JPS6279780A

JPS6279780A - １，５―アンヒドログルシトールの定量法

Info

Publication number: JPS6279780A
Application number: JP61041404A
Authority: JP
Inventors: Tsunero Nakamura; 中村　恒郎; Hiroshi Akanuma; 赤沼　宏史; Akinori Naito; 内藤　明教; Masahiko Yabuuchi; 正彦薮内; Akira Takahashi; 昭高橋; Shigeru Tajima; 茂田島; Tadashi Hashiba; 正橋場; Masuo Katou; 加藤　加夫
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1985-05-28
Filing date: 1986-02-28
Publication date: 1987-04-13
Also published as: JPH0324200B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は糖尿病の診断マーカーとして期待サレル１，５
−アンヒドログルシトール（以下ｒｌ、５−ＡＧＪとい
う）の測定方法、その測定に使用する酵素及びその製法
に関する。

〔従来の技術〕

１、５−　Ａ　Ｇはヒト髄液及び血漿中に存在しある種
の疾患、特に糖尿病において血漿中の量が低下すること
が報告されている化合物である。この１．５−ＡＧを酸
化する酵素の存在は知られておらず、従来、１．５−Ａ
Ｇの測定は主ニガスクロマトグラフィーによりおこなわ
れていた。

〔発明が解決すべき問題点〕

しかし、従来の方法では試料の前処理及び、分析機器の
維持、管理に高度の技術を必要とし、簡便な１．５−　
Ａ　Ｇの測定法が要望されていた＠〔問題点を解決するための手段〕本発明者らは１．５−　Ａ　Ｇの簡便な測定法を鋭意研
究した結果、ピクノボラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）属
又はコリオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　）属に属する微生
物及び土壌より分離したシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　）属のある種の菌株より得た酵素が１．５
−ＡＧに作用し、１．５−　Ａ　Ｇが下記式（１）で表わされる化合物に酸化され、又この化合物は水中で
容易に下記式（２）で表わされる化合物になることを見い出した。

：・　　　　　　　本発明は上記知見に基づいて完成さ
れたものである。

即ち本発明は前記酵素が次の反応（ａＪを行う：　　　
　　　ことに基づいている。

： □ 本反応は酸化反応であり反応液中の酸素濃度の変化を酸
素電極その他により測定するこ、　　　　　　２に１つ
・１・酸化反応に′″り生成ｔ−“過酸：　　　　　化
水素の量を、過酸化水素電極による方法、ペルオキシダ
ーゼを用いる比色法その他の方法により測定することに
より、あるいは反応液中にフェリシアニドなどの電子受
容体を共存させその還元体の量を測定することにより１
．５−ＡＧの量を測定することが出来る。又本反応で生
成する式（１）の化合物はカルボニル基を有するため種
々のカルボニル試薬例えば２．４−ジニトロフェニルヒ
ドラジンなどと反応しヒドラゾンを生成するのでそのヒ
ドラゾン量を測定することにより、１．５−ＡＧｉを測
定することが出来る。さらに、本反応で生成する式（２
）の化合物量を測定することによっても１．５−ＡＧ量
を測定することが出来る。

本発明で用いられる試料としては、ｌ、５−ＡＧの濃度
を測定したいものであれば特に制限はなく、例えば髄液
血漿、血清や尿及び１゜５−ＡＧ濃度を測定しやすいよ
うにこれらの試料を処理した処理液などがあげられる。

本発明で用いられる電子受容体としては、１、５−　Ａ
　Ｇの酸化反応に関与するものであれば、特に制限なく
、例えば、酸素、フエナジンメトサルフエート、ジクロ
ルフェノールインドフェノール、フェリシアン化カリウ
ム、フェリシアン化ナトリウムなどのフェリシアン化化
合物、チトクロムＣ，ＮＡＤ　、ＮＡＤＰ。

ＦＭＮなどの補酵素などがあげられる。

本発明で用いられる、１．５−　Ａ　Ｇを式（］）の化
合物に酸化する能力を有する酵素（以下ｒｌ、５−ＡＧ
酸化酵素」という）は、それを産生ずる微生物より得ら
れる。そのような微生物としては、例えばシュードモナ
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）　ｓｐ−ＮＫ　　８５０
０１　（微工研歯寄第８１００号（Ｆｅｒｍｐ　　８１
００）］、ピクノボラス・コクシネウス（Ｐｙｃｎｏｐ
ｏｒｕｓ　ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ　）ＩＦ０４９２３、同
ＩＦＯ６４９０や、コリオラス・コンソルス（Ｃｏｒｉ
ｏｌｕｓ　ｃｏｎｓｏｒｓ　）　Ｉ　Ｆｏ　９０７８な
どがあげられる。これらの微生物のうち、シュードモナ
ス属に属する微生物は本発明者らが昭和５８年６月に埼
玉県大宮市吉野町で採取した土壌中より分離した新菌株
でありその医学的性質は下記のとおりである。

１、形態（肉汁寒天培地２７℃、１６時間培養）（１）
細胞の大きさ　　０．７〜０．８　Ｘ　１．０−１．７
　ｔａｎ、桿状（２）細胞の多形性　認められない（３）運　　動　　性　　極毛を有し運動性有り（４）
胞子の有無　認められない（５）ダラム染色性　陰性（６）抗　酸　性　陰性２、各種培地における生育状態（１）肉汁寒天斜面培養：　ユロニーは光沢のある不透
明の円形で辺縁は金縁で色は祭日な示す。

（２）肉汁寒天斜面培養：　培地の表面を拡散増殖し不
透明で光沢のある発育を示す。色は祭日（３）肉汁液体培養：　培養１日間で全体が濁り３日間
で試験管底部に一体が沈澱する。菌膜が認められる。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：　　２０℃培養で表面に
のみ生育を認め２０日間の培養でゼラチンの液化を認めず。

（５）リドマスミルク：　変化を認めず。

３、主扉的性質（２７℃培養〕（１）硝酸塩の還元　陽性（２）脱窒反応　陽性（３）　ＭＲテス　ト　陰性（４）　　ＶＰ　　テ　　ス　　ト　　　陰　性（５）
インドールの生成　陰性（６）硫化水素の生成　陰性（７）デンプンの加水分解　　陰　性（８）クエン酸の利用　　クリステンセン及びシモンの
培地でクエン酸を利用するがコーザーの培地では利用しない（９）無機窒素源の利用　　アンモニアを利用するが硝
酸塩を利用しない。

（１０）色素の生成　陰性（］１）ウレアーゼ　陽性（１２）オキシダーゼ　陽性（１３）カタラーゼ　陽性（１４）生育の範囲　１０〜３７６ＣｐＨ７−８，５（
１５）酸素に対する態度　　好気性（１６）　　０−１　テ　ス　ト　　酸化性（１７）炭
水化物の利用　　グルコース、グリセリン、コハク酸ナ
トリウム、クエン酸ナトリウムを利用し酢酸ナトリウムパラヒドロキシ安息香酸を利用しなかった。

（］８）糖類からの酸及びガスの生成酸の生成　　ガスの生成Ｌ−アラビノース　　　　　十　　　　　　　　−Ｄ−
キシロース　　　　十　　　　　　−Ｃ−グルコース　
　　　十　　　　　　　−Ｄ−フラクトース　　　　　
＋　　　　　　　−Ｄ−ガラクトース　　　　　＋　　
　　　　　　−グリセリン　　十　　　− ラムノース　　　十　　　　− Ｄ−マンノース　　　　−　　　　　　−麦　　芽　　
糖　　　　−− 庶　　　　　糖　　　　−− 乳　　　　　　糖　　　　−− トレハロース　　　　−　　　　　　−Ｄ−ソルビット
　　　　−　　　　　　−Ｄ−マンニット　　　　−　
　　　　　−イノジット　　−　　　　− ラフィノース　　　−− デンプン　　−− （Ｉ９）塩化ナトリウムの耐性トリプトン】０ｇ１蒸留水ＩＡｐＨ７，０の基礎培地へ
それぞれ２％、５％、７％濃度となるよう塩化ナトリウ
ムを加え菌液を接種後静置培養した。２％、５％の培地
では生育を認めたが７％の培地では生育を認めなかった
。

（２０）フェニルピルビン酸試験陰性（２］）チロシン溶解性試験　陰性以上の性状をもとに本閑の分類学的性質を「パーシーズ
・マニュアル・オブ・ディターミネーティブ・バクテリ
オロジー」第８版（１９７４年）の分類と対比すると２
２０頁シュードモナス属のシュードモナス・スタトゼリ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｔｕｔｚｅｒｉ　）が近
縁の種として挙げられる。しかし、本菌株はデンプンを
加水分解せず、又麦芽糖より酸を生成しないという性質
を有しており、これらの点でシュードモナス・スタトゼ
リと異なっている。以上の理由から本歯をシュードモナ
ス・ｓｐ、ＮＫ−８５００１と命名した。

上記菌体を培養する培地としては１．５−　ＡＧ、無機
窒素源、無機塩を含む培地が用いられるが生育を促進す
る目的で有機栄養源を添加することができる。無機窒素
源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等が、
無機塩としてはナトリウム、カリウム、マグネシウム、
カルシウム、鉄、亜鉛等の塩類が、有機栄養源としては
ペプトン、カザミノ酸、肉エキス、コーンスチーブリカ
ー、酵母エキス等が使用でき゛る。

培養は振盪あるいは通気攪拌など好気的条件が良＜ｐＨ
６〜８、温度２５〜３５°Ｃで行われる。

本発明で使用するシュードモナス属由来の１、５−　Ａ
　Ｇ酸化酵素は次の方法により単離される。即ちこの酵
素は菌体の膜画分に存在するので、まず培養物から菌体
を分離し適当な沈漬液中で菌体を破壊してその処理液か
ら膜画分を得る。

菌体破壊の方法はダイノミル、フレンチプレス、超音波
等の物理的方法や、トリトンＸ　−１００、ＥＤＴＡ等
の化学的方法リゾチーム等の酵素的方法を単独又は併用
して用いることができる。膜画分は菌体破壊液から異な
る遠心力を複数回利用することにより細胞壁成分、核酸
、菌体内可溶性蛋白質等から分離したサスペンションの
状態で得ることができる。

次いでトリトンＸ−，１００（ポリオキシエチレンオク
チルフェニルエーテル〕、コール酸、デオキシコール酸
等の膜成分可溶化剤などにより活性成分を抽出し不溶分
を遠心分離により除去して１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素抽
出液を得、この抽出液からポリエチレングリコール分画
や硫安分画などの酵素の精製に一般に使われている方法
を用いて、１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素を単離することが
できる。

次にシュードモナス属由来の１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素
の諸性質について述べる。

１、　　作　　用１、５−　Ａ　Ｇを酸化し、上記式（１）の化合物を生
成する。

２、基質特異性１、５−　Ａ　Ｇに特異的に作用する。

３、至適ｐＨｐＨ６〜７，５４、至適温度２５〜４　］　’Ｃ５、安定ｐＨ６，５〜８又、本発明で使用するピクノポラス属及びコリオラス属
由来の１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素は、次の方法により単
離される。

即ち、この酵素は函体の細胞質画分に存在するので、ま
ず培養物から菌体を分離し、適当な緩衝液中で菌体を破
壊して、その処理液から細胞質画分を得る。

菌体破壊の方法としては、前記のシュードモナス属菌の
場合と同様の操作により行うことができる。細胞質両分
は、菌体破壊液を遠心することにより、沈澱物として膜
画分及び細胞壁成分等から分離し得ることができる。

次に、この遠心上澄液をポリエチレングリコール分画や
硫安分画など一般に酵素の精製に使われている方法を用
いて、１．５−、Ａ　Ｇ酸化酵素を単離することができ
る。さらに、高純度の酵素を必要とする場合は、必要に
応じて通常用いられているイオン交換クロマトグラフィ
ー及びゲル濾過等のカラムクロマトグラフィーにより精
製することができる。

次にピクノポラス属及びコリオラス属に属する微生物か
ら得られる１、　５−　Ａ　Ｇ酸化酵素の諸性質を示す
。

本発明では、単離し１こ１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素のみ
ならず、１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素抽出液や膜画分のサ
スペンションなどの菌体処理物も利用しつる。また、こ
れらを樹脂又は膜等の担体に固定化されたものも利用し
つる。

次に１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素又はそれを含む膜画分サ
スペンションあるいは１．５−ＡＧ酸化酵素抽出液に１
．　’５−　Ａ　Ｇを添加して反応させ反応液中に生成
する物質について述べる。

シュードモナス属に属する微生物の膜画分サスペンショ
ン（蛋白質／４度１０■／ｍｌ、トリス・塩酸緩衝液０
．０５ＭｐＨ７）中へ１，５−ＡＧを２ｍｇ／ｍｌ程度
添加し３０℃、１６時間撮盪しながら反応すると１．５
−　Ａ　Ｇは消失し物質囚が生成蓄積する。これはＴＬ
Ｃ分析により確認出来る。反応液をシリカゲルプレート
上へスポットし１ｓｏＰｒＯＨ−）ｈｏ（９５：　５　
）の溶媒で襄開後良く乾燥しアニスアルデヒド硫酸試薬
を噴霧して９０〜１００℃に５〜１０分加熱すると物質
囚はＲｆｏ、４付近に青色スポットとして観察出来る。

反応終了液から超遠心により膜画分を除き、上澄液を凍
結真空乾燥して白色粉末を得る。

白色粉末を少量のエタノールに溶解し不溶物を除ｆした
Ｐｉへ２，４−ジニトロフェニルヒドラジン飽和エタノ
ール溶液と微量の濃塩酸を添加し熱湯中で加熱後冷却し
水を濁りの出るまで加え放置′ｆると褐色沈澱が得られ
る。

この沈澱を戸数しエタノール−水から再結晶し必要な場
合はシリカゲルクロマトにより精製すると黄弓色針状結
晶が得られる。

この結晶の物理化学的性状は次の通りである。

１、　　融　　点　　１９２°Ｃ２、分子量　３４２（マススペクトル）３、分子式　Ｃ１゜ＨＩ３　Ｎ４０８マススペクトルによる実測値　３４３（Ｍ＋Ｈ）”計算
値　　　　　　　　３４２．２７２（メタノール中）　
　２３１　（４１６，２）、２５５ｓｈ（３１３，５）
、２８０ｓｈ（１７８，４）、３６４（６５９゜４）５、　　ＩＲスペクトル赤外線スペクトルは試料なＫＢｒによる錠剤法を用いて
測定する。

３６００〜３０００ｃｍ（フロート）、１６２２゜１５
８４．１５１８．１５０４．１４］５゜１３３３．１２
７３．１２２４．１）３７゜１０７３．１０５０．１０
２８．９９３゜９２５、　８７８．　７４０６、　　　ＣＮＭＲ化学シフトスペクトルはＤＭＳＯ−ｄ６溶媒中で測定する。化学シ
フトはテトラメチルシランを内部基準としてＯｐｐｍとし、これとの比較値、実験
条件下で溶媒ＤＭＳＯ−ｄ６のシグナルは４０．４０　
ｐｐｍに発現。

マススペクトルのデーターと一致して１２個の炭素が観察された。

６１．９ｆｔ＋、　７１．２ｆｔ）、　７３．６（ｄｌ
、　７８．４（ｄｌ。

８２．３（ｄｉ、　］　］　６．２（ｄｌ、　１２４．
０（ｄｌ、　１３０．１（ｓｌ、　］　３０．８（ｄｌ
、　］　３７．６（ｓｌ、　１４５．５（ｓｌ。

１５３．２（ｓ）７、　　　’ＨＮＭＲスペクトルスペクトルはＤＭＳＯ−ｄｄ中で測定。化学シフトはテ
トラメチルシランを内部基準としてＯｐｐｍとしてこれとの比較値。

３．６９　ｐｐｍ（ＩＨ，ｄｄ　）、　４．１４〜４．
１５（２Ｈ，ＡＢｑ　）、　４．６２〜４．６５　（２
Ｈ。

ｔ、　ｄ）ｔ　５．６３〜５．６５（ＩＨ，ｄ）１７．
２４　（Ｉ　Ｈ，ｂｒｏａｄ　）、　７．８７−７．９
０（ＩＨ，ｄ）、８．３３〜８．３７　（ＩＨ，ｄｄ　
）。

８．８６〜８．８７（ＩＨ，ｄ）、４．６２〜４．６５
（ＩＨ，ｔ−０旦）、５．６３〜５．６５（ＩＨ。

ｄ−０旦）、　７．２４　（Ｉ　Ｈ，ｂｒ−Ｎ旦）これ
らの直から前記の黄色針状結晶は次の化学式（３）を有
すると推定され、このことから物質囚は前記式（１）の化学式を有するも
のと推定した。

又、ピクノポラス属及びコリオラス属に属する微生物か
ら得られる酵素を用いて前記シュードモナス属に属する
微生物の膜画分サスペンションの場合と同様に１．５−
　Ａ　Ｇを処理しても上記式（３）の化合物が得られた
。

次に、生成物の構造を確認するため、式（１）の化合物
を化学的に合成したところ、式（］）の化合物は、水存
在下において容易に水和し、式（２）で表わされる化合
物になることを見い出した。この化学的に合成した式（
１）の化合物の水和物式（２）を、前記１．５−　Ａ　
Ｇのシュードモナス属に属する微生物膜画分サスペンシ
ョン処理物に２．４−ジニトロフェニルヒドラジンを反
応させた場合と同様の操作により反応させたところ、上
記式（３）と全く同一の化合物が得られた。このことよ
り、１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素の生成物式（１）の化合
物は、水和物式（２）となって存在しているものと推定
された。

そこで、ガスクロマトグラフィーにより、１．５−ＡＧ
酸化酵素の生成物と化学合成した水和物式（２）の同定
を行った。固化合物をトリメチルシリル（ＴＭＳ）化し
カラムにより分析したところ、両者は全く同一の保持時
間に検出された。また、ガスクロマトグラフィー・マス
スペクトロメトリー（ＧＣ−ＭＳ）により、ピーク化合
物のフラグメントパターンを分析したところ、全く同一
のパターンであった。

以上のことから上記の推定は正しいものと考えられた。

従って本発明で用いられる酵素あるいは膜画分サスペン
ションは下の反応を触媒していると考えられる。

又、本発明における反応は前記（ａｌの反応式で示され
る反応をおこなうと考えられる。

なお、化学的に合成した水和物式（２）の物理化学的性
状は次の通りである。

１、熱分析（窒素気流中）・脱水温度　　８６°Ｃ（水１分子の重量減少有り）・
融　　点　　６３〜７４°Ｃ２、分子量　１８０（マススペクトル）３、分子式　Ｃ６Ｈ１２Ｏ６マススペクトルによる実測値計算値４．　　　ＩＲスペクトルａｍ”−’　。

ＫＢｒ　、３４００，２９５０，２８７５゜１０９０．
１０４０，８４０５、　　　ＣＮＭＲ（］、　ＯＯＭＨｚ　）７２．５６
（ｔｌ、　　６９．８５（ｄｌ、　　６２．０３ｆｔ＋
６、　　’ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ　）’　　ｄ）、３
．６７（ＩＨ，ｄｄ）、３．５６（ＩＨ。

ｄ）、３．４５（ＩＨ，ｄ）、３．４４ＣＩＨ。

ｔ）、３．４０（ＩＨ，ｍ）７、結晶形　無定形白色粉本式（１）及び式（２）の化合物は新規化合物であり、又
１，５−ＡＧが脱水素され式（１）の化合物を与える反
応も新規反応である。

本発明の１．５−　Ａ　Ｇの測定法は上の反応に基づい
ており、反応課程あるいは反応生成物を利用して各種の
測定法が可能であり次にその内容を説明する。

（１）酸素消費に基づく方法密閉型反応容器に０．０５　Ｍト’Ｊスー塩酸緩衝液（
ｐＨ７）１ｍｌ、３０　ｍＭフェナジンメトサルフェー
ト２０μｍ、１．５−ＡＧ酸化硼素又は膜画分サスペン
ジミンあるいは１．５−ＡＧ酸化酵素抽出液０．３　ｍ
ｌを加え酸素電極を挿入し反応容器内を３４℃で攪拌し
ながらこれに１．５−　Ａ　Ｇ溶液５０μＩを加えて反
応を開始し経時的に酸素の消費量をオキシゲンモニター
で測定する。既知濃度の１゜５−ＡＧ浴溶液検量線を作
成しておき試料の酸素消費量から１．５−　Ａ　Ｇの濃
度を算出する。

（２）電子受容体の着色度変化を利用する方法トリス−
塩酸緩衝液（０，０５Ｍ　ｐＨ７）０．７ｍｌ、０．１
Ｍフェリシアン化カリウム溶！　０．１　ｍｌ、シュー
ドモナス属に属する倣生物より得られる１、　５−　Ａ
　Ｇ酸化辱素又はその抽出液Ｑ、　ｌ　ｍｌ及び１．５
−　Ａ　Ｇ溶液０．１　ｍｌを容器に入れ３４℃で１０
分間反応させた後、硫酸茅二鉄τデュバノール試薬（硫
酸第二鉄５ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム３ｇ、８５％リ
ン酸９５ｍ１．蒸留水９００ｍ１）０、５　ｍｌ、蒸留
水’３．５　ｍｌを加え１０分開放置して６６０　ｎｍ
における吸光度を測定する。

既知濃度の１．５−ＡＧ浴溶液検量線を作成しておき試
料の吸光度より１．５−　Ａ　Ｇの濃度を算出する。

電子受容体としては上記のフェリシアン化カリウムやフ
ェリシアン化ナトリウム、フェリシアン化アンモニウム
などのフェリシアニドの他ジクロルフェノールインドフ
ェノールなどが利用出来る。

（３）　　Ｈ２Ｏ２を検出する方法リン酸ナトリウム緩衝液（１／１５Ｍ、Ｉ）Ｈ５，６）
０．３ｍｌ、４　ｍＭ、２．２′−アジノジ〔３−エチ
ルベンツチアゾリンスルホネイト（６）〕（ＡＢＴＳ）
と１２ｕ／ｍ１ｃｙ）ホースラディツシュペルオキシダ
ーゼを含む発色液Ｑ、　５　ｍｌ、１．５−ＡＧ酸化酵
素又はその抽出ｉ　ｏ、　１ｍｌ及びｌ、　５−　Ａ　
Ｇ溶Ｈａ、　１ｍ１を容器に入れ、定する。既知濃度の
１．５−ＡＧ浴溶液検量線を作成しておき、試料の吸光
度より１，５−ＡＧの濃度を算出する。

ホースラディツシュペルオキシダーゼの基質としては、
ＡＢＴＳの外、５−アミンサリチル酸、４−アミノアン
チピリンとフェノール、ｏ−トルイジン等の発色基質や
、ｐ−ヒドロキシ酢酸、ｐ−ヒドロキシプロピオン酸等
のケイ光基質が利用できろ。

また、１．５−　Ａ　Ｇの酸化反応により生成したＨ２
Ｏ２の検出法としては、この他に、■モ０２電極を用い
て直接測定する方法や、ルミノール化合物、ルシゲニン
、アリルシュウ酸エステル類゛のＨ２Ｏ２酸化による化
学発光を利用する方法なども利用し得る。

（４）式（１）又は式（２）の化合物を分析する方法１
、５−　Ａ　Ｇ溶液にシー−トモナス菌由来の膜画分サ
スペンションを加え３０℃、１６時間反応する。反応終
了後超遠心により膜画分を除き、上澄液で凍結直空乾燥
して白色粉本を得る。この粉本をカルボニル基のラベル
化剤又は水酸基の保護剤で処理することにより、分析す
ることができる。

たとえばカルボニル基のラベル化剤として２．４−ジニ
トロフェニルヒドラジンを用いる場合には、凍結乾燥し
た粉本を少量のエタノールに溶解し、不溶物を除去した
ｐ液へ２，４−ジニトロフェニルヒドラジン飽和エタノ
ール溶液と微量の濃塩酸を添加し熱湯中で加熱反応させ
る。この生成物を逆相系のＨＰＬＣＣｉ体りロマトグラ
フィー）により分析することにより、生成物式（１）を
検出することができる。また、水酸基の保護剤としてト
リメチルシリルクロライド（ＴＭＳ）を用いる場合には
、凍結乾燥した粉本を少量のピリジンに溶解後、ＴＭＳ
を添加し、室温下に攪拌することにより、生成物式（２
）の全ての水酸基を保護した化合物にすることができる
。このｍＷの一部を、ガスクロマトグラフィーで分析す
れば式（２）の化合物を検出することができる。

〔効果〕

次に本発明の効果について説明する。

実験例１．　　（基質特異性）後記参考例】で得られる１、　５−　Ａ　Ｇ酸化酵素抽
出液を用い前記フェリシアニド法のうち基質を糖及び糖
アルコールに置きかえて反応させ基質特異性を調べた結
果、シュードモナス属に属する微生物の産生する１、５
−ＡＧ！化啼素は第−表に示される如（１，５−ＡＧに
対し高い特異性を示す。

第−表基質特異性実験例２．（反応至適［）Ｈ１温度条件）後記参考例１
で得られろ抽出液を用いて、シュードモナス属に属する
微生物の産生する１、５−ＡＧ酸化酵素の１．５−　Ａ
　Ｇ変換反応における至適ｐｒ−を及び至適温度を調べ
第１図及び第２図に示される結果を得る。これらの図よ
り至適ｒ＋ＨはｐＨ６〜ｐＨ７，５至適温度は２５〜４
　］　’Ｃ程度である。

又ｐＨ安定性を調べる為異ったｐＨ値を有す、るリン酸
バッファー（ｐＨ６〜７）トリス−塩酸バッファー（ｐ
Ｈ７，２〜９）中へ抽出液を加え４℃で一日保存した後
変換活性を調べたところｐＨ６，５〜８の範囲で安定で
あった。

実験例３．　　（１，５−ＡＧの測定）（］）　　酸素
電極法の検量線後記参考例１で得た抽出液（■白質譲度５■／ｍ］）を
用いた。

酸素濃度計（米国ギルツル社製オキシグラフ）の反応容
器中へ次の反応液を加え攪拌しつつ３４℃とした。

トリス−塩酸緩衝液（０，０５Ｍ　ｐＨ７）　１　　ｍ
ｌ可溶化液（蛋白量５　ｍｇ／ｍｌ　）　　　　　　　
０．３ｍ１３０ｍＭフェナジンメトサルフェート　２０
　μｍ反応器に栓をして密閉した後マイクロシリンジを
用いて既知濃度の１．５−　Ａ　Ｇ浴ｔＬ５０μｍを反
応器中へ注入して酸素、消費速度を記録した。その結果
第３図に示ｊ如＜１．５−Ａ０１度と酸素消費速度の間
に比例μｓ係が認められた。

（２）　　フェリシアニドを電子受容体として用いろ方
法の検量線後記参考例１で得た抽出液（蛋白量５■／ｍｌ　）を用
いる。次の組成の反応液を試験管中で３４℃１０分間反
応させる。

トリス−塩酸緩衝ｉ（０，０５Ｍ、ｐＨ８）　　０．７
ｍｌフェリシアン化カリウム溶液（０，］Ｍ）　　Ｏ，
１ｍｌ抽出液　　　　　　　０．１ｍ１）．５−ＡＧ浴液　　　　　　　　　　　　０．１ｍ１
（ブランクには蒸留水を使用）反応後硫酸第二鉄−デエバノール試薬Ｑ、　５　ｍｌ及
び蒸留水３．５　ｍｌ　ｖ加えて反応を停止させる。

１０分間放置すると緑色に呈色するので６６０ｎｍで吸
光度を測定する。既知濃度の１．５−ＡＧ浴溶液つき試
験すると１．５−ＡＧＪＩ度と６６０　ｎｍにおける吸
光度の間には第四図に示す如く比例関係が認められた。

（３）　　ジクロルフェノールインドフェノール（ＤＣ
ＩＰ）ラミ子受容体として用し・ろ方法の検量線後記参考例１で用いた抽出液（蛋白質５■／ｍ１）を用
いる。次の組成の反応０．を分光光度計のセル中へ入れ
３４°Ｃに保つトリス−塩酸緩衝液（０，０５Ｍ、ｐＨ８）１．８−Ｔ
ＩＪ］　ｍＭＤＣＩ　Ｐ　　　　　　　　　　Ｏ，３ｍ
ｌ］　ＯｍＭＫＣＮ　　　　　　　　　　０．３ｍｌ抽
出液　　　　　　　Ｑ、３　ｍ１３４℃に保温した１、　５−　Ａ　Ｇ溶液をセル中に添
加し攪拌して６００　ｎｍにおける吸光度を経時的に記
録する。

既知（輝度の１．５−　Ａ　Ｇにつき試験すると１．５
−ＡＣ６度と６００　ｎｍにおける吸光度変化速度、即
ちＤＣＩＰの還元速度には第五図に示す如く比例関係が
認められた。

（４）　　Ｈ２Ｏ２を発色により検出する方法の検量線
後記参考例６で得た酵素（３，２ｕ／ｍｌ）を用いる。

次の組成の反応液を試験管中で３７°Ｃ２時間反応させ
る。

・リン酸ナトリウム緩衝液（］　／１５Ｍ、　ｐＨ５，
６）　　０．３ｍｌ・発色試薬　　　　　　　　　　　
　　　　　　　０．５　ｍｌ・酵素　　　　　　　　　
　　　　　０．１ｍ１−１．ｓ−Ａａｍ＊　　　　　　
　　　　　　　　　　ｏ、１ｍ１（ブランクには蒸留水
を使用）反応後、氷冷して反応を止め、４０５　ｎｍにおける吸
光度を測定する。既知濃度の１，５ＡＧ浴液につき試験
すると、１．５−ＡＧｉｌｉ１度と４０５　ｎｍにおけ
る吸光度の間には、第６図に示す如く比例関係が認めら
れた。

（５１Ｈ２Ｏ２をケイ光により検出する方法の検量線後
記参考例６で得た１猪素（１，５ｕ／ｍｌ）を用いる。

次の組成の反応液を試験管中で３７℃２時間反応させる
。

・ケイ光試薬　　　　　　　　　　　　　　　　　０・
２ｍｌ酢酸ナトリウム緩衝液（０，０５Ｍ、　　ｐＩ−
１５，０）・酵　累　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　０．　］　ｍｌ・Ｉ、５ＡＧ溶液　　　　　　　
　　　　　　　Ｑ、　Ｉ　Ｉｔ’ｌｌ（ブランクには蒸
留水を使用）反応後、グリシン・ナトリウム緩衝液（０，１Ｍ、　ｐ
Ｈ１０，３）を２．５　ｍｌ　７ｉ［］えて反反応器め
、レイ起波長３　］　５　ｎｍ、ケイ光波長４５０　ｎ
ｍで相対ケイ光強度？：測定する。

既知１度の１．５−　Ａ　Ｇ溶液につき試、験すると１
．５−ＡＣ３度と相対ケイ光強度の開には、第７図に示
す如く比例関係が認められた。

（６）　　１ｈｏｚ電極法の検量線後記参考例７で得た１、　５−　Ａ　Ｇ酸化酵素固定化
カラムの上流にポンプ、インジェクター）下流にＨ２ｑ
２電極（石川製作所、Ｂ　Ｈ型）を接続する。Ｈ２Ｏ２
電極には過酸化水素計（石川製作所、モデルＡｌ−１０
０６型）とレコーダーをセットする。１．５−　Ａ　Ｇ
固定化カラムと■−１２０２に極部を３７℃に保った恒
温槽に漬ける。

ポンプから１ｍ１／分の流速でリン酸緩衝液（］／１５
Ｍ、　ｐＨ５，６−）を流し、安定化させる。

この流路系へインジエクターカＩ−）　１．５．−Ａ　
Ｇ溶液５０ｍ１を流し、１．５−　Ａ　Ｇ酸化反応によ
って生じたレコーダー上のピーク面積を測定する。既知
濃度の１．５−　Ａ　Ｇ溶液につき試験ｆると、１．５
−ＡＧ濃度とピーク面積の間には、第８図に示す様な検
量線が得られた。

以上から明らかなように本発明の方法によると１．５−
　Ａ　Ｇが極めて簡便に定量しつる。

実施例１゜次の組成の試料を実験例３に示した３種の方法で１．５
−　Ａ　Ｇの含量を測定したところ下に示す如（それぞ
れの方法で１．５−ＡＧの測定が可能であった。

実施例２゜ヒト血清Ｑ、　４　ｍｌ　ヘ過塩素酸水溶１（６０％ｗ
／ｖ）３０局を加え、振盪の後遠心分離して得た上澄液
０．２　ｍｌをホウ酸型強塩基性樹脂ＡＧＩ−Ｘ８（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社製）Ｑ、３ｍｌ’ｉ光填した前処理カラ
ムへ通し、水３ｍ１で洗浄して通過液３　ｍｌ　？：得
た。

このカラム通過液３　ｍｌを濃縮乾固してから、蒸留水
を加え、正確に０．５　ｍｌに調整した。この様にして
得られた除タンパク質と前処理を施した資料を、前記、
実験例３に示した３種のＩ（２０２を検出する方法で測
定したところ下に示す如く、それぞれの方法で、血清中
の１．５−　Ａ　Ｇの測定が可能であった。なお、検量
線は、既知濃度の１、５−　Ａ　Ｇを含む標準溶液を用
いて前記と全く同一の処珂を施し、それぞれの方法で測
定して参考例１．（シー−トモナス属に属する微生物由
来の１．５−　Ａ　Ｇ変換活性微生物処理物の取得）カザミノ酸１％、１．５−　Ａ　Ｇ　０．２％、（Ｎル
）２ＳＯ４０，１％、Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、ＮａＣｌ
０．１％、ＭｇＳＯ４・７８２００．０２％、啼母エキ
ス０．１％、ｐＨ７蒸留水から成る培地１００ｍ１宛を
５００ｍ１容三角フラスコに分注し１）５℃、１５分間
殺菌しＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ−ＮＫ　　８５０
０　］　（微工研菌寄第８１００号（Ｆｅｒｍ　ｐ　　
８１００　）　）の斜面培養物の一白金耳を接種し３０
°Ｃで回転振盪培養機（２２０ｒｐｍ　）上で１６時間
培養する。培養液から遠心分離により菌体を分離しトリ
ス・塩酸緩衝ｆｆ（０，０５Ｍ、　ｐＨ７）で洗浄して
出発液量の１／ＩＯ容の菌体げんだく液とする。この菌
体けんだく液を冷却してフレンチプレスにより菌体破壊
液を得、これを１０分間遠心分離（１０，０００×ｇ）
して、沈澱する細胞壁を除去した後、さらに１時間遠心
分離（１００，０００Ｘｇ）して沈澱物を得、トリス塩
酸緩衝液（０，０５Ｍ、　ｐＨ７）で洗浄し、同緩衝液
中に懸濁して膜画分懸濁液を得る。この）曹濁液にトリ
トンＸ−１００を１％（ｗ／ｖ）となるように添加し、
４°Ｃで１時間攪拌した後、不溶物を遠心分離（１００
，ＯＯＯＸｇ）して除去し、１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素
抽出液を得る。

参考例２゜参考例１で得られる活性成分可溶化液を冷却しつつ硫酸
アンモニウム粉本を加え析出する蛋白質を遠心分離（１
０，ＯＯＯＸｇ、Ｉ　０分）で分離し本文記載のフェリ
シアニド法で活性を測定すると活性は硫酸アンモニウム
４０％飽和区分に抽　　出　　ｉ　　　　　　　　　　
　　　　　　０．４７４０％硫安飽和画分　　　　０．
８５６０％　　　　　　　　　　０８０％　　　　　　　　　　０＊酵素一単位をフェリシアニド２μｍｏｌｅｓ　を１０
分間に還元する活性とし、蛋白１ｍｇ当りに換算した値参考例３．　　（ビクノポラスＩＦ０４９２３由来の１
．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素の取得）１、５−　Ａ　Ｇ　０．３％、酵母エキス０．４％、麦
芽エキス０．５％、水道水からなる培地１００ｍ１宛を
５００　ｍｌ容三角フラスコに分注し、１）５℃、１５
分間殺菌しビクノポラス・コクシネウス（ＩＦＯ４９２
３）の斜面培養物の一白金耳を接種し２７℃で回転振盪
培養機（２２０ｒｐｍ）上で６日間培養する。培養液か
ら遠心分離により菌体を分離し、リン酸ナトリウム緩衝
ｉ　（０，１Ｍ。

ｐＨ６）で洗浄して、湿菌体重量の７．５倍容の菌体け
んだく液とする。この固体けんだく液を冷却してフレン
チプレスにより菌体破壊液を得、冷却下にこれを１０分
間遠心分離（１０，０００Ｘｇ）して、沈澱する細胞壁
を除去した後、さらに１時間遠心分離（］００．ＯＯＯ
Ｘｇ）して膜画分を除き、細胞質上清を得る。冷却下、
この上清に硫酸アンモニウム粉本を加えて攪拌しながら
溶解する。この時析出するタンパク質を遠心分離（１０
，０００Ｘｇ、１０分）で分離し、各硫酸アンモニウム
画分を本文記載の■−１２０２を検出する方法（１，５
−ＡＧ浴溶液して１％濃度のものを使用〕で１．５−　
Ａ　Ｇ酸化活性を測定すると、活性は、主に４０〜６０
％飽和画分に存在する。酵素一単位を、１分間当り１．
５−　Ａ　Ｇを酸化して）１２０２１μｍｏｌｅを発生
する量と定義すると、この硫安画分の比活性は４．０で
ある。湿菌体１ｇ当りからＩ】単位の酵素を得る。

参考例４゜参考例３において、菌株をピクノポラス・コクシネウス
（ＩＦＯ６４９０）に変え、参考例３と同じ培地組成を
有する培地で４日間培養する。

参考例３と同様の精製操作をへて、比活性３．６の１．
５−ＡＧ酸化醪素を得る。

参考例５．　　（コリオラス・コンソルス（ＩＦＯ９０
７８）由来１．５−　Ａ　Ｇ酸化ｇ素の取得）参考例３において菌株をコリオラス・コンソルス（ＩＦ
Ｏ９０７８）に変え、参考例３と同じ培地組成を有する
培地で１０日間培養する。参考例３と同様の精製操作を
へて、比活性２．８の１、５−　Ａ　Ｇ酸化酵素を得る
。

参考例６．（高純度酵素の取得）参考例３で得られた１、　５−　Ａ　Ｇ酸化酵素の６０
％飽和硫安沈澱物を蒸留水に溶解したものを用い、全操
作を４℃に冷却下にＤＥＡＥ−トヨパール（東洋ソーダ
社製）クロマトを行い精製した。酵素４１００単位／　
２０　ｍｌ溶液を１００倍容のリン酸緩衝液（０，０１
Ｍ、　ｐＨ６，０）で透析し、同緩衝液で平衝化された
Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−Ｔｏｙｏｐｅａｒ　ｌカラム（２，
５ｃｍＸ　４０　ｃｍ　）にチャージする。カラムをリ
ン酸緩衝液（０，０１Ｍ、　ｐＨ６，０）で十分洗浄の
後、リン酸緩衝液で０．ＯＩＭから０．５Ｍ（ｐＨ６，
０）の濃度勾配を付は溶出する。活性は０．１Ｍから０
．２　Ｍ濃度の間に溶出されるので、活性フラクション
を集めｐＭ−１０限外濾過膜（アミコン社製ンを用いて
濃縮すると、比活性１８の酵素溶液（３６０単位／ｍｌ
ン５．５　ｍｌが得られろ。

参考例７．（固定化カラムの製法）多孔質ガ７スＣＰＧ　　］　Ｏ（２００／４００メ７シ
ユ、平均ポアサイズ５００Ａ、エレクトロヌクレオニッ
ク社ｆｆ）０．５ｇをγ−アミノプロピルトリエトキシ
シラン０．５ｇにて、常法によリカツブリング処理し、
続いて無水コハク酸０．５ｇにてカルボキシル化を行５
゜乾燥した多孔質ガラスは、クロロホルム中で、過剰の
チオニルクロライドにてカルボキシル基を酸クロライド
とする。得られた酸クロライド化多孔質ガラス１ｇに前
記参考例６で作成した１、　５−　Ａ、　Ｇ酸化慴素溶
液２゜５　ｍｌを加え、ｐＨを６〜７に保ちながら２５
℃にて１２時間ゆっくり攪拌しながら反応させ、縮合反
応を完結させる。得られた１、　５−　Ａ　Ｇ酸化酵素
固定化多孔質ガラスを内径２、３　ｍｍ　Ｘ長さ７０　
ｍｍＯカラム（１ｍｌの注射筒）に充填する。１Ｍ食塩
を含有するリン酸緩衝液（１／１５Ｍ、　ｐＨ５，６）
　２０　ｍｌを流し、共有結合していない酵素を除き、
さらにリン酸緩衝液（］／１５Ｍ、　ｐＨ５，６）を流
して洗浄し、１．５−　Ａ　Ｇ酸化實素固定化カラムを
得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で使用する酵素の至適ｐｕを示す曲線で
あり、第２図は該酵素の至適温度を示す曲線であり、第
３図は酸素電極法における検量線を、第４図はフェリシ
アニド法における検ｔｉを、第５図はジクロルフェノー
ルインドフェノール法における検量線を、第６図ハ）ｈ
０２（７）発色法による検量線を、第７図はＨ２Ｏ２の
ケイ先広による検量線を、第８図はＨ２Ｏ２電極法によ
る検量線をそれぞれ示したものである。

Claims

【特許請求の範囲】（１）試料中の１，５−アンヒドログルシトールに電子
受容体の存在下、１，５−アンヒドログルシトール酸化
能を有する酵素を作用させ、試料中の酸素の消費量を測
定するか、又は生成する過酸化水素電子受容体の還元体
もしくは下記式（１）又は（２）で示される化合物を定
量することを特徴とする１，５−アンヒドログルシトー
ルの定量法。 ▲数式、化学式、表等があります▼（１）▲数式、化学
式、表等があります▼（２）（２）下記特性を有する１，５−アンヒドログルシトー
ル酸化能を有する酵素１、基質特異性 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２、至適ｐＨｐＨ６〜７．５３、至適温度２５〜４１℃ ４、安定ｐＨ６．５〜８（３）１，５−アンヒドログルシトール酸化能を有する
酵素を産生する微生物を培地中で培養し培養物から１，
５−アンヒドログルシトール酸化能を有する酵素を採取
することを特徴とする１，５−アンヒドログルシトール
酸化能を有する酵素の製造方法。