JPS6230789A - ７−ホルミルアミノセフアロスポリン化合物およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、抗菌活性を有する新規７−ホルミルアミノセ
ファロスポリン化合物およびその製造法に関する。

（発明の解決手段） 本発明の化合物は、っぎの一般式（１）で表わされる。

１７Ｈ０ Ｃ式中、Ｒ’＆末カルボキシ基またはアミノカルＲ２は
水素原子またはカルボキシ基の 保護基 Ｒ３は置換基を有して℃・てもよい５または６員複素環
基。

を意味する。） 一般式（Ｉ）で表わされる化合物の５ち　Ｂ＋がる化合
物（■、）は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａａ　）に属する菌を、複素環チオール化合物（Ｈ８−
Ｒ３）を添加した培地で培養した培養液の中から１本発
明者等が採取した新規化合物である。また。

Ｒ１がカルボキシ基である化合物（Ｉ２）はｌ　Ｒ’が
アミノカルボキシメチル基である化合物（Ｉ、　）にＤ
−アミノ酸酸化酵素生産菌の菌体またはその処理物を作
用させることによって得られた新規化合物である。

本発明の化合物は、抗菌活性を有し、抗菌剤として有用
であるばかりでなく、他の７−ホルミルアミノセファロ
スボリ／系抗菌化合物を製造するための原料としても利
用できる。

本発明で使用するシー−トモナス属に属する７−ホルミ
ルアミノセファロスポリン化合物（１，）の生産菌の一
例としては１本発明者等が埼玉県入間郡毛呂山町の山林
土壌より分離したシュードモナス　エスピー（Ｐｓｅｕ
ｄｎｍｏｎａｓ　ｓｐ、　）　Ｙ　０９０６９に株（微
工研菌寄第８３４０号）がある。その菌学的性状を以下
に示す。

（１１形　　態 肉汁寒天上で培養した細胞は、０．４〜０．６　Ｘ　１
．０〜１，４マイクロメーターの桿菌であり、多形性は
特に認められない。胞子は認められず。

極毛性のペン毛を有し、運動性がある。ダラム染色は陰
性である。

（２）　　各種培地における生育状態 ■　肉汁寒天培地 コロニーは、半球形でなめらかに隆起し。

辺縁は、平滑で円形を呈す。菌体は、うす黄〜黄色を呈
し、顕著な粘稠性および遊走性は認められず、拡散性色
素の生成も認められない。

■　肉汁液体培養 培地全体が濁る。特に液面付近の濁りが多い。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養 液化される。

■　リドマスミルク 凝固、ペプトノ化共に陽性、−培地は酸性となる。

（３）　　生理学的性質 （１）　　硝酸塩の還元　　二　弱陽性（２）脱窒反応
　　　　：　陰　性 ＋３１ＭＲテスト　　　：　陰　性 ｆ４１ＶＰテスト　　　：　陰　性 （５）　　インドールの生成　：陰　性（６）　　硫化
水素の生成　　：陰　性（カ　デンプンの加水分解：陰
　性 （９）　　無機窒素源の利用　：アンモニウム塩を唯一
の窒素源として利用する。

αＱ　色素の生成　　　　：蛍光性色素の生成は。

認められない。

ａυ　ウレアーゼ　　　：陰　性 ０２　　オキシダーゼ　　：陽　性 Ｏｊ　　カタラーゼ　　　：陽　性 ０荀　生育温度　　　　＝　１０Ｃ〜３３Ｃ至適生育温
度　　：１８〜２ｔＣ 生育ｐＨ：　５〜８．５ 至適生育　ｐＨ：６〜７．５ αつ　嫌気条件下での生育：生育できないα［ｉ　　０
Ｆテスト　　　二〇型 αη　栄養要求性　　　：なし αυ　アルギニン分解反応：陰　性 αｊ　　ポリβ−ハイドロキシブチレートの菌体内蓄積
：陽性■　ＮａＣ１加肉汁培地での生育　：　３％以上
で生育しない。

Ｑυ　炭素源の利用性 （ａ）　　次の炭素化合物を唯一の炭素源として利用し
生育できる。

グルコース、フラクトース、トレハトース。

シュクロース、ラフィノース、Ｄ−ガラクトースマルト
ース、ラクトース、サリシノ、クエン酸。

コハク酸、　酢酸、Ｌ−アラニン、　　Ｌ−７スパラギ
ン （ｂ）　　次の炭素化合物を唯一の炭素源としては利用
できない。

Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース。

イノシトール、Ｌ−ラムノース、マンニトール。

Ｄ−ソルビトール、グリセリン、Ｌ−アルギニン。

Ｌ−リジン ＠　菌体内色素の抽出 菌体内の黄色色素は１分析の結果、フーナジン（ｐｈｅ
ｎａｚｉｎｅ　）系のものであった。

以上の菌学的性質を要約すると９本菌株は。

ダラム陰性の桿菌で、極便毛により運動し、胞子を作ら
ず培地てよっては菌体内て黄色のフーナジン系色素を沈
着し、絶対好気性であり、栄養要求性は特になし・。ポ
リβ−ハイドロキシブチレートを菌体内に蓄積し、オキ
シダーゼ、カタラーゼ陽性であるが硝酸塩の還元性と、
　　Ｌ　−アルギニンの分解性および脱窒反応は陰性で
ある。また種々の糖類、アミノ酸、有機酸などを唯一の
炭素源として利用できる。生育温度範囲は１０〜３３　
Ｃで、　ｐＨ６〜７．５で良（生育する。

このような性質を有する菌につ（・てパージーイのマニ
ュアルＩ　Ｂｅｒｇｅ７ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　
８　ｔｈ　ｅｄ、、　１９７５．、及びＢｅｒｇｅｙ’
ｓ　Ｍａｎｕａｌｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ　１．１９８４　］　Ｋ
より検索した結果１本菌株は、シー−トモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　）属に属する菌種であると同定した
。

しかし既知菌種のうち本菌株と生質の一致するものは見
あたらな（・ため１本菌株を、シュードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　）属の新菌種と認め、シュードモナ
ス　エスピー（Ｐｓｅｕｄｎｍｏｎａｓ　ｓｐ、）　Ｙ
−０９０６９に株と命名した。

なお２本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所て受
託番号微工研菌寄第８３４０号として寄託されている。

以上Ｙ−０９０６９Ｋ株について説明したが、微生物の
諸性質は一定したものではなく、自然的人工的に変化す
ることは周知のとおりである。本発明において用（・ら
れる菌株としてはシー−トモナス属に属し、７−ホルミ
ルアミノセファロスポリン化合物を産生ずる全ての菌株
が挙げられる。また本発明で使用する菌株には例えばＸ
線、γ線、紫外線等の照射、化学変異剤処理。

）７−ジ接触、形質転換、形質導入、接合による遺伝子
組換え、細胞融合てよる遺伝子組換え。

プラスミドＶこよる遺伝子導入などの処理をすることに
よって７−ホルミルアミノセファロスポリン化合物の生
産能を高めた人工的変異株、あるいは自然発生した突然
変異株も包含される。

（製造方法） 本発明によれば、７−ホルミルアミツセフ７シーードモ
ナス属に属する７−ホルミルアミツセ７７０スポリ７化
合物生産菌を複素環チオール化合物（Ｒ３−Ｒ３）を添
加した培地に培養し。

培養物より該化合物を採取することにより行われる。

培養はその微生物が利用する栄養源を含有する培地を用
いて行なわれる。培地の合成、半合成又は天然の、固体
又は液体培地のいずれを用℃・てもよ（・が９通常天然
の栄養源を含んだ液体培地を使用するのが好ましい。培
地に添加する栄養源としては、炭素源としてはＤ−グル
コース、スターチ、グリセリンの他に種々のアミノ酸及
び有機酸が、窒素源としては肉エキス、ペプトン、グル
テンミール、カゼイン加水分解物。

綿実粕、大豆粉、落下生粉、魚粉、コーンスチープリカ
ー、乾燥酵母、酵母エキス、各種アミノ酸（例えばグル
タミン酸、アラニン、リジン等）、アンモニウム塩（例
えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム９等）や尿素
などの有機。

無機の窒素源が用（・られる。

また、培地には必要に応じナトリウム、カリウム、マグ
ネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄などの金属の硫酸塩、
硝酸塩、塩化物、炭酸塩。

リン酸塩などを添加することができる。

培養は好気的条件下に行なうのが良く、静置。

振盪９通気攪拌培養のいずれでも可能であるが。

振盪あるいは通気攪拌培養が有利である。培養温度はお
よそ１８〜３０　Ｃの範囲内が好ましく。

殊に約２４〜２８Ｃが有利である。また、培地のｐＨは
約５゜５〜８．５．殊に６〜８の中性付近に保持するの
が好適である。培養期間は培地の組成。

温度等の培養条件によって異なるが１通常約２日〜１０
日程度がよい。

培養物より目的化合物を単離、精製、採取するには１通
常微生物工業の分野で用いられる手段を適用すればよい
。目的化合物は主に培養液中に蓄積されるので、遠心分
離又は濾過等シてより菌体を除去した後、除菌液より単
離・精製される。

単離・精製は適当な溶剤に対する溶解性及び溶解度の差
、溶液からの析出性及び析出速度の差１種々の吸着剤に
対する吸着親和性の差、２種の液相間における分配の差
などを利用する方法を適用して行なうのが好まし℃・。

これらの方法は必要に応じて単独に用いられ、あるいは
任意、順序て組合せ、また反覆して適用できる。

上記発酵製造法におし・て、培地に添加される複素環チ
オール化合物（Ｈ８−Ｒ３）としては、置換基を有して
いてもよい５または６員の複素環チオール化合物が用い
られる。さらに詳しく言えば、複素環チオールとしては
、たとえば酸素原子、硫黄原子、窒素原子から選択され
た複素原子１乃至・１個を含むものであり、また、置換
基としては、炭素数１乃至５個の低級アルキル基を挙げ
ることができる。これらの複素環チオール化合物に包含
される代表的なものとしては。

ピリジルチオール、テトラゾリルチール、チアジアゾリ
ルチオールおよびそれらの複素環チオールに低級アルキ
ル基が置換されたものであり。

具体的には、４−メルカプトピリジン、３−メチル−４
−メルカプトビリジ／、５−メルカプト−１−メチル−
ＩＨ−テトラゾール、　５−メルカプト−１，３，４−
チアジアゾール、５−メルカプト−２−メチル−１，３
，４−チアジアゾール等を挙げることができる。これら
の複素環チオール化合物は適宜塩の形態で用−・ること
もできる。塩としては、水溶性の高いものを選ぶことが
でき、また、当該複素環チオール化合物が微生物に対し
、毒性が強いときは水に難溶性の塩を選ぶこともできる
。さらに、複素環チオールは、Ｒ３−８Ｈのジスルフィ
ド誘導体（Ｒ３−３−８−Ｒ３）等、培養中に所望の複
素環チオール化合物に変化しうろ形態で使用することも
できる。

こうして得られた本発明の化合物（Ｉ＋）（Ｒ’＝であ
る。なお、これらの化合物は、７位のホルミルアミノ基
がα−立体配置を、他方の７位の酸アミド基がβ−立体
配置を有している。また。

これらの化合物は、遊離の酸の状態だけでなく。

塩（アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、有機アミン
塩等）やエステルとして採取できる。

■　７−（５−アミノ−５−カルボキシバレラミド）−
７−ホルミルアミノ−３−（１−メチル−ＩＨ−テトラ
ゾール−５−イル）チオメチル−３−セフェム−４−カ
ルボン酸（ｐＨ０ 添加複素環チオール化合物＝５−メルカプト−１−メチ
ル−ＩＨ−テトラゾール ■　７−（５−アミノ−５−カルボキシバレラミド）−
７−ホルミルアミノ−３−（ピリジノ−４−イル）チオ
メチル−３−セフェム−４−カルボン酸 ？ＨＯ 添加複素環チオール化合物＝４−メルカプトピリジン ■　７−（５−アミノ−５−カルボキシバレラミド）−
７−ホルミルアミノ−３−（５−メチル−１，３，４−
チアジアゾール−２−イル）チオメチル−３−セフェム
−４−カルボン酸ＨＯ ＯＯＨ 添加複素環チオール化合物：２−メルカプト−５−メチ
ル−１，３，４−チアジアゾールつぎに１本発明の化合
物のうち　Ｒ１がカルボキシ基である化合物（■２）は
、上で得られたＲ１がアミノカルボキシメチル基である
化合物（■１）に好気的条件下でトリゴノプシス属（Ｔ
ｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ　）　ＩＩＣ属するＤ−アミノ酸
酸化酵素生産菌の菌体またはその処理物を作用させるこ
とによって製造される。ここに使用されるトリゴノプシ
ス属に属するＤ−アミノ酸酸化酵素生産菌は、菌保存機
関知保存されているタイプカルチャーの中から選択する
こともできるし、自然界から分類することもできる。

また、化合物（Ｉ２）の生成活性を高めるため上記の菌
株から通常の手段で得られる変異株も本発明に有利に使
用され得る。

上記のＤ−アミノ酸酸化酵素活性を有する微生物として
はトリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓｖａｒｉａ
ｂｉｌｉｓ　）を挙げることができる。本菌は財団法人
醗酵研究所から菌株番号ＩＦＯＯ７５５゜ＩＦＯＯ６７
１として入手することができる。また。

本菌の菌学的性状は、　Ｓ、Ｓｅｎｔｈｅｓｈａｎｍｕ
ｇａｎａｔｈａｎ。

Ｗ、Ｊ、Ｎ１ｃｋｅｒｓｏｎ　：　Ｊ、　ｇｅｎ、　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　２７．４３７−４４９　（１９
６２）　Ｋ記載されている。

このようなり−アミノ酸酸化酵素活性を有する微生物を
用（・て目的物質（Ｉ２）を製造するためには通常、先
ずこれらの微生物を培養し。

得られる菌体またはその処理物を一般式（Ｉ）のＲ１が
アミノカルボキシメチル基である７−ホルミルアミノセ
ファロスポリン化合物（Ｉｌ）に適当な条件下で作用さ
せるのがよし・。菌体を得るための培養方法としては１
通常好気的培養が望ましく、好適ては液体通気攪拌培養
により行なわれる。培地組成としては１通常微生物の培
地として使用される培地が使用される。

すなわち合成培地、半合成培地、あるいは天然培地が用
いられ、培地の組成はたとえば炭素源としては、グルコ
ース、シュークロース。

マンニトール、グリセリン、デキストリン。

でん粉、植物油などが窒素源としては、肉エキス、ペプ
トン、グルテンミール、綿実粕。

大豆粉、落花生粉、魚粉、コーンメチ−プリカー。乾燥
酵母、酵母エキス、硫酸アンモニウム、尿素、その他の
有機または無機の窒素源が用いられる。また金属塩とし
てＮａ　、　Ｋ１Ｍｇ　。

Ｃａ、　Ｚｎ、　Ｆｅなどの硫酸塩、硝酸塩、塩化物。

炭酸塩、リン酸塩などが必要に応じて添加される。さら
に必要に応じて、メチオニン、システィン、シスチン、
オレイン酸メチル。

ラード油、シリコン油、界面活性剤などの生成促進物質
、または消泡剤が適宜使用される。

培地のｐＨは約４〜１０．好ましくは５〜６の範囲に保
持すると好結果が得られる。

特に培地中にＤ−（またはＤＬ−）アミノ酸２例えばＤ
−（またはＤＬ−）メチオニン。

Ｄ−（またはＤＬ−）アラニン、Ｄ−（またはＤＬ−）
バリンなどを含有している場合には優れたＤ−アミノ酸
酸化酵素活性が得られる。培養温度は１８　Ｃ〜３７Ｃ
１好ましくは３０Ｃ近辺がよく、培養時間は培養条件、
特に培養装置、培地組成、培養温度などにより異なるが
、Ｄ−アミノ酸酸化酵素活性が最大を示す時点に培養を
終了するよう決定するのがよく１通常２〜１０日間が適
当である。

こうして得られた菌体またはその処理物が出発物質（Ｉ
１）のＤ−アミノ酸酸化反応に使用されるが、ここでい
う菌体の処理物とは、菌体に適当な処理を加えてＤ−ア
ミノ酸酸化酵素活性を高めろ目的物質（Ｉ２）の製造に
有利な膨圧したものを指し１例えば本発明におけるＤ−
アミノ酸酸化酵素活性は通常菌体内に存在するので、Ｄ
−アミノ酸酸化酵素生産菌の培養物から集菌され洗浄さ
れた菌体から物理的あるいは化学的手段を適用して得ら
れる無細胞抽出液または無細胞抽出液から公知の酵素分
離精製方法を適用して得られる部分精製あるいは、精製
されたＤ−アミノ酸酸化酵素または部分精製、あるいは
精製された後、物理的あるいは化学的手段によって水不
溶性高分子物質または無機担体に結合されたＤ−アミノ
酸酸化酵素活性または菌体を活性化処理して得られる活
性化菌体などを指す。

本発明においては、前記の可溶性酵素は調製および再使
用の点で実用性が限られているので、活性化菌体を使用
するような不溶性酵素を使用する方が回収および再使用
が可能な点で便利である。

前記の菌体の活性化処理は、菌体に崩壊を起こさせる程
ではな（・ある種の緩和な損傷を与えることによりもた
らされる。これらの活性化処理の例としては酸性ｐＨ例
えばｐＨ約３〜４で１０Ｃ以下で凍結させて２次号・で
融解させる方法、菌体を１種またはそれ以上の有機溶媒
１例えばアセトン、ｎ−ブタノール、２−フェニルエタ
ノール、ジメチルエーテル。

シクロヘキサン、ベンゼン、トルエンナトト共π水相中
で処理する方法、０．１〜１０％の界面活性剤、例えば
セチルトＩＪメチルアンモニウム、セチルピリジニウム
、セチルジメチルベンジルアンモニウムハイドライドな
どのカチオノ界面活性剤、ドデシールサルフ一一ト、ア
ルキルアリールスルフォノ酸アルカリ金属塩。

ナトリウムデオキシコレートなどのアニオン界面活性剤
、ソルビタンモノラウレート、トライトンｘ　−ｉｏｏ
なとの非イオン性界面活性剤の水溶液で処理する方法、
水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムの希薄溶液で処
理する方法、高浸透圧溶液９例えば２Ｍ庶糖溶液中に懸
濁させ２次いで急速て水で希釈する方法などが挙げられ
る。これらの活性化処理は。

温度、処理時間、ｐＨ５試薬濃度など種々の要素により
左右されるので活性化の至適条件を適宜確かめることが
必要である。

また菌体中に通常共存するカタラーゼの作用を阻止しな
い時は目的物質（Ｉ２）への酸化的脱カルボキシ化が不
完全となり 一般式 で表わされる７−（５−カルボキシ−５−オキソバレラ
ミド）−７−ホルミルアミノセファロスポリン誘導体を
共生する。従って選択的に目的物質（Ｉ２）を得るため
には、カタラーゼ作用を阻止することが望ましい。適当
なカタラーゼ阻止剤はアスコルビン酸、３−アミノ−１
，２，４−トＩＪアゾール、アルカリ金属アジドである
。特にナトリウムアジドが好ましい。

この阻止剤は出発物質（Ｉ、　’）の目的物質（Ｉ２）
への変換過程中に反応混合物中に存在させてもよいし、
あるいは前記の変換にこれらを使用する前に菌体を前処
理してもよい。ナ）　ＩＪウウアジドの使用量は１〜１
００ｍＭの程度で行なわれる。あるいはまた前記の菌体
中のカタラーゼはその菌体な前記の変換工程に使用する
前に熱処理により失活させることができる。

すなわち前記の菌体を４０Ｃ〜６０Ｃで、好ましくは約
５００で少なくとも３時間処理すると。

それらのカタラーゼ活性は顕著に減少するが。

一方り−アミノ酸オキシダーゼ活性はそのまま残存する
。この熱処理は簡単な水性又は緩衝懸濁液中でその菌体
に対して行うこともできるが菌体なその処理を行うと同
時に「活性化」試薬処理を受けるような処理に付するの
が特に便利である。例えば溶媒トルエンを使って活性化
処理を５０ｔｌ’で４時間行いカタラーゼ作用の阻止と
前記の菌体の活性化を同時に達成することができる。

前記の活性化菌体の酵素系と出発物質（ＩＩ　’）との
反応は通常６〜８のｐＨで行なわれる。

反応温度としては３０ｔｒ〜４０Ｃで行なうことが望ま
しい。反応時間は主として酵素力価により左右されるが
通常１〜５時間である。

上記の酵素反応は好気的条件下で行なわれるので１通常
空気または酸素の通気化で行なうのが好ましい。

前述したように出発物質ＣＩ＋　）はその両性的な構造
のために醗酵プロスから抽出することが困難であるが１
本発明方法によれば出発物質（Ｉ１）の醗酵プロス中で
菌体を除去した後適当な条件下で酵素反応を行なうこと
ができ。

生成した目的物質（Ｉ２）を溶媒抽出またはイオン交換
樹脂の吸着により回収することが容易にできる。反応液
から１例えばｐＨ２，５またはそれ以下に酸性とし、適
当な有機溶媒９例えば酢酸エチル、ｎ−ブタノールなど
で抽出することができるまたイオン交換樹脂と溶媒抽出
の組合せを使用すると好結果が得られる。

適当ナイオン交換樹脂は液体アミンアニオン交換樹脂で
ある。好ましい溶媒は酢酸エチル酢酸ブチル、ｎ−ブタ
ノールなどである。また固体のイオン交換樹脂を使用し
て分離することもできる。その場合の適当な溶媒として
予備的な実験で容易に決めることができる。

更に精製して純粋な物質を得るためには。

抗生物質の精製て通常使用される方法が用いられる。

目的物質（Ｉ２）は遊離の酸ばかりでなく通常のアルカ
リ金属塩、アルカリ土類金属塩、有機アミ／塩等として
採取することができる。

本製法で得られた化合物（Ｉ２）の代表的なものはつぎ
の通りである。

■　７−（４−カルボキシブチルアミド）−７−ホルミ
ルアミノ−３−（１−メチル−ＩＨ−テトラゾール−５
−イル）チオメチル−３−セフェム−４−カルボン酸 ？ＨＯ ■　７〜（４−カルボキシブチルアミド）−７−ホルミ
ルアミノ−３−（ピリジン−４−イル）チオメチル−３
−セフェム−４−カルボン酸 ＨＯ （発明の効果） 本発明の目的化合物はダラム陰性菌および変形彩画など
に対し抗菌活性を示す。また、各種β−ラクタマーゼに
対して極めて安定である特徴を有する。つぎに２代表的
な目的化合物の抗菌活活性を示す。

抗菌活性の測定法：実施例１で得られた化合物に水を加
え溶液を作る。８ｍｍ径の抗菌活性測定用の薄手のペー
パーディスク（東洋製作新製）てこの液をしみ込ませ、
余分な液を除いた後。

乾燥し各種検定歯にてペーパーディスク・アッセイを行
なった。細菌は３７Ｃで１６時間経過後の阻止円径（ｍ
ｍ　）を測定した。なお、培地組成はポリペプトン１．
０％、酵母エキスｎ％、寒天（Ｄｉｆｃｏ社製）１．２
％、ｐＨ７，０である。

結果： （実施例） つぎに、実施例てより本発明の化合物およびその製造法
をさらに説明する。

実施例　１゜ （７ＨＯ ポテトスターチ３．０％、大豆粉１．５％、　ロースト
ジャム０．２％、大豆油０．２５％、塩化ナトリウム０
．２５％を含む培地（ｐＨ７，０）を作製し、これを５
００　ｍｌ三角フラスコに各６０　ｍｌずつ分注し、１
２０１：’で２０分間滅菌した。この培地に肉汁寒天培
地上に生育させたシー−トモナス・エスピ−Ｙ−０９０
６９Ｋ株の菌体なかき取って接種し、２８Ｃで４８時間
振盪培養を行ない種培養液とした。つぎに上記の培地に
５−メルカプト−１−メチル−ＩＨ−テトラゾール（ナ
トリウム塩）０．１％を加えた培地１５ｔを。

２０Ｌ容のステンレス製醗酵槽に入れ、これに種培養液
を３．０％の割合で植菌した。通気量１５１／分。

攪拌２２０回転７／分、温度２８Ｃで７２時間培養を続
けるとプロテウス・エスピーＳＳ　−１２株に対する抗
菌活性は最大となる。このようにして得られた培溶液（
（１規定の塩酸を加えｐＨ５，０に調整後、遠心ｆ＋離
を行なし・菌体を除（と上清１２ｔが得られた。

上清をｐＨ４，５に調整後、活性炭（１ｔ）を充填した
カラムを通過させた。水（２ｔ）でカラムを洗浄後。

抗菌活性物質を５０％アセトン水（５ｔ）で溶出した。

溶出液を減圧下４０Ｃで２ｔまで濃縮後、濃縮液をｐＨ
４，５に調整し、ダウエックスＩ　Ｘ　２　（Ｃ１−型
。

１００　ｍｌ　）　（ザ・ダウ・ケミカル社製）のカラ
ムを通過させた。水（３００ｍｌ　）でカラムを洗浄後
、抗菌活性物質を５％塩化す）　ＩＪウム水（３００ｍ
ｌ　）で溶出した。溶出液をｐＨ４，５Ｋ調整後、活性
炭（５０ｍｔ　）と充填したカラムを通過させた。水（
１００ｍＡ）でカラムを洗浄後、抗菌活性物質を５０％
アセト／水（２００ｍｌ　）で溶出した。溶出液を減圧
下４０Ｃで１００　ｍｌまで濃縮後、濃縮液をｐＨ４，
５に調整し。

ＤＥＡＥ−セフアゾ、クスＡ−２５（リン酸型、３５ｍ
１）（ファルマシア・ファイン・ケミカル社、ＩＪ）ヲ
充填したカラムを通過させた。水（７０ｍｌ）でカラム
を洗浄後、０．００５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０，３
００ｍｌ　）と０．０８　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
，３００ｍｌ　）による直線濃度勾配法により抗菌活性
物質な溶出分画した。

有効区分（５０ｍｌ　）を集めてｐｉ（４，５Ｋ調整後
、活性炭（２０ｍｌ　）を充填し１こカラムを通過させ
た。　水（４０ｍｌ　）で洗浄後、抗菌活性物質を５０
％アセトン水（８０ｍｌ　）で溶出した。溶出液をｐＨ
７，０’ｔて調整後、減圧下４０Ｃで１０ｍ１まで濃縮
し、凍結乾燥すると淡黄色粉末（１２０１Ｔ１ｇ　）が
得られた。淡黄色粉末（１２０唄）をＺｏｒｂａｘ　Ｂ
Ｐ−ＮＨ２（１０／ｌ　Ｘ　２５０　ｍｍ。

デュポン社製）を担体とする分取用高速液体クロマトグ
ラフィーに付し、０．０２Ｍリン酸緩衝ｉ　（ｐＨ６，
５）で溶出分画した。

各分画をＺｏｒｂａｘ　ＢＰ−ＮＨ２（４，３９５Ｘ　
３００　ｍｍ、デュポン社製）を用（・た高速液体クロ
マトグラフィーで０．０２Ｍリノ酸緩衝Ｑ、　（ｐＨ６
，５）　、流速１　ｍｌ１分、検出２６０　ｎｍの条件
にて分析に付し、８４分に単一ピークを示し、かつプロ
テウス・エスピー　ＳＳ　−１２株に抗菌活性を示す部
分を集めた。有効区分（５ｍｔ）をｐＨ４，５に調整後
、活性炭（２ｍｌ）を充填したカラムを通過させた。水
（１０ｍｔ）で洗浄後、５０％アセトン水（１０ｍｌ）
で溶出した。溶出液をｐＨ７，０に調整後、減圧下４０
Ｕで２　ｍｌまで濃縮後、凍結乾燥して７−（５−アミ
ノ−５−カルボキシバレラミド）−７−ホルミルアミノ
−３−（１−メチル−テトラゾール−５−イル）チオメ
チル−３−セフェム−４−カルボン酸の白色粉末（５ｍ
ｇ）を得た。

この化合物は以下の理化学的性状を示す。

１）紫外線吸収スペクトル：　０．０２モルリン酸緩衝
液（ｐＨ６，５）中での紫外線吸収スペクトルを第１図
に示す。

２）赤外線吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法による
測定において３４００〜３２００　、１７７０−１７８
０　。

１６７０〜１６００．１５１０．１４００　ｃｍ−＋に
主な吸収を示す。

３）核磁気共鳴スペクトル二重水中での４００Ｍｆ（ｚ
の核磁気共鳴スペクトルにおいてδ値（ｐｐｍ　）：４
．０７　（３Ｈ，−重線）　、　　５．３２　（ＩＨ，
−重線）８．１６　（Ｉ　Ｈ，−重線）Ｋ主な特徴的シ
グナルを示す。

４）マススペクトル：　ＦＡＲ−ＭＳ　において５１５
（Ｍ＋Ｈ）および５３７　（Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ　）が観測さ
れろ。

５）物質の区分：両性物質 ６）外観：白色粉末 ７）６規定塩酸で加水分解するとα−アミノアジピン酸
を与えろ。

８）　　溶解性：水、含水アセトン、含水アルコールに
易溶 ９）ペーパークロマトグラフィー： 東洋２紙Ａ３１４Ａ（東洋Ｆ紙社製） 溶媒系　６６％アセトニトリル水 Ｒｆ　＝　　０．２６ １０）高速液体クロマトグラフィー： 担体　Ｚｏｒｂａｘ　ＢＰ　−ＮＨ２（デュポン社製）
４．３　＄　Ｘ　３００　ｍｍ 移動相ｏ、ｏ２ｒｗｖ−リン酸１すｌ・リウム水溶液１
規定水酸化ナトリウムにてｐＨ６，５に調整 流速　　１　ｍｌ１分 検出　　２６０　ｎｍ 保持時間　８．４分 実施例２゜ ９ＨＯ 実施例１において、５−メルカプト−１−メチル−ＩＨ
−テトラゾール（ナトリウム塩）の代りに４−メルカプ
トピリジンを培地に加えて実施例１と同様に処理し、　
　Ｚｏｒｂａｘ　ＢＰ−ＮＨｔを担体とする分取用高速
液体クロマトグラフィーに付する前の淡黄色粉末１５０
ｒｒ＠を得た。

この淡黄色粉末を実施例１と同様の条件でＺ　ｏｒｂａ
ｘＢ　Ｐ　−ＮＨ２を担体とする分取用高速液体クロマ
トグラフィーに付して１１，２分に単一ピークを示し、
かつ。

プロテウスエスピー５Ｓ−１２株に抗菌活性を示す部分
から有効区分１０ｍ１を集め、以下実施例１と同様に処
理して７−（５−アミノ−５−カルボキシバレラミド）
−７−ホルミルアミノ−３−（ピリジ７−４−イル）チ
オメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の白色粉末１
０ｍｇを得た。

この化合物は以下の理化学的性状を示す。

１）紫外線吸収スペクトル：　０．０２Ｍ　ＩＪン酸緩
衝液中での紫外線吸収スペクトルを第２図に示す。

２）赤外線吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法による
測定において３４００〜３２００．１７７０〜１７８０
．１６７０〜１６００ｃｍ−’に主な吸収を示す。

３）核磁気共鳴スペクトル：重水中での４００ＭＨｚの
核磁気共鳴スペクトルにおけるδ値（ｐｐｍ）５．２５
（ＬＨ，−重線）ｔ　　７．４４（２Ｈ，二重線、　Ｊ
＝４．８８Ｈｚ）。

８．１５（ＬＨ，−重線）、８．３６（２Ｈ，ブロード
）に主な特徴的シグナルを示す。

４）マススペクトル：　ＦＡＢ−ＭＳにおいて５１０（
Ｍ＋Ｈ）および５３２　（Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ　）が観測され
る。

５）物質の区分：両性物質 ６）外　観　　：白色粉末 ７）６規定塩酸で加水分解すると　α−アミノアジピン
酸を与える。

８）溶解性　：水、含水アセトン、含水アルコールに易
溶 ９）ペーパークロマトグラフィー：東洋Ｐ紙遅５１４　
Ａ（東洋ｒ紙社製）、溶媒系ｎ−ブタノール：酢酸：水
（４：１：２）でＲｆ＝０．１４ １０）高速液体クロマトグラフィー：担体Ｚ　ｏｒｂａ
ｘ　Ｂ　Ｐ　−ＮＨｔ（デュポン社製）４．３ダＸ３０
０ｍｍ移動層　０．０２Ｍ−リン酸１ナトリウム水溶液
、１規定水酸化ナトリウムにてｐＨ６，５に調整流速１
ｍｔＺ分 検出２６０ｎｍ 保持時間　１１．２分 実施例３゜ ？ＨＯ 実施例２で得られた７−（５−アミノ−５−カルボキシ
バレラミド）−７−ホルミルアミノ−３−（ピリジン−
４−イル）チオメチル−３−セフェム−４−カルボン酸
を希釈してプロテウス　エスピー　５Ｓ−１２株に対し
８　ｍｍ径のペーパーディスク法により２０ｍｍの阻、
止円径を示すような溶液を作り、　　ｐＨ７，５に調整
する。この溶液３００μ乙に対し。

１％過酸化水素水を１２μ４．１％アジ化ナトリウム水
溶液１２μＬおよびトリゴノプシスパリアビリス（ＩＦ
Ｏ０７５５，ＩＦｏ　０６７１．特公昭５６−３２３１
６号公報参照）由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼを４０
．０００単位／　＋ａ７になるように０．０２モルリン
酸緩衝液ｐＨ７゜０で希釈した溶液を１８μｔをそれぞ
れ加える。

このようにして調製した溶液を３７℃で１時間反応を行
ウド、　７−（４−カルボキシブチラミド）−７−ホル
ミルアミノ−３−（ピリジン−４−イル）チオメチル−
３−セフェム−４−カルボン酸が得られる。

この化合物は２次の理化学的性状を示す。

１）高速液体クロマトグラフィー： 担体Ｚｏｒｂａｘ　ＢＰ−ＮＨ２４，３０Ｘ３００ｍｍ
移動層　０．０２Ｍ−ＮａＨｔ　ｐｏ４ｐＨ６，５流速
１ｍｔ／分 検出２６０ｎｍ 保持時間　１９．２分

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られた目的化合物の紫外線吸収
スペクトルを示す。 第２図は、実施例２で得られた目的化合物の紫外線吸収
スペクトルを示す。 第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＾１はカルボキシ基またはアミノカルボキシ
   メチル基（▲数式、化学式、表等があります▼）、 Ｒ＾２は水素原子またはカルボキシ基の 保護基、 Ｒ＾３は置換基を有していてもよい５ま たは６員複素環基 を意味する。） で示される７−ホルミルアミノセファロスポリン化合物
   。 ２、Ｒ＾３が酸素原子、硫黄原子、窒素原子から選択さ
   れた複素原子１乃至４個を含む５ま たは６員複素環基である特許請求の範囲第 １項記載の７−ホルミルアミノセファロス ポリン化合物。 ３、Ｒ＾３が低級アルキル基で置換されていてもよいピ
   リジル基、テトラゾリル基またはチ アジアゾリル基である特許請求の範囲第１ 項記載の７−ホルミルアミノセファロスポ リン化合物。 ４、７−ホルミルアミノセファロスポリン化合物を産生
   するシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ）に
   属する菌を、一般式ＨＳ−Ｒ＾３（式中Ｒ＾３は、置換
   基を有していてもよい５乃至６員複素環基を意味する。 ） で表わされる複素環チオール化合物を添加した培地で培
   養して、 一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ＿１） （式中、Ｒ＾２は水素原子またはカルボキシ基の保護基
   、 Ｒ＾３は前記と同じ意味を表わす。） で表わされる７−（５−アミノ−５−カルボキシバレラ
   ミド）−７−ホルミルアミノセファロスポリン化合物を
   培地に蓄積させ、ついでこの化合物を採取することを特
   徴とする上記一般式（ I ＿１）で表わされる７−ホル
   ミルアミノセファロスポリン化合物の製造法。 ５、７−ホルミルアミノセファロスポリン化合物を産生
   する菌がシュードモナス　エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
   ｎａｓ　ｓｐ．）Ｙ−０９０６９に株（微工研菌寄第８
   ３４０号）である特許請求の範囲第４項記載の製造法。 ６、７−ホルミルアミノセファロスポリン化合物を産生
   するシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ）に
   属する菌を一般式ＨＳ−Ｒ＾３（式中、Ｒ＾３は置換基
   を有していてもよい５または６員複素環基を意味する。 ） で表わされる複素環チオ−ル化合物を添加した培地で培
   養して、 一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ＿１） （式中、Ｒ＾２は水素原子またはカルボキシ基の保護基
   を、Ｒ＾３は上記と同じ意味を表わす。）で表わされる
   ７−（５−アミノ−５−カルボキシバレラミド）−７−
   ホルミルアミノセファロスポリン化合物を産生させ、つ
   いでこの化合物に好気的条件下でトリゴノプシス属 （Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）に属するＤ−アミノ酸酸化
   酵素生産菌の菌体またはその処理物を作用させることを
   特徴とする一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ＿２） （式中、Ｒ＾２およびＲ＾３は前記と同じ意味を表わす
   。） で表わされる７−（４−カルボキシブチルアミド）−７
   −ホルミルアミノセファロスポリン化合物の製造法。