JPH02268679A

JPH02268679A - １，５―アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼの製造法

Info

Publication number: JPH02268679A
Application number: JP1087962A
Authority: JP
Inventors: Kunio Nishii; 西井　國夫; Sachiko Sato; 幸子佐藤; Tsunero Nakamura; 中村　恒郎
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1989-04-10
Filing date: 1989-04-10
Publication date: 1990-11-02
Anticipated expiration: 2012-10-22
Also published as: JP2665681B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は糖尿病の診断マーカーとして期待される、１．
５−アンヒドログルシトール（以下１．５　ＡＧという
）の測定に利用しうる１、５Ａ　Ｃデヒドロゲナーゼの
製造法に関する。１．５ＡＣデヒドロゲナーゼは１．５
Ａ　Ｃを基質としＮＡＤを還元型ＮＡＤに変換する反応
を触媒する酵素である。

〔従来の技術〕

１．５Ａ　Ｃはヒト髄液及び血漿中に存在しある種の疾
患１特に糖尿病において血漿中の量が低下することが報
告されている化合物である。この１．５ＡＧを酵素によ
る酸化反応を用いて定量測定する事ができ、１．５ＡＣ
酸化酵素の需゛要が高まっている。従来の１．５Ａ　Ｃ
デヒドロゲナーゼの製造法としては例えばシュードモナ
ス属に属する微生物を培養し採取する方法（特開昭６２
−７９７８０　）等が知られている。

〔発明が解決しようとする［！Ｉ］ＮＡＤを補酵素とし、１．５ＡＣに高い特異性を示す１
．５ＡＣデヒドロゲナーゼを効率良く生産する新規な製
造法を提供する事である。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は真菌類に属する１、５Ａ　Ｃデヒドロゲナーゼ
生産菌を培地に培養し、得られた菌体を破砕し菌体中に
蓄積した１、５Ａ　Ｃデヒドロゲナーゼを採取すること
による１、５Ａ　Ｇデヒドロゲ介−ゼの製造法に関する
。

本発明に使用される真菌類は１．５Ａ　Ｃデヒドロゲナ
ーゼを生産する能力を有するものであればいずれの菌株
でも良い１例えば、モニリエラ属、プレオスボラ属４コ
クリオボラス属、アルターナリア属、ベスタロチア属、
スコビュラリオブシス属ネクトリア属、カエトミウム属
、ドレクスレラ属。

シリンドロセファラム属、コリネスポラ属、クテノマイ
セス属、べｌ・リエラ属、ヒポマイセス属。

ティラノマイセス属、オイペニシリウム属、ネオザル（
・リア属、セファロスポリウム属、スポロルミエラ属、
セラトシチス属、フイアロセファラ属。

パイソクラミス属、グロメレラ属、マイコゴス属。

カルバラリア属１　シリンドロクラブイウム属、ヒボク
レオ属、グリオクラデイウム属、ゴナトポトリウム属　
エメリセロブシス属、バシデイオポラス属、フィアロマ
イセス属、デイヘテロスポラ属すブリスボラ属、デバリ
オマイセス属、ビナア属ハンセヌラ属に属する微生物、
好ましくはベスタロチア・デイオスビリ（Ｐｅｓｔａｌ
ｏｔｉａ　ｄｉｏｓｐｙｒｉ）ＩＦＯ−５２８２ネクト
リア・デイティッシマ　（Ｎｅｃｔｒｉａ　ｃｌｉｔｉ
ｓｓｉｍａ）　ＩＦＯ−５９９５、ドレクス！ノラ・ジ
ザニエ（Ｄｒｅｅｈｓｌｅｒａ　　ｚｉｚａｎｉａｅ）
　ＩＦＯ−６６３２，アルターナリア゛ソラニ（Ａｌｔ
ｅｒｎａｒｉａ　５ｏｌａｎｉ）ＩＦＯ−７５１７スポ
ロルミエラ・インターメディア（Ｓｐｏｒｏｒｍｉｅｌ
ｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）　ＩＦＯ−８３９２、セ
ラＩ゛号イチス・コエルレッセンス（Ｃｅｒａｔｏｃｙ
ｓｔｉｓｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ）　ＮＦＯ−８６６
８、マイコファエレラ・メロニス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅ
ｒｅｌｌａ　ｏ＋ｅｌｏｎｉＳ）　ＩＦＯ−８１１６不
オザルトリアａｕｒａｔａ）　ＩＦＯ−８７８３，オイペニシリウム
・クルスタセウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　　ｃ
ｒｕｓｔａｃｅｕｍ）　ＩＦＯ−８９３８。

フィアロマイセス・マクロポラス（Ｐｈｉａｌｏｍｙｃ
ｅｓｍａｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）　＋ＦＯ−９３２３　、
サブリスボラ・レフチリネタ（Ｓｕｂｕｌｉｓｐｏｒａ
　ｒｅｃｔｉｌｉｎｅａｔａ）　ＩＦＯ３０１６２　、
　ハンセヌラ・カリホニア（　ｌｌａｎｓｅｎｕｒａｃ
ａｒｉｆｏｎｉａ）　ＩＩＬＩＴ−７３２１　　デバリ
オマイセス・ミソ（Ｄｅｂａｒｙｏ＋ｅｙｅｅｓ　ｍｉ
ｓｏ）　ｌｌ［ＩＴ−７０３６　、　　ビチア・シュー
ドボリモルア（Ｐｉｃｈｉａ　　ｐｓｅｕｄｏｐｏｌｙ
ｍｏｒｈａ））ＩＵＴ−７３３０等があげられる。

上記微生物を培養する培地の栄養源としては微生物の培
養に通常用いられるものが広く使用され。

例えば窒素源としてペプトン、酵母エキス、肉エキス、
麦芽エキス、コーンスチープリカー等の窒素含有天然物
及び塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、グルタミン酸等のアミノ酸などの無機あるい
は有椴の窒素化合物が使用できる．炭素源としては資化
可能な炭素化合物であれば良く．グルコース、シェーク
ロース。

デキストリン、デンプン、糖蜜などが使用できる。

無機塩類としてはリン酸第−カリウム，リン酸第二カリ
ウム，硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄，塩化ナトリウム
などが使用できる．培養は振盪あるいは通気撹拌など好
気的条件が良＜、ｐＨ４〜８好ましくは５〜７．温度２
０〜３５°Ｃ好ましくは２５〜３０’Ｃで行われる．培
養期間は２〜７０通常（４、３〜５日で完了するい上記の方法で培養することにより培養物中，主に菌体中
に１．５Ａ　Ｃデヒドロゲナーゼが生成蓄積する．培養
物中からの１．５Ａ　Ｃデヒドロゲナーゼの採取は例え
ば次のように行う。

培！！終了後培養液を濾過して菌体を得，適当なＪ土岐
中で菌体を破砕し破砕液から遼心分Ｐ等によって上清層
を得る．上清液を通常酵素精製に用いられる方法，例え
ば塩析１存機溶媒沈澱．透析イオン交換カラムクロマト
９ゲル濾過等の方法を用いて処理する．以上のようにし
て１．５Ａ　Ｃデヒドロゲナーゼを採取することができ
る。

（実施例）実施例−１、オイペニシリウム・クルスタセウム　ＩＦＯ−８９３８
による　１．５ＡＣデヒドロゲナーゼの製造グルコース
　０．２％，酵母エキス　０．５％．麦芽エキス１．０
％，ＫＨ２　Ｐｏ．０．２％，ＮａＣｌ０．１　　％、
　　Ｍ　　ｇ　　Ｓ　　Ｏａ　　７　　Ｈ！　　０　０
．０５％、　　　　ＦｅＳＯ４・７Ｈ！　０　０．００
１％、ｐＨ６からなる培地１００ｍ１を５００　ｍ　ｌ
容の三角フラスコに分注し。

１２Ｑ　’Ｃ，１５分間殺菌後オイペニシリウム・クル
スタセウム　ＩＦＯ−８９３９を一白金耳植菌し２７°
Ｃで５日間振盪培養を行った。培養液を濾過し菌体を得
た。

この菌体を０．８５％の食塩水で洗浄後、２倍容のトリ
ス−塩酸緩衝液（０，１Ｍ、　　ｐ　Ｈ１０、１５％グ
リセロール含有）に懸濁した。懸濁液を冷却下でフレン
チプレスにより菌体を破砕し、破砕液を遠心分離（ｌｏ
ｏｏＯｘｇ、　１０分間）して菌体残滓を除去し粗酵素
溶液を得た。この粗酵素溶液に硫酸アンモニウム粉末を
加え攪拌？８解させる。この時析出するタンパク質を遠
心分離（１００００ｘｇ、１０分間）し、各硫酸アンモ
ニウム画分の１．５ＡＧデヒドロゲナーゼ活性を測定す
ると活性は主に５０〜８０％飽和画分に存在した。

さらに上記硫安画分をトリス−塩酸緩衝液（０，１Ｍ、
　　ｐ　Ｈ１０、１５％グリセロール含有）に溶解し透
析膜を用いて脱塩する。脱塩液をＤＥＡＥトヨパール６
５０　カラムに通して酵素を吸着させた後ＮａＣｌをＯ
〜０．３Ｍ含むトリス−塩酸緩衝ｆｉ、（０，１Ｍ、　
　ｐ　Ｈ１０）により酵素を溶出した。

各溶出画分の１．５Ａ　Ｃデヒドロゲナーゼ活性を測定
し活性画分を得た。活性画分をアミコン社のグイアフロ
−ＬＪＦ膜を用いて′ａ縮し酵素液を得た。

この酵素液の活性は６単位／ｍｌであり湿菌体１ｇ当た
り　０．６単位の酵素を得た。

実施例−２第２表に示す微生物による１、５Ａ　Ｃデヒドロゲナー
ゼの製造実施例−１と同様の方法で微生物を培養し、培養液をＩ
Ｉ！過し菌体を得る。この菌体を０．８５％の食塩水で
洗浄後２４ｆＪ容のトリス−塩酸緩衝液（０，１Ｍ、　
　ｐＨ１０、１５％グリセロール含有）にｇ濁した　、
Ｑ　４　液を冷却下でフレンチプレスにより菌体を破砕
し破砕液を遠心分離（１１００００ｘ、　１０分間）し
て菌体残滓を除去し粗酵素溶液を得た。

実施例−３ハンセヌラ・カリホニアｌ１１１Ｔ−７３２１による１
、５ＡＧデヒドロゲナーゼの製造グルコース１％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．
３％、ペプトン０．５％、ＫＨ，Ｐｏ、０．２％Ｍ　ｇ
　Ｓ　Ｏａ　　・７　Ｈ２００，０５％、Ｆｅ５Ｏａ　
　・７Ｈ，００，００１％、ｐＨ６から成る培地１００
　ｍ　ｌを５００　ｍ　ｌ容の三角フラスコに分注し、
１２０°Ｃ１１５分間殺菌後、ハンセヌラ・カリホニア
ＨＵＴ−７３２１を一白金耳植菌し２７℃で３日間振盪
培養した。培養液を遠心分離（１００００χｇ１１０分
間）し菌体を得た。

この菌体を実施例−１と同様の方法で処理し酵素溶液を
得た。

実施例−４ビチア・カルソニー１１ｔｌＴ−７２８４，ビチア・シ
ュードポリモルファ　ＨＵ丁−７３３０による１、５Ａ
Ｇデヒドロゲナーゼの製造実施例−３と同様の方法で微生物を培養し培養液を濾過
し菌体を得た。この菌体を０．８５％の食塩水で洗浄後
２倍容のトリス−塩酸緩衝ｅ　（０，１Ｍ。

ｐ　Ｈ１０，１５％グリセロール含有）に！！、濁した
。懸濁液を冷却下でフレンチプレスにより菌体を破砕し
破砕液を遠心分Ｈ（１００００ｘｇ、１０分間）して菌
体残滓を除去し粗酵素）８液を得た。

（作用）本発明で得られた１、５Ａ　Ｇデヒドロゲナーゼは下記
の性質を示す。

１、実施例−１で得られた１、５Ａ　Ｃデヒドロゲナー
ゼは下記の性質を示す。

■酵素作用１．５Ａ、Ｇを基質としＮＡＤを逮元型ＮＡＤに変換す
る反応を触媒する。

■基質特異性第１表に示すように１．５ＡＣに対して高い特異性を示
した。

■至１！ｉｐＨ第１図に示すように至適ｐＨはｐＨ９〜１１である。

■至適温度第２図に示すように至適温度は３０〜５０°Ｃである■
ＰＨ安定性１単位／ｍｌ（ＬＭ）リス−塩酸緩衝液）の酵素溶液を
各ｐＨで４０°Ｃ１３０分間処理し残存活性を本文記載
の方法で測定した。第３図に示すようにｐ　Ｈ９〜１２
で安定である。

２、実施例−２で得られたＬ５ＡＧデヒドロゲナーゼは
第２表に示す基質特異性を示す。

３、実施例−３で得られた１、５Ａ　Ｃデヒドロゲナー
ゼは下記の性質を示す。

■酵素作用１．５Ａ　Ｃを基質としＮＡＤを還元型ＮＡＤに変喚す
る反応を触媒する。

■基質特異性第３表に示すように１．５Ａ　Ｃに対して高い特異性を
示した。

■￥ａｐＨ第４図に示すように至適ＰＨは９〜１１である。

■至適温度第５図に示すように至適温度は３０〜５０°Ｃである。

■ｐＨ安定性１単位／ｍｌ（ＩＭ）リス−塩酸緩衝液〕の酵素ｆ４’
ａを各ＰＨで４０°Ｃ７３０分間処理し残存活性を本文
記載の方法で測定した。第６図に示すようにｐＨ８〜１
２で安定である。

４゜実施例−４で得られた１、５Ａ　Ｃデヒドロゲナー
ゼは第４表に示す基質特異性を示す。

第１表第２表第３表第４表（１，５ＡＣデヒドロゲナーゼ活性測定法）本発明にお
いて得られた１、５Ａ　Ｃデヒドロゲナーゼの活性は下
記のようにして測定した。

ＩＭｈリス−塩酸環土岐（ｐ　Ｈ１０）０．６　ｍ　１
０、ＯＩＭ　　ＮＡＤ　０．１　　ｍｌ、　０．ＯＯＯ
ＩＭ　　Ｍｎ５Ｏ＝　０．１　ｍ　ｌ、　０．５　Ｍ　
　１．５　ＡＣ０，１ｍ　ｌ、酵素溶液　０．１ｍｌよ
り成る全ｉＥ１．ｏｍｌの酵素含有液を３５゛Ｃで３０
分間反応させ３４０ｎｍの吸光度の増加量を測定する。

酵素−単位は一分間に１μｍｏ１の還元型ＮＡＤを生成
する活性とした。

（発明の効果）本発明は１．５Ａ　Ｃデヒドロゲナーゼの新しい製造法
を提供するものである０本発明で得られる１、５ＡＣデ
ヒドロゲナーゼは第１表、第３表に示される如＜　　１
．５ＡＧに対して高い特異性を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図及び第３１２Ｉはそれぞれ、オイペニシ
リウム・タルスタセウム　ＩＦＯ−８９３８により製造
した１、５Ａ　Ｃデヒドロゲナーゼの主通ＰＨ１至過温
度、ｐＨ安定性を表すグラフである。第４図。第５図及び第６図はそれぞれ、ハンセヌラ・カリホニア
　）ＪＵＴ−７３２１により製造した１、５Ａ　Ｃデヒ
ドロゲナーゼの主通ｐＨ，至適温Ｉｆ、ｐＨ安定性を表
すグラフである。特許出願人　　日太化薬株式会社第１図／／混度０Ｃ負ｑ３図ＨＨ

Claims

【特許請求の範囲】

真菌類に属し１，５−アンヒドログルシトールデヒドロ
ゲナーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に培養し培養
菌体中に、１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲ
ナーゼを生成蓄積させこれを採取する事を特徴とする１
，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼの製造
法。