabilis, wie im Beispiel 8 a angegeben, hinzugefügt. Das Gemisch wurde unter Belüftung auf einem Wasserbad bei 33° C durchgerührt. Es wurde dabei die D-Aminosäure-Oxidation ausgeführt. Die Vollständigkeit der Reaktion wurde durch die HochgeschwindigkeitsflüssigkeitsChromatographie-Apparatur, wie im Beispiel 8 b beschrieben, ausgeführt. Die Retentionszeit des Ausgangsmaterials , 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-A^-cephem-4-carbonsäure betrug 1 Minute und 56 Sekunden und jene von 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(l,3j4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure, die durch die D-Aminosäure-Oxidation gebildet wurde, betrug 5 Minuten 28 Sekunden.

Nach beendeter Reaktion wurde das Myeel bei 4° C entfernt. Das Überstehende wurde abgetrennt und auf pH 1,5-2,0 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und viermal mit jeweils einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt und mit einer Phosphatpufferlösung von pH 6,0 reextrahiert.. Die Phosphat lösung wurde erneut viermal jeweils mit dem gleichen Volumen an Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden gesammelt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Das erhaltene Produkt wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) unter Verwendung einer Säule, gefüllt mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel) und des Lösungsmittelgemisches der gleichen vorstehenden Zusammensetzung, entwickelt. Es wurden die Fraktionen, die antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis besitzen, ausgewählt. Die so ausgewählten Fraktionen wurden auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF tropfenförmig aufgetragen. Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser (21 : 3 : 7 : 2 im Volumenverhältnis) bzw. ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser.

(4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) zum Entwickeln verwendet. Die

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Fraktionen mit der Ultraviolett-Absorption im Manasululicht ο
A (Hersteller: Manasulu Kagaku Kogyo K.K.) und mit dem Rf-Wert 0,81 be zw. Rf-Wert 0,65 wurd.en gesammelt. Die Fraktionen wurden eingeengt und lyophilisiert. Es wurden 40 mg reines 7-(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3-(l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-A^-cephem-4-carbonsäure erhalten. Dieses Material besaß antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis, Salmonella gallinarum und Escherichia coli.

Beispiel 19

a.) Herstellung von 7-(5~Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(1,3,^-thiadiazol-2-yI)-thiomethyl-A^-cephem-4-carbonsäure :

Ein Kulturmedium, welches 1 % Stärke, 1 % Glukose, 1,5 % Sojabohnenmehl, 0,5 % Hefeextrakt, 0,1 % Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05 % Magnesiumsulfat und 0,3 % Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakaguchiflaschen mit jeweils 100 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120° C sterilisiert. Dann wurde jedes Kulturmedium mit dem Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm beimpft. Anschließend wurde 48 Stunden bei 30° C kultiviert. Ein weiteres vorstehendes Kulturmedium wurde in 2 Liter Sakaguchiflaschen mit jeweils 400 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120° C sterilisiert. Jedes Kulturmedium wurde mit der Kulturbrühe beimpft, die vorstehend hergestellt worden ist. Es wurde 24 Stunden bei 30° C kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten. Separat wurden 60 Liter Kulturmedium, die 7 % Stärke, 2 % Glutenmehl, 2 % Sojabohnenmehl, 0,8 % Glycerin, 0,1 % Casaminosäure, 0,01 % Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, in 200 Liter Fermentoren zusammen mit 10 ml Adecanol als Entschäumungsmittel gefüllt und 30 Minuten bei 120° C sterilisiert. Jedes Kulturmedium wurde dann mit 800 ml der Animpfkultur beimpft und anschließend 24 Stunden bei 30° C kultiviert. Dann wurde eine Lösung von 2-Mercapto-1,3,4-thiadiazol, hergestellt mit wässeriger Natriumhydroxidlösung und Sterilisieren bei hohem Druck, zu jedem Fermentor in einer solchen Menge gegeben, daß der Gehalt 0,05$ in der Kulturbrühe betrug.
Dann wurde die Kultivierung 90 Stunden fortgesetzt.

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Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit Radiolite als Filterhilfsmittel unter Rühren vermischt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt, und es wurden etxfa 100 Liter Filtratgemisch erhalten. Das Filtrat wurde durch Zugabe einer wässerigen Natriumhydroxidlösung auf pH 3,0 eingestellt und in eine 12-Liter Amberlite XAD-2 Säule gefüllt. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter wässerigem 50$igen Aceton eluiert. Das Eluat wurde auf 5»5 Liter eingeengt, auf pH 3,5 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäure eingestellt und dann in eine 3-Liter Amberlite IRA-68 (Cl-Typ) Säule gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen. Eluiert wurde mit einer wässerigen Lösung (pH 7»2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt. Es wurden 5 Liter Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthält, gewonnen. Die Lösung wurde auf pH 3»0 eingestellt, in eine 1-Liter Amberlite XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit 50$igem Aceton eluiert. Es wurden etwa 400 ml wässerige Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthielt, welches lyophilisiert wurde, erhalten.

Das erhaltene Produkt wurde einer Säulenchromatographie mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4:1:2 im Volumenverhältnis) unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel) als Füllung unterworfen, wobei das Lösungsmittelgemisch mit der gleichen vorstehend angegebenen Zusammensetzung Anwendung fand, um die antimikrobiell aktiven Fraktionen auszuwählen. Die Fraktionen wurden tropfenweise auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen, und es wurde mit einem Lösungsmittelgemiseh aus Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser (21 : 3 : 7 : 9) entwickelt. Eine Pyridinlösung von 0,25 % Ninhydrin wurde aufgesprüht, und durch Erwärmen wurde angefärbt. Dann wurden die' Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 gesammelt, unter vermindertem Druck zur Trockene bei 45 - 50°C eingedampft. Dann wurden die

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Fraktionen einer DünnschichtChromatographie mit Avicel SF in der vorstehend beschriebenen Weise unterworfen, um die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 zu sammeln. Die Faktionen wurden zur Trockene eingedampft, wobei 0,92 rohes Pulver erhalten wurde* Das Pulver wurde in einer kleinen Menge von destilliertem Wasser aufgelöst und einer Säulenchromatographie mit destilliertem Wasser unter Verwendung von Ämberlite CG-50 (Η-Typ) unterworfen, um die antimikrobiell aktiven Fraktionen auszuwählen. Die Fraktionen wurden dann konzentriert und lyophilisiert. Das Produkt wurde in einer kleinen Menge aus destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Säule aus Sephadex G-IO unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die effektiven Fraktionen wurden einer DünnschichtChromatographie in der schon vorstehend erläuterten Weise unterworfen. Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4:1:2 im Volumenverhältnis) verwendet, um die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,38 zu sammeln. Die Fraktionen wurden eingeengt und lyophilisiert, und dabei wurden 75 mg weiße 7~(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7~methoxy-3~(lj3>4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-Δ³-cephem-U-carbonsäure erhalten.

b.) In 10 ml einer 0,1 M Pyrophosphat-Pufferlösung mit pH 8,1, die 0,026 % Natriumazid enthielt, wurden 50 mg 7-(5~Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure aufgelöst. Dann wurde zu der Lösung 0,5 ml aktivierte Mycelsuspension, hergestellt unter Verwendung von Trigonopsis variabilis, wie in Beispiel 8a angegeben, hinzugefügt. Das Gemisch-wurde unter Belüftung in einem Wasserbad bei 33°C gerührt, um die D-Aminosäureoxidation auszuführen. Der vollständige Ablauf der Umsetzung wurde mit der gleichen Hochgeschwindigkeitsflüssigkeits-Chromatographie-Apparatur, wie im Beispiel 8b beschrieben, überwacht. Die Retentionszeit des Ausgangsmaterials 7~(5~ Amino-5-carboxyvaleramido)7~methoxy-3-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure betrug 1 Minute 56 Sekunden und die von 7~(^~Carboxybutyramido)-7~methoxy-3~

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8H

(1,3> 4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-Δ³-cephem-^-carbonsäure, gebildet durch die D-Aminosäure-Oxidation, betrug 5 Minuten 28 Sekunden.

Nach beendeter Reaktion wurde das Myeel bei 4⁰C entfernt. Das überstehende wurde abgetrennt und auf pH 1,5 - 2,0 mit verdünnter wässeriger Chlorwasserstoffsäure eingestellt und viermal mit jeweils dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetat-Fraktionen wurden vereinigt und mit Phosphat-Pufferlösung bei pH 6,0 reextrahiert. Die Phosphatlösung wurde dann auf pH 1,5 - 2,0 eingestellt und erneut viermal mit jeweils dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Es wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft. Das Produkt wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 2 im Volumenverhältnis) unter Verwendung einer Säule mit einer Füllung aus mikrokristalliner Cellulose (Avicel), wobei das Lösungsmittelgemisch die gleiche Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben hatte, entwickelt, um die Fraktionen, die eine antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis besitzen, auszuwählen. Die Fraktionen wurden tropfenweise auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel SF aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol : n-Butanol : Essigsäure : Wasser (21 : 3 : 7 : 9 im Volumenverhältnis) bzw. einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (4:1:2 im Volumenverhältnis) entwickelt; dabei wurden die Fraktionen mit Ultraviolettabsorption im Manasululicht 2536 S (Hersteller: Manasulu Kagaku Kogyo K.K.) gesammelt. Die Faktionen wurden eingeengt und lyophilisiert. Es wurden 40 mg reine 7~(4-Carboxybutyramido)-7-methoxy-3~(1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-Δ³-cephem-4-carbonsäure erhalten. Dieses Material besitzt eine antimikrobielle Aktivität gegen Proteus mirabilis, Salmonella gallinarum und Escherichia coli.

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Beispiel 20

Trocken gefüllte Kapseln mit 120 mg J-(5"Amino-5~carboxyvaleramido )-7-methoxy-3-(1-methy1-IH-tetrazol-5-yl)thiomethy1-Δ³-

cephem-4-carb onsäure

pro Kapsel

7~(5-Amino-5-carboxyvaleramido)~7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure 120 mg

Laktose 20 mg

Magnesiumstearat 5 mg

Kapsel Nr. 3 1^5 mg

7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure wurde zu eiern Pulver Nr. 60 verrieben, und dazu wurden Laktose und Magnesiumstearat durch ein Siebtuch Nr. 60 gegeben. Die vereinigten Ingredientien wurden 10 Minuten zusammen gemischt und dann in trockene Gelatinekapseln Nr. 3 abgefüllt.

Beispiel 21

Tabletten mit 150 mg 7-(5~Amino-5~carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure

7~(5~Amino-5~carboxyvaleramido)-7~methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure

Dicalciumphosphat J.P. Magnesiumstearat Laktose J.P.

Die aktive Komponente wird mit dem Dicalciumphosphat und der Laktose gemischt. Das Gemisch wird mit 15-#iger Kornstärkepaste (4 mg) granuliert und grob gesiebt, bei 40°C getrocknet und erneut durch ein Sieb Nr. 16 gesiebt. Das Magnesiumstearat wird hinzugefügt, und das Gemisch wird in Tabletten mit annähernd 0,8 cm Durchmesser gepreßt.

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pro Tablette	mg
150	mg
•115	mg
3	mg
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Beispiel 22

Parenterale Lösung mit 500 mg 7~(5~Amino-5~carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-A³-cephem-4- carbonsäure

pro Ampulle

7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-A³-500 mg cephem-4-carbonsäure

Die aktive "Verbindung (50,0 g) wird in 150 ml steriles Wasser für Tnjektionszwecke gegeben. Die erhaltene Lösung wird auf pH 8,0 durch Zugabe von verdünnter Natriumhydroxidlösung eingestellt. Das Volumen der Lösung wird auf 200 ml aufgefüllt. Die Lösung wird in 100 Ampullen abgefüllt, lyophilisiert und verschmolzen.

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Le e rs e i te

Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. 7-Methoxy-3-heterocyclische Thiomethylcephalosporinderivate mit der Formel ' ' . "

   OCH.

   R¹- (CH₂) 3CONH |^"'^

   COOM

   worin R¹ den Rest HOOCv oder HOOC- darstellt,

   H₂N ^

   R eine stickstoffenthaltende heterocyclische Gruppe bedeutet und M ein Wasserstoffatom oder einen kationischen salzbildenden Rest darstellt.

   2. 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramiäo)-3-(5-carboxymethylthio-l,3j4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-Δ ■>-cephem-4-carbonsäure nach Anspruch 1.

   3. 7-(5~Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl) thiomethyl-7-methoxy- Δ -^-cephem-4-carbonsäure nach Anspruch 1.

   4. 7-(5-Amino-5~carboxyvaleramido)-3-(5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-Δ^-cephem-4-carbonsäure nach Anspruch 1.

   5· 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-Δ ^-cephem-4-carbonsäure nach Anspruch 1.

   6. 7-(4-Carboxybutyramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-Δ -*-cephem-4-carbonsäure nach Anspruch 1.

   7. 7-(4-Carboxybutyramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-7-methoxy-Δ -cephem-4-carbonsäure nach Anspruch 1.

   8. 7-(4-Carboxybutyramido)-3-(5-methyl-l,3,4-thidiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-Δ ^-cephem-4-carbonsäure nach Anspruch 1.

   9. 7-(4-Carboxyburyramido)-7-methoxy-3-(l,3,4-thiadiazol-2-yl) thiomethyl- Δ -cephem-4-carbonsäure nach Anspruch 1.

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   10. Verfahren zur Herstellung von 7-(4-Carboxybutyramido)-7~ methoxycephalosporinderivaten mit der Formel

   HOOC-(CH₂)-CONH

   worin R und M die schon im Anspruch 1 genannte Bedeutung haben, dadurch gekennzeichnet, daß ein 7~Methoxycephalosporinantibiotikum herstellender Microorganismus, der zum Genus Streptomyces gehört, in einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches Nährstoffe mit dem Zusatz eines heterocyclischen Thiols mit der Formel

   R²SH
   enthält,

   worin R die schon genannte Bedeutung hat, oder einem Salz des heterocyclischen Thiols, oder einer Verbindung, die in das genannte heterocyclische Thiol während der Kultivierung überführbar ist, um 7-Methoxycephalosporinderivate mit der Formel

   .HOOC «^ _CH__(CH j _C0NH

   worin R und M die schon genannte Bedeutung haben, herzustellen und dann aerob ial auf die Verbindung des My eel eines D-Aminosäure oxidierenden Enzyme herstellenden Microorganismus, der zum Genus Trigonopsis gehört oder dem Behandlungsprodukt dieses Mycels einwirken läßt.

   11. Verfahren zur Herstellung von 7-Methoxycephalosporinderivaten mit der Formel

   HOOC^ H₂N-"

   ■ ·.". COOM

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   worin R und M die schon im Anspruch 1 genannte Bedeutung haben, dadurch gekennzeichnet, daß ein 7-Methoxycephalosporinantibiotikum herstellender Microorganismus, der zum Genus Streptomyces gehört, in einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches Nährstoffe mit dem Zusatz eines heterocyclischen Thiols mit der Formel

   R²SH

   enthält, worin R die schon genannte Bedeutung hat, oder einem Salz des heterocyclischen Thiols, oder einer Verbindung, die in das genannte heterocyclische Thiol während der Kultivierung überführbar ist, um die 7~Methoxycephalosporin Verbindung herzustellen.

   12. Verfahren zur Herstellung von 7~(4-Carboxybutyramido)-7~ methoxycephalosporinderivaten mit der Formel

   OCH. HOOC-(CH₂) ₃CONH

   • COOM

   worin R und M die schon im Anspruch 1 genannte Bedeutung haben, dadurch gekennzeichnet, daß aerobial des Mycel eines D-Aminosäure oxidierenden Enzyme herstellenden Microorganismus, der zum Genus Trigonopsis gehört oder dem behandelten Produkt des Mycels auf die Verbindung mit der Formel

   OCH₃

   Hooc ^ _CH_ ₍ j _H LA,.

   I JLcHS-R²

   COOxM

   worin R² und M die schon genannte Bedeutung haben, einwirken läßt.

   13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß als MierοOrganismus Streptomyces oganonensis Y-GI9Z eingesetzt wird.

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   IM. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet,

   daß R eine 5~Carboxymethylthio-l,3j^~thiadiazol-2-ylgruppe und M ein Wasserstoffatom darstellt.

   15« Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet,

   daß R eine!-Methyl-IH-tetrazol-5-yl-gruppe und M ein Wasserstoffatom darstellt.

   16. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß R eine5~Methyl-l,3,¹l-thiadiazol-2-yl-gruppe und M ein Wasserstoffatom darstellt.

   17· Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet,

   daß R eine 1,3, M-Thiadiazol-2-yl-gruppe und M ein Wasserstoff atom ist.

   18. Verfahren nach Anspruch 10 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß R eine 5-Carboxymethylthio-l,3,ⁱi-thiadiazol-2-yl-gruppe und M ein Wasserstoffatom ist.

   19. Verfahren nach Anspruch 10 oder 12, dadurch gekennzeichnet,

   daß R eine 1-Methy1-IH-tetrazol-5-yl-gruppe und M ein Wasserstoffatom ist.

   20. Verfahren nach Anspruch 10 oder 12, dadurch gekennzeichnet,

   daß R eine 5~Methyl-l,3,ⁱi-thiadiazol-2-yl-gruppe und M ein Wasserstoffatom ist.

   21. Verfahren nach Anspruch 10 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß R eine 1,3,4-Thiadiazol-2-yl-gruppe und M ein Wasserstoff atom ist.

   22. Verwendung der in den Patentansprüchen 1 bis 9 genannten 7-(4-Carboxybutyramido)-7"~niethoxycephalosporinderivate sowie ihrer pharmazeutisch zulässigen nichttoxischen Salze als antibiotischer Wirkstoff zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger- und Hilfsstoffen zur Herstellung von Arzneimitteln mit antibiotischer Aktivität zur Behandlung von Mensehen und Tieren.

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