JPH09247A - Ｄ−乳酸脱水素酵素およびその製造法 - Google Patents
Ｄ−乳酸脱水素酵素およびその製造法Info
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- JPH09247A JPH09247A JP7156470A JP15647095A JPH09247A JP H09247 A JPH09247 A JP H09247A JP 7156470 A JP7156470 A JP 7156470A JP 15647095 A JP15647095 A JP 15647095A JP H09247 A JPH09247 A JP H09247A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 安定性に優れ、比活性の高いＤ−乳酸脱水素
酵素を提供する。 【構成】 以下の理化学的性質を有するＤ−乳酸脱水素
酵素。 （１）作用：下記反応式の反応を触媒する。 【化１】 （２）安定性：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
中、グリセリン、または牛血清アルブミン存在下、室温
で１カ月放置後、９０％以上の残存活性を有する。 （３）比活性：ピルビン酸還元反応において、２０００
Ｕ／ｍｇ protein以上（測定温度３０℃） （４）分子量：約８万〜８．５万（セファデックスＧ−
１００ゲル濾過クロマトグラフィー法） （５）至適ｐＨ範囲（ピルビン酸還元反応）：７〜８ （６）安定ｐＨ領域：５〜１１ （７）作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲
（リン酸緩衝液ｐＨ７．５）
酵素を提供する。 【構成】 以下の理化学的性質を有するＤ−乳酸脱水素
酵素。 （１）作用：下記反応式の反応を触媒する。 【化１】 （２）安定性：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
中、グリセリン、または牛血清アルブミン存在下、室温
で１カ月放置後、９０％以上の残存活性を有する。 （３）比活性：ピルビン酸還元反応において、２０００
Ｕ／ｍｇ protein以上（測定温度３０℃） （４）分子量：約８万〜８．５万（セファデックスＧ−
１００ゲル濾過クロマトグラフィー法） （５）至適ｐＨ範囲（ピルビン酸還元反応）：７〜８ （６）安定ｐＨ領域：５〜１１ （７）作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲
（リン酸緩衝液ｐＨ７．５）
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、Ｄ−乳酸脱水素酵素
（以下、Ｄ−ＬＤＨと略記する）とその製造法に関する
ものである。さらに詳しくは、この発明は、臨床検査な
どの分野で各種物質の定量分析に有用な、安定性に優
れ、かつ比活性の高いＤ−ＬＤＨとその製造法に関する
ものである。
（以下、Ｄ−ＬＤＨと略記する）とその製造法に関する
ものである。さらに詳しくは、この発明は、臨床検査な
どの分野で各種物質の定量分析に有用な、安定性に優
れ、かつ比活性の高いＤ−ＬＤＨとその製造法に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】近年、酵素は、その反応の安
定性、基質との特異的結合性、および光学的定量化の容
易性などの優れた特異性が注目され、医療分野や食品の
成分分析などに広く触媒として利用されている。これら
の酵素の一つであるＤ−ＬＤＨは、臨床検査などの分野
で各種物質の定量分析に用いられている。具体的には、
血清や尿中のピルビン酸の定量、グルタミン酸・ピルビ
ン酸トランスアミナーゼ（以下ＧＰＴと略記する。）な
どピルビン酸が生成される反応や、ピルビン酸キナーゼ
の酵素活性測定等に用いられている。また、Ｄ−乳酸の
工業的製造にも有用である。
定性、基質との特異的結合性、および光学的定量化の容
易性などの優れた特異性が注目され、医療分野や食品の
成分分析などに広く触媒として利用されている。これら
の酵素の一つであるＤ−ＬＤＨは、臨床検査などの分野
で各種物質の定量分析に用いられている。具体的には、
血清や尿中のピルビン酸の定量、グルタミン酸・ピルビ
ン酸トランスアミナーゼ（以下ＧＰＴと略記する。）な
どピルビン酸が生成される反応や、ピルビン酸キナーゼ
の酵素活性測定等に用いられている。また、Ｄ−乳酸の
工業的製造にも有用である。
【０００３】そして従来は、上記の各種の測定法やＤ−
乳酸の製造には、ラクトバチラス属(Lactobacillus) 、
ロイコノストック属(Leuconostoc) 、スタフィロコッカ
ス属(Staphylococcus)等の微生物（マイクロバイオロジ
カル・レビューズ(Microbiological Reviews) 、４４
巻、１０６〜１３９頁（１９８０年））を由来とするＤ
−ＬＤＨが用いられてきた。
乳酸の製造には、ラクトバチラス属(Lactobacillus) 、
ロイコノストック属(Leuconostoc) 、スタフィロコッカ
ス属(Staphylococcus)等の微生物（マイクロバイオロジ
カル・レビューズ(Microbiological Reviews) 、４４
巻、１０６〜１３９頁（１９８０年））を由来とするＤ
−ＬＤＨが用いられてきた。
【０００４】しかしながら、この従来のＤ−ＬＤＨは、
安定性に欠けており、臨床検査試薬中に組込む際に種々
の安定化剤を添加しなければならない等の問題があっ
た。また、従来のＤ−ＬＤＨは、比活性も高いもので数
百〜１５００Ｕ／ｍｇ protein程度であり、臨床検査試
薬中に組込む場合、充分量の活性を得るためには添加す
る蛋白質が多くなるという問題があった。その結果、酵
素中に含まれる他の夾雑蛋白が試薬中に多く添加される
ことになり、こうした夾雑蛋白の影響を受ける可能性が
あった。
安定性に欠けており、臨床検査試薬中に組込む際に種々
の安定化剤を添加しなければならない等の問題があっ
た。また、従来のＤ−ＬＤＨは、比活性も高いもので数
百〜１５００Ｕ／ｍｇ protein程度であり、臨床検査試
薬中に組込む場合、充分量の活性を得るためには添加す
る蛋白質が多くなるという問題があった。その結果、酵
素中に含まれる他の夾雑蛋白が試薬中に多く添加される
ことになり、こうした夾雑蛋白の影響を受ける可能性が
あった。
【０００５】この発明は、以上の通りの事情を鑑みてな
されたものであり、従来のＤ−ＬＤＨの欠点を解消し、
安定性に優れ、かつ比活性の高いＤ−ＬＤＨとその製造
方法を提供することを目的としている。
されたものであり、従来のＤ−ＬＤＨの欠点を解消し、
安定性に優れ、かつ比活性の高いＤ−ＬＤＨとその製造
方法を提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、以下の理化学的性質を有するＤ
−乳酸脱水素酵素、すなわちＤ−ＬＤＨと、このＤ−Ｌ
ＤＨ生産能を有する菌株を培養し、培養物からＤ−ＬＤ
Ｈを採取することを特徴とするＤ−ＬＤＨの製造法を提
供する。
を解決するものとして、以下の理化学的性質を有するＤ
−乳酸脱水素酵素、すなわちＤ−ＬＤＨと、このＤ−Ｌ
ＤＨ生産能を有する菌株を培養し、培養物からＤ−ＬＤ
Ｈを採取することを特徴とするＤ−ＬＤＨの製造法を提
供する。
【０００７】（１）作用：下記反応式の反応を触媒す
る。
る。
【０００８】
【化２】
【０００９】（２）安定性：１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）中、グリセリン、または牛血清アルブミ
ン存在下、室温で１カ月放置後、９０％以上の残存活性
を有する。 （３）比活性：ピルビン酸還元反応において、２０００
Ｕ／ｍｇ protein以上（測定温度３０℃） （４）分子量：約８万〜８．５万（セファデックスＧ−
１００ゲル濾過クロマトグラフィー法） （５）至適ｐＨ範囲（ピルビン酸還元反応）：７〜８ （６）安定ｐＨ領域：５〜１１ （７）作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲
（リン酸緩衝液ｐＨ７．５） この発明に用いる微生物は、上記性質を有するＤ−ＬＤ
Ｈを産生し得るものであって、その種類には特に限定は
ないが、より具体的には乳酸菌があげられ、その中でも
好適な例として、次の表１、表２、表３および表４に示
した菌学的性質を有するロイコノストック・ラクティス
(Leuconostoc Lactis)ＳＨＯ４７株、ロイコノストック
・ラクティス(Leuconostoc Lactis)ＳＨＯ５４株が例示
される。
（ｐＨ７．０）中、グリセリン、または牛血清アルブミ
ン存在下、室温で１カ月放置後、９０％以上の残存活性
を有する。 （３）比活性：ピルビン酸還元反応において、２０００
Ｕ／ｍｇ protein以上（測定温度３０℃） （４）分子量：約８万〜８．５万（セファデックスＧ−
１００ゲル濾過クロマトグラフィー法） （５）至適ｐＨ範囲（ピルビン酸還元反応）：７〜８ （６）安定ｐＨ領域：５〜１１ （７）作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲
（リン酸緩衝液ｐＨ７．５） この発明に用いる微生物は、上記性質を有するＤ−ＬＤ
Ｈを産生し得るものであって、その種類には特に限定は
ないが、より具体的には乳酸菌があげられ、その中でも
好適な例として、次の表１、表２、表３および表４に示
した菌学的性質を有するロイコノストック・ラクティス
(Leuconostoc Lactis)ＳＨＯ４７株、ロイコノストック
・ラクティス(Leuconostoc Lactis)ＳＨＯ５４株が例示
される。
【００１０】
【表１】
【００１１】
【表２】
【００１２】
【表３】
【００１３】
【表４】
【００１４】この表１、表２、表３および表４に示した
菌学的性質から、バージィのマニュアル・オブ・システ
マティック・バクテリオロジー(Bergey's Mannual of s
ystematic Bacteriology) およびメソッズ・イン・マイ
クロバイオロジー(METHODS IN MICROBIOLOGY) １６巻、
１４７〜１７８頁(Separation of Species of the Genu
s Leuconostoc and Differentiation of the Leuconost
oc from other Lacticacid Bacteria) に基づいて検索
した結果、ＳＨＯ４７株、ＳＨＯ５４株は、共にロイコ
ノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)に属する
細菌と判明したが、生理的性質において既存菌株とは異
なるものがあり、新菌株と判断できるので、それぞれロ
イコノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)ＳＨ
Ｏ４７株、ロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc
lactis)ＳＨＯ５４株と命名し、平成５年１１月１７日
に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し
た。その寄託番号はそれぞれ、生命研菌寄第１３９７０
号、生命研菌寄第１３９７１号である。
菌学的性質から、バージィのマニュアル・オブ・システ
マティック・バクテリオロジー(Bergey's Mannual of s
ystematic Bacteriology) およびメソッズ・イン・マイ
クロバイオロジー(METHODS IN MICROBIOLOGY) １６巻、
１４７〜１７８頁(Separation of Species of the Genu
s Leuconostoc and Differentiation of the Leuconost
oc from other Lacticacid Bacteria) に基づいて検索
した結果、ＳＨＯ４７株、ＳＨＯ５４株は、共にロイコ
ノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)に属する
細菌と判明したが、生理的性質において既存菌株とは異
なるものがあり、新菌株と判断できるので、それぞれロ
イコノストック・ラクティス(Leuconostoc lactis)ＳＨ
Ｏ４７株、ロイコノストック・ラクティス(Leuconostoc
lactis)ＳＨＯ５４株と命名し、平成５年１１月１７日
に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し
た。その寄託番号はそれぞれ、生命研菌寄第１３９７０
号、生命研菌寄第１３９７１号である。
【００１５】この発明における微生物を培養する際に用
いられる栄養培地において、炭素源として、グルコー
ス、シュークロース、マルトース等が使用でき、窒素源
としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ペプ
トン、肉エキス、酵母エキス等の無機または有機物が使
用できる。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナト
リウム、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン等の各塩
類、必要に応じて微量金属塩、ビタミン類などを使用し
てもよい。
いられる栄養培地において、炭素源として、グルコー
ス、シュークロース、マルトース等が使用でき、窒素源
としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ペプ
トン、肉エキス、酵母エキス等の無機または有機物が使
用できる。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナト
リウム、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン等の各塩
類、必要に応じて微量金属塩、ビタミン類などを使用し
てもよい。
【００１６】培養は通常、嫌気的あるいは微好気的な条
件下で行う。培養温度は２０℃から４０℃、好ましくは
３０℃から４０℃、最適には３５℃から４０℃で行う。
このような条件下で３〜３０時間、好ましくは６から１
０時間培養することにより、菌体内にＤ−ＬＤＨが生
成、蓄積される。そして、この発明によってＤ−ＬＤＨ
を製造するには、たとえば上記のごとく微生物を培養
し、培養終了後、遠心分離や濾過などの操作で培養液か
ら菌体を回収し、菌体から粗酵素液を抽出し、精製すれ
ばよい。抽出法には、自己消化、超音波破砕、フレンチ
プレス、界面活性剤処理、リゾチーム処理などいずれを
用いてもよく、こうした処理後、遠心分離により細胞片
を除去し、粗酵素液を得る。粗酵素液については、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせること
により、本発明のＤ−ＬＤＨを単離、精製することがで
きる。イオン交換樹脂としては、Ｑ−セファロースＦＦ
（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−セファロース（ファ
ルマシア社製）など、アフィニティークロマト用樹脂と
しては、チバクロンブルーＨ−ＥＲＤ（ＩＣＩ製）、チ
バクロンイエローＨＥ−３Ｇ、ブルーセファロースＣＬ
−６Ｂ（ファルマシア社製）など、疎水クロマト用樹脂
としては、オクチル−セファロースＣＬ−４Ｂ（ファル
マシア社製）など、ゲル濾過用担体または樹脂として
は、セファデックスＧ−１００などが挙げられる。ま
た、これらのカラムクロマトグラフィーに加え、硫酸ス
トレプトマイシンや硫酸プロタミン処理による除核酸、
硫酸アンモニウム処理によるタンパク質の塩析を行って
もよい。
件下で行う。培養温度は２０℃から４０℃、好ましくは
３０℃から４０℃、最適には３５℃から４０℃で行う。
このような条件下で３〜３０時間、好ましくは６から１
０時間培養することにより、菌体内にＤ−ＬＤＨが生
成、蓄積される。そして、この発明によってＤ−ＬＤＨ
を製造するには、たとえば上記のごとく微生物を培養
し、培養終了後、遠心分離や濾過などの操作で培養液か
ら菌体を回収し、菌体から粗酵素液を抽出し、精製すれ
ばよい。抽出法には、自己消化、超音波破砕、フレンチ
プレス、界面活性剤処理、リゾチーム処理などいずれを
用いてもよく、こうした処理後、遠心分離により細胞片
を除去し、粗酵素液を得る。粗酵素液については、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせること
により、本発明のＤ−ＬＤＨを単離、精製することがで
きる。イオン交換樹脂としては、Ｑ−セファロースＦＦ
（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−セファロース（ファ
ルマシア社製）など、アフィニティークロマト用樹脂と
しては、チバクロンブルーＨ−ＥＲＤ（ＩＣＩ製）、チ
バクロンイエローＨＥ−３Ｇ、ブルーセファロースＣＬ
−６Ｂ（ファルマシア社製）など、疎水クロマト用樹脂
としては、オクチル−セファロースＣＬ−４Ｂ（ファル
マシア社製）など、ゲル濾過用担体または樹脂として
は、セファデックスＧ−１００などが挙げられる。ま
た、これらのカラムクロマトグラフィーに加え、硫酸ス
トレプトマイシンや硫酸プロタミン処理による除核酸、
硫酸アンモニウム処理によるタンパク質の塩析を行って
もよい。
【００１７】
【作用】この発明のＤ−ＬＤＨは、下記反応式の反応を
触媒する。
触媒する。
【００１８】
【化３】
【００１９】そして、その安定性については、前記の通
り、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、グリセ
リン、または牛血清アルブミン存在下、室温で１カ月放
置後、９０％以上の残存活性を有し、比活性は、ピルビ
ン酸還元反応において、２０００Ｕ／ｍｇ protein以上
（測定温度３０℃）で、分子量は、約８万〜８．５万
（セファデックスＧ−１００ゲル濾過クロマトグラフィ
ー法）、至適ｐＨ範囲（ピルビン酸還元反応）は、７〜
８、並びに安定ｐＨ領域は、５〜１１であって、作用適
温の範囲は、２０℃から５０℃までの範囲（リン酸緩衝
液ｐＨ７．５）である。
り、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、グリセ
リン、または牛血清アルブミン存在下、室温で１カ月放
置後、９０％以上の残存活性を有し、比活性は、ピルビ
ン酸還元反応において、２０００Ｕ／ｍｇ protein以上
（測定温度３０℃）で、分子量は、約８万〜８．５万
（セファデックスＧ−１００ゲル濾過クロマトグラフィ
ー法）、至適ｐＨ範囲（ピルビン酸還元反応）は、７〜
８、並びに安定ｐＨ領域は、５〜１１であって、作用適
温の範囲は、２０℃から５０℃までの範囲（リン酸緩衝
液ｐＨ７．５）である。
【００２０】なお、活性の測定は４．０ｍＭのピルビン
酸、０．２ｍＭのＮＡＤＨを含むリン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）に酵素溶液を加え、緩やかに混和した後、分光
光度計で３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定した。な
お測定は、３０℃で行った。１分間に１マイクロモルの
ＮＡＤＨをＮＡＤ+ に変換する酵素量を１単位（Ｕ）と
した。
酸、０．２ｍＭのＮＡＤＨを含むリン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）に酵素溶液を加え、緩やかに混和した後、分光
光度計で３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定した。な
お測定は、３０℃で行った。１分間に１マイクロモルの
ＮＡＤＨをＮＡＤ+ に変換する酵素量を１単位（Ｕ）と
した。
【００２１】以下、実施例を示してさらに詳しくＤ−乳
酸脱水素酵素およびその製造法について説明する。
酸脱水素酵素およびその製造法について説明する。
【００２２】
【実施例】実施例１ グルコース３．０％（重量％を表す。以下同様）、酵母
エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエン酸三ナトリ
ウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、硫
酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫酸マンガン・
四〜五水和物０．００５％、ツイン８０ ０．１％（容
量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２５リットルを３０リ
ットル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で
１５分間滅菌した後、ロイコノストック・ラクティス(L
euconostoc lactis)ＳＨＯ５４株（生命研菌寄第１３９
７１号）を接種し、４０℃で１０時間、２００ｒｐｍで
攪拌し、通気しない条件下、４ＮのＮａＯＨでｐＨを
６．４に調整しながら培養した。遠心分離により菌体を
採取して約１８０ｇの湿菌体を得た。得られた菌体を凍
結状態で保存した。
エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエン酸三ナトリ
ウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、硫
酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫酸マンガン・
四〜五水和物０．００５％、ツイン８０ ０．１％（容
量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２５リットルを３０リ
ットル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で
１５分間滅菌した後、ロイコノストック・ラクティス(L
euconostoc lactis)ＳＨＯ５４株（生命研菌寄第１３９
７１号）を接種し、４０℃で１０時間、２００ｒｐｍで
攪拌し、通気しない条件下、４ＮのＮａＯＨでｐＨを
６．４に調整しながら培養した。遠心分離により菌体を
採取して約１８０ｇの湿菌体を得た。得られた菌体を凍
結状態で保存した。
【００２３】次に、凍結菌体約１００ｇをＥＤＴＡおよ
び２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１Ｌに懸濁し、これに Tri
tonＸ−１００を０．０１％、リゾチームを０．２ｍｇ
／ｍｌ、ＤＮase を０．２ｍｇ／ｍｌになるように添加
し、２時間室温で攪拌後、遠心分離により細胞片を除去
し、Ｄ−ＬＤＨを含む粗酵素液を得た。
び２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１Ｌに懸濁し、これに Tri
tonＸ−１００を０．０１％、リゾチームを０．２ｍｇ
／ｍｌ、ＤＮase を０．２ｍｇ／ｍｌになるように添加
し、２時間室温で攪拌後、遠心分離により細胞片を除去
し、Ｄ−ＬＤＨを含む粗酵素液を得た。
【００２４】この粗酵素液を酢酸を加えｐＨ５．８に調
整し、予め２ｍＭのＭｇＣｌ2 を含む２０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ５．８）で平衡化したチバクロンブルーＨ−
ＥＲＤカラムに通じ、同緩衝液（ｐＨ５．８）で洗浄し
たところ、Ｄ−ＬＤＨはカラムに吸着せず素通りした。
このＤ−ＬＤＨを含む溶液を、１０ｍＭのＭｇＣｌ2を
含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）で平衡化したチ
バクロンイエローＨＥ−３Ｇカラムに通じたところ、Ｄ
−ＬＤＨは吸着した。１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）をカラムに通じ、Ｄ−ＬＤＨ
を溶出した。活性画分を集め濃縮した。このようにして
得られたＤ−ＬＤＨは、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で単一なバンドを与え、精製酵素標品を得ることがで
きた。また、活性の収率は約４０％で、酵素１ｍｇ当た
り約２３００単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素
液を１とすると約２５倍であった。
整し、予め２ｍＭのＭｇＣｌ2 を含む２０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ５．８）で平衡化したチバクロンブルーＨ−
ＥＲＤカラムに通じ、同緩衝液（ｐＨ５．８）で洗浄し
たところ、Ｄ−ＬＤＨはカラムに吸着せず素通りした。
このＤ−ＬＤＨを含む溶液を、１０ｍＭのＭｇＣｌ2を
含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）で平衡化したチ
バクロンイエローＨＥ−３Ｇカラムに通じたところ、Ｄ
−ＬＤＨは吸着した。１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）をカラムに通じ、Ｄ−ＬＤＨ
を溶出した。活性画分を集め濃縮した。このようにして
得られたＤ−ＬＤＨは、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で単一なバンドを与え、精製酵素標品を得ることがで
きた。また、活性の収率は約４０％で、酵素１ｍｇ当た
り約２３００単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素
液を１とすると約２５倍であった。
【００２５】実施例１で得られたＤ−ＬＤＨは、セファ
デックスＧ−１００（ファルマシア社製）ゲル濾過クロ
マトグラフィーにより分子量を測定したところ、約８万
〜８．５万であった。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動においては分子量約４万の位置に単一のバンド
を与えた。また、ｐＨ５〜１１で安定で、ｐＨ７．５で
最大の活性を示した。実施例２ グルコース３．０％（重量％を表す。以下同様）、酵母
エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエン酸三ナトリ
ウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、硫
酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫酸マンガン・
四〜五水和物０．００５％、ツイン８０ ０．１％（容
量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２５リットルを３０リ
ットル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で
１５分間滅菌した後、ロイコノストック・ラクティス(L
euconostoc lactis)ＳＨＯ４７株（生命研菌寄第１３９
７０号）を接種し、４０℃で７時間、１００ｒｐｍで攪
拌し、通気しない条件下、４ＮのＮａＯＨでｐＨを６．
４に調整しながら培養した。遠心分離により菌体を採取
して約１６０ｇの湿菌体を得た。得られた菌体を凍結状
態で保存した。
デックスＧ−１００（ファルマシア社製）ゲル濾過クロ
マトグラフィーにより分子量を測定したところ、約８万
〜８．５万であった。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動においては分子量約４万の位置に単一のバンド
を与えた。また、ｐＨ５〜１１で安定で、ｐＨ７．５で
最大の活性を示した。実施例２ グルコース３．０％（重量％を表す。以下同様）、酵母
エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエン酸三ナトリ
ウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、硫
酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫酸マンガン・
四〜五水和物０．００５％、ツイン８０ ０．１％（容
量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２５リットルを３０リ
ットル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で
１５分間滅菌した後、ロイコノストック・ラクティス(L
euconostoc lactis)ＳＨＯ４７株（生命研菌寄第１３９
７０号）を接種し、４０℃で７時間、１００ｒｐｍで攪
拌し、通気しない条件下、４ＮのＮａＯＨでｐＨを６．
４に調整しながら培養した。遠心分離により菌体を採取
して約１６０ｇの湿菌体を得た。得られた菌体を凍結状
態で保存した。
【００２６】この粗酵素液を酢酸を加えｐＨ５．８に調
整し、予め２ｍＭのＭｇＣｌ2 を含む２０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ５．８）で平衡化したチバクロンブルーＨ−
ＥＲＤカラムに通じ、同緩衝液（ｐＨ５．８）で洗浄し
たところ、Ｄ−ＬＤＨはカラムに吸着せず素通りした。
このＤ−ＬＤＨを含む溶液を、１０ｍＭのＭｇＣｌ2を
含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）で平衡化したチ
バクロンイエローＨＥ−３Ｇカラムに通じたところ、Ｄ
−ＬＤＨは吸着した。１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）をカラムに通じ、Ｄ−ＬＤＨ
を溶出した。活性画分を集め濃縮した。このようにして
得られたＤ−ＬＤＨは、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で単一なバンドを与え、精製酵素標品を得ることがで
きた。また、活性の収率は約４５％で、酵素１ｍｇ当た
り約２４００単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素
液を１とすると約４０倍であった。実施例３ ＳＨＯ５４株から精製したＤ−ＬＤＨの保存安定性を調
べた。Ｄ−ＬＤＨを、２５％グリセロールまたは０．５
％牛血清アルブミンを含む１００ｍＭのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で希釈することにより、１０Ｕ／ｍｌの
濃度のＤ−ＬＤＨ液を調製した。この酵素液を０．５ｍ
ｌずつ１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに分注
し、３０℃の恒温槽で保存した。
整し、予め２ｍＭのＭｇＣｌ2 を含む２０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ５．８）で平衡化したチバクロンブルーＨ−
ＥＲＤカラムに通じ、同緩衝液（ｐＨ５．８）で洗浄し
たところ、Ｄ−ＬＤＨはカラムに吸着せず素通りした。
このＤ−ＬＤＨを含む溶液を、１０ｍＭのＭｇＣｌ2を
含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）で平衡化したチ
バクロンイエローＨＥ−３Ｇカラムに通じたところ、Ｄ
−ＬＤＨは吸着した。１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）をカラムに通じ、Ｄ−ＬＤＨ
を溶出した。活性画分を集め濃縮した。このようにして
得られたＤ−ＬＤＨは、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で単一なバンドを与え、精製酵素標品を得ることがで
きた。また、活性の収率は約４５％で、酵素１ｍｇ当た
り約２４００単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素
液を１とすると約４０倍であった。実施例３ ＳＨＯ５４株から精製したＤ−ＬＤＨの保存安定性を調
べた。Ｄ−ＬＤＨを、２５％グリセロールまたは０．５
％牛血清アルブミンを含む１００ｍＭのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で希釈することにより、１０Ｕ／ｍｌの
濃度のＤ−ＬＤＨ液を調製した。この酵素液を０．５ｍ
ｌずつ１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに分注
し、３０℃の恒温槽で保存した。
【００２７】適当な時間保存した後の残存酵素活性を測
定した。添付した図面の図１は、保存開始時の酵素活性
を１００％として、各保存時間活性をプロットしたもの
である。図１に示したように、この発明のＤ−ＬＤＨ
は、保存開始から３０日後においても、９０％以上の残
存活性を示すことが確認された。
定した。添付した図面の図１は、保存開始時の酵素活性
を１００％として、各保存時間活性をプロットしたもの
である。図１に示したように、この発明のＤ−ＬＤＨ
は、保存開始から３０日後においても、９０％以上の残
存活性を示すことが確認された。
【００２８】
【発明の効果】この発明により、以上詳しく説明したと
おり、安定性に優れかつ高い比活性を有するＤ−ＬＤＨ
が生成され、このＤ−ＬＤＨによって生成ピルビン酸ま
たは存在するピルビン酸を測定する各種測定用試薬や、
Ｄ−乳酸生産への利用が容易となる。
おり、安定性に優れかつ高い比活性を有するＤ−ＬＤＨ
が生成され、このＤ−ＬＤＨによって生成ピルビン酸ま
たは存在するピルビン酸を測定する各種測定用試薬や、
Ｄ−乳酸生産への利用が容易となる。
【図１】この発明のＤ−ＬＤＨの保存安定性試験におけ
る安定性曲線を示した図である。
る安定性曲線を示した図である。
【手続補正書】
【提出日】平成７年１２月１５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 （２）安定性：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
中、グリセリン、または牛血清アルブミン存在下、室温
で１カ月放置後、９０％以上の残存活性を有する。 （３）比活性：ピルビン酸還元反応において、２０００
Ｕ／ｍｇ protein以上（測定温度３０℃） （４）分子量：約８万〜８．５万（セファデックスＧ−
１００ゲル濾過クロマトグラフィー法） （５）至適ｐＨ範囲（ピルビン酸還元反応）：７〜８ （６）安定ｐＨ領域：５〜１１ （７）作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲
（リン酸緩衝液ｐＨ７．５）
中、グリセリン、または牛血清アルブミン存在下、室温
で１カ月放置後、９０％以上の残存活性を有する。 （３）比活性：ピルビン酸還元反応において、２０００
Ｕ／ｍｇ protein以上（測定温度３０℃） （４）分子量：約８万〜８．５万（セファデックスＧ−
１００ゲル濾過クロマトグラフィー法） （５）至適ｐＨ範囲（ピルビン酸還元反応）：７〜８ （６）安定ｐＨ領域：５〜１１ （７）作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲
（リン酸緩衝液ｐＨ７．５）
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】
【化２】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】
【化３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロイ ラッセル 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 近藤 仁司 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 小原 仁実 京都府京都市中京区西ノ京桑原町１ 株式 会社島津製作所三条工場内 (72)発明者 矢幡 雅人 京都府京都市中京区西ノ京桑原町１ 株式 会社島津製作所三条工場内
Claims (2)
- 【請求項１】 以下の理化学的性質を有するＤ−乳酸脱
水素酵素。 （１）作用：下記反応式の反応を触媒する。 【化１】 （２）安定性：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
中、グリセリン、または牛血清アルブミン存在下、室温
で１カ月放置後、９０％以上の残存活性を有する。 （３）比活性：ピルビン酸還元反応において、２０００
Ｕ／ｍｇ protein以上（測定温度３０℃） （４）分子量：約８万〜８．５万（セファデックスＧ−
１００ゲル濾過クロマトグラフィー法） （５）至適ｐＨ範囲（ピルビン酸還元反応）：７〜８ （６）安定ｐＨ領域：５〜１１ （７）作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲
（リン酸緩衝液ｐＨ７．５） - 【請求項２】 請求項１記載のＤ−乳酸脱水素酵素の生
産能を有する菌株を培養し、培養物からＤ−乳酸脱水素
酵素を採取することを特徴とする請求項１のＤ−乳酸脱
水素酵素の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15647095A JP3773283B2 (ja) | 1995-06-22 | 1995-06-22 | Ｄ−乳酸脱水素酵素およびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15647095A JP3773283B2 (ja) | 1995-06-22 | 1995-06-22 | Ｄ−乳酸脱水素酵素およびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09247A true JPH09247A (ja) | 1997-01-07 |
| JP3773283B2 JP3773283B2 (ja) | 2006-05-10 |
Family
ID=15628459
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15647095A Expired - Fee Related JP3773283B2 (ja) | 1995-06-22 | 1995-06-22 | Ｄ−乳酸脱水素酵素およびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3773283B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007075032A (ja) * | 2005-09-15 | 2007-03-29 | Oriental Yeast Co Ltd | Ｄ−乳酸脱水素酵素 |
| KR101326583B1 (ko) * | 2011-02-23 | 2013-11-07 | 주식회사 마크로젠 | 고광학순도의 젖산 생산용 형질전환체 및 이를 이용한 젖산 생산 방법 |
| US9428775B2 (en) | 2011-02-23 | 2016-08-30 | Macrogen Inc. | Transformant for production of lactic acid of high optical purity and method for producing lactic acid using the same |
-
1995
- 1995-06-22 JP JP15647095A patent/JP3773283B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007075032A (ja) * | 2005-09-15 | 2007-03-29 | Oriental Yeast Co Ltd | Ｄ−乳酸脱水素酵素 |
| KR101326583B1 (ko) * | 2011-02-23 | 2013-11-07 | 주식회사 마크로젠 | 고광학순도의 젖산 생산용 형질전환체 및 이를 이용한 젖산 생산 방법 |
| US9428775B2 (en) | 2011-02-23 | 2016-08-30 | Macrogen Inc. | Transformant for production of lactic acid of high optical purity and method for producing lactic acid using the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3773283B2 (ja) | 2006-05-10 |
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