KR800001396B1 - 7-메톡시 세파로스포린의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

7-메톡시 세파로스포린의 제조방법

제1도 : 일반식 A의 목적화합물(I)의 U.V. 스펙트럼.

제2도 : 일반식 A의 목저화합물(Ⅰ)의 I.R. 스펙트럼(KBr).

제3도 : 일반식 A의 목적화합물(Ⅱ)의 U.V. 스펙트럼.

제4도 : 일반식 A의 목적화합물 (Ⅱ)의 I.R. 스펙트럼(KBr.)

제5도 : 일반식 A의 목적화합물 (Ⅲ)의 U.V. 스펙트럼.

제6도 : 일반식 A의 목적화합물 (Ⅲ)의 I.R. 스펙트럼(KBr).

제7도 : 일반식 A의 목적화합물 (Ⅳ)의 U.V. 스펙트럼.

제8도 : 일반식 A의 목적화합물 (Ⅳ)의 I.R. 스펙트럼(KBr).

제9도 : 일반식 A의 목적화합물 (Ⅴ)의 U.V 스펙트럼.

제10도 : 일반식 A의 목적화합물 (Ⅴ)의 I.R. 스펙트럼(KBr).

제11도 : 일반식 A의 목적화합물 (Ⅴ)의 N.M.R .스펙트럼.

제12도 : 일반식 A의 목적화합물 (Ⅵ)의 U.V. 스펙트럼.

제13도 : 일반식 A의 목적화합물 (Ⅵ)의 I.R. 스펙트럼(KBr).

제14도 : 일반식 A의 목적화합물 (Ⅵ)의 N.M.R. 스펙트럼.

제15도 : 일반식 A의 목적화합물 (Ⅶ)의 U.V. 스펙트럼.

제16도 : 일반식 A의 목적화합물 (Ⅶ)의 I.R. 스펙트럼(KBr).

제17도 : 일반식 A의 목저화합물 (Ⅶ)의 N.M.R. 스펙트럼.

제18도 : 일반식 A의 목적화합물 (Ⅷ)의 U.V. 스펙트럼.

제19도 : 일반식 A의 목적화합물 (Ⅷ)의 I.R. 스펙트럼(KBr).

제20도 : 일반식 A의 목적화합물 (Ⅷ)의 N.M.R. 스펙트럼.

본 발명은 7-위치에 메톡시기를 갖는 세파로스포린의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 특별히 본 발명은 7-위치에 메톡시와 5-아미노-5-카복시바레르아미드나 4-카복시부티르 아미드를 갖고 3위치에 헤테로 사이클릭티오메틸을 갖는 세파로스포린을 발효에 의해 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 화합물은 아래 일반식(A)에 의해 나타낸다.

상기 식에서

R¹은

기나 HOOC-기를 나타내며,

R²는 질소원자를 포함하는 헤테로사이클릭기이며,

M은 수소원자이거나 염을 형성하는 양이온 잔기이다.

상기 구조식의 R²에 의해 나타낸 질소함유 헤테로사이클릭기로서는 5-카복시메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일, 1-메틸-1-테트라졸-5-일, 5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일, 1,3,4-티아디아졸-2-일기 등으로 설명된다.

세파로스포린의 염을 형성하는데 M에 의해 나타낸 양이온 잔기는 유기 또는 무기잔기이다. 무기잔기의 예는 나트륨, 칼륨 등과 같은 알카리금속; 칼슘, 마그네슘, 바륨등과 같은 알카리 토금속; 철, 구리, 아-연등과 같은 중금속이며 유기잔기의 예는 4급염이나 아민염(예, 트리에틸아민, 디에타놀아민, 피페리딘, 몰포린 등)을 형성하는 염기이다.

본 발명의 화합물의 실제적인 예는 아래와 같다:

어떤 7-메톡시-3-헤테로사이클티오메틸세파로스포린은 영국특허 제1,321,412(1970)에 화학적 합성에 의해 수득되었지만 이 화합물들의 실제적 화확적, 물리적 특성이 밝혀지지 않았다.

본 발명의 목적은 발효에 의해 7-메톡시페라로스포린 유도체의 제조방법에 관한 것이다.

세파로스포린은 그람 양성균 및 그람음성균에 대해 우수한 항균작용을 나타내며 7위치에 메톡시기를 갖고 3위치에 헤테로사이클릭메틸기를 갖는 세파로스포린 유도체는 통상의 항생제로는 효과가 없는 슈도모나스(Prseudomonas) 및 프로테우스(Proteus) 속(屬)과 같은 박테이아에 의해 감염된 중환의 치료에 특별히 우수한 효과가 있으며 7-위치에 메톡시기가 없는 원래의 세파로스포린은 효과가 없다. 이 화합물들은 처음에 3위치에 아세톡시메틸기나 카바모일옥시메틸기를 갖는 상응하는 화합물을 발효방법으로 수득한 후 헤테로사이클릭티올 화합물로 반응시킴으로서 생성된다.

한편 본 발명은 3위치에 헤테로사이클릭티오 메틸기를 갖는 화합물은 단일 발효단게로 직접 수득될 수 있다는 장점을 갖고 있다. 이렇게 수득된 화합물은 일반식(A)의 화합물(여기서 R¹은

기이다. 이하 Aa라 칭한다)이다. 구조식(A)의 화합물(R¹-Aa)은 그 자체가 탁월한 항균작용을 나타내며 이 화합물의 항균활성과 항균작용 범위는

로 나타낸 7위치의 아실기 측쇄를 α-아미노페닐아세틸기, α-카복시페닐아세틸기, α-설포페닐아세틸기, α-하이드록시페닐아세틸기, 피리딜티오아세틸기. 티아디아졸릴티오아세틸기, 트리아졸릴아세틸기, 시아노메틸티오아세틸기, 트리플루오로메틸티오아세틸기 등과 같은 다른 아실기로 치환시킴에 의해 증가하거나 변하게 되며 따라서 구조식 (A)(R¹=Aa)의 화합물은 이러한 아실기를 갖는 사응하는 유도체를 제조하는데 중간생성물로 유용하다. 예를 들면 7β-시아노메틸티오아세트아미도-7α-메톡시-3-(1-메틸테트라졸-5-일티오메틸)-Δ³-세펨-4-카복실산 및 7α-메톡시-3-(1-메틸테트라졸-5-일티오메틸)-7β-(트리플루오로메틸티오아세트아미도)-Δ³-세펨-4-카복실산이다.

구조식 A(R1=Aa)의 화합물은 양성 물질이다. 왜냐하면 분자내에 하나의 아미노기와 두 개의 카복시기를 갖고 있기 때문이다. 그래서 생성된 이 화합물을 분리 및 정제는 어렵다. 그러나 화합물의 R1기를 Aa로부터 HOOC-1기(이하 Abfk 칭한다)로 전환시키면 구조식 A(R1=Ab)의 화합물은 단지 산성만 나타내며 이것은 유기용매에 잘 녹고 화하물의 분리 및 정제를 용이하게 하며 다음 반응을 수행하는데 용이하게 한다. 그러새 이 화합물은 전술한 아실기를 갖는 유도체를 생성하는데 중간생성물로 유용하다.

본 발명에 사용된 스트렙토마이세스(Streptomyces)에 속하는 7-메톡시세파로스포린을 제조하는데 유용한 미생물의 예는 새로운 균주 즉 일본 사이타마 프리펙춰 치치부군 오가노-읍에서 토양으로부터 분리된 스트렙토마이세스 오가노넨시스(Streptomyces oganonensis) Y-G 19Z 균주이다. 이 균주는 일본의 미생물공업학회, 공업과학기술처, 통산성기탁번호 FERM-P2725, 미국 록빌 매리랜드 20852, 파크론 드라이브 12301번지의 미합중국 타잎 배지 모음(American Type Culture Collection) ATCC 31167으로 기탁되었다. 균주의 균학적 특성은 다음과 같다.

I. 에스. 오가노낸시스(S. oganensis) Y-G 19 Z 균주의 형태학적 특성.

천연 및 합성배지상에서 잘 가지를 뻗친 기질 균사체의 형성으로 잘 자란다. 반면 호기성 균사체의 형성은 충분치 않고 포자의 형성은 빈약하다. 포자사슬(Spore Chain)은 R(Rectus : 직근)이나 RF(Rectifiexibiles) 속하는 직선이며 각 사슬마다 10 내지 50포자를 생성된다. 포자는 타원형, 구형, 원주형이며 0.45내지 0.60x0.55 내지 0.90μ의 크기를 갖는다. 포자표면은 매끄럽다. 편모포자도 포자낭도 아니다.

II. 에스 오가노렌시스 Y-G 19 Z 균주의 배양특성

III. 에스 오가노넨시스 Y-G 19 Z 균주의 생리적 특성

에스 오가노넨시스 Y-G 19 Z 에 의한 탄소화합물의 이용

스트렙토마이세스 오가노넨시스 Y-G 19 Z 균의 특성은 아래와 같이 요약된다.

1. 비-색소 유전자의 스트렘토마이세스균주에 속한다.

2. 이의 기성(氣性)균사체는 윤생체(輪生體)(R 또는 RF타잎) 없이 직선이다.

3. 포자는 구형이나 타원형이다.

4. 포자표면은 매끄럽다.

5. 여러 가지 배지상에서 담황희색-담황갈색으로 성장한다.

6. 기성균사체의 색깔은 백갈색, 황백색 및 황회색이다.

7. 7-메톡시세파로스포린 군에 속하는 항생물질 Y-G 19ZD 3이 생성된다.

상기 성질을 갖고 있는 기지 균주를 찾는데는 다음의 종(種)이 가장 밀접한 관련주로 말하여진다.

에스. 에이. 왁스만이 스트렙토마이세스 글로비스포루스 : Actinomycetes 2,2318(1961) 및 International Journal of Systematic Bacteriology, 18(4) 324-325(1968)에 발표했다.

그러나 상기 문헌에 발표된 에스. 글로비스포루스와 비교할 때 균주 Y-G 19Z는 다음 표에 나타낸 점에서 다르다.

[표]

상기 표에서 나타난 차이가 분명한 바와 같이 본 발명에서 사용된 균주는 전술한 기지의 균주와 다르다. Y-G 19Z는 상기 관찰 결과의 새로운 균주이므로 스트렙토마이세스 오가노넨시스라 명명했다.

스트렙토마이세스 오가노넨시스 Y-G 19Z(ATCC 31167) 균주는 7-메톡시세파로스포린 항생물질을 제조하는 균주이며 스트렙토마이세스 속(屬)에 속하는 균주로 설명되며 다음의 균주는 7-메톡시 세파로스포린 항생물질을 생성한다고 알려졌다. 즉 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griesus), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromoqenes) IFO 13347, 스트렙토마이세스 펌브리아투스(Streptomyces fimbriatus), 스트렙토마이스세 할스태디(Streptomyces Halstedii), 스트렙토마이세스로체이(Streptomyces rochei) IFO 12908, 스트렙토마이세스 신나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis), 스트렙토마이세스 카르트레우시스(Streptomyces chartreusis), 스트렙토마이세스 락탐두란스(Streptomyces lactamdurans)(참조, 일본특허철원 공고번호 3286/71 및 벨지음특허 제764,563) 스트랩토마이에스 클라부리게루스(Streptomyces clavluigerus) IFO 13307(일본특허 공고번호 45,594/74) 스트렙토마이세스 와다야멘시스(Streptomyces Wadayamensis)(일본특허출원 26488/74), 스트렙토마이세스 주몬지넨시스(Streptomyces jumonjinensis)(일본특허출원 공고 제42893/74), 스트렙토마이세스 헤테로모르푸스(Streptomyces heteromorphus) 스트렙토마이세스 파나엔시스)(Streptomyces panayensis)(일본특허출원 공고 제53594/75) 및 스트렙토마이에스 카르트레우시스 SF-1623(일본특허출원공고 제8229/75 및 121,488/75).

그러나 본 발명에서 사용된 균주는 전술한 균주나 스트렙토마이세스 속(屬) 에 속하는 균주에 한정되지 않으며 7-메톡시 세파로스포린 상생물질을 생성할 수 있는 균주는 본 발명에 사용될 수 있다.

목적하는 화합물 A(R¹=Aa)의 제조는 목적하는 바와 같이 3-위치에 도입되는 헤테로사이클릭 티오군에 상응하는 헤테로사이클릭티올을 함유하는 원래의 배양용 배지에 전술한 7-메톡시세파로스포린 항생물질을 생성하는 균주를 배양시키므로서 수행될 수 있다.

배양용 배지에 가해진 헤테로사이클릭티올의 예는 피롤티올, 이미다졸티올, 디하이드로이미다졸티올, 피라졸티올, 트리아졸티올, 테트라졸티올, 메틸레트라졸, 티올, 피리딘티올, 디아진티올, 리오펜티올, 티아졸티올, 디하이드로티아졸티올, 티아디아졸티올, 티아트리아졸티올, 푸란티올, 피란티올, 옥사졸티올, 이속사졸티올, 옥사디아졸티올, 인돌티올, 벤즈이미다졸티올, 벤즈옥사졸디톨, 벤조티아졸티올, 트리아졸로피리딘티올, 티안트렌티올, 퓨리티올 등이다. 이러한 헤테로사이클릭 링은 할로겐원자, 아미노기, 니트로기, 알킬기, 하이드록시기, 알콕시기, 아릴기, 아르알킬기, 푸릴기, 티에닐기, 옥사졸릴기, 카복시기, 카복시메틸기, 카복시알킬티오기, 카복시알킬옥시기 등과 같은 하나 또는 그 이상의 치완체를 갖을 수 있다.

이러한 헤테로사이클릭 티올은 이의 염으로 사용되며 이 염은 알카리금속염, 알카리토금속염, 알모늄염등과 같은 무기염과 트리에틸아민, 트리에탕올아민, 디사이클로헥실아민, 라이신, 알기닌, 히스티딘과 같은 유기염기를 갖는 염; 카나마이신, 알카로이드, 염기성단백질 등과 같은 염기성 수용성 항생물질이다. 물에 아주 잘 녹는 염이 선택적으로 사용되면 헤테로사이클릭티올이 항생제를 생성하는 균주에 강한 독성을 나타낼 때 물에 잘 녹지 않는 염이 선택적으로 사용될 수 있다.

더욱이 배양하는 동안 전술한 헤테로사이클릭티올로 전환될 수 있는 화합물로 무기 또는 유기의 SH 화합물에 S-S 결합이 연결되어 있는 화합물을 예시될 수 있다. 이와 같은 S-S 화합물은 화학적 전환이나 균사체의 효소 작용에 의해 배양배지상 또는 배양배지상의 균사체에서 전술한 헤테로사이클릭 티올을 형성하고 더욱이 이 화합물은 때때로 전구물질로 사용될 수 있다. 이러한 S-S 화합물의 예는 다음과 같다.

R²S-SCH₂CH₂OH,

, R²S-SG, R²S-SCH₃, R²S-SC₂H₅, (여기서 G는 글루타티온잔기를 나타낸다) R²S-SCH₂CH₂NH₂, R²S-SCoA(여기서 CoA는 코엔자임 A잔기를 나타낸다.)

또한 S-S 결합에 의해 연결된 똑같은 헤테로 사이클릭티올 2몰이 R²S-SR²로 사용할 수 있다. 더욱이 항생제를 생성하는 균주가 황산을 환원할 수 있는 능력을 갖고 있는 경우에는 R²-SO₃H, R²-SO²H, R²-SOH 및 이의 염의 R₂SH 대신 사용될 수 있다.

본 발명의 목적하는 항생물질의 제조는 전술한 헤테로사이클릭티올 또는 이의 염 또는 유도체를 배양배지에 가하여 7-메톡시세파로스포린 항생물질을 생성하는 스트렙토마이세스 속(屬)에 속하는 균주를 배양시키므로서 수행될 수 있다. 이 배양방법은 일반미생물의 통상의 방법에 따라 수행되며 액체 배양지에 잠구어 배양시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 스트렙토마이세스 속(屬)에 속하는 7-메톡시세파로스포린 항생제를 생성하는 균주를 위한 자양분을 함유하는 배양배지를 사용한다. 전술한 자양분을 함유하는 합성 배양배지, 반합성 배양배지, 천연 배양배지가 본 발명에 사용될 수 있다. 본 배지의 조성물로 글루코오즈, 서당, 만니톨, 글리세롤, 텍스트린, 전분, 식용유 등이 탄소원으로 사용되고 육즙, 펩톤, 클루텐가루, 목화종자가루, 대두박, 땅콩가루, 생성가루, 옥수수발효폐액, 건조효모, 효모추출분, 황산암모늄, 질산암모늄, 우레아와 다른 유기 및 무기질소원이 질소원으로 사용된다. 또한 필요하면 Na,K,Mg,Ca,Zn 및 Fe의 황산염, 질산염, 염화물, 탄산염, 인산염 등을 배양배지에 가한다. 더욱이 필요하면 메티오닌, 시스테인, 시스틴, 메틸올리에이트, 실리콘 오일, 계면활성제 등과 같이 항생물질의 형성을 촉진시키는 물질 또는 소포제를 배양배지에 적당히 가할 수 있다.

전술 헤테로사이클릭티올 또는 이의염 또는 유도체를 헤테로사이클릭티올로 0.1 내지 5밀리그람/밀리리터, 바람직하기로는 0.5 내지 2밀리그람/밀리리터의 농도로 가하고 그것은 배양전 일시에 가하거나 배양의 초기단계에서 여러번 분할하여 가한다.

호기성 조건하에서 배양시키는 것이 편리하며 배양온도는 약 18내지 30℃ 바람직 하기로는 약30℃이다 더욱이 배지의 pH가 약 5 내지 10, 바람직하기로는 6 내지 8을 유지할 때 결과가 수득된다. 배양기간은 사용된 배지의 조성물과 온도에 따라 다르나 약 3 내지 10일이며 이 목적하는 물질을 매양이 끝난 후 배지중에 선택적으로 축적된다.

본 발명의 목적하는 물질은 균사체의 배양육즙에서 항생물질을 분리하는데 사용되는 원래의 방법에 의해 배양된 육즙으로부터의 분리 또는 회수될 수 있다. 본 발명의 목적하는 항생물질은 주로 배양육즙에 포함되어 있고 따라서 원십분리나 여과에 의해 이로부터 균사체를 제거하면 효과적인 목적물을 여액으로부터 추출한다. 즉 이 목적물은 여러 가지 흡착 친화력에 대한 적당한 용매차이에 대한 용해도 차이나 두 액상사이의 분배차를 이용하는 것과 같은 항생물질을 제조하는데 사용되는 일반적인 방법에 의해서 여액으로부터의 분리회수 및 정제되어진다. 필요하면 이러한 방법은 각각 사용되거나 이 방법의 적당한 복합 또는 반복하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 새로운 7-케톡시세파로스포린화합물의 실제적인 몇가지 예는 아래와 같다.

Ⅰ. 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-3-(5-카복시메틸티오-1,3,4-티올디아졸-2-일)-티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산:

첨가물 : 5-멀캅토-1,3,4-티아디아졸-2-티오아세틴산;

일반식 (R¹=Aa, R²=

, M=H)의 목적물(Ⅰ)의 물리적 및 화학적성질은 아래와 같다.

(1) 백색분말

(2) 156 내지 160℃에서 녹기 시작하고 약 170℃에서부터 갈색으로 되고 분해된다.

(3) 물에 쉽게 녹고, 메탄올에 약간 녹으며 다른 유기용매에는 거의 녹지 않는다.

(4) 닌히드린 반응(+)을 나타내는 양쪽성물질

(5) Ph 6.4의

인산염 완충액에 측정될 때 첨부된 제1도에 나타난 바와 같은 자외선흡수 스펙트럼을 갖으며 287㎛에서 최대흡수룰 나타낸다.

(6) kbR 정으로 측정될 때 제2도에 나타낸 바와 같은 적외선 흡수를 나타내며 3413cm^-1, 2920cm^-1, 1763cm^-1, 1620cm^-1, 1515cm^-1, 및 1380cm^-1에서 흡수를 나타낸다.

(7) 중수에서 내부표준제로 TMS를 사용해서측정할 때 다음과 같은 N.M.R 스펙트럼을 갖는다.

δ값(ppm)

2.35(4H, 다중선), 2.96(2H, 다중선), 4.00(3H, 단일선), 3.73-4.33(2H, 4중선, J=18HZ), 4.25(1H, 다중선), 4.44(2H, 단일선), 4.42-4.19(2H, 4중선, J=14Hz), 5.63(1H, 단일선).

(8) 가장 순수한 상태로 수득된 목적물을 다음의 원소분석치를 나타낸다.

C :35.95%, H :3.87%, N :10.85%, S : 18.33%

(9) 6N 염산으로 가수분해할 때 α-아미노 아디핀산을 수득한다.

(10) 이 화합물을 N-클로로 아세틸화하고 이 생성물을 메틸아세트르로 전환한 후 질량 분석기에 의한 데이타는 m/e 362의 다음 부분, 즉

을 얻는다.

상기에서 나타낸 적체 결과를 고찰하면 이 화합물은 7-메톡시세팔로스포린 화합물이다. 왜냐하면 이 화합물을 1763cm^-1(사이클릭락탐)에서 적외선 흡수를 나타내고 N.M.R 스펙트럼은 4.00ppm(3H, 단일선, 7-OCH₃), 5.63ppm(1H, 단일선 6-CH), 3.73-4.33(2H, 4중선, J=18Hz, 2-CH₂) 및 4.42-4.91(2H, 4중선, J=14Hz, 3-측쇄 CH₂)의 시그널이 존재하고 이 화합물은 산 가수 분해하면 α-아미노아디핀산이 수득되며 어둑이 이 화합물의 N.M.R 스펙트럼은 4.44ppm(2H, 단일선 -S-CH₂-COOH의 CH₂)에서 흡수를 나타내고 이 유도체의 질량분석에서 m/e 392의 부분을 나타내는 사실에서 이 화합물은 헤테로사이클릭티오에서 도입된 전술한 구조식을 갖는 것이 결정된다.

II. 7-(5-아미노-5-카복시 바레르아미도)-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산 :

첨가 화합물 :

5-멀캅토-1-메틸-1H-테트라졸

구조식 A(R¹-Aa, R²=

, M=H)의 목적물(II)의 물리적 화학적 특성은 아래와 같다.

(1) 백색분말

(2) 변색되는 갈색을 나타내며 160 내지 170℃에서 분해된다.

(3) 물에 쉽게 녹고, 메탄올에 약간 녹으며 다른 유기용매에는 거의 녹지 않는다.

(4) 닌히드린 반응(+)을 나타내는 양성 물질

(5) pH 6.4의 1/100M 인산염 완충액에 측정될 때 첨부된 제3도에서 보여준 바와 같은 U.V. 스펙트럼은 273mμ에서 최대흡수룰 나타낸다.

(6) KBr 정으로 측정될 때 제4도에 나타낸 바와 같은 I.R. 스펙트럼은 3413cm^-1, 2920cm^-1, 1763cm^-1, 1620cm^-1, 1515cm^-1, 1380cm^-1에서 흡수를 나타낸다.

(7) 내부표준제로 TMS를 사용해서 중수중에서 측정할 때의 N.M.R 은 아래의 시그널을 나타낸다.

δ값(ppm) :

2.36(4H, 다중선), 2.96(2H, 다중선), 3.98(3H, 단일선), 4.38(1H, 다중선), 4.50(3H, 다중선), 5.59(1H, 단일선).

(8) 가장 순수한 상태로 수득된 목적물을 다음의 원소분석치를 나타낸다.

C : 37.48%, H : 4.25%, N :16.74%, S : 10.90%

(9) 6N 염산으로 가수분해할 때 α-아미노 아디핀산을 수득하며도왁스 50W(H-타잎, 상표명)으로 메탄올중 가수분해할 때 5-멀캅토-1-메틸-1H-테트라졸을 수득한다.

전체 결과를 고찰해 보면 이 화합물은 틀립없이 7-메톡시세파로스포린 화합물임이 틀림없다. 왜냐하면 이 화합물은 N.M.R. 흡수 스펙트럼에서 3.98ppm(3H, 단일선, 7-DCH₃) 및 5.59ppm(1H, 단일선, 6-CH)의 시그널을 나타내고 I.R. 흡수 스펙트럼은 1765cm^-1(사이클릭락탐)에서 흡수를 나타내며 이를 산가수분해하면 α-아미노 아디핀산을 수득하며 더욱이 N.M.R. 스펙트럼은 4.5ppm(3H, 단일선 테트라졸-N-메틸)에서 시그널을 나타내며 또한 완화한 가수분해를 하면 5-멀캅토-1-메틸-1H-테트라졸을 얻는 사실에서 이 화합물은 여기에 헤테로 사이클릭티올을 도입한 전술한 구조식을 갖는다는 것이 결정된다.

III. 7-(5-아미노-5-카복시 바레르아미도)-7-메톡시-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ₃-세펨-4-카복실산

첨가 화합물 :

2-멀캅토-5-메틸-1,2,4-티아디아졸 :

구조식 A(R¹=Aa, R²=

, M=H)의 목적물(III)의 물리, 화학적 특성은 아래와 같다.

(1) 담황백색 분말

(2) 분명한 융점이 없으며 변색된 갈색을 나타내며 170℃에서 분해된다.

(3) 물에 쉽게 녹고 메탄올에는 약간 녹으며 다른 유기화합물에는 거의 녹지 않는다.

(4) 닌히드린 반응(+)을 나타내는 양성물질

(5) Ph 6.4의

인산염 완충액에 측정될 때 제5도에서 보여준 바와같은 U.V. 스펙트럼을 나타내며 272mμ에서 최대흡수룰 나타낸다.

(6) kbR 정으로 측정될 때 제6도에서 보여준 바와 같은 I.R. 스펙트럼을 나타내며 3420cm^-1, 2930cm^-1, 1765cm^-1, 1610cm^-1, 1515cm^-1및 1385cm^-1에서 흡수를 나타낸다.

(7) 중수중 내부표준액으로 TMS를 사용하여 측정할 때 N.M.R 스펙트럼은 아래와 같다.

δ값(ppm) :

2.34(4H, 다중선), 2.95(2H, 다중선), 3.19(3H, 단일선), 3.72-4.41(2H, 4중선, J=18Hz), 4.26(1H, 다중선), 4.40-4.95(2H, 4중선, J=14Hz), 5.63(1H, 단일선)

(8) 가장 순수한 상태로 수득된 목적물은 다음의 원소분석치를 나타낸다.

(9) 6N 염산으로 가수분해할 때 α-아미노아디핀산을 수득하며 도왁스 50w(H-타잎, 상표명)으로 메탄올중 가수분해할 때 2-멀캅토-5-메틸-1,3,4-티아디아졸을 수득한다.

모든 결과로부터 고찰할 때 이 화합물은 7-메톡시 세파로스포린 화합물임이 명백하다. 왜냐하면 이 화합물의 I.R. 스펙트럼은 1765cm^-1(사이클릭락탐)에서 흡수를 나타내며 N.M.R. 스펙트럼은 3.99ppm(3H, 단일선, 7-OCH₃), 5.63ppm(1H, 단일선, 6-CH), 3.72-4.21ppm(2H, 4중선, J=18Hz, 2-CH₂), 4.40-4.95ppm(2H, 4중선, J=14Jz), 3-측쇄 CH₂)에서 시그널을 나타내고 산 가수분해 하면 α-아미노 아디핀산을 수득하며 더욱이 N.M.R. 스펙트럼은 3.19ppm(3H, 단일선, 티아디아졸 C-CH₃)에서 시그널을 나타내고 가수분해하면 2-멀캅토-5-메틸-1,3,4-티아디아졸이 얻어진다는 사실로부터 이 화합물은 헤테로사이클릭 티올을 거기에 도입시킨 전술한 구조식을 갖는다고 결정되어진다.

IV. 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ₃-세펨-4-카복실산

첨가 화합물 :

2-멀캅토-1,3,4-티아디아졸 :

구조식 A(R¹=Aa, R²=

, M=H)의 목적물(III)의 물리, 화학적 특성은 아래와 같다.

(1) 담황백색 분말

(2) 융점은 분명치 않으며 변색된 갈색을 나타내며 약 175 내지 180℃에서 분해된다.

(3) 물에 쉽게 녹고, 메탄올에 약간 녹으며 다른 유기용매에는 거의 녹지 않는다.

(4) 닌히드린 반응이 나타내는 양성물질

(5) pH 6.4의 1/100M 인산염 완충액에서 측정될 때 첨부된 제7도의 U.V. 스펙트럼을 나타내며 274mμ에서의 최대흡수룰 나타낸다.

(6) I.R. 스펙트럼은 KBr 정으로 측정될 때 제8도에 나타내 있으며 3400cm^-1, 2925cm^-1, 1765cm^-1, 1610cm^-1, 1515cm^-1및 1365cm^-1에서 흡수를 나타낸다.

(7) N.M.R. 스펙트럼은 내부표준액으로 TMS를 사용하여 측정할 때 아래와 같다.

δ값(ppm) :

2.30(4H, 다중선), 2.93(2H, 다중선), 3.69-4.29(2H, 4중선, J=18Mz), 3.97(CH, 단일선), 4.26(1H, 다중선), 4.45-4.99(2H, 4중선, J=14Hz0, 5.56(1H, 단일선), 9.85(1H, 단일선)

(8) 가장 순수한 상태로 수득된 목적물을 아래의 원소분석치를 나타낸다.

C : 37.53%, H : 4.36%, N :12.77%, S : 16.42%

(9) 6N 염산에 의해 가수분해될 때 α-아미노아디핀산을 수득하며 도왁스 50W(H타잎, 상표명)에 의해 메탄올에서 가수분해할 때 2-멀캅토-1,3,4-티아디아졸을 수득한다.

모든 결과를 고찰하면 이 화합물은 7-메톡시세파로스포린 화합물임이 명백하다. 왜냐하면 이 화합물의 I.R. 스펙트럼은 1765cm^-1(사이클릭락탐)에서 흡수를 나타내고 3.97ppm(3H, 단일선, 7-OCH₃), 5.56ppm(1H, 단일선, 6-CH), 3.69-4.29ppm(2H, 4중선, J=18Hz, 2-CH₂), 4.45-4.99ppm(2H, 4중선, J=14Hz), 3-측쇄 CH₂)에서 시그널을 나타내고 산 가수분해 하면 α-아미노 아디핀산을 수득하며 더욱이 스펙트럼은 9.85ppm(1H, 단일선 티아디아졸 CH)에서 시그널을 나타내고 더욱이 완화한 가수분해에 의해 2-멀캅토-1,3,4-티아디아졸이 얻는 사실에서 명백하다. 본 발명의 화합물은 헤테로 사이클릭 티올인 도입된 전술한 구조식을 갖는다는 것이 결정된다.

본 발명의 목적물(I),(II),(III) 및 (IV)의 목적물에 대한 여러가지 크로마토그라피 분석과 전기영동(여지)의 결과는 아래와 같다.

미세결정 셀루로오즈(아비셀 SF, 상표명)을 사용하는 박층크로마토그라피에서 이 화합물의 Rf치는 아래표와 같이 나타낸다.

사용된 용매계(체적비)

1. 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9)

2. n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2)

3. n-부탄올 : 초산 : 물(6 : 1.5 : 2.5)

대조물인 세파마이신 C는 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-3-카바모일옥시메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산이다.

상기 비교실험에서 사용된 Y-G 19Z-D₃및 Y-G 19Z-D₂는 같은 발명자(일본특허 출원 제109,753/74 및 146,593/75)에 의해 스트렙토 마이세스 오가노넨시스의 배양액으로부터 분리된 새로운 7-메톡시세파로스포린 화합물이다. 또한 와트만 1호 여지(Wattmann No. 1 filtev paper) 및 전계용매계가 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2 체적비)를 사용하는 페이퍼 분배 크로마토그라피에 의해 수득된 Rf치는 아래와 같다.

그런 다음 이 화합물은 히타찌 635고속 액체 크로마토그라피를 사용해 분석하면 얻어진 결과는 아래와 같다.

컬럼 : 3x500밀리미터 스텐레스 스틸컬럼

수지 : 히타찌 2610(양이온성 교환수지 상품명)

전개용매계 0.2몰 구연산 염 완충액(pH 3.6)

유속(flow speed) ; 0.6밀리리터/분

기록속도 : 1.0센티미터/분

또한 아래 조건하에서 상기 기구로 사용해서 얻어진 결과는 다음의 표에 나타나 있다.

컬럼 : μ본다팩 C₁₈(워터즈 주식회사제품)의 4x300밀리미터

전계용매계 : 아세토니트림 : 0.15 초산용액(pH 3.3) (1: 9, 체적비)

유속 : 0.8밀리미터/분

고압 페이퍼 전기영동에 의해 수득된 결과는 아래와 같다.

여지 : 와트만 1호

전계용매 : 10%초산(pH 2.2)

전압 : 42볼트/센티미터

가동시간 : 1시간

본 발명의 목적 화합물 I, II, III 및 IV의 항균작용은 비교로 세파로스포린(C)의 작용과 함게 다음 표에 나타내었다.

심장 조각을 주입시킨 한천 디스크 방법(500γ/ml용액사용)

표상의 수치는 증식된 부분의 직경(밀리미터)을 나타낸다.

주 : (I) : 본 발명에 따른 화합물(I)

(II) : 본 발명에 따른 화합물(II)

(III) : 본 발명에 따른 화합물 (III)

(IV) : 본 발명에 따른 화합물 (IV)

(C) : 세파로스포린 C(비교)

본 발명에 따른 각각의 화합물(I), (II), (III) 및 (IV)은 단독으로 투여되거나 다른 약물과 조합해서 투여된다. 즉 본 발명에 따른 화합물은 정맥주사, 근육주사에 의해 비경구로, 정제, 캡슐제, 산제, 입제, 액제, 현탁제와 같은 형태로 경구 투여될 수 있다. 여러 가지 담체 즉 만티톨, 서당, 글루코오즈, 무균증류수, 식염수 및 낙화생유와 참기름 같은 식용유를 제제에 가할 수 있다. 더욱이 안정제, 결합제, 산화방지제, 보존제, 정제에서 사용되는 윤활제, 현탁제, 점도조절제, 향료등과 같은 다른 성분을 가할 수 있다.

구조식 A(R¹=Aa)의 화합물의 염으로 약학적으로 무독한 무기 또는 유기염기의 염이 사용된다. 이 약물의 투여는 신체적 조건 및 체중에 따라 다르며 투여방법 즉 경구투여 또는 비경구투여에 따라 다르다. 일반적으로 일일 50밀리그람/킬로그람이 일시 또는 분할 투여된다.

본 발명에 따른 화합물A(R¹=Aa)은 우수한 항균작용을 나타내며 인간 및 동물의 질병의 예방과 치료에 사용되며 또한 다른 유효한 7-메톡시 세파로스포린 유도체 생성하는 중간물로 사용되기도 한다. 어떤 경우에는 구조식 A(R¹=Aa)의 화합물은 순수한 생성물로 분리되도하고 또 고농축된 조생성물로 분리되기도 한다.

특별히 구조식 A(R¹=Aa)의 화합물의 7위치의 치환체

가 다른 아크릴아마이드에 의해 치환될 때 양성 성질이 사라지고 개량된 산성성분의 생성물은 편리하게 분리되고 유기용매에 녹게되고 다음 반응은 어려움없이 수행될 수 있다. 그래서 구조식 A(R¹=Aa)의 화합물을 상기에서 지시한 구조식 A(R¹=Aa)로 변형시키는 것은 공업적 실제에서 바람직하다.

전술한 문제를 해결하기 위한 계속적인 연구의 결과로 발명자들은 구조식 A(R¹=Aa)의 화합물을 트리고녹시스(Trygonopsis)속(屬)에 속하는 D-아미노산 산화효소를 생성하는 균주나 처리된 균주를 구조식 A(R¹=Aa)의 화합물이나 이의 염 또는 이를 포함하는 발효육즙에 작용시켜 구조식 A(R¹=Ab)의 화합물로 전환시킥 구조식 A(R¹=Aa)의 화합물은 유기용매에 쉽게 녹으며 이의 분리 및 정제를 간단히 할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

이렇게 수득된 구조식 A(R¹=Ab)의 화합물은 우수한 항균작용을 나타내며 이 화합물이 유기용매에 녹기 때문에 7위치에 다른 아실기가 도입된 7-메톡시세파로스포린 유도체를 생성하는 중간체로 더욱 유용하다.

본 발명의 구체화에 있어서 트리고놉시스(Trigonopsis)속에 속하는 D-아미노산 산화효소를 생성하는 균주가 적당히 사용된다. 이와같은 균주는 균주보존 연구소에 보존된 배양으로부터 선택하거나 토양에서 분리될 수 있다. 또한 구조식 A(R¹=Ab)의 목적화합물의 생성작용을 증가시키기 위해서 원래의 방법에 의해 전술한 균주로부터 생성된 돌연변이체는 본 발명에 적합하게 사용된다. 전술한 D-아미노산 산화작용을 갖는 미생물로 트리고놉시스 바리아빌리스(Trigonopsis Variabilis)로 예로 들 수 있다. 균주번호 IFO 0755(ATCC10679) 및 균주번호 IFO 0671은 일본 오사까 발효협회로부터 얻을 수 있다.

D-아미노산 산화 효소작용을 갖는 미생물을 사용하여 목적물 A(R¹=Ab)를 제조하기 위해서 미생물을 먼저 배양하고 이렇게 수득된 균사체나 처리된 균사체를 적당한 조건에서 일반식 A(R¹=Aa)의 세파로스포린 화합물과 작용시킨다. 균사체를 생성하는 배양방법으로 보통 호기성 균주를 사용하는 것이 바람직하며 공기접촉하여 교반하며 액체 배양하는 것이 더욱 바람직하다. 통상의 배야배지는 이 방법으로 사용되었다.

즉 합성 배양배지, 반합성배양배지, 또는 천연배양배지가 사용될 수 있고 배양배지의 조성물로 글루코오즈, 서당, 만니콜, 글리세를, 덱스트린, 전분, 식용유가 탄소원으로 사용될 수 있고 육즙, 펩톤, 글루텐가루, 목화종자가루, 대두박, 낙화생가루, 어박, 옥수수발효폐액, 건조효모, 효모가루, 황산암모늄, 질산암모늄, 우레아 및 다른 유기 및 무기질소 화합물이 질소원으로 사용된다. 또 필요하면 Na, K, Mg, Ca, Zn, Fe등의 황산염, 질산염, 염화물, 탄산염, 인산염등의 금속염이 배양배지에 가해질 수 있다. 더욱이, 필요하면, 메티오닌, 시스레인, 시스틴, 메틸올리에이트, 라드유, 실리콘오일, 계면활성제 등이 증식 촉진제 또는 소포제로 배양배지에 가해질 수 있다. 원하는 결과는 배지의를 약 4 내지 10, 바람직하기로는 5 내지 6을 유지함으로써 수득될 수 있다.

특별히 해양배지가 D-(또는 DL-)메티오닌, D(또는 DL-)알라닌, D(또는 DL-)바린등과 같은 D-(또는 DL-)아미노산을 포함할 때 우수한 D-아미노산 산화효소 작용이 얻어진다. 배양온도는 18 내지 37℃, 바람직하기로는 약 30℃이다. 배양기간(시간)은 배양조건, 특히 배양기구, 배양배지의 조성물 온도에 따라 다르나 D-아미노산 산화 효소작용이 최대일 때 배양을 완전히 하는 것이 바람직하다. 보통 2 내지 10일의 배양기간이 적당하다.

이렇게 수득된 균사체나 처리된 균사체는 구조식 A(R¹=Aa)의 출발물질의 D-아미노산 산화반응에 사용된다. 이 경우에 처리된 균사체는 거기에 적당히 처리하여 D-아미노산 산화 효소작용을 증가시키므로서 목적물 A(R¹=Ab)을 제조하는데 유용한 형태로 전환되는 균사체를 의미한다. 예를들면 본 발명에서 이용된 D-아미노산을 산화시키는 효소작용은 균사체에 존재하며 여기에 처리된 균사체란 D-아미노산 산화효소를 생성하는 균주를 배양시켜 얻은 균사체를 물리적 및/또는 화학적 수단을 사용하여 수득한 세포없는 추출물을 의미하거나 기지의 효소 분리 및 정제방법을 적용시켜 세포없는 추출물로부터 수득한 D-아미노산 산화효소를 세척하거나 일부 또는 완전히 정제한 효소를 의미하거나 일부 또는 전부 정제한 D-아미노산 산화효소를 물리적 또는 화학적 수단으로 수불용성 폴리머 또는 무기담체와 합하여 고형 D-아미노산 산화효소 활성물 또는 균사체로 만들고 활성물이나 균사체를 작용시켜 활성처리하는 것을 의미한다.

본 발명에서 전술한 용성효소를 제조 및 재순환하는 것은 실제적인 사용에 한정되고 활성화 균사체와 같은 불용성효소의 사용은 공업적 적용에 적합하여 쉽게 회수되고 다시 사용될 수 있다.

전술한 균사체의 활성처리는 파괴되지 않을 정도로 균사체에 완화한 손상을 주어 수행하는 것이다. 이러한 활성처리의 예로 다음 예시한 방법이 있다. 즉 여기서 균사체는 pH 약 3 내지 4에서, -10℃이하에서 얼리고 여름을 제거하거나, 아세톤, n-부탄올, 2-페닐에탄올, 디에틸에테르, 사이클로헥산, 벤젠, 톨루엔등과 같은 하나 또는 그 이상으로 욕((浴)상에서처리하는 방법 도는 균사체를 세틸 트리메틸 암모니움, 세틸피리디니움, 세틸디메틸 벤질암모늄 할라이드등과 같은 양이온성 계면활성제, 도데실 설페이트, 알카리금속알킬아릴 설포네이트, 나트륨데소시콜레이트와 같은 음이온 계면활성제, 소르비탄모노라우레이트, 트리톤-100(상품명)등과 같은 비이온성 계면활성제등과 같은 0.1 내지 10% 계면활성제로 이의 수용액내에서 처리하는 방법 또는 균사체를 수산화칼륨 또는 수산화나트륨의 묽은 수용액으로 처리하는 방법 또는 균사체를 2M의 설탕 수용액과 같은 높은 삼투압용액에 현탁시키고 재빨리 물로 희석시키는 방법등이 있다. 이러한 활성처리는 온도, 반응시간, pH값, 시약의 농도와 같은 여러 가지 인자에 의해 영향을 받으며 따라서 활성조건을 선택하는 것이 필요하다.

또한 균사체에 묘하는 카타라제의 작용을 억제하지 않을 때 목적물 A(R¹=Ab)로 산화탈카복실화되어 일반식 B로 나타내는 7-(5-카복시-5-옥소바레르아미도)-7-메톡시세파로스포린 유도체를 함께 불완전하게 형성한다.

따라서 목적물 A(R¹=Ab)을 선택적으로 수득하기 위해서 카타라제 활성을 억제시키는 것이 필요하다. 적당한 카타라제 억제제의 예는 아스코르빈산, 3-아미노-1,2,4-트리졸, 알카리금속아지드 등이 잇으며 나트륨아지드가 특별히 바람직하다. 이 억제제는 목적물 A(R¹=Aa)들 목적물 A(R¹=Ab)로 전환시키는 동안 반응혼합물에 가하거나 균사체가 전술한 전환점에 사용되기전에 균사체를 억제제로 전처리될 수 있다. 이 목적으로 사용되는 나트륨아지드의 양은 1 내지 100mM이다. 더욱이 전술한 균사체에서 카타라제는 균사체를 전술한 전환단계에서 사용전에 열처리하므로서 불활성화 시킬 수 있다. 즉 전술하나 균사체가 40 내지 60℃, 바람직하기로는 약 50℃에서 적어도 3시간 처리될 때 카타라제 활성은 현저하게 감소된다. 그러나 D-아미노산 산화작용은 전과 같다. 이 열처리는 수용액 또는 완충현탁액에서 간단히 수행될 수 있지만 특별히 균사체를 전술한 열처리와 “활성화”시약처리와 동시에 처리하는 것이 효과적이다. 예를들면 톨루엔과 같은 용매를 사용해서 50℃에서 4시간동안 균사체를 활성화시키므로서 카타라제 작용의 억제와 균사체의 활서잉 동시에 수득된다.

전술한 활성화 균사체의 효소계와 출발물질 A(R¹=Aa)의 반응은 보통 pH 6내지 8에서 수행될 수 있다. 이 반응은 30 내지 40℃ 수행되는 것이 바람직하다. 반응시간은 효소의 역가에 따라 다르나 보통 1 내지 5시간이 걸린다.

전술한 효소작용이 호기성 조건하에서 수행되므로 이 반응은 공기나 산소압하 수행하는 것이 바람직하다.

전술한 바와 같이 양쪽성 구조 때문에 발효육즙으로부터 구조식 A(R¹=Aa)의 출발물질을 추출하기 어렵다. 그러나 본 발명의 바람직한 실제화에 따라서 구조식 A(R¹=Ab)의 목적물의 회수는 균사체를 제거한 후 구조식 A(R¹=Aa)의 출발물질의 발효육즙으로부터 적당한 조건하 수행될 수 있다. 즉 형성된 목적물 A(R¹=Ab)는 이온교환수지에 의해 용매추출 또는 흡착에 의해 쉽게 회수될 수 있다. 예를들면, 반응혼합 생성물은 ph 2.5이하에서 산성화되고 이 목적물은 반응혼합물을 에틸아세테이트, n-부탄올등과 같은 유기용매로 추출해서 수득한다. 이 경우에 이온교환 수지와 용매추출을 합해서 사용하면 더 좋은 결과를 얻을 수 있다. 적당한 이온교환수지는 액체 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, n-부탄올등이다. 또한 목적물은 고형이온교환수지를 사용해서 분리할 수 있다. 이 경우 적당한 용매는 예비실험에 의해서 쉽게 결정될 수 있다.

순수한 생성물을 수득하기 n이해 항생물질의 정제에 사용되는 통상의 방법이 보통 사용될 수 있다. 구조식 A(R¹=Ab)의 목적물은 유리산 상태로 뿐만 아니라, 이의 알카리금속염, 알카리토금속염, 유기아민염등으로 회수될 수 있다.

본 발명에 따른 구조식 A(R¹=Ab)의 새로운 7-메톡시세파로스포린 유도체를 이의 특성과 함께 아래에 열거했다.

V. 7-(4-카복시부티르아미도)-5-(5-카복시메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일)티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산

출발물질(I) :

7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-3-(5-카복시메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일)티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산

구조식 A(R¹-Ab, R²=

, M=H), 의 목적물(V)의 물리적, 화학적 특성은 아래와 같다.

(1) 백색분말

(2) 융점 75 내지 78℃

(3) 메탄올 및 에탄올에 쉽게 녹고, 물, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 부탄올에 녹고 다른 유기용매에 거의 녹지 않는다.

(4) 니히드린 반응에 음성을 나타내는 산성물질

(5) pH 6.5의 1/100M인산염 완충액에서 측정될 때 U.V스펙트럼은 제9도에 나타나 있으며 278mμ에서 최대흡수를 나타낸다.

(6) I.R스펙트럼은 KBr 정으로 측정할 때 제10도와 같으며 3250cm^-1, 2925cm^-1, 1770cm^-1, 1715cm^-1, 1520cm^-1, 1380cm^-1에서 흡수를 나타낸다.

(7) 중수중 내부 표준액으로 TMS를 사용할 때 N.M.R. 스펙트럼은 제11도와 같으며 다음의 시그널을 나타낸다. δ값(ppm) :

1.93(2H, 다중선), 2.41(4H, 다중선), 3.51(3H, 단일선), 3.37-3.81(2H, 4중선, J=18Hz), 4.11(2H, 단일선), 4.154.63(2H, 4중선, J=14Hz), 5.05(1H, 단일선).

(8) C₁₈H₂₀N₄O₉S₄·2H₂O에 대한 다음의 원소분석치를 나타낸다.

(9) 6N 염산으로 2.5시간 동안 100℃에서, 가수분해하고 가수분해된 생성물을 에틸 에테르로 추출하고 증발 건조시키고 BSA(비스 트리메틸 실릴 아세트 아미도)로 실리화한 후 목적물 V를 질량분석기로 측정하면 (CH₃)₃Si-OOC-CH₂CH₂CH₂-COO-Si(CH₃)₃m/e 276의 부분을 수득한다.

상기 전체 결과들 고찰해보면 이 목적물은 7-메톡시세파로스포린 화합물임이 틀림없다. 왜냐하면 I.R스펙트럼은 1770cm^-1에서 흡수를 나타내고 N.M.R스펙트럼은 3.51ppm(3H, 단일선, 7-OCH₃), 5.05ppm(1H, 단일선, 6-CH), 3.37-3.81ppm(2H, 4중선, J=18Hz, 2-CH₂), 4.15-4.6ppm(2H, 4중선, J=14Hz, 3-측쇄 CH₂) 및 4.11ppm(2H, 단일선 -S-CH₂-COOH의 CH₂)를 나타내는 사실에서 틀림없다. 더욱이 1.93ppm(2H, 다중선, β-CH₂)와 2.41ppm(4H, 다중선, α,γ-CH₂)는 4-카복시부티르아미다. 더욱이 1.93ppm(2H, 다중선, β-CH₂)와 2.41ppm(4H, 다중선, α,γ-CH₂)는 4-카복시부티르아미드의 존재를 나타내며 염산에 의해 가수분해되고 실릴화된 목적물의 유도체의 질량분석기는 m/e 276의 부분을 나타내며 본 발명에 따른 목적물(V)는 출발물질의 7위치에 5-아미노-5-카복시바레르아미도기가 산화적으로 탈아민화되어 4-카복시-부티르아미도기가 된다는 전술한 구조식을 갖는 것이 확실하다.

VI. 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산.

출발물질(II) :

7-(5-아미노-5-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산.

구조식 A(R¹=Ab, R²=

, M=H)의 목적물(VI)의 물리적 화학적 특성은 아래와 같다.

(1) 백색분말

(2) 융점 80 내지 83℃

(3) 메탄올 및 에탄올에 쉽게 녹으며 물, 에틸아세테이트, 부티아세테이트, 부탄올에 녹으며 다른 유기용매에는 거의 녹지 않는다. 나트륨염은 물에 쉽게 녹는다.

(4) 닌히드린 반응이 음성인 산성물질

(5) pH 6.5의 1/100M인산염 완충액에서 측정될 때 U.V.스텍트럼은 제12도와 같으며 269mμ에서 최대 흡수를 나타낸다.

(6) I.R.스펙트럼은 KRr 정으로 측정할 때 제13도와 같으며 3420cm^-1, 2940cm^-1, 1765cm^-1, 1680cm^-1, 1610cm^-1, 1525cm^-1, 1390cm^-1에서 흡수한다.

(7) 중수중 내부표준액으로 TMS를 사용하는 N.M.R스펙트럼은 제14도와 같으며 다음의 시그널을 나타낸다. δ값(ppm) :

1.94(2H, 다중선), 2.40(4H, 다중선), 3.51(3H, 단일선), 3.40-3.83(2H, 4중선, JH=18Hz), 3.99(3H, 단일선), 4.17-4.50(2H, 4중선, J=14Hz), 5.02(1H, 단일선)

(8) C₁₈H₂₀N₆O₇S₂·2H₂O에 대한 다음의 원소분석치를 나타낸다.

(9) 6N 염산으로 100℃에서 2시간동안, 가수분해된 생성물을 에틸에테르로 추출하고 증발 건조한 후 BSA (비스트리메틸실릴 아세트아미도)로 실릴화 시킨 후 목적물 VI를 질량분석기로 측정하면 me/e (CH₃)₃Si-OOC-CH₂CH₂CH₂-COO-Si(CH₃)₃의 부분을 수득한다.

상기 전체 결과를 고찰하면 이 목적물은 7-메톡시세파로스포린 화합물임이 명백하다. 왜냐하면 I.R스펙트럼은 1765cm^-1(사이클릭 락탐)에서 흡수존재를 나타내고 N.M.R스펙트럼은 3.51ppm(3H, 단일선, 7-OCH₃), 5.02ppm(1H, 단일선, 6-CH), 3.99(3H, 단일선, 7OCH₃), 3.403.83ppm(2H, 4중선, J=18Hz, 2-CH₂) 4.17-4.50ppm(2H, 4중선, J=14Hz, 3-측쇄 CH₂)에서 시그널을 나타내고 .94ppm(2H, 다중선, β-CH₂) 및 2.40ppm(4H, 다중선, α,γ-CH₂)은 N.M.R에서 4-카복시부티르아미드의 존재를 나타내며 더욱이 염산으로 가수분해하고 실리화시킨 목적물의 유도체의 질량분석은 m/e 276의 조각을 나타내고 출발물질의 7위치에 5-아미노-5-카복시바레르아미도기를 산화적으로 탈아민시켜 4-카복시부티르아미도기로 전환되기 때문에 본 발명의 목적물(VI)이 전술한 구조식을 갖는다.

VII. 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일)티아디아졸-2-일)티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산.

출발물질(III) :

구조식 A(R¹=Ab, R²=

, M=H)을 갖는 본 발명의 목적물(VII)의 물리 화학적 특성은 아래왁 같다.

(1) 백색분말

(2) 융점 95 내지 99℃

(3) 메탄올과 에탄올에 쉽게 녹으며 물, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 부탄올에 녹고 다른 유기용매에는 거의 녹지 않는다.

(4) 닌히드린 반응이 음성인 산성물질

(5) pH 6.5의 1/100M인산염 완충액에서 측정한 U.V.스텍트럼은 제15도와 같으며 273mμ에서 최대 흡수를 나타낸다.

(6) I.R.스펙트럼은 제16도에 나타낸 것처럼 KBr 정으로 측정할 때 3460cm^-1, 2925cm^-1, 1773cm^-1, 1515cm^-1, 1375cm^-1에서 흡수를 나타낸다.

(7) 중수중 내부표준액으로 TMS를 사용하는 N.M.R스펙트럼은 제17도와 같으며 다음의 시그널을 나타낸다.

δ값(ppm) :

1.92(2H, 다중선), 2.40(4H, 다중선), 2.71(3H, 단일선), 3.38-3.80(2H, 4중선, JH=18Hz), 3.51(3H, 단일선), 4.17-4.64(2H, 4중선, J=14Hz), 5.03(1H, 단일선)

(8) C₁₇H₂₀N₄O₇S₃에 대한 다음의 원소분석치를 나타낸다.

(9) 6N 염산으로 100℃에서 2시간 동안, 가수분해하고 이를 에틸에테르로 추출하고 증발 건조한 후 BSA로 실릴화 시킨후 목적물(VIII)의 질량분석은 me/e 276(CH₃)₃Si-OOC-CH₂CH₂CH₂-CO-OSi(CH₃)₃의 부분을 나타낸다.

상기 전체 결과를 고찰하면 이 목적물은 7-메톡시 세파로스포린임에 틀림없다. 왜냐하면 I.R스펙트럼은 1773cm^-1(사이클릭 락탐)의 존재를 나타내고 N.M.R스펙트럼은 3.51ppm(3H, 단일선, 7-OCH₃), 5.03ppm(1H, 단일선, 6-CH), 2.71(3H, 단일선, 티아디아졸의 C-CH₃), 3.38-3.80ppm(2H, 4중선, J=18Hz, 2-CH₂) 4.17-4.64ppm(2H, 4중선, J=14Hz, 3-측쇄 CH₂)에서 시그널을 나타내고 더욱이 1.92ppm(2H, 다중선, β-CH₂) 및 2.40ppm(4H, 다중선, α,γ-CH₂)은 4-카복시부티르아미드의 존재를 나타낸다. 더욱이 목적물을 염산으로 가수분해하고 실리화함으로써 제조된 유도체의 질량분석은 m/e 276의 부분을 나태는 사실로 보아 명백하다 구조식 A의 목적물(VII)은 출발물질의 7 위치에 5-아미노-5-카복시바레르 아미도기가 탈아민으로 산화되어 4-카복시부티르아미도기가 되는 것으로 보다 전술한 구조식을 갖는다고 결정된다.

VIII. 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(1,3-티아디아졸-2-일)티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산

출발물질(IV) :

7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(1,2,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산.

구조식 A(R¹=Ab, R²=

, M=H)을 갖는 본 발명의 목적물(VII)의 물리 화학적 특성은 아래왁 같다.

(1) 백색분말

(2) 융점 88 내지 92℃

(3) 메탄올과 에탄올에 쉽게 녹고 물, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 부탄올에 녹으며 다른 유기용매에는 거의 녹지 않는다.

(4) 닌히드린 반응이 음성인 산성물질

(5) pH 6.5의 1/100M인산염 완충액에서 측정한 U.V.스텍트럼은 제18도와 같으며 274mμ에서 최대 흡수를 나타낸다.

(6) I.R.스펙트럼은 KBr 정으로 측정할 때 제19도와 같으며 3250cm^-1, 2925cm^-1, 1770cm^-1, 1515cm^-1및 1365cm^-1에서 흡수를 나타낸다.

(7) 중수중 내부표준액으로 TMS를 사용하는 N.M.R 스펙트럼을 측정하면 제20도와 같으며 다음의 시그널을 나타낸다.

δ값(ppm) :

1.92(2H, 다중선), 2.40(4H, 다중선), 3.39-3.8032H, 4중선, JH=18Hz), 3.51(3H, 단일선), 4.24-4.73(2H, 4중선, J=14Hz), 5.03(1H, 단일선), 9.35(1H, 단일선)

(8) C₁₆H₁₈N₄O₇S₃·1/2 H₂O에 대한 다음의 원소분석치는 다음과 같다.

(9) 목적물(VIII)을 6N염산으로 100℃에서 2.5시간 동안 가수분해하고 에틸 에테르로 추출하고 증발시킨 후 BSA(비스트리메틸실릴아세트아미도)로 실릴화한 후 질량분석기를 측정하면 me/e 276(CH₃)₃Si-OOC-CH₂CH₂CH₂-CO-OSi(CH₃)₃의 부분을 나타낸다.

상기 전체 결과를 고찰해 보면 본 발명의 목적물은 7-메톡시 세파로스포린임이 명백하다. 왜냐하면 I.R스펙트럼은 1777cm^-1(사이클릭 락탐)에서 흡수를 나타내고 N.M.R스펙트럼은 3.51ppm(3H, 단일선, 7-OCH₃), 5.03ppm(1H, 단일선, 6-CH), 9.35ppm(1H, 단일선, 티아디아졸의 CH), 3.39-3.83ppm(2H, 4중선, J=18Hz, 2-CH₂) 4.24-4.73ppm(2H, 4중선, J=14Hz, 3-측쇄 CH₂)에서 시그널을 나타내고 1.92ppm(2H, 다중선, -CH₂) 및 2.40ppm(4H, 다중선, α,γ-CH₂)은 4-카복시부티르아미드의 존재를 나타내는 사실에서 확실하며 목적물을 염산으로 가수분해하고 실리화한 후 질량분석기로 측정하면 m/e 276의 부분을 나타내는 사실로 보아 명백하다. 이 목적물(VIII)은 출발물질의 7위치의 5-아미노-5-카복시 바레르아미도기를 탈아민으로 산화시켜 4-카복시부티르아미도기로 전환시키는 사실로 보아 전술한 구조식을 갖는 것이 틀림없다.

본 발명에 따른 목적물(V)-(VII)화합물을 박층크로마토그라피와 고속 액체크로마토그라피로 분석한 결과가 본 발명의 출발물질(I)-(VI)의 결과와 함게 아래표에 나타냈다.

미세결정 셀루로오즈(아비셀, 상품명)을 사용하는 박층크로마토그라피의 Rf치는 아래와 같다.

[표 1]

전개용매계 :

1. 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9) 체적비)

2. n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2 체적비)

검출 : 닌히드린 반응 또는 U.V흡수(마나슬루 라이트 : 상품명 2536Å) 또는 생물학적 자가시험(프로테우스 미라빌리스 사용).

전체화합물은 다음의 두 테스트에 양성을 나타낸다. 고속 액체크로마토그라피에 의한 결과는 다음의 표에 나타나 있다.

[표 2]

사용된 컬럼 ; 워터스 주식회사 μ본다펙 C₁₈

용매계 : 아세토니트릴 : 0.1% 초산(pH 3.3)(1 : 9, 체적비)

고속 액체 크로마토그라피에 의한 세파로스포린의 보지시간은 아래와 같다 :

사용된 컬럼 : μ본다펙 C₁₈(워터즈 주식회사)

용매계 : 아세토니트릴 : 0.1% 초산(pH 3.5)(2 : 8 : 체적비)

화합물 (II), (III), (IV) 및 (VII)의 생체내 실엄은 아래와 같다 :

ddY족의 건강한 숫쥐 5마리에 이. 콜라이 10⁶개의 세포를 정맥내 주사하고 2시간후 피하에서 샘플을 취하고 5일후 잔존하는 %를 다음 표에 나타냈다. 유사한 실험을 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilies) 1287, 10⁵세포로 실시했다.

대조군은 각각 10마리로 이루어져 있다.

본 발명의 실시예는 아래에 상세하게 기술되어 있다.

[실시예 1]

7-(5-아미노-5-카복시부티르아미도)-3-(5-카복시메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일)티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산의 제조

1% 전분, 1% 글루코오즈, 1.5% 콩가루, 0.5% 이스트가루, 0.1% 일수소인산칼륨, 0.05% 황산마그네슘 및 0.3% 염화나트륨을 포함하는 배지를 500밀리리터 용량의 사가구찌 플라스크에 각각 100밀리리터씩 넣고 120℃에서 20분간 무균시킨다. 각 배지는 스트렙토마이세스 오가노넨시스 Y-G 19z 균주로 접종시키고 48시간동안 30℃에서 배양시킨다.

전술한 배양배지를 200밀리리터 용량의 사가구찌 플라스크에 각각 400밀리리터씩 가하고 120℃에서 20분간 멸균시키고 상기 접종물을 2 내지 3% 농도로 접종하고 30℃에서 24시간 동안 배양시켜 접종용 배지로 만든다.

더욱이 7% 전분, 2% 글루텐가루, 2% 콩가루, 0.8% 글리세롤, 0.1% 카사리노산, 0.01% 황산제2철 55그람의 수산화나트륨을 포할하는 배양배지 60리터 2개의 100리터 발효관에 소포제로 아데카놀(상품명) 10밀리리터와 함께 넣은 다음 120℃에서 30분간 멸균시킨다. 각 배지는 800밀리리터의 접종용 배지에 접종하고 30℃에서 24시간 배양시킨다.

수산화나트륨 수용액에 5-멀캅토-1,3,4-티아디아졸-2-티오아세틴산을 녹이고 이 용액을 고압에서 멸균시키고 각 발효관에 접종물의 0.05%까지 가하고 90시간 배양시킨다.

배양이 완전히 끝난 후 배양된 육즙의 pH를 2.0으로 조정하고 라디오라이트(상품명)으로 혼합한다. 이 혼합물을 가압여과기를 사용하여 여과하고 각각의 여액을 합하면 약 10리터의 여액 혼합물이 된다. 이 여액을 수산화나트륨수용액으로 pH 3.0으로 맞추고 12리터의 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼을 통과시키고 이 컬럼을 30리터의 물로 세척한 다음 30리터의 50% 아세톤으로 용출시킨다. 수집된 용출물을 농축시켜 5.5리터로 만들고 형성된 불순물을 제거하고 물을 잔유물에 가해 10리터의 용액으로 만든다. 이 용액을 묽은 염산용액으로 pH 3.5로 맞추고 3리터 앰버라이트 IRA-68(Cl-타입)(상품명) 컬럼을 통해 통과시킨다. 6리터의 물로 세척한 후 용출액을 1M의 질산나트륨과 0.1M의 초산나트륨을 포함하는 수용액(pH 7.2)을 사용해서 처리하면 항균작용을 갖는 활성물질을 포함하는 용액 약 5리터를 수득한다. 이 용액을 pH 3.0으로 맞추고 1리터의 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼을 통해 통과시키고 이 컬럼을 물로 세척하고 50%의 아세톤 수용액으로 용출시키면 항균작용을 갖는 활성물질을 포함하는 400밀리리터의 수용액을 수득한다. 이 용액을 동결 건조시키면 구조식(I)의 조생성 가루 약 18그람을 수득한다.

그런 다음 조생성가루 18그람을 0.5M의 브롬화암모늄-초산완충용액 소량으로 채워진 DEAE-세파텍스 A-25(초산 타입)(상품명)의 800밀리리터를 사용해서 컬럼크로마토그라피하고 유효성분을 분획한다. 수득된 항균활성 분획을 수집하고 500밀리리터 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼을 통해 통과시키고 이 컬럼을 물로 세척한 후 25% 아세톤 수용액으로 이 컬럼을 용출시키고 용출액을 증발 건고시킨다.

그런 후 이소프로판올 : 물(7 : 3 체적비)의 용매혼합을 사용해서 수득된 생성잔유물을 미세결정 셀루로오즈(아비셀)을 사용하는 컬럼크로마토그라피에 상기 용매로 용출시킨다. 수득된 항균적으로 활성획분을 아비셀 에스에프9상품명)의 박층 크로마토 그라피에 점적하고 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9, 체적비)의 혼합물로 전개시키고 0.25% 니히드린의 피리딘 용액을 박층크로마토그라피상에 분무하고 가열하므로서 착색된다. Rf치 0.39를 나타내는 획분을 수집한다. 획분을 45 내지 50℃에서 진공증발 건고시킨 다음 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9, 체적비)의 혼합을 사용하여 미세결정 셀루로오즈(아비셀)상 컬럼 크로마토그라피한다. 이렇게 수득된 항균적으로 활성인 물질을 상기와 같은 용매혼합물로 아비셀 에스 에프상 박층크로마토그라피에 전개시키고 Rf 0.39치를 나타내는 획분을 수집하고 진공 증발 건고시킨다.

생성된 잔유물을 n-부탄올 : 초산 : 물(6 : 1.5 : 2.5, 체적비)의 혼합용매를 사용하는 미세결정셀루로오즈 컬럼크로마토그라피로 정제시킨다. 정제된 활성획분을 증발 건고시키고 소량의 증류수에 녹인다. 이 용액을 증류수를 사용하여 세파덱스-10(상품명)의 컬럼상에 전개시킨다.

항균작용을 나타내는 획분을 모으고 n-부탄올 : 초산 : 물(6 : 1.5 : 2.5, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 전술한 바와 같이 박층크로마토그라피상에 전개시킨다. Rf 0.32치를 나타내는 획분을 모으고 농축시킨 후 동결 건조시키면 80밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시-바레르아미도)-3-(5-카복시메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산이 백색으로 수득된다.

[실시예 2]

7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산(II)

1% 전분, 1% 글루코오즈, 1.5% 콩가루, 이스트가루, 0.1% 일수소인산나트륨, 0.05% 황산마그네슘, 0.3% 염화나트륨을 포함하는 배양배지를 500밀리리터 용량의 사가구찌 플라스크에 각각 100밀리리터씩 넣고 120℃에서 20분간 멸균시킨다. 그런후 각 배지를 스트렙토마이세스 오가노넨시스 YG 19-Z 균주로 접종시키고 30℃에서 48시간동안 배양시킨다. 더욱 전술한 배양배지를 2리터 사가구찌 플라스크에 각각 400밀리리터씩 넣고 120℃에서 20분간 멸균시키고 각 배지를 상기에서 만들어진 배양된 육즙을 2 내지 3%까지 접종시키고 24시간동안 30℃에서 배양시키면 접종물이 만들어진다.

또한 7% 전분, 2% 글루텐가루, 2% 콩가루, 0.8% 글리세롤, 0.1% 카사미노산, 0.01% 황산제2철, 55그람의 수산화나트륨을 포함하는 배양배지 60리터를 100리터 바효관에 10밀리리터의 아데카놀(상품명)을 소포제로 함께 넣고 120℃에서 30분간 멸균시키고 각 배지를 상기에서 만들어진 접종물 800밀리리터로 접종시키고 30℃에서 24시간 배양시킨다. 그런후 1-메틸-5-멜캅토-1H-테트라졸을 수산화나트륨 수용액에 녹이고 이 용액을 고압에서 멸균시키고 배양육즙을 가해 이의 농도를 0.05%로 만들고 이 혼합물은 90시간동안 배양시킨다.

배양이 완전히 된 후 형성된 배양육즙을 pH 2.0으로 맞추고 이 혼합물 라디오라이트(Radiolite)(상품명)와 교반하여 섞는다. 이 혼합물을 가압 여과기로 통해 여과하고 수득된 여액을 합해 약 100리터의 여액 혼합물로 만든다. 이 여액을 수산화나트륨 수용액으로 pH 3.0으로 맞추고 12리터의 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼을 통해 통과시키고 이 컬럼을 30리터의 물로 세척하고 50% 아세톤 수용액으로 용출시킨다. 이 용출액을 농축시켜 5.5리터로 만들고 이 농축물을 묽은 염산수용액으로 pH 3.5로 조정하고 3리터 엠버라이트 IRA-6(Cl-타입)(상품명) 컬럼을 통해 통과시킨다. 이 용액을 6리터의 물로 세척하고 1M의 질산나트륨 및 0.1M의 초산나트륨을 획분시키면 항균작용을 갖는 물질을 포함하는 용액 약 5리터를 수득한다. 이 용액을 pH 3.0으로 맞추고 1리터 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼을 통해 통과시키고 물로 세척하고 50% 아세톤 수용액으로 용출시키면 항균작용을 갖는 물질 약 400밀리리터를 수득한다. 이 용액을 동결 건조시키면 목적물(II)의 조생성분말 54그람을 수득한다. 이 조생성분말을 소량의 0.5M브롬화암모늄-초산완충액이 충진된 DEAE 세파덱스 A-25(초산타입)(상품명) 약 800밀리리터로 컬럼 크로마토그라피하여 활성성분을 획분시킨다. 항균작용을 갖는 획분을 모으고 500밀리리터의 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼을 통해 통과시키고 이 컬럼을 물로 세척하고 25% 아세톤 수용액으로 용출시킨다. 항균작용을 갖는 획분을 모으고 진공증발 건조시킨다. 형성된 잔유물을 미세결정의 셀루로오즈(아비셀)(상품명)을 사용하는 컬럼 크로마토그라피에 이소프로판올 : 물(7 : 3, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 용출시킨다.l 수득된 항균작용을 갖는 획분을 아미셀 에스에프(상품명)의 박층 플레이트에 점적하고 n-부탄올 : 초산 : 물(6 : 1.5 : 2.5, 체적비)의 혼합용매로 전개시키고 0.25% 니히드린-피리딘 용액으로 분무한 후 가열하여 발생시킨다. 그런 다음 Rf 0.31을 나태나는 획분을 수집한다. 이 획분을 감압하 농축시키고 건고시켜 형성된 잔유물을 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9, 체적비)를 사용하는 미세결정 셀루로오즈상 컬럼크로마토그라피한다. 수득한 항균작용을 갖는 활성획분을 아미셀 에스 에프(상품명)의 박층크로마토그라피상 전술한 조성물의 용매로 전개시키고 상기와 같은 방법으로 Rf 0.39를 나타내는 획분을 모으고 진공증발 건고시킨다.

이렇게 형성된 잔유물을 n-부탄올 : 초산 : 물(6 : 1.5 : 2.5, 체적비)의 혼합용매를 사용해서 미세결정셀루로오즈상 컬럼 크로마토그라피하여 유효성분을 정제한다.

이렇게 정제된 유효성분을 진공증발 건고시키고 소량의 증류수에 녹이고 증류수를 사용하여 세파덱스 G 10(상품명)의 컬럼상 용출시킨다. 항균자을 갖는 획분을 수집하고 전술한 바와 같이 n-부탄올 : 초산 : 물(6 : 1.5 : 2.5, 체적비)의 혼합 용매를 사용해서 박층크로마토그라피에 전개시킨다. 그런 후 Rf 0.31을 갖는 획분을 모으고 농축시키고 동결 건조시키면 60밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산을 수득한다.

[실시예 3]

7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산(III)

1% 전분, 1% 글루코오즈, 1.5% 콩가루, 0.5% 이스트가루, 0.1% 일수소인산칼륨, 0.05% 황산마그네슘 및 0.3% 염화나트륨을 포함하는 배양배지를 500밀리리터짜리 사가구찌 플라스크에 100밀리리터씩 넣고 120℃에서 20분동안 멸균시킨다. 각 배지를 스트렙토마이세스 오가노넨시스 YG 19Z 균주로 접종하고 30℃에서 48시간동안 배양시킨다. 전술한 또 다른 배양배지 2리터짜리 사가구찌 플라스크에 각각 400밀리터씩 넣고 120℃에서 20분간 멸균시킨다. 각 배지를 상기에서 2 내지 3% 농도로 만들어진 배양육즙으로 접종시키고 30℃에서 24시간동안 배양시키면 접종용 배양이 만들어진다.

따라 7% 전분, 2% 글루텐가루, 2% 콩가루, 0.8% 글리세롤, 0.1% 카사미노산, 0.01% 황산제2철 및 55그람의 수산화나트륨을 포함하는 60리터의 배양배지를 100리터의 발효관에 10밀리리터의 아데카놀(상품명)을 소포제로 함께 가한 다음 120℃에서 30분간 멸균시킨다. 800밀리리터 접종용 배지에 접종시키고 30℃에서 24시간동안 배양시킨다.

그런후 2-멀캅토-5-메틸-1,3,4-티아디아졸을 수산화나트륨 수용액에 녹인 다음 고압하 멸균시키고 배양된 육즙을 가해 농도를 육즙의 0.05%로 되게한 후 90시간동안 배양시킨다. 배양이 완전히 된 후 배양된 육즙을 pH 2.0으로 맞추고 라디오라이드(상품명)으로 교반하여 혼합한다. 이 혼합물을 가압여과기를 통해 여과한 후 여액을 합하면 약 100리터의 여액 혼합물을 얻는다.

이 여액을 수산화나트륨 수용액을 가해 pH 3.0으로 맞추고 12리터의 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼을 통해 통과시키고 칼럼을 30리터의 물로 세척하고 50%의 아세톤 수용액으로 용출시킨다. 이 용출액을 농축시켜 5.5리터로 만들고 이 농축물을 묽은 염산으로 pH 3.5로 맞추고 3리터의 앰버라이트 IRA-68(Cl-타입)(상품명) 컬럼을 통해 통과시킨다. 이 컬럼을 6리터의 물로 세척하고 1M 질산나트륨과 0.1M 초산나트륨을 포함하는 수용액(pH 7.2)으로 용출시키면 항균작용을 갖는 활성물질 약 5리터를 포함하는 용액을 얻는다. 이 용액을 pH 3.0으로 맞추고 1리터의 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼을 통해 통과시키고 물로 세척한 후 50%의 아세톤 수용액으로 용출하면 활성항균물질을 포함하는 수용액 400밀리리터를 얻는다. 이 생성물을 돌결 건조시킨다.

n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)의 혼합용매를 사용해서 형성된 잔유물을 상기와 같은 조성물을 갖는 혼합용매로 채워진 미세결정 셀루로오즈(아비셀)(상품명)을 사용해서 컬럼 크로마토그라피한다. 그런 후 수득된 활성항균물질 획분을 분별시키고 아비셀 에스에프(상품명)의 박층플레이트에 점적하고 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9, 체적비)의 혼합용매로 전개시키고 0.25% 니히드린 피리딘 용액으로 분무한 후 가열하여 발색시킨다. Rf 0.43을 나타내는 획분을 수집하고 45 내지 50℃에서 진공증발 건조시킨 다음 아세토니트릴 : 물(7 : 3, 체적비)의 용매 혼합물을 사용하여 미세입자 셀루로오즈(아비셀)상 컬럼크로마토그라피한다.

수득된 항균 활성물질 획분을 전술화 같이 아비셀 에스에프상 박층크로마토그라피시키고 Rf 0.43을 나타내는 획분을 모으고 증발건조시키면 0.78그람의 조생성분말을 얻는다.

이 분말을 소량의 증류수에 녹이고 증류수를 사용하는 세파덱스 G 10(상품명)의 컬럼에 전개시킨다. 항균활성획분을 분별시키고 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 박층크로마토그라피시키고 Rf치 0.43을 나타내는 획분을 모으고 농축시킨 후 동결건조시키면 82밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산이 백색으로 수득된다.

[실시예 4]

실시예 1과 같은 방법으로, 메탄올을 포함하는 물에 설파이드를 가해 비스(5-카복시메틸티오01,3,4-티아디아졸-2-일) 디설파이드의 용액을 만들고 수산화나트륨수용액을 사용하여 제조된 5-멜캅토-1,3,4-티아디아졸-2-티오아세틴산의 용액대신에 밀리포아 여과기를 사용해 여과멸균시킨다음 고압에서 멸균시키고 목적물(I)의 조생성분말 23그람을 제조하고 실시예 1과 같이 정제하므로서 약 45밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-3-(5-카복시메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산(목적물 I)이 얻어진다.

[실시예 5]

실시예 2에서 사용된 방법과 동일한 방법으로, 비스(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 디설파이드의 용액은 메탄올을 포함하는 물에 디설파이드를 녹여 만들고 수산화나트륨의 수용액을 사용하는 테트라졸에 녹인 1-메틸-5-멜캅토-1H-테트라졸용액 대신에 밀리포아 필터를 사용하여 여과 멸균시킨 다음 고압멸균시킨다. 약 26그람의 목적물(II)의 조생성분말을 수득하고 실시예 2와 같이 정제하면 약 37밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산(목적물 II)을 수득한다.

[실시예 6]

실시예 3의 방법과 동일한 방법으로, 비스(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 디설파이드는 메탄올을 포함하는 물에 디설파이드를 녹여 만들고 2-멀캅토-5-메틸-1,3,4-티아디아졸 용액(수산화나트륨 수용액을 사용하여 만든다)을 사용하는 대신 밀리포아 여과기를 사용하여 여과멸균시키고 고압에서 멸균시킨다. 목적물(III)의 조생성분말 약 19그람을 수득하며 실시예 4와 같이 정제하면 약 50밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산(목적물 III)이 수득된다.

[실시예 7]

7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산(IV)의 제조방법.

1% 전분, 1% 글루코오즈, 1.5% 콩가루, 0.5% 이스트가루, 0.1% 일수소인산칼륨, 0.05% 황산마그네슘 및 0.3% 염화나트륨을 포함하는 배지를 500밀리리터 사가구찌 플라스크에 100밀리리터씩 넣고 120℃에서 20분동안 멸균시킨 다음 스트렙토마이세스 오가노넨시스(Streptomyces oganonensis) YG 19Z 균주로 접종하고 30℃에서 48시간동안 배양시킨다. 전술한 배지를 2리터 사가구찌 플라스크에 400밀리터씩 각각 가하고 120℃에서 20분간 멸균시킨다음 전술한 방법으로 만들어진 2 내지 3% 배양육즙으로 접종시키고 30℃에서 24시간동안 배양시키면 접종용 배양이 된다.

따로, 7% 전분, 2% 글루텐가루, 2% 콩가루, 0.8% 글리세롤, 0.1% 카사미노산, 0.1% 황산제이철 55그람의 수산화나트륨을 포함하는 배양배지 60리터를 100밀리리터의 발효관에 10밀리리터의 아데카놀(상품명)을 소포제로 함께 넣고 120℃에서 30분간 멸균시키고 800밀리리터의 접종용 배양을 접종시킨 후 30℃에서 24시간동안 배양시킨다. 그런후 수산화나트륨 수용액을 사용하여 물에 티아디아졸을 녹여 만든 2-멜캅토-1,3,4-티아디아졸 용액을 고압에서 멸균시키고 배양육즙에 가해 티아디아졸의 농도를 0.05% 되게하고 다시 90시간동안 배양시킨다.

배양이 완전히 된 후 배양된 육즙을 pH 2.0으로 맞추고 라디오라이트(상품명)을 교반하여 혼합한다. 이 혼합물을 고압여과기를 사용하여 여과하고 이 여액을 합하면 약 100리터의 여액혼합물을 얻게 된다.

이 여액을 pH 3.0으로 맞추고 12리터 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼을 통해 통과시키고 이 컬럼을 30리터의 물로 세척하고 30리터의 50% 아세톤 수용액으로 용출시킨다. 이 용출액을 농축시켜 5.5리터로 만든다. 이 농축액을 pH 3.5로 맞추고 1M 질산나트륨 및 0.1M의초산나트륨의 수용액(pH 7.2)으로 용출시키면 항생활성물질을 포함하는 용액 약 5리터를 얻는다. 이 용액을 pH 3.0으로 맞추고 1리터의 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼을 통해 통과시키고 50%의 아세톤수용액으로 용출시키면 항생활성물질을 포함하는 수용액 약 400밀리리터를 수득한다. 이 용액을 동결건조시킨다.

n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 형성된 잔유물을 미세입자 셀루로오즈(아비셀, 상품명)상 컬럼 크로마토그라피(용매는 전술과 같다)시킨다. 항균작용을 갖는 획분을 아비셀(상품명0의 박층플레이트에 점적시키고 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 전개시키고 0.25% 니히드린의 피리딘 용액을 분무시키고 가열하여 발색시켜 분류시킨다.

Rf 0.39치를 나타내는 획분을 모으고 45 내지 50℃에서 진공증발 건고시킨다. 잔유생성물을 아세토니트릴 : 물(7 : 3, 체적비)의 혼합용매를 사용하는 미세입자 셀루로오즈9아비셀)상 컬럼 크로마토그라피시킨다. 항균작용을 갖는 활성획분을 상기 방법과 같이 아비셀 에스에프 상에 박층크로마토그라피시키고 Rf 0.39를 나타내는 획분을 모으고 진공증발 건조시키면 0.92그람의 조생성분말을 수득한다.

조생성분말을 소량의 물에 녹이고 앰버라이트 CG-50(H-타입)을 사용하는 컬럼크로마토그라피에 증류수로 용출시키고 항균작용을 갖는 활성획분을 모으고 농축시키고 동결 건조시킨다. 이 잔유물을 소량의 증류수에 녹이고 증류수를 사용하는 세파덱스 G 10(상품명)의 컬럼에 전개시킨다. 각 획분의 항균작용을 검사하고 유효획분을 전술한 바와 같이 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 박층크로마토그라피시킨다. 이때 Rf 0.38을 나타내는 획분을 모으고 농축시키고 동결건조시키면 75밀리그람의 백색 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산(IV)이 수득된다.

[실시예 8]

가) 20그람의 글루코오즈, 4그람의 이수소인산칼륨, 1그람의 황산마그네슘, 2그람의 황산암모늄, 0.5그람의 염화칼슘, 0.1그람의 붕산, 0.04그람의 암모늄몰리브데이트, 0.04그람의 황산망간, 0.04그람의 황산아연, 0.045그람의 황산등, 0.025그람의 황산제일철 20마이크로그람의 바이오틴, 2밀리그람의 염산티아민, 1그람의 DL-매티오닌, 1,000밀리리터의 물을 포함하는 6.0의 배지를 500밀리리터의 삼각플라스크에 각각 100밀리리터씩 가하고 통상의 방법으로 멸균시키고 각 배지를 트리고놉시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis) IFO 00755균주를 접종시키고 30℃에서 72시간동안 진탕 배양시킨다.

배양이 완전히 된 후 약 1,000밀리리터의 배양육즙을 모으고 4℃에서 30분동안 2,000r.p.m으로 이 육즙을 원심 분리시키고 균사체를 모으고 500밀리리터의 0.1M 인산염 완충용액(pH 8.1)으로 현탁시키면 균사체 현탁액이 생긴다. 균사체 현탁액에 5밀리리터의 트리톤 X-100 (상품명)을 가하고 이 혼합물을 37℃에서 20 내지 40분간 진탕시켜 균사체를 활성화시킨다. 진탕된 혼합물을 4℃에서 2,000r.p.m으로 30분간 원심 분리시키고 활성화된 균사체를 모으고 pH 7 내지 8의 인산염 완충액으로 두 번 세척하고 pH 8.1의 0.1M의 피로인산염 완충액 100 내지 200밀리리터로 재현탁시키면 활성화된 균사체의 현탁액이 된다.

나) 0.026% 나트륨 아자이드를 포함하는 pH 8.1의 0.1M 피로인산염 완충액 10밀리리터에 54.4밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 녹이고 여기에 0.5밀리리터의 활성화된 균사체 현탁액을 가하고 이 혼합물을 33℃의 수욕상에서 공기를 접촉시키며 교반한다. 반응계는 반응의 완전을 측정하기 위해서 매 30분마다 히타찌 고속액체크로마토그라피 기구(워터즈주식회사제품 μ본다펙 C₁₈을 사용, 용매계 아세토니트릴 : 0.1% 초산(1 : 9 체적비)를 사용해서 검사한다. 즉 출발물질 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산의 보지시간은 1분 53초이며 7-(4-카복시부틸아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H1테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산은 D-아미노산 산화에 의해 전환되는 보지시간은 4분 54초이었다.

반응이 끝난 후 균사체를 원심분리하고 상등액을 분리하고 다시 회수하고 묽은 염산 수용액으로 pH 1.5내지 2.0으로 맞추고 에틸아세테이트를 같은 양으로 4회 추출한다. 에틸아세테이트 추출액을 수집하고 다시 pH 6.0의 인산염 완충액으로 재추출한다. 인산염 용액을 묽은 염산으로 pH 1.5 내지 2.0으로 맞추고 다시 에틸아세테이트를 같은 양으로 4회 추출한다. 에틸아세테이트 추출액을 합하고 무수황산나트륨으로 탈수시키고 증발건고시킨다. 이 생성물을 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 미세입자 셀루로오즈(아비셀, 상품명)상 컬럼 크로마토그라피시키고 상기 용매로 분류시킨다. 프로테우수미라빌리스(Proteus mirabilis)에 대한 각 획분의 항균작용을 검사하고 항균작용을 갖는 획분을 분리하고 아비셀 에스 에프(상품명)의 박층 플레이트에 점적하고 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9, 체적비)와 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2)의 혼합용매로 전개시킨다.

그런후 마나슬루라이트의 2536Å의 자외선 흡수를 나타내는 획분과 Rf 0.81과 Rf 0.64를 나타내는 획분을 각각 수집하고 농축하고 동결 건조시키면 35밀리그람의 순수한 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-카복실산을 얻는다. 이 물질은 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)살모넬라 가리나룸(Salmonella gallinarum) 및 이. 콜라이(E. coli)에 대해 항균작용을 나타낸다.

[실시예 9]

0.026% 나트륨 아자이드를 포함하는 pH 8.1의 0.1M 피로인산염 용액 10밀리리터에 50밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 녹이고 이 용액에 0.5밀리리터의 실시예 8에서 같은 방법으로 만들어진 트리고놉시스 바리아빌리스(Triqonopsis variabilis) IFO 0775의 활성화된 균사체 현탁액을 가한다.

이 혼합물을 33℃의 수욕상에서 공기접촉하 교반하여 D-아미노산 산화로 만들고 이 반응도는 실시예 8에서와 같은 고속 액체크로마토그라피에 의해 정해진다. 출발물질 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산의 보지시간은 2분 55초이고 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산(D-아미노산 산화에 의해 형성됨)의 보지시간은 11분 18초이다.

반응이 끝난 후 이 균사체를 4℃에서 제거하고 상응액을 회수하고 묽은 염산용액으로 pH 1.5 내지 2.0으로 맞추고 같은 양의 에틸아세테이트로 4회 추출한다. 에틸아세테이트추출액을 합하고 pH 6의 인산염 완충액으로 추출한다. 이 인산염 용액을 pH 1.5 내지 2.0으로 맞추고 다시 같은 양의 에틸아세테이트로 4회 추출한다. 에틸아세테이트추출액을 모으고 무수황산 나트륨으로 탈수시키고 진공증발 건조시킨다.

n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)의 혼합용매를 사용하는 미세입자셀루로오즈9아비셀, 상품명) 상의 컬럼을 사용하여 잔유 생성물을 상기 조성을 갖는 용매로 전개시킨다. 프로테우스 미라빌리스(Proteusmirabilis)에 항균작용을 나타내는 획분을 선택하고 아비셀 에스 에프의 박층 플레이트상 점적하고 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9, 체적비)와 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)의 혼합용매로 각각 전개시킨다.

그런 후 마타슬루 라이트 2536Å(마나슬루 카가쿠 코교 케. 케 제작)에 자외선흡수를 나타내는 획분과 Rf 0.82와 Rf 0.77를 나타내는 획분을 각각 모으고 농축시키고 동결 건조시키면 32밀리그람의 순수한 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 얻는다. 이 물질을 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 살모넬라 카리나룸(Soalmonellagallinarum) 및 이. 콜라이(E. coli)에 대해 항균작용을 나타낸다.

[실시예 10]

0.026% 아자이드 나트륨을 포함하는 pH 8.1의 0.1M 피로인산염 완충액 10밀리리터에 50밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-3-(5-카복시메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산을 녹이고 여기에 0.5밀리리터의 실시예 8에서 만든 활성화된 균사체f 현탁액을 가한 후 이 혼합물을 33℃의 수욕상에서 공기 접촉하 교반하면 D-아미노산 산화를 수행한다. 반응도는 실시예 8에서와 같이 히다찌 고속 액체 크로마토그라피 기구로 매 30분마다 검사한다. 출발물질 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-3-(5-카복시메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산의 보지시간은 3분 14초이고 D-아미노산 산화효소의 작용에 의해 형성된 7-(4-카복시부티르아미도)-3-(5-카복시메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산의 보지시간은 13분 24초이다. 반응이 끝난 후 균사체를 4℃에서 원심분리에 의해 제거시키고 상등액을 회수하고 묽은 염산으로 pH 1.5 내지 2.0으로 맞추고 다시 동량의 에틸 아세테이트로 4회 추출한다. 에틸 아세테이트 추출물을 모으고 무수황산 마그네슘으로 탈수시키고 진공 증발 건조시킨다.

잔유물을 n-부탄올 : 초산 : 물(4: 1 : 2, 체적비의 혼합용매를 사용하는 미세입자 셀루로오즈(아비셀, 상품명)상 컬럼 크로마토그라피 한다. 각 획분의 항균작용을 검사하고 프로테우스 미라빌리스에 항균작용을 갖는 획분을 선택하고 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9 체적비)의 혼합용매와 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)의 혼합용매로 각각 전개시킨다. 마나슬루라이트 2536Å에 자외선 흡수를 나타내는 획분과 Rf 0.79와 0.72를 나타내는 획분을 각각 모으고 농축시키고 동결 건조시키면 30밀리그람의 순수한 7-(4-카복시부티르아미도)-3-(5-카복시 메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산을 수득한다. 이 물질은 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 살모넬라 가리나룸(Salmonella gallinarum) 및 이. 콜라이(E. Choi)에 대해 항균작용을 나타낸다.

[실시예 11]

가) 1% 전분, 1% 글루코오즈, 1.5% 콩가루, 0.5% 이스트 추출물, 0.1% 일수소인산칼륨, 0.05% 황산마그네슘, 0.3% 염화나트륨을 포함하는 배지를 500밀리리터 사가구찌 플라스크에 100밀리리터씩 각각 넣고 120℃에서 20분동안 멸균시킨다. 각 배지를 스트렙토마이세스 오가노넨시스 균주로 접종시키고 30℃에서 48시간동안 배양시킨다. 다른 배양배지를 2리터 사가구찌 플라스크에 400밀리터씩 넣고 120℃에서 20분간 멸균시킨 다음 상기에서 만든 2 내지 3% 배양육즙으로 접종하고 30℃에서 24시간동안 배양하여 접종용 배양지를 만든다.

따로, 7% 전분, 2% 글루텐가루, 2% 콩가루, 0.8% 글리세롤, 0.1% 카사미노산, 0.1% 황산 제이철 55그람의 수산화나트륨을 포함하는 배지 60리터를 100밀리리터의 발효관에 10밀리리터의 아데카놀(상품명)과 함께 가한다음 120℃에서 30분간 멸균시키고 상기 방법에 따라 만든 접종용 배지 800밀리리터의 접종시키고 30℃에서 24시간동안 배양시킨다. 수산화나트륨 수용액으로 만든 5-멜캅토-1-메틸-1H-테트라졸의 용액을 고압에서 멸균시키고 배양육즙에 가해 테트라졸의 농도를 0.05%로 만든다. 90시간동안 배양시킨다.

배양이 완전히 된 후 배양육즙을 pH 2.0으로 맞추고 라디오라이트(상품명)을 교반하여 혼합한다. 이 혼합물을 고압여과기로 여과하고 이 여액을 합하면 100마이크로그람/밀리리터의 7-(5-아미노-5-카복시바레르 아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 포함하는 여액혼합물을 100리터를 얻는다.

나) 이 여액을 pH 3.0으로 맞추고 12리터 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼을 통해 통과시키고 이 컬럼을 30리터의 물로 세척하고 30리터의 50% 아세톤 수용액으로 용출시킨다. 이 용출액을 농축시켜 5.5리터로 만들고 이 농축액을 수산화 나트륨수용액을 사용하여 pH 7.5로 맞춘다. 형성된 불용물을 제거한 후 실시예 8가)에서 제조된 트리고놉시스 바리아빌리스(Trigonopsis Variabilis) iro 0755균주의 활균사체 현탁액 320밀리리터를 용액에 가한다. 이 혼합물을 공기접촉하 4시간 동안 교반하고 염수산용애으로 pH 1.5 내지 2.0으로 맞추고 각각 같은 양의 에틸 아세테이트로 4회 추출한다.

에틸아세테이트 추출액을 모으로 20리터의 에틸아세테이트 추출액을 pH 6.0의 인산염완충액 2리터로 재추출한다. 인산염 용액을 pH 1.5 내지 2.0, 로 맞추고(염산수용액으로), 각각 동량의 에틸아세테이트로 4회 추출한다. 에틸아세테이트 여액을 합하고 이렇게 수득된 8리터의 추출물을 진공 증발시키면 약 15그람의 조생성물질이 얻어진다. 이 물질을 실시예 8 나)와 같은 방법으로 셀루로오즈 분말을 사용하여 컬럼 크로마토그라피 하면 6.1그람의 백색 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산이 수득된다.

[실시예 12]

50그람의 글루코오즈, 10그람의 펩톤, 1그람의 이수소인산칼륨, 0.5그람의 황산마그네슘, 10그람의 맥아추출물, 1그람의 DL-메티오닌 및 pH 6.0의 물 1,000밀리리터를 함유하는 배지를 트리고놉시스 바리아빌리스 IFO 0755 균주로 접종시키고 실시예 8 가)와 같이 배양시키고 이렇게 형성된 배양육즙 1,000밀리리터를 모은다. 1,000밀리리터의 배양육즙을 4℃에서 2,000r.p.m으로 원심분리하고 형성된 균사체를 모은다.

이 균사체를 pH8.1의 0.1M 피로소포린염 완충액 200 밀리리터에 현탁시키고 현탁된 균사체를 500밀리리터 삼각플라스크에 50밀리리터씩 넣는다. 이 현탁액에 5밀리리터씩의 톨루엔을 가한 후 37℃에서 1시간동안 활성화시킨다. 그런후 활성화된 균사체를 2,000r.p.m에서 30분간 원심분리하고 pH8.1의 0.1M 피로인산 완충액 200밀리리터로 원심분리 세척한다.

활성화된 균사체를 다시 pH 8.1의 0.1M 피로인산염 완충액 200밀리리터로 다시 현탁시키고 이 현탁액 50℃의 수욕상에서 교반시켜 카타라제 활성을 불활성시킨다. 그런후 5밀리리터의 활성화된 균사체현탁액을 100밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르 아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 0.1M 피로인산 20밀리리터에 녹인 용액에 가한다. 33℃에서 공기 접촉하 5시간동안 이 혼합물로 교반한 후 이 혼합물을 실시예 8 나)와 같이 처리하면 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 얻는다.

[실시예 13]

실시예 5 가) 같은 방법으로 트리고늄시스 바리아빌리스로부터 수득된 균사체를 1시간 이상 20℃에서 얼리고 실온에서 녹을 때까지 방치한 다음 pH 8.1의 0.1M 피로인산염 용액 200밀리리터에 현탁시킨다. 그런후 5밀리리터의 현탁액을 100밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르 아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 0.026% 나트륨 아자이드를 포함하는 pH 8.1의 0.1M 피로인산염 완충액 20밀리리터에 녹인 용액에 가한다. 이 혼합물을 33℃에서 공기 접촉하 5시간 동안 교반한 후 이 혼합물을 실시예 8 가)의 방법에 따라 처리하면 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 수득한다.

[실시예 14]

50밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-3-(3-P-하이드록시페닐-2-메톡시프로페노일)옥시메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산을 0.026% 아자이드 나트륨을 포함하는 pH 8.1의 0.1M 피로인산염 완충액 10밀리리터에 녹인 용액에 실시예 8 가)와 같은 방법으로 트리고놉시스 바리아빌리스로부터 수득된 활성균사체 현탁액 0.5밀리리터를 가한 다음 이 혼합물을 실시예 8 나)의 방법과 같이 처리하면 7-(4-카복시부티르아미도)-3-(3-P-하이드록시 페닐-2-메톡시프로페노일)옥시메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산을 수득한다.

수득된 획분을 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9, 체적비)의 혼합용매와 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)이 혼합용매를 사용하여 아비셀(상품명)의 박층크로마토그라피시킨 다음 Rf 0.67과 Rf 0.67을 각각 나타내는 획분을 모은다. 이 획분은 고속 액체크로마토그라피(워터즈 주식회사 제품 μ본다팩 C₁₈을 사용 용매계는 아세토니트릴 : 0.1% 초산수용액(2 : 8, 체적비)에 5분 55초의 보지시간을 나타낸다. 이 생성물은 닌히드린 반응에 음성을 나타낸다.

[실시예 15]

가) 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산의 제조

1% 전분, 1% 글루코오즈, 1.5% 콩가루, 0.5% 효소 추출물, 0.1% 일수소 인산칼륨, 0.05% 황산마그네슘, 0.3% 염화나트륨을 포함하는 배지를 500밀리리터 사가구찌 플라스크에 각각 100밀리리터씩 넣고 각 배지를 120℃에서 20분동안 멸균시킨다. 이 멸균배지에 스트렙토마이세스 오가노넨시스 Y-G 19Z를 접종하고 30℃에서 48시간동안 배양시킨다.

상기같이 제조된 또 다른 배지를 2리터 사가구찌 플라스크에 400밀리터씩 가하고 120℃에서 20분간 멸균시킨 후 이 배지에서 상기 방법과 같이 2 내지 3% 배양육즙을 접종하고 30℃에서 24시간동안 배양시켜 접종용 배양지를 만든다.

별도로 7% 전분, 2% 글루텐가루, 2% 콩가루, 0.8% 글리세롤, 0.5% 카사미노산, 0.1% 황산 제2철 55그람의 수산화나트륨을 포함하는 배지 60리터를 100밀리리터의 발효관에 10밀리리터의 아데카놀(상품명)을 소포제로 함께 가한다. 각각의 배지를 120℃에서 30분간 멸균시키고 상기 방법에서 제조된 접종용 배지 800밀리리터의 접종시킨다. 그런후 각각 발효관에 수산화나트륨 수용액으로 만들어진 1-메틸-5-멜캅토-1H테트라졸의 용액을 가한 다음 고압에서 멸균시켜 포함물이 0.05% 되게 배양된 육즙을 90시간 동안 더 배양시킨다.

배양이 끝난 후 배양육즙을 pH 2.0으로 맞추고 라디오라이트(상품명)로 교반하여 혼합한다. 이 혼합물을 고압여과기로 여과하고 이 여액을 합하면 100리터의 혼합여액을 얻게 된다. 이 혼합물을 수산화나트륨수용액을 가해 pH 3.0으로 맞추고 12리터의 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼을 통해 통과시키고 이 컬럼을 30리터의 물로 세척하고 50% 아세톤 수용액으로 용출시킨다. 이 용출액을 농축시켜 5.5리터로 만들고 이농축물을 묽은 염산액을 pH 3.5로 맞춘다음 3리터의 앰버라이트 IRA-68(Cl-타입)(상품명) 컬럼을 통해 통과시키고 이 컬럼을 6리터의 물로 세척하고 1N 질산나트륨과 0.1M 초산나트륨을 포함하는 수용액(pH 7.2)으로 용출시키면 항균활성물질을 포함하는 용액 5리터를 얻는다. 이 용액을 pH 3.0으로 맞추고 1리터의 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼을 통해 통과시키고 이 컬럼을 물로 세척하고 50% 아세톤 수용액을 용출시키면 항균 활성물질을 포함하는 수용액 약 400밀리리터를 얻으며 이를 동결건조시키면 액 54그람의 조생성분말을 수득한다. 이 조생성분말을 소량의 0.5M 브롬화 암모늄-초산으로 채원진 DEAE 세파덱스 A-25(초산타입)약 800밀리리터로 컬럼크로마토그라피하여 유효획분을 분류한다. 이렇게 수득된 항균활성획분을 500밀리리터의 앰버라이트 XAD-2(상품명)컬럼을 통해 통과시키고 이 컬럼을 물로 세척하고 25% 아세톤 수용액으로 용출시킨다. 이 용출액을 감압 증발 건조시킨다. 건조 생성물을 이소프로판올 : 물(7 : 3)의 혼합용매로 미세입자 셀루로오즈(아비셀, 상품명)을 사용하여 컬럼크로마토 그라피시킨다. 이때 항균작용을 나타내는 획분을 아비셀 에스에프의 박층 프레이트에 점적하고 n-부탄올 : 초산 : 물(6 : 1.5 : 2.5, 체적비)의 혼합용매로 전개시키고, 0.25%의 닌히드린 피리딘용액으로 분무하고 가열하여 발색시킨다. Rf 0.31을 나타내는 획분을 모으고 약 45 내지 50℃에서 진공증발 건고시키고 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 미세입자 셀루로오즈(아비셀, 상품명)상 컬럼 크로마토그라피시킨다. 항균활성획분을 선택하고 상기와 같은 방법으로 아비셀 에스 에프(상품명)상에 박층크로마토그라피 시킨다. Rf 0.39를 나타내는 획분을 모으고 진공증발 건조시킨다.

건조된 생성물을 n-부탄올 : 초산 : 물(6 : 1.5 : 2.5, 체적비)의 혼합용매를 사용하는 미세입자 셀루로오즈상 컬럼크로마토그라피시키면 유효성분을 정제한다. 정제된 활성성분을 농축 건고시키고 소량의 증류수에 녹인 후 증류수를 사용하는 세파덱스 G10(상품명)상 컬럼크로마토 그라피시킨다. 각 획분의 항균작용을 검사하고 유효성분을 선택하고 n-부탄올 : 초산 : 물(6 : 1.5 : 2.5, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 전술한 바와 같이 박층크로마토 그라피시키고 Rf 0.31을 나타내면 획분을 모으고 농축시킨 후 동결건조시키면 60밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산이 얻어진다.

나) 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산의 제조방법

0.02% 아자이드 나트륨을 포함하는 pH 8.1의 0.1M 피로인산 완충액 10미릴리터에 54.4밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-5-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 녹이고 실시예 8 가)에서와 같은 방법으로 제조된 활성화된 균사체 0.5밀리리터에 가한후, 이 혼합물을 33℃의 수욕상에 공기접촉하 교반한다. 반응도를 히타찌 고속 액체 크로마토그라피로 매 30분마다 검사한다.

7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일)티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산의 보지시간은 1분 53초이었고 D-아미노산 산화에 의해 수득된 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산의 보지시간은 4분 54초이었다. 반응이 끝난 후 1.5 내지 2.0으로 맞추고 동량의 에틸 아세테이트로 4회 추출한다.

에틸 아세테이트 추출액을 합하고 pH 6.0의 인산염 완충액으로 재추출한다. 인산염 완충액을 묽은 염산으로 pH 1.5 내지 2.0으로 맞추고 다시 에틸아세테이트로 4회 추출한다. 에틸아세테이트 추출액을 합하고 무수황산 나트륨으로 탈수시키고 진공증발 건조시킨다. 건조된 생성물을 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 미세입자 셀루로오즈(아비셀, 상품명)상 컬럼 크로마토 그라피시킨다. 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabbilis)에 대해 항균작용을 갖는 획분을 검사하고 항균작용을 갖는 획분을 선택하고 아비셀 에스에프(상품명)의 박층플레이트에 점적하고 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9, 체적비)의 혼합용매와 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)의 혼합용매로 전개시키면 마나슬루 라이트 2536Å9마나슬루 카가쿠 고교 케. 케)에 자외선 흡수를 나타내는 획분과 Rf 0.84와 Rf 0.64를 각각 나타내는 획분을 몬은다. 이 획분을 합하고 농축하고 동결건조시키면 35밀리그람 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 수득한다. 이렇게 생성된 물질을 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 살로넬라 가리나룸(Salmonella gallinarum) 및 이. 콜라이(E. Coli)에 항균작용을 나타낸다.

또한, 다음의 참조 실시예 가), 나타낸 방법에 의해 본 실시예에서 수득한 생성물로부터 유도된 메틸에스테르화합물은 아래 나타낸 참조 실시예 나) 합성방법에 의해 생성된 상응화합물과 구조적으로 완전히 일치한다.

참조 실시예 가) :

10밀리리터의 클로로포름에 100밀리그람의 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 현탁시키고 1% 디아조메탄 에테르 용액 4밀리리터를 상기 현탁액에 가한 후 이 혼합물을 실온에서 30분간 교반한다. 수득된 반응혼합물을 묽은 초산으로 세척하고 무수황산마그네슘으로 탈수시키고 감압하 농축시킨다.

수득된 잔유물을 실리카겔 컬럼을 사용하여 컬럼크로마토그라피 하고 벤젠 : 에틸아세테이트(1 : 3, 체적비)의 혼합용매로 용출시킨다. 목적하는 획분을 모으고 감압하 농축시키면 80밀리그람의 7-메톡시-7-(4-메톡시카보닐부티르 아미도)-3-(1-메틸-1H, 테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실레이트를 수득한다.

I.R. 흡수 스펙트럼 :

참조 실시예 나) :

30밀리리터의 에틸아세테이트가 50밀리리터의 메탄올의 혼합물에 1.0그람의 디페닐메틸 7β-(3,5-디-4급-부틸-4-하이드록시벤질리덴아미노)-7α-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오-메틸-Δ³-세펨-4-카복실레이트와 1.8그람의 길라드 시약을 가하고 이 혼합물을 실온에서 30분간 교반한다. 반응이 끝난 후 반응혼합물을 감압하 농축시키고 생성된 잔유물을 50밀리리터의 에틸 아세테이트에 녹이고 물 20밀리리터씩 3회 세척한다. 유기용매층을 회수하고 무수 황산마그네슘상에서 탈수시키고 용매를 감압하 증류시키면 0.6그람의 조생성 디페닐메틸 7β-아미노-7α-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실레이트를 얻는다.

이 생성물을 10밀리리터의 클로로포름에 녹이고 -20℃ 내지 -30℃까지 냉각시킨 다음 0.6그람의 메틸-클로로-포르밀 부티레이트를 교반하면서 점적 가한다. 이 혼합물을 갖는 온도에서 1시간 더 교반한다.

이 반응혼합물을 20밀리리터의 클로로포름으로 혼합하고 이 혼합물을 10밀리리터의 1N 염산으로 세척한 후 10밀리리터의 물로 세척한다. 유기용매층을 회수하고 무수황산마그네슘 상에서 탈수시킨다. 이 용매를 감압하 증류시키고 형성된 잔유물을 실리카겔상 크로마토그라피 한다. 그런 다음 이 컬럼을 벤젠 : 에틸아세테이트(3 : 1, 체적비)의 혼합용매로 용출하고 벤젠 : 이틸아세테이트(1 : 3, 체적비)의 혼합용매로 용출하면 500밀리그람의 순수한 7α-메톡시-7β-(4-메톡시카보닐 부티르아미도)-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실레이트를 수득한다. 이의 특성은 아래와 같다.

N.M.R. 스펙트럼(CDCl₃) :

(나) 삼불화초산 : 아니솔(4 : 1, 체적비)의 혼합용매 4밀리리터에 400밀리그람의 디페닐메틸 7α-메톡시-7β-(4-메톡시 카보닐부티르아미도)-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실레이트 -10℃ 내지 -20℃에서 녹이고 이 혼합물을 같은 온도에서 30분간 교반한다. 반응이 끝난 후 용매를 갑압하 증류하여 제거하고 잔류물에 에테르를 가한다. 여기서 7α-메톡시-7β-(4-메톡시카보닐 부티르아미도)-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산이 침전된다. 이를 여과해서 모으고 10밀리리터의 클로로포름에 현탁시킨다. 이 현탁액을 1% 디아조 메탄에테르 0.4밀리리터와 10 내지 20℃에서 합한다. 이 반응혼합물을 묽은 초산수용액으로 세척하고 물로 세척한후 무수황산마그네슘으로 탈수시킨다.

그런후 용매를 감압하 증류하여 제거하고 형성된 잔유물을 실리카겔상 컬럼 크로마토 그라피시킨다. 이 컬럼을 벤젠 : 에틸 아세테이트(1 : 3, 체적비)의 혼합용매로 용출시키고 목적하는 획분을 모으고 갑암하 농축시키면 150밀리그람의 메틸 7α-메톡시-7β-(4-메톡시카보닐 부티르아미도)-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실레이트를 수득하며 이의 특성은 아래와 같다.

I.R. 스펙트럼 :

[실시예 16]

가) 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(5-메톡시-1,3,4-테아디아졸-2-일)티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산의 제조방법.

1% 전분, 1% 글루코오즈, 1.5% 콩가루, 0.5% 효소추출물, 1% 일수소인산칼륨, 0.05% 황산마그네슘, 0.3% 염화나트륨을 포함하는 배지를 500밀리리터 사가구찌 플라스크에 각각 100밀리리터씩 가하고 각 배지를 120℃에서 20분동안 멸균시킨다.

이 배지에 스트렙토마이세스 오가노넨시스(Streptomyces Oganonensis) Y-G 19z를 접종하고 30℃에서 48시간동안 배양시킨다.

또 다른 배지를 2리터 사가구찌 플라스크에 각각 400밀리터씩 넣고 120℃에서 20분간 멸균시키고 상기 방법에 의해 제조된 2 내지 3% 배양육즙을 접종하고 30℃에서 24시간동안 배양하여 접종용 배양을 만든다.

별도로, 7% 전분, 2% 글루텐가루, 2% 콩가루, 0.8% 글리세롤, 0.1% 카사미노산, 0.01% 황산제2철 55그람의 수산화나트륨을 포함하는 배지 60리터를 100리터의 발효관에 10밀리리터의 아데카놀(상품명)과 함께 넣고 120℃에서 30분간 멸균시킨 다음 상기 방법에서 제조된 접종용 배지 800밀리리터의 접종시키고 30℃에서 24시간 배양시킨다. 각 배양관에 2-멜캅토-5-메틸-1,3,4-티아디아졸(수산화나트륨 수용액으로 만든) 용액을 가하고 고압에서 멸균시켜 이의 함유를 0.05%의 배양 육즙으로 만들고 90시간 동안 더 배양시킨다.

배양이 완전히 끝난 후 배양육즙을 pH 2.0으로 맞추고 라디오라이트(상품명)로 교반하여 가한다. 이 혼합물을 고압여과기를 통해 여과시키기 이 여액을 합하면 100리터의 혼합여액이 된다. 이 요액을 수산화나트륨 수용액을 가해 pH 3.0으로 맞추고 12리터의 앰버라이트 XAD-2(상품명)에 흡착시키고, 이 컬럼을 30리터의 물로 세척하고 3-리터의 50% 아세톤 수용액으로 용출시킨다. 이 용출액을 농축시켜 5.5리터로 만들고 묽은 염산수용액으로 pH 3.5로 맞추고 3리터의 앰버라이트 IRA-68(Cl-타입)(상품명) 컬럼에 흡착시킨다. 이 컬럼을 6리터의 물로 세척하고 1M 질산나트륨과 0.1M 초산나트륨을 포함하는 수용액(pH 7.2)으로 용출시키면 항균작용을 갖는 활성물질을 포함하는 용액 5리터를 얻는다. 이 용액을 pH 3.0으로 맞추고 1리터의 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼에 흡착시키고 이 컬럼을 물로 세척하고 50% 아세톤 수용액을 용출시키면 항균작용을 갖는 물질을 포함하는 수용액 약 400밀리리터를 얻는다. 이를 동결 건조시킨다.

이 생성물 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 미세입자 셀루로오즈(아비셀, 상푸명)상 컬럼크로마토그라피 시킨다음 수득된 항균활성획분을 아비셀 에스에프(상품명)상의 플레이트에 점적하고 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9, 체적비)의 혼합용매로 전개시키고 0.25% 니히드린 피리딘 용액으로 분무하고 가열하여 발색시킨다. Rf 0.43을 나타내는 획분을 모으고 진공하 45 내지 50℃에서 증발 건조시킨 다음 수득된 생성물을 아세토나트릴 : 물(7 : 3, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 미세결정 셀루로오즈(아비셀, 상품명)상 컬럼크로마토 그라피시킨다. 이렇게 수득된 항균활성물질을 상기 방법과 같이 아비셀 에스 에프상 박층 크로마토그라피하고 Rf 0.43의 획분을 모으고 감압하 증발 건조시키면 0.78그람의 조생성분말을 얻는다.

이 생성물을 소량의물에 녹이고 증류수를 사용하는 세파덱스 G10(상품명)상 전개시킨다. 각 획분의 항균작용을 검사하고 유효성분을 전술한 방법과 같이 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 박층크로마토그라피 시킨다. 이때 Rf 0.43을 나타내는 획분을 모으고 농축하고 동결건조시키면 82밀리그람의 백색 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(5-메톡시-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 얻는다.

나) 7-(4-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산의 제조

0.026% 아자이드 나트륨을 포함하는 pH 8.1의 0.1M 피로인산염 완충욕 10밀리리터에 50밀리리터의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 녹이고 실시예 8 가)와 같이 트리고놉시스 바리아빌리스 IFO 0755를 사용하여 제조된 활성화된 균사체 현탁액 0.5밀리리터를 이 용액을 가한다음 이 혼합물을 33℃의 수욕상에서 공기 접촉하 교반하면 D-아미노산 산화가 일어난다. 반응도는 실시예 8 나)에서와 같이 고속액체 크로마토그라피시켜 결정한다. 출발물질 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산의 보지시간은 2분 55초이었으며 D-아미노산 산화에 의해 제조된 7-(4-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산의 보지시간은 11분 18초이다. 반응이 끝난 후 균사체를 4℃에서 원심분리하여 제거하고 상등액을 수집하고 묽은 염산용액으로 pH를 1.5 내지 2.0으로 맞춘 다음 등량의 에틸아세테이트로 4회 추출한다.

에틸아세테이트 추출액을 합하고 pH 6.0 인산염 완충액으로 재추출한다. 인산염 용액을 pH 1.5내지 2.0으로 맞추고 등량의 에틸아세테이트로 4회 추출한다. 에틸아세테이트 추출액을 합하고 무수황산마그네슘상에서 탈수시키고 증발건조시킨다. 이 생성물을 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 미세결정 셀루로오즈9아비셀, 상품명)상 컬럼크로마토그라피시킨다. 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)에 항균작용을 나타내는 획분을 선택하고 아비셀 에스에프(상품명)의 박층 플레이트에 점적하고 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3: 7: 9, 체적비)의 혼합용매와 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비) 혼합용매로 전개시키고 마나술르 라이트 2536Å(마나슬루카가쿠 코교 케 케제작)에 자외선 흡수를 나타내는 획분과 Rf 0.82와 0.77을 나타내는 획분을 각각 모은다.

이 획분을 농축하고 동결건조시키면 32밀리그람의 순수한 7-(4-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산이 수득된다. 이 물질은 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 살모넬라 가리나룸(Salmonella gallinarum), 및 이 콜라이(E. coli)이 항균 활성을 나타낸다.

[실시예 17]

7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-3-(5-카복시메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-7-메틸-Δ³-세펨-4-카복실산의 제조

1% 전분, 1% 글루코오즈, 1.5% 콩가루, 0.5% 효소추출물, 0.1% 일수소인산칼륨, 0.05% 황산마그네슘, 0.3% 염화나트륨을 포함하는 배지를 500밀리리터 사가구찌 플라스크에 각각 100밀리리터씩 낳고 120℃에서 20분동안 멸균시킨다.

각 배지를 스트렙토 오가노넨시스 Y-G 19Z를 접종하고 48시간동안 배양시킨다. 또 다른 전술한 배지를 2,000밀리리터 사가구찌 플라스크에 400밀리터씩 넣고 각 배지를 120℃에서 20분간 멸균시킨 다음 상기 방법에 따라 제조된 2 내지 3% 배양육즙을 접종시키고 30℃에서 24시간동안 배양시켜 접종용 배양을 만든다.

별도로, 7% 전분, 2% 글루텐가루, 2% 콩가루, 0.8% 글리세롤, 0.1% 카사미노산, 0.01% 황산제2철 55그람의 수산화나트륨을 포함하는 배지 60리터를 100리터의 발효관에 10밀리리터의 아데카놀(상품명)을 소포제로 함께 넣는다. 각 배지를 120℃에서 30분간 멸균시키고 800밀리리터의 접종용 배지를 접종하고 30℃에서 24시간 배양시킨다.

그런 다음 각 발효관에 비스(5-카복시메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일)디설파이드의 용액(디설파이드를 메탄올을 포함하는 물에 녹여 만든다)을 가하고 밀리포어 여과기를 사용해 멸균여과시켜 배양육즙의 0.05%가 되게하고 90시간동안 배양시킨다.

배양이 끝난 후 배양육즙을 pH 2.0으로 만들고 라디오라이트(상품명)으로 혼합한다. 이 혼합물을 고압여과기로 여과하고 이 여액을 합하면 100리터의 혼합여액이 된다. 이 여액을 수산화나트륨을 가해 pH 3.0으로 맞추고 12리터의 앰버라이트 XAD-2(상품명)컬럼으로 흡착하고, 이 컬럼을 30리터의 물로 세척하고 30리터의 50% 아세톤 수용액으로 액출한다. 이 용출액을 농축시켜 5.5리터로 만들고 형성된 불용물 제거하고 농축시켜 10리터의 용액으로 만든다. 이 용액을 pH 3.5로 맞추고 (묽은 염산으로), 3리터의 IRA-68(Cl-타입)(상품명) 컬럼을 통해 통과시키고 이 컬럼을 물로 세척하고 1M 질산나트륨과 0.1M 초산나트륨을 포함하는 수용액(pH 7.2)으로 용출시키면 항균작용을 갖는 활성물질을 포함하는 용액 5리터를 얻는다. 이 용액을 pH 3.0으로 맞추고 1리터의 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼에 흡착시키고 물로 세척한 후 50% 아세톤 수용액을 용출시키면 항균활성물질을 포함하는 수용액 약 400밀리리터를 얻는다. 이 수용액을 동결 건조시키면 약 23그람의 조생성분말을 수득한다.

그런후 23그람의조생성분말을 소량의 0.5M브롬화암모늄-초산 완충용액을 넣은 DEAE-세파덱스 A-25(초산타입) 800밀리리터상 컬럼크로마토그라피시켜 유효성분을 선택한다. 항균적으로 활성인 성분을 모으고 500밀리리터의 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼에 흡착시키고 이 컬럼을 물로 세척한 후 25%아세톤 수용액으로 용출한다. 이 용출액을 감압증발 건고시킨다.

이 생성물 이소프로판올 : 물(7 : 3, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 미세결정 셀루로오즈(아비셀, 상품명)상 컬럼크로마트그라피하여 항균활성 획분을 모은다. 이 획분을 아비셀 에스 에프(상품명)의 박층 플레이트에 점적하고 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9, 체적비)의 용매로 전개시킨 다음 0.25% 닌히드린피리딘용액으로 분무하고 가열하여 발색시킨다.

그런다음 Rf 0.39를 나타내는 획분을 모으고 감압증발건조시키고 이소프로판올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9, 체적비)의 용매를 사용하여 미세결정 셀루로오즈9아비셀, 상품명)상 컬럼크로마토그라피시킨다. 항균 활성획분을 상기 조성의 용매를 사용하여 박층 크로마토그라피시키고 상기 기술한 방법과 같이 수행한다. Rf 0.39를 나타내는 획분을 모으고 진공증발 건조시킨다.

이 농축물을 n-부탄올 : 초산 : 물(6 : 1.5 : 2.5, 체적비)의 용액을 사용하여 미세입자 셀루로오즈(아비셀, 상품명)상 컬럼 크로마토그라피하여 정제한다. 정제된 활성성분을 진공증발건조시키고 소량의 증류수에 녹이고 증류수를 사용하여 세파덱스 G-10의 컬럼에 전개시킨다. 각 획분의 항균작용을 검사하고 유효획분을 n-부탄올 : 초산 : 물(6 :1.5 : 2.5, 체적비)의 용매를 사용하여 전술한 바와 같이 박층크로마토그라피시킨다. Rf 0.32를 나타내는 획분을 모으고 농축시키고 동결건조시키면 45밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-3-(5-카복시메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산을 얻는다.

나) 7-(4-카복시부티르아미도)-3-(5-카복시메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산의 제조

0.026% 나트륨 아자이드를 포함하는 pH 8.1의 0.1M 피로인산염 완충용액 5밀리리터에 25밀리리터의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-3-(5-카복시메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산(가)에서 제조)을 녹이고 실시예 8)가에서 제조된 활성 균사체 현탁액을 0.5밀리리터를 이 용액에 가한 후 33Å의 수욕상에서 공기접촉하 교반시켜 D-아미노산 산화를 시킨다. 반응도를 실시예 8가)에서와 같은 방법으로 고속액체 크로마토그라피기구를 사용해서 매 30분마다 검사하여 반응도를 측정한다. 즉 출발물질 7-(5-아미노-5-카복시바레르 아미도)-3-(5-카복시메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산의 보지시간은 3분 14초이었고 D-아미노산 산화에 의해 제조된 7-(4-카복시바레르아미도)-3-(5-카복시메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산의 보지시간은 13분 24초이었다.

반응이 끝난 후 균사체를 4℃에서 원심분리해서 제거하고 상등액을 회수하고 묽은 염산용액으로 pH를 1.5 내지 2.0으로 맞추고 동량의 에틸아세테이트로 4회 추출한다. 에틸아세테이트 추출액을 합하고 pH 6.0 인산염 완충액으로 재추출한다. 인산염 완충액을 묽은 염산용액으로 pH 1.5내지 2.0으로 맞추고 동량의 에틸아세테이트로 4회 추출한다. 에틸아세테이트 추출물을 모으고 무수황산마그네슘상에서 탈수시키고 진공하 증발 건조시킨다. 이 농축액을 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 미세결정 셀루로오즈(아비셀, 상품명)상 컬럼크로마토그라피시킨다. 각 획분의 항균작용을 검사하고 프로테우스 미라빌리스에 항균작용을 나타내는 획분을 아비셀 에스에프의 박층플레이트에 점적하고 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3: 7: 9, 체적비)의 혼합용매와 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비) 혼합용매를 사용해서 전개시키고 마나술루 2536Å에 자외선을 흡수하는 획분과 Rf 0.79와 Rf 0.72를 나타내는 획분을 모은다. 이 획분을 농축하고 동결건조시키면 16밀리그람의 순수한 7-(4-카복시바레르아미도)-3-(5-카복시메틸티오-1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-7-메톡시-Δ³-세펨-4-카복실산을 얻는다. 이 물질은 프로테우스 미라빌리스, 살모넬라 가리나룸, 및 이 콜라이에 항균작용을 나타낸다.

[실시예 18]

0.026% 나트륨 아자이드를 포함하는 pH 8.1의 0.1M 피로인산염 완충액 10밀리리터에 50밀리리터의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 녹이고 실시예 8)가와 같이 트리고놉시스 바리아빌리스를 사용하여 만든 활성화된 균사체 현탁액 0.5밀리리터를 여기에 가하고 이 혼합물을 33℃의 수욕상에서 공기접촉 하 교반시키면 D-아미노산 산화를 된다. 반응도는 실시예 8나)의 방법과 같이 고속액체 크로마토그라피기구로 결정한다. 출발물질 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산의 보지시간은 15분 56초이었고 D-아미노산 산화에 의해 형성된 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산의 보지시간은 5분 28초이었다. 반응이 끝난 후 균사체를 4℃에서 원심분리해서 제거하고 상등액을 회수하고 묽은 염산 수용액으로 pH를 1.5 내지 2.0으로 맞추고 동량의 에틸아세테이트로 4회 추출한다. 에틸아세테이트 추출액을 합하고 pH 6.0 인산염 완충액으로 재추출한다.

이 인산염 완충액을 동량 에틸아세테이트로 4회 추출하고 에틸아세테이트 추출물을 모으고 무수 황산마그네슘상 건조하고 진공하 증발 건조시킨다.

수득된 생성물을 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)을 사용하여 미세한 결정 의 셀루로오즈(아비셀, 상품명)상 컬럼크로마토그라피하여 프로테우스 미라빌리스에 항균작용을 나타내는 획분을 선택한다. 선택된 획분은 아비셀 에스 에프의 박층 플레이트상에 점적하고 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3: 7: 9, 체적비)의 혼합용매와 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비) 혼합용매를 사용해서 전개시킨다. 마나술루 2536Å에 자외선을 흡수하는 획분과 Rf 0.81와 Rf 0.65를 나타내는 획분을 모은다. 이 획분을 농축시키고 동결건조시키면 40밀리그람의 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 얻는다. 이 물질은 프로테우스 미라빌리스, 살모넬라 가리나룸 및 이 콜라이에 항균작용을 나타낸다.

[실시예 19]

가) 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산의 제조

1% 전분, 1% 글루코오즈, 1.5% 콩가루, 0.5% 효소추출물, 0.1% 일수소인산칼륨, 0.05% 황산마그네슘 및 0.3% 염화나트륨을 포함하는 배지를 500밀리리터 사가구찌 플라스크에 프라스크에 100밀리리터씩 가하고 120℃에서 20분동안 멸균시킨다.

그런 다음 각 배양배지를 스트렙토마이세스 오가노넨시스 Y-G 19Z를 접종하고 30℃에서 48시간동안 배양시킨다.

또 다른 전술한 배지를 2리터 사가구찌 플라스크에 각각 400밀리터씩 넣고 120℃에서 20분간 멸균시킨다. 그런다음 각 배지를 스트렙토마이세스 오가노넨시스를 접촉시키고 30℃에서 48시간 접종시킨다. 또 다른 전술한 배지를 2리터의 사가구찌 플라스크에 400밀리리터씩 120℃에서 20분간 멸균시킨다. 각 배지를 전술한 방법에 따라 제조된 배양육즙에 접종시킨다. 다음 30℃에서 24시간 배양시키면 접종용 배양이 된다.

별도로, 7% 전분, 2% 글루텐가루, 2% 콩가루, 0.8% 글리세롤, 0.1% 카사미노산, 0.01% 황산 제2철 및 55그람의 수산화나트륨을 포함하는 배지 60리터를 두 개의 100리터의 발효관에 10밀리리터의 아데카놀 (상품명)을 소포제로 함께 가하고 120℃에서 30분간 멸균시킨다. 각 배지를 800밀리리터의 접종용 배양에 접종하고 30℃에서 24시간 배양시킨다.

그런다음 2-멜갑토-1,3,4-티아디아졸 용액(수산화나트륨 수용액으로 만들고 가압멸균)을 각 발효관에 넣어 함유물을 0.05%의 배양육즙이 되게한 다음 90시간 배양시킨다.

배양이 끝난 후 배양육즙을 pH 2.0으로 만들고 라디오라이트(상품명)을 교반하여 혼합한다. 이 혼합물을 가압여과기를 사용해 여과하고 이 여액을 합하면 100리터의 혼합여액이 된다.

이 여액을 묽은 수산화나트륨용액을 가해 pH 3.0으로 맞추고 12리터의 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼을 통해 통과시키고 이 컬럼을 30리터의 물로 세척하고 50%아세톤수용액 30리터의 용출시킨다. 이 용출액을 농축시켜 5.5리터로 만들고 묽은 염산으로 pH 3.5로 맞추고 3리터 IRA-68(Cl-타입)(상품명) 컬럼을 통해 통과시킨다. 이 컬럼을 6리터의 물에 세척하고 1M 질산나트륨과 0.1M 초산나트륨을 포함하는 수용액(pH 7.2)으로 용출시키면 항균작용을 갖는 활성물질을 포함하는 용액 5리터를 얻는다.

이 용액을 pH 3.0으로 맞추고 앰버라이트 XAD-2(상품명) 컬럼에 통과시키고 이 컬럼을 물로 세척하고 50% 아세톤수용액으로 용출시키면 항균작용을 갖는 활성물질을 포함하는 수용액 약 400밀리리터를 얻는다. 이를 동결 건조시킨다.

수득된 생성물 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)를 사용하여 미세결정 셀루로오즈(아비셀, 상품명)상 컬럼 크로마토그라피시켜 항균작용을 갖는 활성획분을 선택한다. 이 획분을 아비셀 에스 에프(상품명0의 박층플레이트상에 점적하고 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3 : 7 : 9)의 혼합용매로 전개시키고 0.25% 니히드린 피리딘 용액으로 분무시키고 가열하여 발색시킨다.

그런다음 Rf 0.39를 나타내는 획분을 모으고 365내지 50℃에서 감압하 증발 건조시킨다음 아세토니트릴 : 물 (7 : 3, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 미세결정 셀루로오즈(아비셀)상 컬럼 크로마토그라피시킨다. 그런 후 항균활성획분을 상기와 같이 아비셀 에스 에프상에 박층크로마토그라피시키고 Rf 0.39를 나타내는 획분을 모은다. 이 획분을 증발 건조시키면 0.92그람의 조생성분말을 얻는다. 이 분말을 소량의 증류수에 녹이고 증류수를 사용하여 엠버라이트 CG-50(H-타입)상 컬럼크로마토그라피시켜 항균 활성획분을 선택한다. 이 획분을 농축하고 동결시킨다. 이 생성물을 소량의 증류수에 녹이고 증류수를 사용하는 세파덱스 G-10(상품명) 컬럼상에 전개시킨다. 각 획분의 항균작용을 검사하고 유효성분을 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)의 혼합용매를 사용하여 진술한 바와 같이 박층크로마토그라피한 다음 Rf 0.38을 나타내는 획분을 모은다. 이 획분을 농축시키고 동결건조시키면 75밀리그람의 백색 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 수득한다.

나) 0.026% 나트륨 아자이드를 포함하는 pH 8.1의 0.1M 피로인산염 완충액 10밀리리터에 50밀리리터의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 녹이고 실시예 8)가에서와 같이 트리고놉시스 바리아빌리스를 사용하여 제조한 활성화된 균사체 현탁액 0.5밀리리터를 여기에 가한 후 이 혼합물을 33℃의 수욕상 공기접촉하 교반하면 D-아미노산 산화가 일어난다. 반응도는 실시예 8 가)에서와 같이 고속액체 크로마토그라피기구로 결정한다.

출발물질 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산의 보지시간은 1분 56초이었고 D-아미노산 산화에 의해 형성된 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산의 보지시간은 5분 28초이었다.

반응이 끝난 후 균사체를 4℃에서 원심분리해서 제거하고 상등액을 회수하고 묽은 염산으로 pH를 1.5 내지 2.0으로 맞추고 동량의 에틸아세테이트로 4회 추출한다. 에틸아세테이트 추출물을 합하고 pH 6.0 인산염 용액으로 다시 추출한 다음 pH 1.5 내지 2.0으로 맞춘다. 이 추출물을 다시 동량의 에틸아세테이트로 4회 추출한다. 에틸아세테이트 추출물을 합하고 무수황산마그네슘상에서 탈수하고 진공증발 건조시킨다. 이 생성물을 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)을 사용하여 미세한 결정 셀루로오즈(아비셀, 상품명)상 컬럼크로마토그라피시킨다. 프로테우스 미라빌리스에 항균작용을 나타내는 획분을 모은다. 이 획분을 아비셀 에스 에프의 박층플레이트상에 점적하고 이소프로판올 : n-부탄올 : 초산 : 물(21 : 3: 7: 9, 체적비)의 혼합용매와 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2, 체적비)의 혼합용매에 전개시켜 마나술루 라이트 2536Å에 자외선을 흡수를 나타내는 획분을 모은다. 이 획분을 농축시키고 동결건조시키면 40밀리그람의 순수한 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시-3-(1,3,4-티아디아졸-2-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 얻는다. 이 물질은 프로테우스 미라빌리스, 살모넬라 가리나룸 및 이 콜라이에 항균작용을 나타낸다.

[실시예 20]

글루코스 1.0%, 1.0%감자전분, 1.5%대두분, 0.5%효모추출물, 0.1%인산 수소2칼륨 및 0.05%황산마그네슘수화물을 포함하는 배지 100ml를 500mldydfid의 플라스크에 붓고 여기에 스트렙토마이세스 클라불리게루스(Strepmyces clavuligerus) IFP 13307를 접종하여 왕복진탕기 위해서 27℃로 3일간 배양한다. 따로 500밀리리터 삼각 플라스크에 3%감자전분, 1.5%콩가루, 1.5%면실가스, 0.45%구연산나트륨, 0.06%황산망간. 0.96%황산마그네슘 수화물 및 0.05%황산제2철 수화물을 포함하는 배지 50밀리리터씩을 100개에 넣고 상법으로 멸균하여 둔다. 여기에 상기한 전 배양액을 무균적으로 접종하여 27℃에서 회전진탕(220r.p.m)배양한다. 별도로 수산화나트륨 수용액을 써서 물에 용해시켜 고압멸균한 5-멜캅도-1-메틸-1H-테트라졸 용액을 배양액에 0.06%가 되도록 24시간될 대에 가한다. 160시간 배양후 배양물을 여과하여 고형분을 제거하고 2.5ℓ의 여액을 얻었다. 이 여액을 pH2.0으로 조절하고 동량의 아세트산 에틸로 씻은 수층을 얻었다. 수층을 다우엑스 50w 50밀리리터의 컬럼에 흡착시킨다. 수세후 0.2M인산나트륨(pH 4.60) 125밀리리터로 용출하였다. 농축후에 아비셀컬럼크로마토그라피[전개용매 n-프로판올 : 에탄올 : 물(7: 0.5 : 2.5(용량비)]를 실시하고 이어서 활성부분을 다시 아비셀컬럼크로마토그라피 [전개용매 n-부탄올 : 아세트산 : 물(4 : 1 : 2(용량비)]를 실시하였다. 항균활성은 획분 No.24내지 No.33에서 인정되었다. 농축, 동결건조에 의하여 조분말 29.5밀리그람을 얻었다. 이 분획은 고속액체 크로마토그라피에서 4개의 피크로 나누어진다. 이 피크 II(30%)를 분리 분취하고 동결건조하여 백색물질 약 4.9밀리그람을 얻었다.

이 물질은 NMR., U.V., IR.스펙트럼으로 판단하여 7-(5-아미노-5-카복시 바레르아미도)-7α-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산임이 확인되었다.

[실시예 21]

상기한 실시예 20과 유사하게 스트렙토마이세스 클라부리게루스(IFO 13307)대신 각각 스트렙토 로체이 IFO 12908, 스트렙토 리파만니(IFO 1336) 및 스트렙토 비리도크게네스(IFO 13347)을 사용하여 그 과정을 반복하면 각각 조생성물 28밀리그람, 및 25밀리그람 및 정제생성물 3밀리그람, 7밀리그람 및 5밀리그람을 각각 얻었다.

[제제형태 1]

120밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 포함하는 건조충진 캡슐.

7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 60호체를 통과하는 분말로 만든다음 유당과 스테아린산 마그네슘을 69호체를 통해 통과시키고 합한 성분을 10분안에 혼합하고 3호 건조젤라틴 캡슘에 충진한다.

[제제형태 2]

150밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 포함하는 정제

활성성분을 이수소인산칼슘과 유당으로 혼합한다. 이 혼합물을 15% 옥수수전분 페이스트(4밀리그람)으로 과립으로 하고 제과시킨다. 약 40℃에서 건조시키고 16호 체로 체과시킨다. 스테아린산 마그네슘을 가하고 이 혼합물을 직경 0.3인치로 타정하여 정제로 만든다.

[제제형태 3]

500밀리그람의 7-(5-아미노-5-카복시바레르아미도)-7-메톡시-3-(1-메틸-1H-테트라졸-5-일) 티오메틸-Δ³-세펨-4-카복실산을 포함하는 비경구용액

활성화합물(50.0그람)을 150밀리리터의 주사용 무균수에 가하고 수득된 용액을 묽은 수산화나트륨을 가해 pH8.0으로 맞추고 용액의 체적을 200밀리리터로 만든다. 이 용액을 100앰플로 나누고 동결 건조시키고 봉한다.

Claims (1)

1. 구조식, R²SH의 헤테로사이클릭 티올이나 헤테로사이클릭티올의 염 또는 배양중에 전술한 헤테로 사이클릭티올로 전환될 수 있는 화합물을 함유하는 영양배지에 7-메톡시 세파로스포린 항생물질을 생성하는 미생물인 스트렙토 마이세스 오가노넨시스 YG 19Z(ATCC31167), 스트렙토 마이세스플라부리게루소(IFO 13307), 스트렙토마이세스 로체이(IF) 12908), 스트렙토마이세스 리파만니(IFO 13306) 또는 스트렙토마이세스 비리도크모게네스(IFO 13347)중의 하나를 배양시켜 구조식(2)의 7-메톡시세파로스포린 유도체를 생성한 다음 이 화합물에 트리고놉시스(Trigonopsis)속(屬)에 속하는 D-아미노산 산화효소생성 미생물의 균사체를 작용하거나 균사체의 처리된 생성물을 작용시키는 것을 특징으로 하는 구조식(1)의 7-(4-카복시부티르아미도)-7-메톡시세파로스포린유도체 및 그것의 약학적 수용 가능한 염의 제조방법.

   

   상기식에서 R²는 치환 또는 치환되지 않은 테트라졸릴 및 치환 또는 치환되지 않은 티아디아졸릴이며, M은 수소원자이다.

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