JPS62107798A - セフアロスポリン誘導体の製造法 - Google Patents
セフアロスポリン誘導体の製造法Info
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- JPS62107798A JPS62107798A JP24619485A JP24619485A JPS62107798A JP S62107798 A JPS62107798 A JP S62107798A JP 24619485 A JP24619485 A JP 24619485A JP 24619485 A JP24619485 A JP 24619485A JP S62107798 A JPS62107798 A JP S62107798A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、７−アミノセファロスポラン酸（以下、７−
ＡＣＡと略す）およびその誘導体の製造における中間体
の酵素的手段による人造法に関するものである。
ＡＣＡと略す）およびその誘導体の製造における中間体
の酵素的手段による人造法に関するものである。
（従来の技術および発明が解決しようとする問題点）
発酵生産によって得られるセファロスポリンＣは、７位
アミノ基に結合したアシル基を除去する反応（以下、脱
アシル化と略す）により、７−ＡＣＡに誘導され、これ
から優れた抗菌活性を有する種々のセファロスポリン系
抗生物質が合成され、実用に供されている。
アミノ基に結合したアシル基を除去する反応（以下、脱
アシル化と略す）により、７−ＡＣＡに誘導され、これ
から優れた抗菌活性を有する種々のセファロスポリン系
抗生物質が合成され、実用に供されている。
セファロスポリンＣの脱アシル化方法としては、様々な
方法が知られているが、その一つに ７β−（５−カル
ボキシ−５−オキソペンタンアミド）−セファロスポラ
ンａｔ中間体とする方法がある。
方法が知られているが、その一つに ７β−（５−カル
ボキシ−５−オキソペンタンアミド）−セファロスポラ
ンａｔ中間体とする方法がある。
本法においてＶｉ％筐す、セファロスポリンＣＫ例えば
グリオキシル酸などのアルデヒド類を作用させ、セファ
ロスポリンＣの７β−（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキ
シペンタンアミド）基のＤ−５−アミン基金酸化除去し
、７β−（５−カルボキシ−５−オキソペンタンアミド
）−セファロスポラン酸を誘導する（特公昭５５−１２
９１０）。
グリオキシル酸などのアルデヒド類を作用させ、セファ
ロスポリンＣの７β−（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキ
シペンタンアミド）基のＤ−５−アミン基金酸化除去し
、７β−（５−カルボキシ−５−オキソペンタンアミド
）−セファロスポラン酸を誘導する（特公昭５５−１２
９１０）。
この７β−（５−カルボキシ−５−オキソペンタンアミ
ド）−セファロスポラン酸は、過酸化水素を作用させる
ことにより、容易にかつ定量的に脱炭酸して、７β−（
４−カルボキシブタンアミドウ−セファロスポラン酸に
誘導される。次に、これに微生物酵素１例えば、アグリ
カルチャー・アンド・バイオロジカル・ケミスト！Ｊ
−（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ） ４５巻、１５６１頁、
１９８１年記載の酵素を作用させることにより、７−Ａ
ＣＡとゲルタール酸に定量的に加水分解される。
ド）−セファロスポラン酸は、過酸化水素を作用させる
ことにより、容易にかつ定量的に脱炭酸して、７β−（
４−カルボキシブタンアミドウ−セファロスポラン酸に
誘導される。次に、これに微生物酵素１例えば、アグリ
カルチャー・アンド・バイオロジカル・ケミスト！Ｊ
−（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ） ４５巻、１５６１頁、
１９８１年記載の酵素を作用させることにより、７−Ａ
ＣＡとゲルタール酸に定量的に加水分解される。
本法は、発酵生産されたセファロスポリンＣ全単離精製
することなく７β−（４−カルボキシブタンアミド）−
セファロスポラン酸まで誘導でさる点をはじめ、工業的
にすぐｎ−ｉ特徴を有している。
することなく７β−（４−カルボキシブタンアミド）−
セファロスポラン酸まで誘導でさる点をはじめ、工業的
にすぐｎ−ｉ特徴を有している。
一方、セファロスポリンＣから７β−（５−カルボキン
−５−オキソペンタンアミド）−セファロスポラン酸全
化学的ではなく酵素的に製造できれば、経済的により有
利であると予想されていた。
−５−オキソペンタンアミド）−セファロスポラン酸全
化学的ではなく酵素的に製造できれば、経済的により有
利であると予想されていた。
微生物の産生するＤ−アミノｃＲ酸化酵素を利用してセ
ファロスポリンＣから７β−（５−カルボキシ−５−オ
キソペンタンアミド）−セファロスポラン酸？製造する
方法は、従来から知られており、例えば、次に示す生産
菌がある。すなわち、（１）％−公昭５０−７１５８記
載のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ）属、
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ニューロ
スポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ）属、トリボノブシス
（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ ）属の真菌、あるいはエア
ロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ）属の細菌、（２
）特公昭５７−１８８７９記載のフザリウム（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ ）属の真菌、（３）ｔ￥ｆ公昭５７−３０４
７９記載のセファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏ
ｒｉｕｍ ）属の真菌、あるいは（４）特開昭５１−１
１２５９４記載のグリオクラディウム（Ｇｌｉｏｃｌａ
ｄｉｕｍ ）属の真菌などが、セフ ７０ヌボリンｃ２
酸化するＤ−アミノ酸酸化酵素生産菌として知られてい
る。
ファロスポリンＣから７β−（５−カルボキシ−５−オ
キソペンタンアミド）−セファロスポラン酸？製造する
方法は、従来から知られており、例えば、次に示す生産
菌がある。すなわち、（１）％−公昭５０−７１５８記
載のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ）属、
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ニューロ
スポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ）属、トリボノブシス
（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ ）属の真菌、あるいはエア
ロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ）属の細菌、（２
）特公昭５７−１８８７９記載のフザリウム（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ ）属の真菌、（３）ｔ￥ｆ公昭５７−３０４
７９記載のセファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏ
ｒｉｕｍ ）属の真菌、あるいは（４）特開昭５１−１
１２５９４記載のグリオクラディウム（Ｇｌｉｏｃｌａ
ｄｉｕｍ ）属の真菌などが、セフ ７０ヌボリンｃ２
酸化するＤ−アミノ酸酸化酵素生産菌として知られてい
る。
そこで、本発明者らは、７−ＡＣＡの酵素的製造法ある
いは中間体である７β−（５−カルボキシ−５−オキソ
ペンタンアミド）−セファロスポラン酸の酵素的製造法
の開発金目的に、よりすぐれた新規産生菌の探索を行っ
てきた。
いは中間体である７β−（５−カルボキシ−５−オキソ
ペンタンアミド）−セファロスポラン酸の酵素的製造法
の開発金目的に、よりすぐれた新規産生菌の探索を行っ
てきた。
（問題点全解決するための手段および作用）本発明者ら
は、先にシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｓｐ、） Ｓ Ｅ −８３（微工研菌寄第７６
４９号、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１７）がセファロスポリン
Ｃを７ＡＣＡとＤ−α−７ミノアジピン酸に加水分解す
る酵素（セファロスポリンＣアシラーゼ）全産生するこ
と全発見し７’ｃ（特願昭５９−１４１４７５）。また
、シュードモナス・エスピ５Ｅ−４９５（微工研条寄
ＦＦＥＲＭ ＢＰ−８１８）がＳ Ｅ−８３株のセフ
ァロスポリンＣアシラーゼとは理化学的性質の異なるセ
ファロスポリンＣアシラーゼを産生ずること全発見し九
（特願昭６Ｏ−１８７３２７）。さらに、本発明者らは
、５Ｅ−８３株あるいは５Ｅ−４９５株の菌体処理物を
セファロスポリンＣＫ作用させると、７−ＡＣＡト同時
に７β−（５−カルボキシ−５−オキソペンタンアミド
ラ−セファロスポラン酸３よび７β−（４−カルボキシ
ブタンアミド）−セファロスポラン酸が生成すること金
見込出し、その酵素反応機構を解析し友。その結果、セ
ファロスポリンＣｉ７β−（５−カルボキシ−５−オキ
ソペンタンアミド）−セファロスポラン酸に酸化する酵
素が存在すること、および７β−（５−カルボキシ−５
−オキンベンタンアミド）−セファロスポラン酸の７β
−（４−カルボキシブタンアミド）−セファロスポラン
酸への変換は、細胞内で生成する過酸化水素により化学
的に進行することを認めた。さらに、本発明者らは、セ
ファロスポリンＣの該酸化反応を触媒する酵素が、従来
知られていたＤ−アミノ酸酸化酵素ではなく、脱水素酵
素に分類される新規な酵素であることを見い出し、本発
明？完成するに至つ友。
は、先にシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｓｐ、） Ｓ Ｅ −８３（微工研菌寄第７６
４９号、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１７）がセファロスポリン
Ｃを７ＡＣＡとＤ−α−７ミノアジピン酸に加水分解す
る酵素（セファロスポリンＣアシラーゼ）全産生するこ
と全発見し７’ｃ（特願昭５９−１４１４７５）。また
、シュードモナス・エスピ５Ｅ−４９５（微工研条寄
ＦＦＥＲＭ ＢＰ−８１８）がＳ Ｅ−８３株のセフ
ァロスポリンＣアシラーゼとは理化学的性質の異なるセ
ファロスポリンＣアシラーゼを産生ずること全発見し九
（特願昭６Ｏ−１８７３２７）。さらに、本発明者らは
、５Ｅ−８３株あるいは５Ｅ−４９５株の菌体処理物を
セファロスポリンＣＫ作用させると、７−ＡＣＡト同時
に７β−（５−カルボキシ−５−オキソペンタンアミド
ラ−セファロスポラン酸３よび７β−（４−カルボキシ
ブタンアミド）−セファロスポラン酸が生成すること金
見込出し、その酵素反応機構を解析し友。その結果、セ
ファロスポリンＣｉ７β−（５−カルボキシ−５−オキ
ソペンタンアミド）−セファロスポラン酸に酸化する酵
素が存在すること、および７β−（５−カルボキシ−５
−オキンベンタンアミド）−セファロスポラン酸の７β
−（４−カルボキシブタンアミド）−セファロスポラン
酸への変換は、細胞内で生成する過酸化水素により化学
的に進行することを認めた。さらに、本発明者らは、セ
ファロスポリンＣの該酸化反応を触媒する酵素が、従来
知られていたＤ−アミノ酸酸化酵素ではなく、脱水素酵
素に分類される新規な酵素であることを見い出し、本発
明？完成するに至つ友。
これらの発見に基づく本発明は、一般式ＣＩ）（式中、
Ｒ２は一０ＣＯＣＨ３、−Ｈま之は−ＯＨを示す。）で
表わされる化合物まｔはその塩に、土壌より分離された
シュードモナス属に属する細菌の培養物ま九はその処理
物を作用させ、一般式〇０ＯＨ （式中、Ｒ１は前記と同じ意味金有し、Ｒ２はＨＯＯＣ
−Ｃｏ−プたはＨＯＯＣ−である。）で表わされる化合
物またはその塩を製造すること全特徴としている。
Ｒ２は一０ＣＯＣＨ３、−Ｈま之は−ＯＨを示す。）で
表わされる化合物まｔはその塩に、土壌より分離された
シュードモナス属に属する細菌の培養物ま九はその処理
物を作用させ、一般式〇０ＯＨ （式中、Ｒ１は前記と同じ意味金有し、Ｒ２はＨＯＯＣ
−Ｃｏ−プたはＨＯＯＣ−である。）で表わされる化合
物またはその塩を製造すること全特徴としている。
５Ｅ−８３株は北海道の土壌から分離された細菌であっ
て、分類学的研究の結果、シュードモプス０デミニュー
タ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｒｒａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ）
４に近縁ではあるが、これと異なる新種であると判定
されている（％以餡５９−１４．１１７５ ）。一方、
５Ｅ−４９５株は山口基の土壌から分ｉ Ｊ ｆＬ友細
菌であって、分類学的研究の結果、シュードモナス・デ
ミニュータ櫨に属すると同定されている（特願昭６Ｏ−
１８７５２７）。
て、分類学的研究の結果、シュードモプス０デミニュー
タ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｒｒａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ）
４に近縁ではあるが、これと異なる新種であると判定
されている（％以餡５９−１４．１１７５ ）。一方、
５Ｅ−４９５株は山口基の土壌から分ｉ Ｊ ｆＬ友細
菌であって、分類学的研究の結果、シュードモナス・デ
ミニュータ櫨に属すると同定されている（特願昭６Ｏ−
１８７５２７）。
本発明に係る酵素かＤ−アミノ酸酸化酵素でなく脱水素
酵素であることは、次のようにして明らかにされている
。すなわち、Ｄ−アミノ酸酸化酵素によって触媒される
脱アミン化反応においては、過酸化水素が生成すること
が知られており、この過酸化水素は、例えば、４−アミ
ノアンチピリンあるいＦｉＯ−ジアニシジンを使用する
例えば臨床検査、２２巻、１２３２頁、１９７８年記載
の発色法によって検出することができる。しかし、本発
明に係る酵素を部分精製して酵素反応を行うと、過酸化
水素の発生は検出されないことから、該酵素はＤ−アミ
ノ酸酸化酵素でないことがわかる。
酵素であることは、次のようにして明らかにされている
。すなわち、Ｄ−アミノ酸酸化酵素によって触媒される
脱アミン化反応においては、過酸化水素が生成すること
が知られており、この過酸化水素は、例えば、４−アミ
ノアンチピリンあるいＦｉＯ−ジアニシジンを使用する
例えば臨床検査、２２巻、１２３２頁、１９７８年記載
の発色法によって検出することができる。しかし、本発
明に係る酵素を部分精製して酵素反応を行うと、過酸化
水素の発生は検出されないことから、該酵素はＤ−アミ
ノ酸酸化酵素でないことがわかる。
−万、部分子ＩＩ裂しｔ該酵素を用いる反応に、例えば
、フエナジンメソサルフエイト、２，６−シクロルフエ
ノールインドフエノールあるいはベンゾキノンを添加し
ないと酵素反応が進行しない。反応系に添加されたこれ
らのものは、一般的に電子受容体として知られているも
のである。したがって、本発明に係る酵素は、酸化酵素
ではなく脱水素酵ｆ、に分類されるものであることがわ
かる。
、フエナジンメソサルフエイト、２，６−シクロルフエ
ノールインドフエノールあるいはベンゾキノンを添加し
ないと酵素反応が進行しない。反応系に添加されたこれ
らのものは、一般的に電子受容体として知られているも
のである。したがって、本発明に係る酵素は、酸化酵素
ではなく脱水素酵ｆ、に分類されるものであることがわ
かる。
上記のように、本脱水素酵素の作用には電゛子受容体が
必要であるが、酵素反応液中に存在する細胞由来の電子
受容体が細胞由来の呼吸系で再生される条件下では、こ
れらの添加なしに反応は進行する。しかし、呼吸阻害剤
、例えば、シアン化カリウムあるいはヒドロキシルアミ
ンなどの存在下では、細胞由来の電子受容体が再生され
ないので、酵素反応の進行には、前記の電子受容体の添
加が必要である。
必要であるが、酵素反応液中に存在する細胞由来の電子
受容体が細胞由来の呼吸系で再生される条件下では、こ
れらの添加なしに反応は進行する。しかし、呼吸阻害剤
、例えば、シアン化カリウムあるいはヒドロキシルアミ
ンなどの存在下では、細胞由来の電子受容体が再生され
ないので、酵素反応の進行には、前記の電子受容体の添
加が必要である。
なお、本脱水素酵素は、セファロスポリンＣ以外の化合
物（Ｉ）にも作用し、対応する化合物ｏを生成する。
物（Ｉ）にも作用し、対応する化合物ｏを生成する。
次に、本発明に係る微生物を用いて化合物（Ｉ）から化
合物（Ｄを製造する方法について説明する。
合物（Ｄを製造する方法について説明する。
培養は発酵工業における通常の培養法に準じて行うこと
ができる。培地成分としては、一般微生物の栄養源とし
て公知のものが使用され、例えば、炭素源として撞々の
有機酸類、望素源として大豆粉、小麦胚芽、肉エキス、
ペプトン、コーンステイープリカー、酵母エキス等？使
用することができる。その他必要に応じて、マグネシウ
ム塩、リン酸塩、カルシウム塩などの無機塩類、ビタミ
ン類などの種々の生育促進物質、きらには、酵素活性を
促進する目的でアミノ酸類、例えば、アラニン、メチオ
ニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、α−アミノアジ
ピン酸などのＤ一体あるいはＤＬ一体全適宜組合わせて
使用してもよい。培養方法としては、好気的な液体培養
法が適している。培養温度＃′ｉ２５〜５２Ｃの範囲で
選べばよい。培養時間は活性が最大を示す時点に培＃を
止めればよく、通常２〜４日間が適当である。
ができる。培地成分としては、一般微生物の栄養源とし
て公知のものが使用され、例えば、炭素源として撞々の
有機酸類、望素源として大豆粉、小麦胚芽、肉エキス、
ペプトン、コーンステイープリカー、酵母エキス等？使
用することができる。その他必要に応じて、マグネシウ
ム塩、リン酸塩、カルシウム塩などの無機塩類、ビタミ
ン類などの種々の生育促進物質、きらには、酵素活性を
促進する目的でアミノ酸類、例えば、アラニン、メチオ
ニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、α−アミノアジ
ピン酸などのＤ一体あるいはＤＬ一体全適宜組合わせて
使用してもよい。培養方法としては、好気的な液体培養
法が適している。培養温度＃′ｉ２５〜５２Ｃの範囲で
選べばよい。培養時間は活性が最大を示す時点に培＃を
止めればよく、通常２〜４日間が適当である。
化合物ＣＩ）から化合物ＱＩＤ全製造するにあたっては
、本脱水素酵素が細胞内に蓄積されるので、上記の方法
で得られた培養液から遠心分離などの方法で細胞金集め
た細胞懸濁液の形で使用できるし、基質の細胞膜透過性
を高めるために、超音波処理などの物理的処理、あるい
は有機溶媒処理などの化学的処理を行った細胞懸濁液の
形でも使用できる。
、本脱水素酵素が細胞内に蓄積されるので、上記の方法
で得られた培養液から遠心分離などの方法で細胞金集め
た細胞懸濁液の形で使用できるし、基質の細胞膜透過性
を高めるために、超音波処理などの物理的処理、あるい
は有機溶媒処理などの化学的処理を行った細胞懸濁液の
形でも使用できる。
ま之、本脱水素酵素は、細胞内の細胞膜に結合して存在
するので、細胞金屑い物理的あるいは化学的処理を行っ
た後、細胞液を除いて得られる細胞液除去細胞あるいは
細胞膜結合酵素液が使用できる。そして、これら細胞処
理物を、さらに物理的あるいは化学的処理、例えば、超
音波処理あるいは界面活性剤処理などを加えて可溶化し
た無細胞抽出酵素液も使用できる。
するので、細胞金屑い物理的あるいは化学的処理を行っ
た後、細胞液を除いて得られる細胞液除去細胞あるいは
細胞膜結合酵素液が使用できる。そして、これら細胞処
理物を、さらに物理的あるいは化学的処理、例えば、超
音波処理あるいは界面活性剤処理などを加えて可溶化し
た無細胞抽出酵素液も使用できる。
このように調製された培養物ま之はその処理物を用いて
化合物但ヲ段進する反応は、水性溶媒中で行われ、反応
ｐＨは７．０〜８．５、反応＠度は２５〜４０Ｃの範囲
が望ましい。本発明で使用する培養物あるいはその処理
物が電子受容体の再生機能を有している場合には、酸素
補給のために十分攪拌するだけで反応は進行する。しか
し、本発明に係る酵素反応の進行には電子受容体、例え
ば、コエンザイムＱ６、コエンザイムＱＩ０、フエナシ
ンメノサルフエイト、２．６−シクロルフエノールイン
ドフエノール、あるいはベンゾキノン金適当盆添加する
ことが望ましい。
化合物但ヲ段進する反応は、水性溶媒中で行われ、反応
ｐＨは７．０〜８．５、反応＠度は２５〜４０Ｃの範囲
が望ましい。本発明で使用する培養物あるいはその処理
物が電子受容体の再生機能を有している場合には、酸素
補給のために十分攪拌するだけで反応は進行する。しか
し、本発明に係る酵素反応の進行には電子受容体、例え
ば、コエンザイムＱ６、コエンザイムＱＩ０、フエナシ
ンメノサルフエイト、２．６−シクロルフエノールイン
ドフエノール、あるいはベンゾキノン金適当盆添加する
ことが望ましい。
ところで、本発明に係る細菌は、いずれもセファロスポ
リンＣアシラーゼおよび７β−（４−カルボキシブタン
アミド）−セファロスポラン酸をゲルタール酸と７−Ａ
ＣＡに加水分解するアシラーゼを産生じている。したが
って、化合物（Ｉ）から化合物（ＥＤ金製造する場合、
ｊ＠女物あるいはその処理物が、これらのアシラーゼを
含む場合は７−ＡＣＡが副生する。しかし、これらの７
シラーゼは細胞質中に存在し、一方、本脱水素酵素は細
胞膜に結合して存在する。よって、副反Ｇｋおこすアシ
ラーゼは、細胞および細胞膜から、例えば弱い超音波処
理をした後、司溶画分を除けば除去されるので、該アシ
ラーゼ活性を除い友処理物を容易に調製することができ
る。
リンＣアシラーゼおよび７β−（４−カルボキシブタン
アミド）−セファロスポラン酸をゲルタール酸と７−Ａ
ＣＡに加水分解するアシラーゼを産生じている。したが
って、化合物（Ｉ）から化合物（ＥＤ金製造する場合、
ｊ＠女物あるいはその処理物が、これらのアシラーゼを
含む場合は７−ＡＣＡが副生する。しかし、これらの７
シラーゼは細胞質中に存在し、一方、本脱水素酵素は細
胞膜に結合して存在する。よって、副反Ｇｋおこすアシ
ラーゼは、細胞および細胞膜から、例えば弱い超音波処
理をした後、司溶画分を除けば除去されるので、該アシ
ラーゼ活性を除い友処理物を容易に調製することができ
る。
本発明の実施においては、化合物（Ｉ）ｋ含む溶液中に
培養物またはその処理物を発散させて、＠濁液として反
るさせることができる。あるいは培養物またはその処理
物に常用の過当な処理を加えて。
培養物またはその処理物を発散させて、＠濁液として反
るさせることができる。あるいは培養物またはその処理
物に常用の過当な処理を加えて。
固定化菌体処理物または固定化酵素を調製し、これ金力
ラムに充填し、適当な緩衝液に溶解した化合物（Ｉ）
金、このカラム内を通過させる形で反応させることもで
きる。反応時間は化合物（Ｉ）の濃度と使用条件などで
決定されるが、通常１〜１０時間である。
ラムに充填し、適当な緩衝液に溶解した化合物（Ｉ）
金、このカラム内を通過させる形で反応させることもで
きる。反応時間は化合物（Ｉ）の濃度と使用条件などで
決定されるが、通常１〜１０時間である。
本発明で使用する培養物あるいはその処理物が過酸化水
素生成機能？有していれば、化合物（１）から生成する
化合物０は、一部が７β−（４−カルボキシブタンアミ
ド）−セファロスポラン酸化合物となり、過酸化水素生
成がなければ、生成する化合物０は、主として７β−（
５−カルボキシ−５−オキソペンタンアミド）−セファ
ロスポラン酸化合物となる。
素生成機能？有していれば、化合物（１）から生成する
化合物０は、一部が７β−（４−カルボキシブタンアミ
ド）−セファロスポラン酸化合物となり、過酸化水素生
成がなければ、生成する化合物０は、主として７β−（
５−カルボキシ−５−オキソペンタンアミド）−セファ
ロスポラン酸化合物となる。
反応生成物が７β−（５−カルボキシ−５−オキソペン
タンアミド）−セファロスポラン酸化合物である場合、
まｔは本化合物と７β−（４−カルボキシブタンアミド
）−セファロスポラン酸化合物の混合物である場合は、
酵素反応終了後、過酸化水素を作用させて、７β−（５
−カルボキシ−５−オキソペンタンアミド）−セファロ
スポラン酸化合物を７β−（４−カルボキシブタンアミ
ド）−セファロスポラン酸化合物に誘導することが望ま
しい。
タンアミド）−セファロスポラン酸化合物である場合、
まｔは本化合物と７β−（４−カルボキシブタンアミド
）−セファロスポラン酸化合物の混合物である場合は、
酵素反応終了後、過酸化水素を作用させて、７β−（５
−カルボキシ−５−オキソペンタンアミド）−セファロ
スポラン酸化合物を７β−（４−カルボキシブタンアミ
ド）−セファロスポラン酸化合物に誘導することが望ま
しい。
上記の方法で生成し北化合物但は、公知の溶媒抽出法、
公知の種々の樹脂全使用する方法、あるいは等電点沈殿
法などを適宜使用することにより単離される。
公知の種々の樹脂全使用する方法、あるいは等電点沈殿
法などを適宜使用することにより単離される。
なお、生成し文化合物■の定量には、高速液体クロマト
グラフィーが用すられる。カラムはマイクロホンタハツ
ク（μｍ Ｂｏｎｄａｐａｋ ） Ｃ１ｇ （ウォータ
ーズ社製）を用い、移動相としては５チ酢酸アンモニウ
ムとアセトニトリルの混合液を用Ａる。
グラフィーが用すられる。カラムはマイクロホンタハツ
ク（μｍ Ｂｏｎｄａｐａｋ ） Ｃ１ｇ （ウォータ
ーズ社製）を用い、移動相としては５チ酢酸アンモニウ
ムとアセトニトリルの混合液を用Ａる。
アセトニトリルの量は１ ／ １００容から１／１０容
の範囲で適宜選択する。検出は２６０ ｎｍで行う。
の範囲で適宜選択する。検出は２６０ ｎｍで行う。
（実施例）
実施例１
肉エキス０．２％、酵母エキス０．２％、ヘフトン０．
５％、グルタミン酸ソーダ０．５％、硫鍍マグネンウム
ｏ、ｏ ｏ ｓ％、Ｄ−アスパラギン酸０−２％の組成
からなる培地（ｐＨ７，０）１５１を５０を容量ジャー
ファーメンタ−に仕込み、１２０Ｃ，３０分殺菌後、予
め同培地で前培養し之シュードモナス・エスピー・５Ｅ
−８５ｆ２％になるように植菌した。２５Ｃで４８時間
培養後、函体を遠心分離により染め、生理食塩水で洗浄
後、湿脳体４８１を得た。この湿菌体１０７をＱ、Ｑ５
Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，５）４０ゴに懸濁し、５Ｃ
で超音波細胞破砕約２分処理後、遠心分離により司溶画
分金除い友。次に、上記緩衝液６０ゴに再度懸濁し、５
Ｃで超音波細胞破砕約２０分処理後、遠心分離により固
形物を除去し、無細胞抽出酵素液６〇−を調製した。
５％、グルタミン酸ソーダ０．５％、硫鍍マグネンウム
ｏ、ｏ ｏ ｓ％、Ｄ−アスパラギン酸０−２％の組成
からなる培地（ｐＨ７，０）１５１を５０を容量ジャー
ファーメンタ−に仕込み、１２０Ｃ，３０分殺菌後、予
め同培地で前培養し之シュードモナス・エスピー・５Ｅ
−８５ｆ２％になるように植菌した。２５Ｃで４８時間
培養後、函体を遠心分離により染め、生理食塩水で洗浄
後、湿脳体４８１を得た。この湿菌体１０７をＱ、Ｑ５
Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，５）４０ゴに懸濁し、５Ｃ
で超音波細胞破砕約２分処理後、遠心分離により司溶画
分金除い友。次に、上記緩衝液６０ゴに再度懸濁し、５
Ｃで超音波細胞破砕約２０分処理後、遠心分離により固
形物を除去し、無細胞抽出酵素液６〇−を調製した。
得られた酵素液に、セファロスポリンＣ（純度７０％）
６００ηとフエナジンメンサルフエイト１５０・π９全
祭加し、３７Ｕで４時間中分攪、拌しｌがら反［６を行
った。反応終了液中の７β−（５−カルボキシ−５−オ
キソペンタンアミド）−セファロスポラン酸の生成ｆｄ
５２Ｉｎ９．７β−（４−カルボキシブタンアミド）−
セファロスポラン酸の生収量は７〜であった。
６００ηとフエナジンメンサルフエイト１５０・π９全
祭加し、３７Ｕで４時間中分攪、拌しｌがら反［６を行
った。反応終了液中の７β−（５−カルボキシ−５−オ
キソペンタンアミド）−セファロスポラン酸の生成ｆｄ
５２Ｉｎ９．７β−（４−カルボキシブタンアミド）−
セファロスポラン酸の生収量は７〜であった。
反応終了液に１０チ過暇化水素１ｒｎｔ全攪拌しながら
添加し、次に、塩酸でｐＨ２，Ｄに調製し、酢酸エチル
６０−で２回抽出した後、酢酸エチル層を無水硫酸ナト
リウムで乾燥後、減圧ｊ縮乾固した。これを重ｄ金含む
水で溶解してｐ Ｈ７，０としｆｃ後、予め０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐ Ｈ３，０） テ洗ったダイヤイオンＨ
Ｐ−２０（三菱化成製）１０〇−のカラム全通過させ、
次に、脱イオン水でカラムを水洗した後、５０チメタノ
ール水で溶出し友。
添加し、次に、塩酸でｐＨ２，Ｄに調製し、酢酸エチル
６０−で２回抽出した後、酢酸エチル層を無水硫酸ナト
リウムで乾燥後、減圧ｊ縮乾固した。これを重ｄ金含む
水で溶解してｐ Ｈ７，０としｆｃ後、予め０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐ Ｈ３，０） テ洗ったダイヤイオンＨ
Ｐ−２０（三菱化成製）１０〇−のカラム全通過させ、
次に、脱イオン水でカラムを水洗した後、５０チメタノ
ール水で溶出し友。
７β−（４−カルボキシブタンアミド）−セファロスポ
ラン酸の溶出画分を果め減圧譲縮後、ｐＨ３，０ＫＦＡ
節し、冷所に放置し九ところ、結晶が析出した。この結
晶を集め真空乾燥したところ、２１〜の７β−（４−カ
ルボキシブタンアミド）−セファロスポラン酸を得之。
ラン酸の溶出画分を果め減圧譲縮後、ｐＨ３，０ＫＦＡ
節し、冷所に放置し九ところ、結晶が析出した。この結
晶を集め真空乾燥したところ、２１〜の７β−（４−カ
ルボキシブタンアミド）−セファロスポラン酸を得之。
この純度は７４％であった。
実施例２
実施例１と同様の方法で得られ定酵素液６０ゴに、セフ
ァロスポリンＣ（純度７０チ） ３００ ｍ９と１，４
−ベンゾキノン５５ ”Ｑ 金ｌｉｄ、１１１０し、３
７Ｃで４時間中分攪拌しながら反応を行った。反応終了
液中の７β−（５−カルボキン−５−オキソペンタンア
ミド）−セファロスポラン酸の生成率は２３％であった
。
ァロスポリンＣ（純度７０チ） ３００ ｍ９と１，４
−ベンゾキノン５５ ”Ｑ 金ｌｉｄ、１１１０し、３
７Ｃで４時間中分攪拌しながら反応を行った。反応終了
液中の７β−（５−カルボキン−５−オキソペンタンア
ミド）−セファロスポラン酸の生成率は２３％であった
。
実施例５
実施例１と同様の方法で得られ几酵素液６０ゼに、デア
セチルセファロスポリンＣ（ＭＩＩｆ６５％）３００〜
、あるｂはデアセトキシセファロスポリンＣ（ｆ４度６
０％）２５０■とフエナジンメンサルフエイト１５０〜
を添加して反応ヲ行ったところ、７β−（５−カルボキ
シ−５−オキソペンタンアミド）−デアセチルセファロ
スポラン酸あるいは７β−（５−カルボキシ−５−オキ
ソペンタンアミド）−デアセトキンセファロスボラン酸
の生成率は、それぞれ２６％、２１％であった。
セチルセファロスポリンＣ（ＭＩＩｆ６５％）３００〜
、あるｂはデアセトキシセファロスポリンＣ（ｆ４度６
０％）２５０■とフエナジンメンサルフエイト１５０〜
を添加して反応ヲ行ったところ、７β−（５−カルボキ
シ−５−オキソペンタンアミド）−デアセチルセファロ
スポラン酸あるいは７β−（５−カルボキシ−５−オキ
ソペンタンアミド）−デアセトキンセファロスボラン酸
の生成率は、それぞれ２６％、２１％であった。
実施例４
実施例１と同様な方法で取得したシュードモナス・エス
ピー・５Ｅ−８５の湿菌体１０ｙを０．０５Ｍリン酸緩
衝液（ｐ Ｈ７，５） ６０−に懸濁し、さらにクロロ
ホルム１ｊ−ｉ添加し、３２Ｃで約１０分はげしく攪拌
したもの全酵素液とした。得られ次酵素液にセファロス
ポリンＣ（Ｍ１度７０％）３００〜を添加し、３７Ｃで
５時間中分攪拌しながら反応を行った。反応終了液中の
７β−（５−カルボキシ−５−オキソペンタンアミド）
−セファロスポラン酸および７β−（４−カルボキシブ
タンアミド）−セファロスポラン酸の生成率は、それぞ
れ７．６チ、１．４％であった。
ピー・５Ｅ−８５の湿菌体１０ｙを０．０５Ｍリン酸緩
衝液（ｐ Ｈ７，５） ６０−に懸濁し、さらにクロロ
ホルム１ｊ−ｉ添加し、３２Ｃで約１０分はげしく攪拌
したもの全酵素液とした。得られ次酵素液にセファロス
ポリンＣ（Ｍ１度７０％）３００〜を添加し、３７Ｃで
５時間中分攪拌しながら反応を行った。反応終了液中の
７β−（５−カルボキシ−５−オキソペンタンアミド）
−セファロスポラン酸および７β−（４−カルボキシブ
タンアミド）−セファロスポラン酸の生成率は、それぞ
れ７．６チ、１．４％であった。
実施例５
実施例１と同様な方法でシュードモナス・エスピー・５
Ｂ−４９５ｉジャーファーメンタ−で培誉し、一体を集
めたところ、湿田体５２１を得之。
Ｂ−４９５ｉジャーファーメンタ−で培誉し、一体を集
めたところ、湿田体５２１を得之。
この湿菌体１０１を０．０５Ｍリン酸緩４ＪｆＩ液（ｐ
Ｈ７，５） ４０−に憑濁し、５Ｃで超音波４ｄ胞破砕
約２分処理後、遠心分離により可溶画分を除き、沈殿画
分全上記緩衝液６０−に再度懸濁しｔものを酵素液とし
た。得られた酵素液に、セファロスポリンＣ（Ｍ度７０
％） ５００１％ｌとフエナジンメノサルフエイ）５０
ｔｔＱｆ添加し、３７Ｃで５時間中分攪拌しながら反ら
全行つ九。反乙終了液中の７β−（５−カルボキシ−５
−オキソペンタンアミド）−セファロスポラン酸お上ひ
７β−（４−カルボキシブタンアミド）−セファロスポ
ラン酸の生成率は、−すれぞれ２２チ、５．２チであっ
た。
Ｈ７，５） ４０−に憑濁し、５Ｃで超音波４ｄ胞破砕
約２分処理後、遠心分離により可溶画分を除き、沈殿画
分全上記緩衝液６０−に再度懸濁しｔものを酵素液とし
た。得られた酵素液に、セファロスポリンＣ（Ｍ度７０
％） ５００１％ｌとフエナジンメノサルフエイ）５０
ｔｔＱｆ添加し、３７Ｃで５時間中分攪拌しながら反ら
全行つ九。反乙終了液中の７β−（５−カルボキシ−５
−オキソペンタンアミド）−セファロスポラン酸お上ひ
７β−（４−カルボキシブタンアミド）−セファロスポ
ラン酸の生成率は、−すれぞれ２２チ、５．２チであっ
た。
（発明の効果）
本発明者らは、化合物（Ｉ）から化合物０への反応を触
媒する組方を有する微生物を探索し、シュードモナス・
エスピー・５Ｅ−８３およびシュードモナス・エスピー
・５Ｅ−４９５が、該反応金触媒する新規な脱水素酸素
を生産することを発見した。これらの発見に基づき、実
施例に示す如く、化合＠（Ｉ）から化合物０を製造する
新規な方法が確立され友。
媒する組方を有する微生物を探索し、シュードモナス・
エスピー・５Ｅ−８３およびシュードモナス・エスピー
・５Ｅ−４９５が、該反応金触媒する新規な脱水素酸素
を生産することを発見した。これらの発見に基づき、実
施例に示す如く、化合＠（Ｉ）から化合物０を製造する
新規な方法が確立され友。
代理人 清 水 猛□パ・、
ｑ４・７１．２．）
Claims (3)
- （１）一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒ＿１は−ＯＣＯＣＨ＿３、−Ｈまたは−ＯＨ
を示す。）で表わされる化合物またはその塩にシュード
モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物の
培養物またはその処理物を作用させることを特徴とする
一般式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中、Ｒ＿１は−ＯＣＯＣＨ＿３、−Ｈまたは−ＯＨ
、Ｒ＿２はＨＯＯＣ−ＣＯ−またはＨＯＯＣ−を示す。 ）で表わされる化合物またはその塩の製造法。 - （２）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に
属する微生物がシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．）ＳＥ−８３（微工研菌寄第７６
４９号、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１７）である特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - （３）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に
属する微生物がシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＳＥ−４９５（微工研条寄ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−８１８）である特許請求の範囲第１項記載の
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24619485A JPS62107798A (ja) | 1985-11-05 | 1985-11-05 | セフアロスポリン誘導体の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24619485A JPS62107798A (ja) | 1985-11-05 | 1985-11-05 | セフアロスポリン誘導体の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62107798A true JPS62107798A (ja) | 1987-05-19 |
Family
ID=17144908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24619485A Pending JPS62107798A (ja) | 1985-11-05 | 1985-11-05 | セフアロスポリン誘導体の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62107798A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002086143A3 (en) * | 2001-04-19 | 2003-01-09 | Bioferma Murcia S A | Enzymatic process for preparing cephalosporin derivatives |
-
1985
- 1985-11-05 JP JP24619485A patent/JPS62107798A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002086143A3 (en) * | 2001-04-19 | 2003-01-09 | Bioferma Murcia S A | Enzymatic process for preparing cephalosporin derivatives |
| WO2002085914A3 (en) * | 2001-04-19 | 2003-02-06 | Bioferma Murcia S A | ENZYMATIC PROCESS FOR PREPARING CEPHALOSPORANIC ACID DERIVATIVES USING α-KETOACID DERIVATIVES |
| US6642020B2 (en) | 2001-04-19 | 2003-11-04 | Bioferma Murcia S.A. | Process for preparing cephalosporin derivatives |
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