JPS6279780A - 1,5―アンヒドログルシトールの定量法 - Google Patents

1,5―アンヒドログルシトールの定量法

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JPS6279780A
JPS6279780A JP61041404A JP4140486A JPS6279780A JP S6279780 A JPS6279780 A JP S6279780A JP 61041404 A JP61041404 A JP 61041404A JP 4140486 A JP4140486 A JP 4140486A JP S6279780 A JPS6279780 A JP S6279780A
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中村 恒郎
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赤沼 宏史
Akinori Naito
内藤 明教
Masahiko Yabuuchi
正彦 薮内
Akira Takahashi
昭 高橋
Shigeru Tajima
茂 田島
Tadashi Hashiba
正 橋場
Masuo Katou
加藤 加夫
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は糖尿病の診断マーカーとして期待サレル1,5
−アンヒドログルシトール(以下rl、5−AGJとい
う)の測定方法、その測定に使用する酵素及びその製法
に関する。
〔従来の技術〕
1、5− A Gはヒト髄液及び血漿中に存在しある種
の疾患、特に糖尿病において血漿中の量が低下すること
が報告されている化合物である。この1.5−AGを酸
化する酵素の存在は知られておらず、従来、1.5−A
Gの測定は主ニガスクロマトグラフィーによりおこなわ
れていた。
〔発明が解決すべき問題点〕
しかし、従来の方法では試料の前処理及び、分析機器の
維持、管理に高度の技術を必要とし、簡便な1.5− 
A Gの測定法が要望されていた@ 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは1.5− A Gの簡便な測定法を鋭意研
究した結果、ピクノボラス(Pycnoporus)属
又はコリオラス(Coriolus )属に属する微生
物及び土壌より分離したシュードモナス(Pseudo
monas )属のある種の菌株より得た酵素が1.5
−AGに作用し、1.5− A Gが下記式(1) で表わされる化合物に酸化され、又この化合物は水中で
容易に下記式(2) で表わされる化合物になることを見い出した。
:・       本発明は上記知見に基づいて完成さ
れたものである。
即ち本発明は前記酵素が次の反応(aJを行う:   
   ことに基づいている。
: □ 本反応は酸化反応であり反応液中の酸素濃度の変化を酸
素電極その他により測定するこ、      2に1つ
・1・酸化反応に′″り生成t−“過酸:     化
水素の量を、過酸化水素電極による方法、ペルオキシダ
ーゼを用いる比色法その他の方法により測定することに
より、あるいは反応液中にフェリシアニドなどの電子受
容体を共存させその還元体の量を測定することにより1
.5−AGの量を測定することが出来る。又本反応で生
成する式(1)の化合物はカルボニル基を有するため種
々のカルボニル試薬例えば2.4−ジニトロフェニルヒ
ドラジンなどと反応しヒドラゾンを生成するのでそのヒ
ドラゾン量を測定することにより、1.5−AGiを測
定することが出来る。さらに、本反応で生成する式(2
)の化合物量を測定することによっても1.5−AG量
を測定することが出来る。
本発明で用いられる試料としては、l、5−AGの濃度
を測定したいものであれば特に制限はなく、例えば髄液
血漿、血清や尿及び1゜5−AG濃度を測定しやすいよ
うにこれらの試料を処理した処理液などがあげられる。
本発明で用いられる電子受容体としては、1、5− A
 Gの酸化反応に関与するものであれば、特に制限なく
、例えば、酸素、フエナジンメトサルフエート、ジクロ
ルフェノールインドフェノール、フェリシアン化カリウ
ム、フェリシアン化ナトリウムなどのフェリシアン化化
合物、チトクロムC,NAD 、NADP。
FMNなどの補酵素などがあげられる。
本発明で用いられる、1.5− A Gを式(])の化
合物に酸化する能力を有する酵素(以下rl、5−AG
酸化酵素」という)は、それを産生ずる微生物より得ら
れる。そのような微生物としては、例えばシュードモナ
ス (Pseudomonas ) sp−NK  850
01 (微工研歯寄第8100号(Fermp  81
00)]、ピクノボラス・コクシネウス(Pycnop
orus coccineus )IF04923、同
IFO6490や、コリオラス・コンソルス(Cori
olus consors ) I Fo 9078な
どがあげられる。これらの微生物のうち、シュードモナ
ス属に属する微生物は本発明者らが昭和58年6月に埼
玉県大宮市吉野町で採取した土壌中より分離した新菌株
でありその医学的性質は下記のとおりである。
1、形態(肉汁寒天培地27℃、16時間培養)(1)
細胞の大きさ  0.7〜0.8 X 1.0−1.7
 tan、桿状(2)細胞の多形性 認められない (3)運  動  性  極毛を有し運動性有り(4)
胞子の有無 認められない (5)ダラム染色性 陰性 (6)抗 酸 性 陰性 2、各種培地における生育状態 (1)肉汁寒天斜面培養: ユロニーは光沢のある不透
明の円形で辺縁は金縁で色は祭日 な示す。
(2)肉汁寒天斜面培養: 培地の表面を拡散増殖し不
透明で光沢のある発育を示す。色 は祭日 (3)肉汁液体培養: 培養1日間で全体が濁り3日間
で試験管底部に一体が沈澱す る。菌膜が認められる。
(4)肉汁ゼラチン穿刺培養:  20℃培養で表面に
のみ生育を認め20日間の培養でゼラチン の液化を認めず。
(5)リドマスミルク: 変化を認めず。
3、主扉的性質(27℃培養〕 (1)硝酸塩の還元 陽性 (2)脱窒反応 陽性 (3) MRテス ト 陰性 (4)  VP  テ  ス  ト   陰 性(5)
インドールの生成 陰性 (6)硫化水素の生成 陰性 (7)デンプンの加水分解  陰 性 (8)クエン酸の利用  クリステンセン及びシモンの
培地でクエン酸を利用するが コーザーの培地では利用しな い (9)無機窒素源の利用  アンモニアを利用するが硝
酸塩を利用しない。
(10)色素の生成 陰性 (]1)ウレアーゼ 陽性 (12)オキシダーゼ 陽性 (13)カタラーゼ 陽性 (14)生育の範囲 10〜376CpH7−8,5(
15)酸素に対する態度  好気性 (16)  0−1 テ ス ト  酸化性(17)炭
水化物の利用  グルコース、グリセリン、コハク酸ナ
トリウム、クエン酸 ナトリウムを利用し酢酸ナト リウムパラヒドロキシ安息香 酸を利用しなかった。
(]8)糖類からの酸及びガスの生成 酸の生成  ガスの生成 L−アラビノース     十        −D−
キシロース    十      −C−グルコース 
   十       −D−フラクトース     
+       −D−ガラクトース     +  
      −グリセリン  十   − ラムノース   十    − D−マンノース    −      −麦  芽  
糖    −− 庶     糖    −− 乳      糖    −− トレハロース    −      −D−ソルビット
    −      −D−マンニット    − 
     −イノジット  −    − ラフィノース   −− デンプン  −− (I9)塩化ナトリウムの耐性 トリプトン】0g1蒸留水IApH7,0の基礎培地へ
それぞれ2%、5%、7%濃度となるよう塩化ナトリウ
ムを加え菌液を接種後静置培養した。2%、5%の培地
では生育を認めたが7%の培地では生育を認めなかった
(20)フェニルピルビン酸試験陰性 (2])チロシン溶解性試験 陰性 以上の性状をもとに本閑の分類学的性質を「パーシーズ
・マニュアル・オブ・ディターミネーティブ・バクテリ
オロジー」第8版(1974年)の分類と対比すると2
20頁シュードモナス属のシュードモナス・スタトゼリ
(Pseudomonas 5tutzeri )が近
縁の種として挙げられる。しかし、本菌株はデンプンを
加水分解せず、又麦芽糖より酸を生成しないという性質
を有しており、これらの点でシュードモナス・スタトゼ
リと異なっている。以上の理由から本歯をシュードモナ
ス・sp、NK−85001と命名した。
上記菌体を培養する培地としては1.5− AG、無機
窒素源、無機塩を含む培地が用いられるが生育を促進す
る目的で有機栄養源を添加することができる。無機窒素
源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等が、
無機塩としてはナトリウム、カリウム、マグネシウム、
カルシウム、鉄、亜鉛等の塩類が、有機栄養源としては
ペプトン、カザミノ酸、肉エキス、コーンスチーブリカ
ー、酵母エキス等が使用でき゛る。
培養は振盪あるいは通気攪拌など好気的条件が良<pH
6〜8、温度25〜35°Cで行われる。
本発明で使用するシュードモナス属由来の1、5− A
 G酸化酵素は次の方法により単離される。即ちこの酵
素は菌体の膜画分に存在するので、まず培養物から菌体
を分離し適当な沈漬液中で菌体を破壊してその処理液か
ら膜画分を得る。
菌体破壊の方法はダイノミル、フレンチプレス、超音波
等の物理的方法や、トリトンX −100、EDTA等
の化学的方法リゾチーム等の酵素的方法を単独又は併用
して用いることができる。膜画分は菌体破壊液から異な
る遠心力を複数回利用することにより細胞壁成分、核酸
、菌体内可溶性蛋白質等から分離したサスペンションの
状態で得ることができる。
次いでトリトンX−,100(ポリオキシエチレンオク
チルフェニルエーテル〕、コール酸、デオキシコール酸
等の膜成分可溶化剤などにより活性成分を抽出し不溶分
を遠心分離により除去して1.5− A G酸化酵素抽
出液を得、この抽出液からポリエチレングリコール分画
や硫安分画などの酵素の精製に一般に使われている方法
を用いて、1.5− A G酸化酵素を単離することが
できる。
次にシュードモナス属由来の1.5− A G酸化酵素
の諸性質について述べる。
1、  作  用 1、5− A Gを酸化し、上記式(1)の化合物を生
成する。
2、基質特異性 1、5− A Gに特異的に作用する。
3、至適pH pH6〜7,5 4、至適温度 25〜4 ] ’C 5、安定pH 6,5〜8 又、本発明で使用するピクノポラス属及びコリオラス属
由来の1.5− A G酸化酵素は、次の方法により単
離される。
即ち、この酵素は函体の細胞質画分に存在するので、ま
ず培養物から菌体を分離し、適当な緩衝液中で菌体を破
壊して、その処理液から細胞質画分を得る。
菌体破壊の方法としては、前記のシュードモナス属菌の
場合と同様の操作により行うことができる。細胞質両分
は、菌体破壊液を遠心することにより、沈澱物として膜
画分及び細胞壁成分等から分離し得ることができる。
次に、この遠心上澄液をポリエチレングリコール分画や
硫安分画など一般に酵素の精製に使われている方法を用
いて、1.5−、A G酸化酵素を単離することができ
る。さらに、高純度の酵素を必要とする場合は、必要に
応じて通常用いられているイオン交換クロマトグラフィ
ー及びゲル濾過等のカラムクロマトグラフィーにより精
製することができる。
次にピクノポラス属及びコリオラス属に属する微生物か
ら得られる1、 5− A G酸化酵素の諸性質を示す
本発明では、単離し1こ1.5− A G酸化酵素のみ
ならず、1.5− A G酸化酵素抽出液や膜画分のサ
スペンションなどの菌体処理物も利用しつる。また、こ
れらを樹脂又は膜等の担体に固定化されたものも利用し
つる。
次に1.5− A G酸化酵素又はそれを含む膜画分サ
スペンションあるいは1.5−AG酸化酵素抽出液に1
. ’5− A Gを添加して反応させ反応液中に生成
する物質について述べる。
シュードモナス属に属する微生物の膜画分サスペンショ
ン(蛋白質/4度10■/ml、トリス・塩酸緩衝液0
.05MpH7)中へ1,5−AGを2mg/ml程度
添加し30℃、16時間撮盪しながら反応すると1.5
− A Gは消失し物質囚が生成蓄積する。これはTL
C分析により確認出来る。反応液をシリカゲルプレート
上へスポットし1soPrOH−)ho(95: 5 
)の溶媒で襄開後良く乾燥しアニスアルデヒド硫酸試薬
を噴霧して90〜100℃に5〜10分加熱すると物質
囚はRfo、4付近に青色スポットとして観察出来る。
反応終了液から超遠心により膜画分を除き、上澄液を凍
結真空乾燥して白色粉末を得る。
白色粉末を少量のエタノールに溶解し不溶物を除fした
Piへ2,4−ジニトロフェニルヒドラジン飽和エタノ
ール溶液と微量の濃塩酸を添加し熱湯中で加熱後冷却し
水を濁りの出るまで加え放置′fると褐色沈澱が得られ
る。
この沈澱を戸数しエタノール−水から再結晶し必要な場
合はシリカゲルクロマトにより精製すると黄弓色針状結
晶が得られる。
この結晶の物理化学的性状は次の通りである。
1、  融  点  192°C 2、分子量 342 (マススペクトル) 3、分子式 C1゜HI3 N408 マススペクトルによる実測値 343(M+H)”計算
値        342.272(メタノール中) 
 231 (416,2)、255sh(313,5)
、280sh(178,4)、364(659゜4) 5、  IRスペクトル 赤外線スペクトルは試料なKBrによる錠剤法を用いて
測定する。
3600〜3000cm(フロート)、1622゜15
84.1518.1504.14]5゜1333.12
73.1224.1)37゜1073.1050.10
28.993゜925、 878. 740 6、   CNMR化学シフト スペクトルはDMSO−d6溶媒中で測定する。化学シ
フトはテトラメチルシラン を内部基準としてOppmとし、これとの比較値、実験
条件下で溶媒DMSO−d6のシグナルは40.40 
ppmに発現。
マススペクトルのデーターと一致して 12個の炭素が観察された。
61.9ft+、 71.2ft)、 73.6(dl
、 78.4(dl。
82.3(di、 ] ] 6.2(dl、 124.
0(dl、 130.1(sl、 ] 30.8(dl
、 ] 37.6(sl、 145.5(sl。
153.2(s) 7、   ’HNMRスペクトル スペクトルはDMSO−dd中で測定。化学シフトはテ
トラメチルシランを内部 基準としてOppmとしてこれとの比較値。
3.69 ppm(IH,dd )、 4.14〜4.
15(2H,ABq )、 4.62〜4.65 (2
H。
t、 d)t 5.63〜5.65(IH,d)17.
24 (I H,broad )、 7.87−7.9
0(IH,d)、8.33〜8.37 (IH,dd 
)。
8.86〜8.87(IH,d)、4.62〜4.65
(IH,t−0旦)、5.63〜5.65(IH。
d−0旦)、 7.24 (I H,br−N旦)これ
らの直から前記の黄色針状結晶は次の化学式(3)を有
すると推定され、 このことから物質囚は前記式(1)の化学式を有するも
のと推定した。
又、ピクノポラス属及びコリオラス属に属する微生物か
ら得られる酵素を用いて前記シュードモナス属に属する
微生物の膜画分サスペンションの場合と同様に1.5−
 A Gを処理しても上記式(3)の化合物が得られた
次に、生成物の構造を確認するため、式(1)の化合物
を化学的に合成したところ、式(])の化合物は、水存
在下において容易に水和し、式(2)で表わされる化合
物になることを見い出した。この化学的に合成した式(
1)の化合物の水和物式(2)を、前記1.5− A 
Gのシュードモナス属に属する微生物膜画分サスペンシ
ョン処理物に2.4−ジニトロフェニルヒドラジンを反
応させた場合と同様の操作により反応させたところ、上
記式(3)と全く同一の化合物が得られた。このことよ
り、1.5− A G酸化酵素の生成物式(1)の化合
物は、水和物式(2)となって存在しているものと推定
された。
そこで、ガスクロマトグラフィーにより、1.5−AG
酸化酵素の生成物と化学合成した水和物式(2)の同定
を行った。固化合物をトリメチルシリル(TMS)化し
カラムにより分析したところ、両者は全く同一の保持時
間に検出された。また、ガスクロマトグラフィー・マス
スペクトロメトリー(GC−MS)により、ピーク化合
物のフラグメントパターンを分析したところ、全く同一
のパターンであった。
以上のことから上記の推定は正しいものと考えられた。
従って本発明で用いられる酵素あるいは膜画分サスペン
ションは下の反応を触媒していると考えられる。
又、本発明における反応は前記(alの反応式で示され
る反応をおこなうと考えられる。
なお、化学的に合成した水和物式(2)の物理化学的性
状は次の通りである。
1、熱分析(窒素気流中) ・脱水温度  86°C(水1分子の重量減少有り)・
融  点  63〜74°C 2、分子量 180 (マススペクトル) 3、分子式 C6H12O6 マススペクトルによる実測値 計算値 4.   IRスペクトル am”−’ 。
KBr 、3400,2950,2875゜1090.
1040,840 5、   CNMR(]、 OOMHz )72.56
(tl、  69.85(dl、  62.03ft+
6、  ’HNMR(400MHz )’  d)、3
.67(IH,dd)、3.56(IH。
d)、3.45(IH,d)、3.44CIH。
t)、3.40(IH,m) 7、結晶形 無定形白色粉本 式(1)及び式(2)の化合物は新規化合物であり、又
1,5−AGが脱水素され式(1)の化合物を与える反
応も新規反応である。
本発明の1.5− A Gの測定法は上の反応に基づい
ており、反応課程あるいは反応生成物を利用して各種の
測定法が可能であり次にその内容を説明する。
(1)酸素消費に基づく方法 密閉型反応容器に0.05 Mト’Jスー塩酸緩衝液(
pH7)1ml、30 mMフェナジンメトサルフェー
ト20μm、1.5−AG酸化硼素又は膜画分サスペン
ジミンあるいは1.5−AG酸化酵素抽出液0.3 m
lを加え酸素電極を挿入し反応容器内を34℃で攪拌し
ながらこれに1.5− A G溶液50μIを加えて反
応を開始し経時的に酸素の消費量をオキシゲンモニター
で測定する。既知濃度の1゜5−AG浴溶液検量線を作
成しておき試料の酸素消費量から1.5− A Gの濃
度を算出する。
(2)電子受容体の着色度変化を利用する方法トリス−
塩酸緩衝液(0,05M pH7)0.7ml、0.1
Mフェリシアン化カリウム溶! 0.1 ml、シュー
ドモナス属に属する倣生物より得られる1、 5− A
 G酸化辱素又はその抽出液Q、 l ml及び1.5
− A G溶液0.1 mlを容器に入れ34℃で10
分間反応させた後、硫酸茅二鉄τデュバノール試薬(硫
酸第二鉄5g、ラウリル硫酸ナトリウム3g、85%リ
ン酸95m1.蒸留水900m1)0、5 ml、蒸留
水’3.5 mlを加え10分開放置して660 nm
における吸光度を測定する。
既知濃度の1.5−AG浴溶液検量線を作成しておき試
料の吸光度より1.5− A Gの濃度を算出する。
電子受容体としては上記のフェリシアン化カリウムやフ
ェリシアン化ナトリウム、フェリシアン化アンモニウム
などのフェリシアニドの他ジクロルフェノールインドフ
ェノールなどが利用出来る。
(3)  H2O2を検出する方法 リン酸ナトリウム緩衝液(1/15M、I)H5,6)
0.3ml、4 mM、2.2′−アジノジ〔3−エチ
ルベンツチアゾリンスルホネイト(6)〕(ABTS)
と12u/m1cy)ホースラディツシュペルオキシダ
ーゼを含む発色液Q、 5 ml、1.5−AG酸化酵
素又はその抽出i o、 1ml及びl、 5− A 
G溶Ha、 1m1を容器に入れ、定する。既知濃度の
1.5−AG浴溶液検量線を作成しておき、試料の吸光
度より1,5−AGの濃度を算出する。
ホースラディツシュペルオキシダーゼの基質としては、
ABTSの外、5−アミンサリチル酸、4−アミノアン
チピリンとフェノール、o−トルイジン等の発色基質や
、p−ヒドロキシ酢酸、p−ヒドロキシプロピオン酸等
のケイ光基質が利用できろ。
また、1.5− A Gの酸化反応により生成したH2
O2の検出法としては、この他に、■モ02電極を用い
て直接測定する方法や、ルミノール化合物、ルシゲニン
、アリルシュウ酸エステル類゛のH2O2酸化による化
学発光を利用する方法なども利用し得る。
(4)式(1)又は式(2)の化合物を分析する方法1
、5− A G溶液にシー−トモナス菌由来の膜画分サ
スペンションを加え30℃、16時間反応する。反応終
了後超遠心により膜画分を除き、上澄液で凍結直空乾燥
して白色粉本を得る。この粉本をカルボニル基のラベル
化剤又は水酸基の保護剤で処理することにより、分析す
ることができる。
たとえばカルボニル基のラベル化剤として2.4−ジニ
トロフェニルヒドラジンを用いる場合には、凍結乾燥し
た粉本を少量のエタノールに溶解し、不溶物を除去した
p液へ2,4−ジニトロフェニルヒドラジン飽和エタノ
ール溶液と微量の濃塩酸を添加し熱湯中で加熱反応させ
る。この生成物を逆相系のHPLCCi体りロマトグラ
フィー)により分析することにより、生成物式(1)を
検出することができる。また、水酸基の保護剤としてト
リメチルシリルクロライド(TMS)を用いる場合には
、凍結乾燥した粉本を少量のピリジンに溶解後、TMS
を添加し、室温下に攪拌することにより、生成物式(2
)の全ての水酸基を保護した化合物にすることができる
。このmWの一部を、ガスクロマトグラフィーで分析す
れば式(2)の化合物を検出することができる。
〔効果〕
次に本発明の効果について説明する。
実験例1.  (基質特異性) 後記参考例】で得られる1、 5− A G酸化酵素抽
出液を用い前記フェリシアニド法のうち基質を糖及び糖
アルコールに置きかえて反応させ基質特異性を調べた結
果、シュードモナス属に属する微生物の産生する1、5
−AG!化啼素は第−表に示される如(1,5−AGに
対し高い特異性を示す。
第−表基質特異性 実験例2.(反応至適[)H1温度条件)後記参考例1
で得られろ抽出液を用いて、シュードモナス属に属する
微生物の産生する1、5−AG酸化酵素の1.5− A
 G変換反応における至適pr−を及び至適温度を調べ
第1図及び第2図に示される結果を得る。これらの図よ
り至適r+HはpH6〜pH7,5至適温度は25〜4
 ] ’C程度である。
又pH安定性を調べる為異ったpH値を有す、るリン酸
バッファー(pH6〜7)トリス−塩酸バッファー(p
H7,2〜9)中へ抽出液を加え4℃で一日保存した後
変換活性を調べたところpH6,5〜8の範囲で安定で
あった。
実験例3.  (1,5−AGの測定)(])  酸素
電極法の検量線 後記参考例1で得た抽出液(■白質譲度5■/m])を
用いた。
酸素濃度計(米国ギルツル社製オキシグラフ)の反応容
器中へ次の反応液を加え攪拌しつつ34℃とした。
トリス−塩酸緩衝液(0,05M pH7) 1  m
l可溶化液(蛋白量5 mg/ml )       
0.3m130mMフェナジンメトサルフェート 20
 μm反応器に栓をして密閉した後マイクロシリンジを
用いて既知濃度の1.5− A G浴tL50μmを反
応器中へ注入して酸素、消費速度を記録した。その結果
第3図に示j如<1.5−A01度と酸素消費速度の間
に比例μs係が認められた。
(2)  フェリシアニドを電子受容体として用いろ方
法の検量線 後記参考例1で得た抽出液(蛋白量5■/ml )を用
いる。次の組成の反応液を試験管中で34℃10分間反
応させる。
トリス−塩酸緩衝i(0,05M、pH8)  0.7
mlフェリシアン化カリウム溶液(0,]M)  O,
1ml抽出液       0.1m1 ).5−AG浴液            0.1m1
(ブランクには蒸留水を使用) 反応後硫酸第二鉄−デエバノール試薬Q、 5 ml及
び蒸留水3.5 ml v加えて反応を停止させる。
10分間放置すると緑色に呈色するので660nmで吸
光度を測定する。既知濃度の1.5−AG浴溶液つき試
験すると1.5−AGJI度と660 nmにおける吸
光度の間には第四図に示す如く比例関係が認められた。
(3)  ジクロルフェノールインドフェノール(DC
IP)ラミ子受容体として用し・ろ方法の検量線 後記参考例1で用いた抽出液(蛋白質5■/m1)を用
いる。次の組成の反応0.を分光光度計のセル中へ入れ
34°Cに保つ トリス−塩酸緩衝液(0,05M、pH8)1.8−T
IJ] mMDCI P          O,3m
l] OmMKCN          0.3ml抽
出液       Q、3 m1 34℃に保温した1、 5− A G溶液をセル中に添
加し攪拌して600 nmにおける吸光度を経時的に記
録する。
既知(輝度の1.5− A Gにつき試験すると1.5
−AC6度と600 nmにおける吸光度変化速度、即
ちDCIPの還元速度には第五図に示す如く比例関係が
認められた。
(4)  H2O2を発色により検出する方法の検量線
後記参考例6で得た酵素(3,2u/ml)を用いる。
次の組成の反応液を試験管中で37°C2時間反応させ
る。
・リン酸ナトリウム緩衝液(] /15M、 pH5,
6)  0.3ml・発色試薬           
       0.5 ml・酵素         
     0.1m1−1.s−Aam*      
          o、1m1(ブランクには蒸留水
を使用) 反応後、氷冷して反応を止め、405 nmにおける吸
光度を測定する。既知濃度の1,5AG浴液につき試験
すると、1.5−AGili1度と405 nmにおけ
る吸光度の間には、第6図に示す如く比例関係が認めら
れた。
(51H2O2をケイ光により検出する方法の検量線後
記参考例6で得た1猪素(1,5u/ml)を用いる。
次の組成の反応液を試験管中で37℃2時間反応させる
・ケイ光試薬                 0・
2ml酢酸ナトリウム緩衝液(0,05M、  pI−
15,0)・酵 累                
   0. ] ml・I、5AG溶液       
       Q、 I It’ll(ブランクには蒸
留水を使用) 反応後、グリシン・ナトリウム緩衝液(0,1M、 p
H10,3)を2.5 ml 7i[]えて反反応器め
、レイ起波長3 ] 5 nm、ケイ光波長450 n
mで相対ケイ光強度?:測定する。
既知1度の1.5− A G溶液につき試、験すると1
.5−AC3度と相対ケイ光強度の開には、第7図に示
す如く比例関係が認められた。
(6)  1hoz電極法の検量線 後記参考例7で得た1、 5− A G酸化酵素固定化
カラムの上流にポンプ、インジェクター)下流にH2q
2電極(石川製作所、B H型)を接続する。H2O2
電極には過酸化水素計(石川製作所、モデルAl−10
06型)とレコーダーをセットする。1.5− A G
固定化カラムと■−1202に極部を37℃に保った恒
温槽に漬ける。
ポンプから1m1/分の流速でリン酸緩衝液(]/15
M、 pH5,6−)を流し、安定化させる。
この流路系へインジエクターカI−) 1.5.−A 
G溶液50m1を流し、1.5− A G酸化反応によ
って生じたレコーダー上のピーク面積を測定する。既知
濃度の1.5− A G溶液につき試験fると、1.5
−AG濃度とピーク面積の間には、第8図に示す様な検
量線が得られた。
以上から明らかなように本発明の方法によると1.5−
 A Gが極めて簡便に定量しつる。
実施例1゜ 次の組成の試料を実験例3に示した3種の方法で1.5
− A Gの含量を測定したところ下に示す如(それぞ
れの方法で1.5−AGの測定が可能であった。
実施例2゜ ヒト血清Q、 4 ml ヘ過塩素酸水溶1(60%w
/v)30局を加え、振盪の後遠心分離して得た上澄液
0.2 mlをホウ酸型強塩基性樹脂AGI−X8(B
io−Rad社製)Q、3ml’i光填した前処理カラ
ムへ通し、水3m1で洗浄して通過液3 ml ?:得
た。
このカラム通過液3 mlを濃縮乾固してから、蒸留水
を加え、正確に0.5 mlに調整した。この様にして
得られた除タンパク質と前処理を施した資料を、前記、
実験例3に示した3種のI(202を検出する方法で測
定したところ下に示す如く、それぞれの方法で、血清中
の1.5− A Gの測定が可能であった。なお、検量
線は、既知濃度の1、5− A Gを含む標準溶液を用
いて前記と全く同一の処珂を施し、それぞれの方法で測
定して参考例1.(シー−トモナス属に属する微生物由
来の1.5− A G変換活性微生物処理物の取得) カザミノ酸1%、1.5− A G 0.2%、(Nル
)2SO40,1%、K2HPO40,1%、NaCl
0.1%、MgSO4・78200.02%、啼母エキ
ス0.1%、pH7蒸留水から成る培地100m1宛を
500m1容三角フラスコに分注し1)5℃、15分間
殺菌しPseudomonas sp−NK  850
0 ] (微工研菌寄第8100号(Ferm p  
8100 ) )の斜面培養物の一白金耳を接種し30
°Cで回転振盪培養機(220rpm )上で16時間
培養する。培養液から遠心分離により菌体を分離しトリ
ス・塩酸緩衝ff(0,05M、 pH7)で洗浄して
出発液量の1/IO容の菌体げんだく液とする。この菌
体けんだく液を冷却してフレンチプレスにより菌体破壊
液を得、これを10分間遠心分離(10,000×g)
して、沈澱する細胞壁を除去した後、さらに1時間遠心
分離(100,000Xg)して沈澱物を得、トリス塩
酸緩衝液(0,05M、 pH7)で洗浄し、同緩衝液
中に懸濁して膜画分懸濁液を得る。この)曹濁液にトリ
トンX−100を1%(w/v)となるように添加し、
4°Cで1時間攪拌した後、不溶物を遠心分離(100
,OOOXg)して除去し、1.5− A G酸化酵素
抽出液を得る。
参考例2゜ 参考例1で得られる活性成分可溶化液を冷却しつつ硫酸
アンモニウム粉本を加え析出する蛋白質を遠心分離(1
0,OOOXg、I 0分)で分離し本文記載のフェリ
シアニド法で活性を測定すると活性は硫酸アンモニウム
40%飽和区分に抽  出  i          
      0.4740%硫安飽和画分    0.
85 60%          0 80%          0 *酵素一単位をフェリシアニド2μmoles を10
分間に還元する活性とし、蛋白1mg当りに換算した値 参考例3.  (ビクノポラスIF04923由来の1
.5− A G酸化酵素の取得) 1、5− A G 0.3%、酵母エキス0.4%、麦
芽エキス0.5%、水道水からなる培地100m1宛を
500 ml容三角フラスコに分注し、1)5℃、15
分間殺菌しビクノポラス・コクシネウス(IFO492
3)の斜面培養物の一白金耳を接種し27℃で回転振盪
培養機(220rpm)上で6日間培養する。培養液か
ら遠心分離により菌体を分離し、リン酸ナトリウム緩衝
i (0,1M。
pH6)で洗浄して、湿菌体重量の7.5倍容の菌体け
んだく液とする。この固体けんだく液を冷却してフレン
チプレスにより菌体破壊液を得、冷却下にこれを10分
間遠心分離(10,000Xg)して、沈澱する細胞壁
を除去した後、さらに1時間遠心分離(]00.OOO
Xg)して膜画分を除き、細胞質上清を得る。冷却下、
この上清に硫酸アンモニウム粉本を加えて攪拌しながら
溶解する。この時析出するタンパク質を遠心分離(10
,000Xg、10分)で分離し、各硫酸アンモニウム
画分を本文記載の■−1202を検出する方法(1,5
−AG浴溶液して1%濃度のものを使用〕で1.5− 
A G酸化活性を測定すると、活性は、主に40〜60
%飽和画分に存在する。酵素一単位を、1分間当り1.
5− A Gを酸化して)12021μmoleを発生
する量と定義すると、この硫安画分の比活性は4.0で
ある。湿菌体1g当りからI】単位の酵素を得る。
参考例4゜ 参考例3において、菌株をピクノポラス・コクシネウス
(IFO6490)に変え、参考例3と同じ培地組成を
有する培地で4日間培養する。
参考例3と同様の精製操作をへて、比活性3.6の1.
5−AG酸化醪素を得る。
参考例5.  (コリオラス・コンソルス(IFO90
78)由来1.5− A G酸化g素の取得) 参考例3において菌株をコリオラス・コンソルス(IF
O9078)に変え、参考例3と同じ培地組成を有する
培地で10日間培養する。参考例3と同様の精製操作を
へて、比活性2.8の1、5− A G酸化酵素を得る
参考例6.(高純度酵素の取得) 参考例3で得られた1、 5− A G酸化酵素の60
%飽和硫安沈澱物を蒸留水に溶解したものを用い、全操
作を4℃に冷却下にDEAE−トヨパール(東洋ソーダ
社製)クロマトを行い精製した。酵素4100単位/ 
20 ml溶液を100倍容のリン酸緩衝液(0,01
M、 pH6,0)で透析し、同緩衝液で平衝化された
D E A E −Toyopear lカラム(2,
5cmX 40 cm )にチャージする。カラムをリ
ン酸緩衝液(0,01M、 pH6,0)で十分洗浄の
後、リン酸緩衝液で0.OIMから0.5M(pH6,
0)の濃度勾配を付は溶出する。活性は0.1Mから0
.2 M濃度の間に溶出されるので、活性フラクション
を集めpM−10限外濾過膜(アミコン社製ンを用いて
濃縮すると、比活性18の酵素溶液(360単位/ml
ン5.5 mlが得られろ。
参考例7.(固定化カラムの製法) 多孔質ガ7スCPG  ] O(200/400メ7シ
ユ、平均ポアサイズ500A、エレクトロヌクレオニッ
ク社ff)0.5gをγ−アミノプロピルトリエトキシ
シラン0.5gにて、常法によリカツブリング処理し、
続いて無水コハク酸0.5gにてカルボキシル化を行5
゜乾燥した多孔質ガラスは、クロロホルム中で、過剰の
チオニルクロライドにてカルボキシル基を酸クロライド
とする。得られた酸クロライド化多孔質ガラス1gに前
記参考例6で作成した1、 5− A、 G酸化慴素溶
液2゜5 mlを加え、pHを6〜7に保ちながら25
℃にて12時間ゆっくり攪拌しながら反応させ、縮合反
応を完結させる。得られた1、 5− A G酸化酵素
固定化多孔質ガラスを内径2、3 mm X長さ70 
mmOカラム(1mlの注射筒)に充填する。1M食塩
を含有するリン酸緩衝液(1/15M、 pH5,6)
 20 mlを流し、共有結合していない酵素を除き、
さらにリン酸緩衝液(]/15M、 pH5,6)を流
して洗浄し、1.5− A G酸化實素固定化カラムを
得る。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明で使用する酵素の至適puを示す曲線で
あり、第2図は該酵素の至適温度を示す曲線であり、第
3図は酸素電極法における検量線を、第4図はフェリシ
アニド法における検tiを、第5図はジクロルフェノー
ルインドフェノール法における検量線を、第6図ハ)h
02(7)発色法による検量線を、第7図はH2O2の
ケイ先広による検量線を、第8図はH2O2電極法によ
る検量線をそれぞれ示したものである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 (1)試料中の1,5−アンヒドログルシトールに電子
    受容体の存在下、1,5−アンヒドログルシトール酸化
    能を有する酵素を作用させ、試料中の酸素の消費量を測
    定するか、又は生成する過酸化水素電子受容体の還元体
    もしくは下記式(1)又は(2)で示される化合物を定
    量することを特徴とする1,5−アンヒドログルシトー
    ルの定量法。 ▲数式、化学式、表等があります▼(1)▲数式、化学
    式、表等があります▼(2) (2)下記特性を有する1,5−アンヒドログルシトー
    ル酸化能を有する酵素 1、基質特異性 ▲数式、化学式、表等があります▼ 2、至適pH pH6〜7.5 3、至適温度 25〜41℃ 4、安定pH 6.5〜8 (3)1,5−アンヒドログルシトール酸化能を有する
    酵素を産生する微生物を培地中で培養し培養物から1,
    5−アンヒドログルシトール酸化能を有する酵素を採取
    することを特徴とする1,5−アンヒドログルシトール
    酸化能を有する酵素の製造方法。
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