JPH0767697A - １，５−アンヒドログルシトールの定量方法 - Google Patents
１，５−アンヒドログルシトールの定量方法Info
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- JPH0767697A JPH0767697A JP5243617A JP24361793A JPH0767697A JP H0767697 A JPH0767697 A JP H0767697A JP 5243617 A JP5243617 A JP 5243617A JP 24361793 A JP24361793 A JP 24361793A JP H0767697 A JPH0767697 A JP H0767697A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 １，５−アンヒドログルシトールに電子受容
体の存在下でデヒドロゲナーゼ、例えば、サイトファー
ガ属に属する微生物が生産するＤ−グルコシド−３−デ
ヒドロゲナーゼを作用させ、アンペロメトリ型１，５−
アンヒドログルシトールセンサにより定量するか、電子
受容体の還元体を定量するか、あるいはまた、１，５−
アンヒドログルシトールの酸化物を定量することによっ
て、１，５−アンヒドログルシトールを定量する。 【効果】 高精度かつ簡易に定量することができる。
体の存在下でデヒドロゲナーゼ、例えば、サイトファー
ガ属に属する微生物が生産するＤ−グルコシド−３−デ
ヒドロゲナーゼを作用させ、アンペロメトリ型１，５−
アンヒドログルシトールセンサにより定量するか、電子
受容体の還元体を定量するか、あるいはまた、１，５−
アンヒドログルシトールの酸化物を定量することによっ
て、１，５−アンヒドログルシトールを定量する。 【効果】 高精度かつ簡易に定量することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、１，５−アンヒドログ
ルシトールの定量方法に関する。
ルシトールの定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】１，５−アンヒドログルシトールは、人
体、例えば、髄液や血漿中などに存在し、人が病気、特
には糖尿病、にかかると存在量が変化することから、こ
れを利用して、診断マーカー、特に糖尿病の診断マーカ
ーとして利用が図られている。
体、例えば、髄液や血漿中などに存在し、人が病気、特
には糖尿病、にかかると存在量が変化することから、こ
れを利用して、診断マーカー、特に糖尿病の診断マーカ
ーとして利用が図られている。
【０００３】この１，５−アンヒドログルシトールの定
量方法としては、ガスクロマトグラフィによる方法もあ
るが、近年は、ピラノースオキシダーゼなどの酸化酵素
を用いる方法が一般的となっている。具体的には、１，
５−アンヒドログルシトールを基質とし、オキシダーゼ
活性により濃度減少する反応液中の酸素を酸素電極を用
いて測定したり、脱水素による酸化反応で生成する過酸
化水素の量を、過酸化水素電極を用いたりペルオキシダ
ーゼ使用の比色法を用いたりして測定したり、フェリシ
アニドなどの電子受容体を共存させた反応液中の還元体
の量を測定したりするなどである。ここで、グルコース
と１，５−アンヒドログルシトールをカラムで分離し、
ピラノースオキシダーゼ使用のセンサで発生する過酸化
水素を測定することによってグルコースと１，５−アン
ヒドログルシトールとを同時定量するようにしたものも
ある。
量方法としては、ガスクロマトグラフィによる方法もあ
るが、近年は、ピラノースオキシダーゼなどの酸化酵素
を用いる方法が一般的となっている。具体的には、１，
５−アンヒドログルシトールを基質とし、オキシダーゼ
活性により濃度減少する反応液中の酸素を酸素電極を用
いて測定したり、脱水素による酸化反応で生成する過酸
化水素の量を、過酸化水素電極を用いたりペルオキシダ
ーゼ使用の比色法を用いたりして測定したり、フェリシ
アニドなどの電子受容体を共存させた反応液中の還元体
の量を測定したりするなどである。ここで、グルコース
と１，５−アンヒドログルシトールをカラムで分離し、
ピラノースオキシダーゼ使用のセンサで発生する過酸化
水素を測定することによってグルコースと１，５−アン
ヒドログルシトールとを同時定量するようにしたものも
ある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上述した酸化酵素を用
いる方法には、酸素も酵素反応の基質の一つとなってい
ることによる欠点がある。例えば、オキシダーゼ活性に
より濃度減少する反応液中の酸素を酸素電極を用いて測
定したり、脱水素による酸化反応で生成する過酸化水素
の量を過酸化水素電極を用いて測定したりする方法で
は、測定する試料溶液中の酸素濃度が低いと精度の高い
測定ができない。酸素によって酵素反応が制限されてし
まうためである。また、易酸化性物質による影響も受け
易い。更に、ややもすると、測定が煩雑になってしま
う。
いる方法には、酸素も酵素反応の基質の一つとなってい
ることによる欠点がある。例えば、オキシダーゼ活性に
より濃度減少する反応液中の酸素を酸素電極を用いて測
定したり、脱水素による酸化反応で生成する過酸化水素
の量を過酸化水素電極を用いて測定したりする方法で
は、測定する試料溶液中の酸素濃度が低いと精度の高い
測定ができない。酸素によって酵素反応が制限されてし
まうためである。また、易酸化性物質による影響も受け
易い。更に、ややもすると、測定が煩雑になってしま
う。
【０００５】
【課題を解決するための手段】１，５−アンヒドログル
シトールに電子受容体の存在下でデヒドロゲナーゼを作
用させ、アンペロメトリ型１，５−アンヒドログルシト
ールセンサにより定量するか、電子受容体の還元体を定
量するか、あるいはまた、１，５−アンヒドログルシト
ールの酸化物を定量するようにする。即ち、本発明は、
「１，５−アンヒドログルシトールに電子受容体の存在
下でデヒドロゲナーゼを作用させてアンペロメトリ型
１，５−アンヒドログルシトールセンサにより定量して
なる１，５−アンヒドログルシトールの定量方法。」、
「１，５−アンヒドログルシトールに電子受容体の存在
下でデヒドロゲナーゼを作用させて電子受容体の還元体
を定量してなる１，５−アンヒドログルシトールの定量
方法。」、「１，５−アンヒドログルシトールに電子受
容体の存在下でデヒドロゲナーゼを作用させて１，５−
アンヒドログルシトールの酸化物を定量してなる１，５
−アンヒドログルシトールの定量方法。」を要旨とす
る。
シトールに電子受容体の存在下でデヒドロゲナーゼを作
用させ、アンペロメトリ型１，５−アンヒドログルシト
ールセンサにより定量するか、電子受容体の還元体を定
量するか、あるいはまた、１，５−アンヒドログルシト
ールの酸化物を定量するようにする。即ち、本発明は、
「１，５−アンヒドログルシトールに電子受容体の存在
下でデヒドロゲナーゼを作用させてアンペロメトリ型
１，５−アンヒドログルシトールセンサにより定量して
なる１，５−アンヒドログルシトールの定量方法。」、
「１，５−アンヒドログルシトールに電子受容体の存在
下でデヒドロゲナーゼを作用させて電子受容体の還元体
を定量してなる１，５−アンヒドログルシトールの定量
方法。」、「１，５−アンヒドログルシトールに電子受
容体の存在下でデヒドロゲナーゼを作用させて１，５−
アンヒドログルシトールの酸化物を定量してなる１，５
−アンヒドログルシトールの定量方法。」を要旨とす
る。
【０００６】また、本発明で用いるデヒドロゲナーゼと
しては、１，５−アンヒドログルシトールを基質として
のデヒドロゲナーゼ活性を有するものであれば適宜選択
できるし、酵素生産能を有する微生物からも適宜の培養
方法、分離方法を利用して容易に得られるが、また、一
般に、ＰＱＱ酵素のようなホロ酵素が好ましいが、殊更
に、Ｄ−グルコシド−３−デヒドロゲナーゼ（分類につ
いて；ＥＣ１．１．９９．１３）が好ましい。ここで、
この酵素の生産能を有する微生物としては、サイトファ
ーガ属に属する微生物、例えば、サイトファーガ．マリ
ノフラバ（Ｃ．ｍａｒｉｎｏｆｌａｖａ）ＡＴＣＣ１９
３２６を挙げられる。勿論、保存菌株の中から選択する
だけでなく、自然界から分離してもよいし、変異菌株を
用いてもよいし、これら菌株からの人為的創成物、例え
ば、菌株細胞（特に、膜画分）中から酵素生産に関与す
る遺伝子を切出し、プラスミドなどのベクターに挿入
し、このベクターにより宿主を形質転換したものを用い
たりしてもよい。ちなみに、宿主には、エシェリヒア・
コリや酵母のような異種宿主、また、サイトファーガ属
に属する微生物のような同種宿主がある。尚、デヒドロ
ゲナーゼは、適宜精製度に分離したデヒドロゲナーゼ含
有物として使用されてよい。
しては、１，５−アンヒドログルシトールを基質として
のデヒドロゲナーゼ活性を有するものであれば適宜選択
できるし、酵素生産能を有する微生物からも適宜の培養
方法、分離方法を利用して容易に得られるが、また、一
般に、ＰＱＱ酵素のようなホロ酵素が好ましいが、殊更
に、Ｄ−グルコシド−３−デヒドロゲナーゼ（分類につ
いて；ＥＣ１．１．９９．１３）が好ましい。ここで、
この酵素の生産能を有する微生物としては、サイトファ
ーガ属に属する微生物、例えば、サイトファーガ．マリ
ノフラバ（Ｃ．ｍａｒｉｎｏｆｌａｖａ）ＡＴＣＣ１９
３２６を挙げられる。勿論、保存菌株の中から選択する
だけでなく、自然界から分離してもよいし、変異菌株を
用いてもよいし、これら菌株からの人為的創成物、例え
ば、菌株細胞（特に、膜画分）中から酵素生産に関与す
る遺伝子を切出し、プラスミドなどのベクターに挿入
し、このベクターにより宿主を形質転換したものを用い
たりしてもよい。ちなみに、宿主には、エシェリヒア・
コリや酵母のような異種宿主、また、サイトファーガ属
に属する微生物のような同種宿主がある。尚、デヒドロ
ゲナーゼは、適宜精製度に分離したデヒドロゲナーゼ含
有物として使用されてよい。
【０００７】髄液、血漿、血清、尿などをそのまま、あ
るいは、これらを基にして準備したものを試料とし、ま
た、電子受容体には、フェナジンメトサルフェート、ジ
クロロフェノールインドフェノール、フェリシアン化化
合物、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、
ニトロブルーテトラゾリウムクロライドなど、デヒドロ
ゲナーゼ活性による１，５−アンヒドログルシトールの
酸化に寄与するものを適宜一種もしくは二種以上選択
し、この電子受容体を、試料液中に溶解あるいは分散し
たり、電極表面に結合（直接結合することもできるし、
酵素固定化担体に酵素とともに共有結合法などで固定し
たものを用いるなど間接的に結合することもできる）し
たものに試料を接触させたりして、上記の如きデヒドロ
ゲナーゼに活性を働かせて酵素反応を生じさせ、反応で
生成した１，５−アンヒドログルシトールの酸化物や電
子受容体の還元体を定量する。あるいは、反応に伴う電
子授受を直接的に定量する。
るいは、これらを基にして準備したものを試料とし、ま
た、電子受容体には、フェナジンメトサルフェート、ジ
クロロフェノールインドフェノール、フェリシアン化化
合物、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、
ニトロブルーテトラゾリウムクロライドなど、デヒドロ
ゲナーゼ活性による１，５−アンヒドログルシトールの
酸化に寄与するものを適宜一種もしくは二種以上選択
し、この電子受容体を、試料液中に溶解あるいは分散し
たり、電極表面に結合（直接結合することもできるし、
酵素固定化担体に酵素とともに共有結合法などで固定し
たものを用いるなど間接的に結合することもできる）し
たものに試料を接触させたりして、上記の如きデヒドロ
ゲナーゼに活性を働かせて酵素反応を生じさせ、反応で
生成した１，５−アンヒドログルシトールの酸化物や電
子受容体の還元体を定量する。あるいは、反応に伴う電
子授受を直接的に定量する。
【０００８】定量にはセンサを用いることができる。デ
ヒドロゲナーゼの固定化膜をグラシーカーボン電極など
の表面に装着した、電子受容体を介在させる型のもの、
デヒドロゲナーゼの固定化膜に電子受容体を固定化（吸
着法、架橋法、共有結合法などの固定化法がある）した
型のもの、表面に電子受容体を固定化した電極を備えた
型のものなどを挙げられ、デヒドロゲナーゼや電子受容
体の種類などに応じて適宜選択し、また、構築すればよ
い。そして、ここで例示した最後の型のものがアンペロ
メトリ型１，５−アンヒドログルシトールセンサであ
り、該センサによれば、反応に伴う電子授受を電極表面
で直接的にとらえることができる。
ヒドロゲナーゼの固定化膜をグラシーカーボン電極など
の表面に装着した、電子受容体を介在させる型のもの、
デヒドロゲナーゼの固定化膜に電子受容体を固定化（吸
着法、架橋法、共有結合法などの固定化法がある）した
型のもの、表面に電子受容体を固定化した電極を備えた
型のものなどを挙げられ、デヒドロゲナーゼや電子受容
体の種類などに応じて適宜選択し、また、構築すればよ
い。そして、ここで例示した最後の型のものがアンペロ
メトリ型１，５−アンヒドログルシトールセンサであ
り、該センサによれば、反応に伴う電子授受を電極表面
で直接的にとらえることができる。
【０００９】また、センサを用いない定量もできる。公
知の種々分離分析法による定量もできる訳で、例えば、
電子受容体の還元体の定量には簡易定量法としての比色
法を用いてもよい。また例えば、１，５−アンヒドログ
ルシトールの酸化物を定量するにあたり、Ｄ−グルコシ
ド−３−デヒドロゲナーゼを基質に作用させる場合に
は、１，５−アンヒドログルシトールが３位の水酸基の
脱水素による酸化によってケト化する（酵素ハンドブッ
ク参照；７３頁、朝倉書店、１９８２）ので、この生成
した３ケト体化合物を、例えば、糖分析用カラムを高速
液体クロマトグラフィに接続し、示差屈折計を用いて定
量することもできる。
知の種々分離分析法による定量もできる訳で、例えば、
電子受容体の還元体の定量には簡易定量法としての比色
法を用いてもよい。また例えば、１，５−アンヒドログ
ルシトールの酸化物を定量するにあたり、Ｄ−グルコシ
ド−３−デヒドロゲナーゼを基質に作用させる場合に
は、１，５−アンヒドログルシトールが３位の水酸基の
脱水素による酸化によってケト化する（酵素ハンドブッ
ク参照；７３頁、朝倉書店、１９８２）ので、この生成
した３ケト体化合物を、例えば、糖分析用カラムを高速
液体クロマトグラフィに接続し、示差屈折計を用いて定
量することもできる。
【００１０】また、デヒドロゲナーゼの基質特異性によ
る測定誤差に対する懸念があるならば、適宜分離して定
量すればよい。例えば、グルコースのような夾雑物の混
入が想定され、これが測定誤差の要因と考えられるなら
ば、この夾雑物の分離をすればよい。例えば、糖分離カ
ラムを装着した高速液体クロマトグラフィシステムもあ
るし、イオン交換カラムをなどの適宜選択可能な夾雑物
分離システムもある。尚、これら夾雑物分離システムを
利用する場合、グルコースセンサなど目的物の検出セン
サを複数用いてもよいし、また、前述の如き１，５−ア
ンヒドログルシトールの定量を目的として用いるセンサ
の機能をも備えたものを用いてもよい。
る測定誤差に対する懸念があるならば、適宜分離して定
量すればよい。例えば、グルコースのような夾雑物の混
入が想定され、これが測定誤差の要因と考えられるなら
ば、この夾雑物の分離をすればよい。例えば、糖分離カ
ラムを装着した高速液体クロマトグラフィシステムもあ
るし、イオン交換カラムをなどの適宜選択可能な夾雑物
分離システムもある。尚、これら夾雑物分離システムを
利用する場合、グルコースセンサなど目的物の検出セン
サを複数用いてもよいし、また、前述の如き１，５−ア
ンヒドログルシトールの定量を目的として用いるセンサ
の機能をも備えたものを用いてもよい。
【００１１】
【実施例】例１：アンペロメトリ型１，５−アンヒドログルシトー
ルセンサによる定量例 （１）Ｄ−グルコシド−３−デヒドロゲナーゼの調製 サイトファーガ．マリノフラバ（Ｃ．ｍａｒｉｎｏｆｌ
ａｖａ）ＡＴＣＣ１９３２６をＡＴＣＣ指定の培養条件
で培養したものを遠心分離して集菌し、フレンチプレス
で菌体を破砕し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）中で
撹拌し、遠心分離して破砕菌体を除去し、沈殿を２％ト
ライトンｘ−１００で可溶化し、これを粗酵素液とし
て、この粗酵素液をＤＥＡＥトヨパールカラムに通して
酵素を吸着させ、ＮａＣｌを０〜０．５Ｍ含む１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６）で酵素を溶出し、また、この溶
出酵素をＰｈｅｎｙｌトヨパール５ＰＷカラムに通して
酵素を吸着させ、これを０．０５％トライトンｘ−１０
０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）にＮａＣｌを
０．５〜０Ｍ添加した緩衝液で酵素を溶出し、更に、得
た活性画分をＤＥＡＥ５ＰＷカラムに通して酵素を吸着
させ、ＮａＣｌを０〜０．５Ｍ含む１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６）で酵素を溶出した。こうして得たフラクシ
ョンを精製酵素液としたが、この精製酵素液は、ディス
ク−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での均一性を有す
るものであり、また、この精製酵素液中の酵素がＤ−グ
ルコシド−３−デヒドロゲナーゼであることは、スクロ
ース、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルコシドなどに作用し、
相当する糖の３位を特異的に脱水素し、３ケト糖を精製
することで確認された。
ルセンサによる定量例 （１）Ｄ−グルコシド−３−デヒドロゲナーゼの調製 サイトファーガ．マリノフラバ（Ｃ．ｍａｒｉｎｏｆｌ
ａｖａ）ＡＴＣＣ１９３２６をＡＴＣＣ指定の培養条件
で培養したものを遠心分離して集菌し、フレンチプレス
で菌体を破砕し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）中で
撹拌し、遠心分離して破砕菌体を除去し、沈殿を２％ト
ライトンｘ−１００で可溶化し、これを粗酵素液とし
て、この粗酵素液をＤＥＡＥトヨパールカラムに通して
酵素を吸着させ、ＮａＣｌを０〜０．５Ｍ含む１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６）で酵素を溶出し、また、この溶
出酵素をＰｈｅｎｙｌトヨパール５ＰＷカラムに通して
酵素を吸着させ、これを０．０５％トライトンｘ−１０
０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）にＮａＣｌを
０．５〜０Ｍ添加した緩衝液で酵素を溶出し、更に、得
た活性画分をＤＥＡＥ５ＰＷカラムに通して酵素を吸着
させ、ＮａＣｌを０〜０．５Ｍ含む１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６）で酵素を溶出した。こうして得たフラクシ
ョンを精製酵素液としたが、この精製酵素液は、ディス
ク−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での均一性を有す
るものであり、また、この精製酵素液中の酵素がＤ−グ
ルコシド−３−デヒドロゲナーゼであることは、スクロ
ース、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルコシドなどに作用し、
相当する糖の３位を特異的に脱水素し、３ケト糖を精製
することで確認された。
【００１２】（２）酵素固定化膜の調製 上記（１）で調製した粗酵素液及び精製酵素液を５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）と混合撹拌し、それぞれ
の液にニトロセルロース板（直径２５ｍｍ）を浸漬した
（２時間、２５℃）。
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）と混合撹拌し、それぞれ
の液にニトロセルロース板（直径２５ｍｍ）を浸漬した
（２時間、２５℃）。
【００１３】（３）１，５−アンヒドログルシトールセ
ンサの構築と定量 上記（２）で調製した酵素固定化膜をグラシーカーボン
電極上に装着して作用電極とした。参照電極は銀／塩化
銀、対極は白金である。電子受容体にはフェナジンメト
サルフェートを用い、１，５−アンヒドログルシトール
の測定は、１ｍＭのフェナジンメトサルフェートを含む
２０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中にセ
ンサを浸し、１，５−アンヒドログルシトールの添加に
よって作用電極に発生する電流値を電流計で測定し、ま
た、記録計に記録させて行った。
ンサの構築と定量 上記（２）で調製した酵素固定化膜をグラシーカーボン
電極上に装着して作用電極とした。参照電極は銀／塩化
銀、対極は白金である。電子受容体にはフェナジンメト
サルフェートを用い、１，５−アンヒドログルシトール
の測定は、１ｍＭのフェナジンメトサルフェートを含む
２０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中にセ
ンサを浸し、１，５−アンヒドログルシトールの添加に
よって作用電極に発生する電流値を電流計で測定し、ま
た、記録計に記録させて行った。
【００１４】粗酵素液を用いた場合も精製酵素液を用い
た場合も同様であるが、添付図１に示すように、検量線
は直線的となり、１，５−アンヒドログルシトールの濃
度と電流値とは強い相関関係を有する。反応に十分な量
の酵素が膜に固定化されておれば、基質濃度に依存して
酵素反応が進行すると考えられるところである。
た場合も同様であるが、添付図１に示すように、検量線
は直線的となり、１，５−アンヒドログルシトールの濃
度と電流値とは強い相関関係を有する。反応に十分な量
の酵素が膜に固定化されておれば、基質濃度に依存して
酵素反応が進行すると考えられるところである。
【００１５】例２：電子受容体の還元体の比色定量によ
る定量例 所定濃度の１，５−アンヒドログルシトールと０．７５
ｍＭのフェナジンメトサルフェートと０．７５ｍＭの
２，６−ジクロロフェノールインドフェノールとを含む
２０μｌの２５ｍＭトリス塩酸緩衝液中に前述例１で調
製した粗酵素液を１μｌ添加し、素早く混合して３分間
反応させ（反応ｐＨ８．０、３７℃）、還元された２，
６−ジクロロフェノールインドフェノールの量を６００
ｎｍの吸光度の増加量として測定した。添付図２に、
１，５−アンヒドログルシトールの濃度と、２，６−ジ
クロロフェノールインドフェノールの還元量を示す６０
０ｎｍの吸光度の増加量との相関関係を示す。
る定量例 所定濃度の１，５−アンヒドログルシトールと０．７５
ｍＭのフェナジンメトサルフェートと０．７５ｍＭの
２，６−ジクロロフェノールインドフェノールとを含む
２０μｌの２５ｍＭトリス塩酸緩衝液中に前述例１で調
製した粗酵素液を１μｌ添加し、素早く混合して３分間
反応させ（反応ｐＨ８．０、３７℃）、還元された２，
６−ジクロロフェノールインドフェノールの量を６００
ｎｍの吸光度の増加量として測定した。添付図２に、
１，５−アンヒドログルシトールの濃度と、２，６−ジ
クロロフェノールインドフェノールの還元量を示す６０
０ｎｍの吸光度の増加量との相関関係を示す。
【００１６】例３：１，５−アンヒドログルシトールの
酸化物の定量による定量例 高速液体クロマトグラフィシステムの注入口より前述例
２における反応試料液（３分間反応させたもの）２０μ
ｌを注入し、検出器（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ）で計測し、
面積比（１５ｍＭの１，５−アンヒドログルシトールの
酸化物の面積を１としたときの相対比）を求めて酵素反
応で生成した１，５−アンヒドログルシトールの酸化物
を定量した。結果を添付図３に示す。糖分析カラム（Ｓ
ｈｏｄｅｘＳＰ−０８１０ｐ）を用い、流量０．９ｍｌ
／分、圧力１１ｋｇ／ｃｍ2、カラム温度８０℃の条件
で行ったものである。溶離水には蒸留水を用いた。
酸化物の定量による定量例 高速液体クロマトグラフィシステムの注入口より前述例
２における反応試料液（３分間反応させたもの）２０μ
ｌを注入し、検出器（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ）で計測し、
面積比（１５ｍＭの１，５−アンヒドログルシトールの
酸化物の面積を１としたときの相対比）を求めて酵素反
応で生成した１，５−アンヒドログルシトールの酸化物
を定量した。結果を添付図３に示す。糖分析カラム（Ｓ
ｈｏｄｅｘＳＰ−０８１０ｐ）を用い、流量０．９ｍｌ
／分、圧力１１ｋｇ／ｃｍ2、カラム温度８０℃の条件
で行ったものである。溶離水には蒸留水を用いた。
【００１７】
【発明の効果】各例の結果が示すように、１，５−アン
ヒドログルシトールに電子受容体の存在下でデヒドロゲ
ナーゼを作用させ、アンペロメトリ型１，５−アンヒド
ログルシトールセンサにより定量するか、電子受容体の
還元体を定量するか、あるいはまた、１，５−アンヒド
ログルシトールの酸化物を定量することによって、１，
５−アンヒドログルシトールを高精度かつ簡易に定量す
ることができる。
ヒドログルシトールに電子受容体の存在下でデヒドロゲ
ナーゼを作用させ、アンペロメトリ型１，５−アンヒド
ログルシトールセンサにより定量するか、電子受容体の
還元体を定量するか、あるいはまた、１，５−アンヒド
ログルシトールの酸化物を定量することによって、１，
５−アンヒドログルシトールを高精度かつ簡易に定量す
ることができる。
【図１】本発明の一実施例における検量線を示す図。
【図２】本発明の別の一実施例における検量線を示す
図。
図。
【図３】本発明のまた別の一実施例における検量線を示
す図。
す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松永 是 東京都府中市幸町２−41−13府中第三住宅 ２−304
Claims (4)
- 【請求項１】 １，５−アンヒドログルシトールに電子
受容体の存在下でデヒドロゲナーゼを作用させてアンペ
ロメトリ型１，５−アンヒドログルシトールセンサによ
り定量してなる１，５−アンヒドログルシトールの定量
方法。 - 【請求項２】 １，５−アンヒドログルシトールに電子
受容体の存在下でデヒドロゲナーゼを作用させて電子受
容体の還元体を定量してなる１，５−アンヒドログルシ
トールの定量方法。 - 【請求項３】 １，５−アンヒドログルシトールに電子
受容体の存在下でデヒドロゲナーゼを作用させて１，５
−アンヒドログルシトールの酸化物を定量してなる１，
５−アンヒドログルシトールの定量方法。 - 【請求項４】 前記デヒドロゲナーゼとして、サイトフ
ァーガ属に属する微生物由来のＤ−グルコシド−３−デ
ヒドロゲナーゼを使用することを特徴とする請求項１乃
至請求項３のいずれかに記載の１，５−アンヒドログル
シトールの定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5243617A JPH0767697A (ja) | 1993-09-03 | 1993-09-03 | １，５−アンヒドログルシトールの定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5243617A JPH0767697A (ja) | 1993-09-03 | 1993-09-03 | １，５−アンヒドログルシトールの定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0767697A true JPH0767697A (ja) | 1995-03-14 |
Family
ID=17106490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5243617A Pending JPH0767697A (ja) | 1993-09-03 | 1993-09-03 | １，５−アンヒドログルシトールの定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0767697A (ja) |
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