JPS6279780A - １，５―アンヒドログルシトールの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は糖尿病の診断マーカーとして期待サレル１，５
−アンヒドログルシトール（以下ｒｌ、５−ＡＧＪとい
う）の測定方法、その測定に使用する酵素及びその製法
に関する。

〔従来の技術〕

１、５−　Ａ　Ｇはヒト髄液及び血漿中に存在しある種
の疾患、特に糖尿病において血漿中の量が低下すること
が報告されている化合物である。この１．５−ＡＧを酸
化する酵素の存在は知られておらず、従来、１．５−Ａ
Ｇの測定は主ニガスクロマトグラフィーによりおこなわ
れていた。

〔発明が解決すべき問題点〕

しかし、従来の方法では試料の前処理及び、分析機器の
維持、管理に高度の技術を必要とし、簡便な１．５−　
Ａ　Ｇの測定法が要望されていた＠ 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは１．５−　Ａ　Ｇの簡便な測定法を鋭意研
究した結果、ピクノボラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）属
又はコリオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　）属に属する微生
物及び土壌より分離したシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　）属のある種の菌株より得た酵素が１．５
−ＡＧに作用し、１．５−　Ａ　Ｇが下記式（１） で表わされる化合物に酸化され、又この化合物は水中で
容易に下記式（２） で表わされる化合物になることを見い出した。

：・　　　　　　　本発明は上記知見に基づいて完成さ
れたものである。

即ち本発明は前記酵素が次の反応（ａＪを行う：　　　
　　　ことに基づいている。

： □ 本反応は酸化反応であり反応液中の酸素濃度の変化を酸
素電極その他により測定するこ、　　　　　　２に１つ
・１・酸化反応に′″り生成ｔ−“過酸：　　　　　化
水素の量を、過酸化水素電極による方法、ペルオキシダ
ーゼを用いる比色法その他の方法により測定することに
より、あるいは反応液中にフェリシアニドなどの電子受
容体を共存させその還元体の量を測定することにより１
．５−ＡＧの量を測定することが出来る。又本反応で生
成する式（１）の化合物はカルボニル基を有するため種
々のカルボニル試薬例えば２．４−ジニトロフェニルヒ
ドラジンなどと反応しヒドラゾンを生成するのでそのヒ
ドラゾン量を測定することにより、１．５−ＡＧｉを測
定することが出来る。さらに、本反応で生成する式（２
）の化合物量を測定することによっても１．５−ＡＧ量
を測定することが出来る。

本発明で用いられる試料としては、ｌ、５−ＡＧの濃度
を測定したいものであれば特に制限はなく、例えば髄液
血漿、血清や尿及び１゜５−ＡＧ濃度を測定しやすいよ
うにこれらの試料を処理した処理液などがあげられる。

本発明で用いられる電子受容体としては、１、５−　Ａ
　Ｇの酸化反応に関与するものであれば、特に制限なく
、例えば、酸素、フエナジンメトサルフエート、ジクロ
ルフェノールインドフェノール、フェリシアン化カリウ
ム、フェリシアン化ナトリウムなどのフェリシアン化化
合物、チトクロムＣ，ＮＡＤ　、ＮＡＤＰ。

ＦＭＮなどの補酵素などがあげられる。

本発明で用いられる、１．５−　Ａ　Ｇを式（］）の化
合物に酸化する能力を有する酵素（以下ｒｌ、５−ＡＧ
酸化酵素」という）は、それを産生ずる微生物より得ら
れる。そのような微生物としては、例えばシュードモナ
ス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）　ｓｐ−ＮＫ　　８５０
０１　（微工研歯寄第８１００号（Ｆｅｒｍｐ　　８１
００）］、ピクノボラス・コクシネウス（Ｐｙｃｎｏｐ
ｏｒｕｓ　ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ　）ＩＦ０４９２３、同
ＩＦＯ６４９０や、コリオラス・コンソルス（Ｃｏｒｉ
ｏｌｕｓ　ｃｏｎｓｏｒｓ　）　Ｉ　Ｆｏ　９０７８な
どがあげられる。これらの微生物のうち、シュードモナ
ス属に属する微生物は本発明者らが昭和５８年６月に埼
玉県大宮市吉野町で採取した土壌中より分離した新菌株
でありその医学的性質は下記のとおりである。

１、形態（肉汁寒天培地２７℃、１６時間培養）（１）
細胞の大きさ　　０．７〜０．８　Ｘ　１．０−１．７
　ｔａｎ、桿状（２）細胞の多形性　認められない （３）運　　動　　性　　極毛を有し運動性有り（４）
胞子の有無　認められない （５）ダラム染色性　陰性 （６）抗　酸　性　陰性 ２、各種培地における生育状態 （１）肉汁寒天斜面培養：　ユロニーは光沢のある不透
明の円形で辺縁は金縁で色は祭日 な示す。

（２）肉汁寒天斜面培養：　培地の表面を拡散増殖し不
透明で光沢のある発育を示す。色 は祭日 （３）肉汁液体培養：　培養１日間で全体が濁り３日間
で試験管底部に一体が沈澱す る。菌膜が認められる。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：　　２０℃培養で表面に
のみ生育を認め２０日間の培養でゼラチン の液化を認めず。

（５）リドマスミルク：　変化を認めず。

３、主扉的性質（２７℃培養〕 （１）硝酸塩の還元　陽性 （２）脱窒反応　陽性 （３）　ＭＲテス　ト　陰性 （４）　　ＶＰ　　テ　　ス　　ト　　　陰　性（５）
インドールの生成　陰性 （６）硫化水素の生成　陰性 （７）デンプンの加水分解　　陰　性 （８）クエン酸の利用　　クリステンセン及びシモンの
培地でクエン酸を利用するが コーザーの培地では利用しな い （９）無機窒素源の利用　　アンモニアを利用するが硝
酸塩を利用しない。

（１０）色素の生成　陰性 （］１）ウレアーゼ　陽性 （１２）オキシダーゼ　陽性 （１３）カタラーゼ　陽性 （１４）生育の範囲　１０〜３７６ＣｐＨ７−８，５（
１５）酸素に対する態度　　好気性 （１６）　　０−１　テ　ス　ト　　酸化性（１７）炭
水化物の利用　　グルコース、グリセリン、コハク酸ナ
トリウム、クエン酸 ナトリウムを利用し酢酸ナト リウムパラヒドロキシ安息香 酸を利用しなかった。

（］８）糖類からの酸及びガスの生成 酸の生成　　ガスの生成 Ｌ−アラビノース　　　　　十　　　　　　　　−Ｄ−
キシロース　　　　十　　　　　　−Ｃ−グルコース　
　　　十　　　　　　　−Ｄ−フラクトース　　　　　
＋　　　　　　　−Ｄ−ガラクトース　　　　　＋　　
　　　　　　−グリセリン　　十　　　− ラムノース　　　十　　　　− Ｄ−マンノース　　　　−　　　　　　−麦　　芽　　
糖　　　　−− 庶　　　　　糖　　　　−− 乳　　　　　　糖　　　　−− トレハロース　　　　−　　　　　　−Ｄ−ソルビット
　　　　−　　　　　　−Ｄ−マンニット　　　　−　
　　　　　−イノジット　　−　　　　− ラフィノース　　　−− デンプン　　−− （Ｉ９）塩化ナトリウムの耐性 トリプトン】０ｇ１蒸留水ＩＡｐＨ７，０の基礎培地へ
それぞれ２％、５％、７％濃度となるよう塩化ナトリウ
ムを加え菌液を接種後静置培養した。２％、５％の培地
では生育を認めたが７％の培地では生育を認めなかった
。

（２０）フェニルピルビン酸試験陰性 （２］）チロシン溶解性試験　陰性 以上の性状をもとに本閑の分類学的性質を「パーシーズ
・マニュアル・オブ・ディターミネーティブ・バクテリ
オロジー」第８版（１９７４年）の分類と対比すると２
２０頁シュードモナス属のシュードモナス・スタトゼリ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｔｕｔｚｅｒｉ　）が近
縁の種として挙げられる。しかし、本菌株はデンプンを
加水分解せず、又麦芽糖より酸を生成しないという性質
を有しており、これらの点でシュードモナス・スタトゼ
リと異なっている。以上の理由から本歯をシュードモナ
ス・ｓｐ、ＮＫ−８５００１と命名した。

上記菌体を培養する培地としては１．５−　ＡＧ、無機
窒素源、無機塩を含む培地が用いられるが生育を促進す
る目的で有機栄養源を添加することができる。無機窒素
源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等が、
無機塩としてはナトリウム、カリウム、マグネシウム、
カルシウム、鉄、亜鉛等の塩類が、有機栄養源としては
ペプトン、カザミノ酸、肉エキス、コーンスチーブリカ
ー、酵母エキス等が使用でき゛る。

培養は振盪あるいは通気攪拌など好気的条件が良＜ｐＨ
６〜８、温度２５〜３５°Ｃで行われる。

本発明で使用するシュードモナス属由来の１、５−　Ａ
　Ｇ酸化酵素は次の方法により単離される。即ちこの酵
素は菌体の膜画分に存在するので、まず培養物から菌体
を分離し適当な沈漬液中で菌体を破壊してその処理液か
ら膜画分を得る。

菌体破壊の方法はダイノミル、フレンチプレス、超音波
等の物理的方法や、トリトンＸ　−１００、ＥＤＴＡ等
の化学的方法リゾチーム等の酵素的方法を単独又は併用
して用いることができる。膜画分は菌体破壊液から異な
る遠心力を複数回利用することにより細胞壁成分、核酸
、菌体内可溶性蛋白質等から分離したサスペンションの
状態で得ることができる。

次いでトリトンＸ−，１００（ポリオキシエチレンオク
チルフェニルエーテル〕、コール酸、デオキシコール酸
等の膜成分可溶化剤などにより活性成分を抽出し不溶分
を遠心分離により除去して１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素抽
出液を得、この抽出液からポリエチレングリコール分画
や硫安分画などの酵素の精製に一般に使われている方法
を用いて、１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素を単離することが
できる。

次にシュードモナス属由来の１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素
の諸性質について述べる。

１、　　作　　用 １、５−　Ａ　Ｇを酸化し、上記式（１）の化合物を生
成する。

２、基質特異性 １、５−　Ａ　Ｇに特異的に作用する。

３、至適ｐＨ ｐＨ６〜７，５ ４、至適温度 ２５〜４　］　’Ｃ ５、安定ｐＨ ６，５〜８ 又、本発明で使用するピクノポラス属及びコリオラス属
由来の１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素は、次の方法により単
離される。

即ち、この酵素は函体の細胞質画分に存在するので、ま
ず培養物から菌体を分離し、適当な緩衝液中で菌体を破
壊して、その処理液から細胞質画分を得る。

菌体破壊の方法としては、前記のシュードモナス属菌の
場合と同様の操作により行うことができる。細胞質両分
は、菌体破壊液を遠心することにより、沈澱物として膜
画分及び細胞壁成分等から分離し得ることができる。

次に、この遠心上澄液をポリエチレングリコール分画や
硫安分画など一般に酵素の精製に使われている方法を用
いて、１．５−、Ａ　Ｇ酸化酵素を単離することができ
る。さらに、高純度の酵素を必要とする場合は、必要に
応じて通常用いられているイオン交換クロマトグラフィ
ー及びゲル濾過等のカラムクロマトグラフィーにより精
製することができる。

次にピクノポラス属及びコリオラス属に属する微生物か
ら得られる１、　５−　Ａ　Ｇ酸化酵素の諸性質を示す
。

本発明では、単離し１こ１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素のみ
ならず、１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素抽出液や膜画分のサ
スペンションなどの菌体処理物も利用しつる。また、こ
れらを樹脂又は膜等の担体に固定化されたものも利用し
つる。

次に１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素又はそれを含む膜画分サ
スペンションあるいは１．５−ＡＧ酸化酵素抽出液に１
．　’５−　Ａ　Ｇを添加して反応させ反応液中に生成
する物質について述べる。

シュードモナス属に属する微生物の膜画分サスペンショ
ン（蛋白質／４度１０■／ｍｌ、トリス・塩酸緩衝液０
．０５ＭｐＨ７）中へ１，５−ＡＧを２ｍｇ／ｍｌ程度
添加し３０℃、１６時間撮盪しながら反応すると１．５
−　Ａ　Ｇは消失し物質囚が生成蓄積する。これはＴＬ
Ｃ分析により確認出来る。反応液をシリカゲルプレート
上へスポットし１ｓｏＰｒＯＨ−）ｈｏ（９５：　５　
）の溶媒で襄開後良く乾燥しアニスアルデヒド硫酸試薬
を噴霧して９０〜１００℃に５〜１０分加熱すると物質
囚はＲｆｏ、４付近に青色スポットとして観察出来る。

反応終了液から超遠心により膜画分を除き、上澄液を凍
結真空乾燥して白色粉末を得る。

白色粉末を少量のエタノールに溶解し不溶物を除ｆした
Ｐｉへ２，４−ジニトロフェニルヒドラジン飽和エタノ
ール溶液と微量の濃塩酸を添加し熱湯中で加熱後冷却し
水を濁りの出るまで加え放置′ｆると褐色沈澱が得られ
る。

この沈澱を戸数しエタノール−水から再結晶し必要な場
合はシリカゲルクロマトにより精製すると黄弓色針状結
晶が得られる。

この結晶の物理化学的性状は次の通りである。

１、　　融　　点　　１９２°Ｃ ２、分子量　３４２ （マススペクトル） ３、分子式　Ｃ１゜ＨＩ３　Ｎ４０８ マススペクトルによる実測値　３４３（Ｍ＋Ｈ）”計算
値　　　　　　　　３４２．２７２（メタノール中）　
　２３１　（４１６，２）、２５５ｓｈ（３１３，５）
、２８０ｓｈ（１７８，４）、３６４（６５９゜４） ５、　　ＩＲスペクトル 赤外線スペクトルは試料なＫＢｒによる錠剤法を用いて
測定する。

３６００〜３０００ｃｍ（フロート）、１６２２゜１５
８４．１５１８．１５０４．１４］５゜１３３３．１２
７３．１２２４．１）３７゜１０７３．１０５０．１０
２８．９９３゜９２５、　８７８．　７４０ ６、　　　ＣＮＭＲ化学シフト スペクトルはＤＭＳＯ−ｄ６溶媒中で測定する。化学シ
フトはテトラメチルシラン を内部基準としてＯｐｐｍとし、これとの比較値、実験
条件下で溶媒ＤＭＳＯ−ｄ６のシグナルは４０．４０　
ｐｐｍに発現。

マススペクトルのデーターと一致して １２個の炭素が観察された。

６１．９ｆｔ＋、　７１．２ｆｔ）、　７３．６（ｄｌ
、　７８．４（ｄｌ。

８２．３（ｄｉ、　］　］　６．２（ｄｌ、　１２４．
０（ｄｌ、　１３０．１（ｓｌ、　］　３０．８（ｄｌ
、　］　３７．６（ｓｌ、　１４５．５（ｓｌ。

１５３．２（ｓ） ７、　　　’ＨＮＭＲスペクトル スペクトルはＤＭＳＯ−ｄｄ中で測定。化学シフトはテ
トラメチルシランを内部 基準としてＯｐｐｍとしてこれとの比較値。

３．６９　ｐｐｍ（ＩＨ，ｄｄ　）、　４．１４〜４．
１５（２Ｈ，ＡＢｑ　）、　４．６２〜４．６５　（２
Ｈ。

ｔ、　ｄ）ｔ　５．６３〜５．６５（ＩＨ，ｄ）１７．
２４　（Ｉ　Ｈ，ｂｒｏａｄ　）、　７．８７−７．９
０（ＩＨ，ｄ）、８．３３〜８．３７　（ＩＨ，ｄｄ　
）。

８．８６〜８．８７（ＩＨ，ｄ）、４．６２〜４．６５
（ＩＨ，ｔ−０旦）、５．６３〜５．６５（ＩＨ。

ｄ−０旦）、　７．２４　（Ｉ　Ｈ，ｂｒ−Ｎ旦）これ
らの直から前記の黄色針状結晶は次の化学式（３）を有
すると推定され、 このことから物質囚は前記式（１）の化学式を有するも
のと推定した。

又、ピクノポラス属及びコリオラス属に属する微生物か
ら得られる酵素を用いて前記シュードモナス属に属する
微生物の膜画分サスペンションの場合と同様に１．５−
　Ａ　Ｇを処理しても上記式（３）の化合物が得られた
。

次に、生成物の構造を確認するため、式（１）の化合物
を化学的に合成したところ、式（］）の化合物は、水存
在下において容易に水和し、式（２）で表わされる化合
物になることを見い出した。この化学的に合成した式（
１）の化合物の水和物式（２）を、前記１．５−　Ａ　
Ｇのシュードモナス属に属する微生物膜画分サスペンシ
ョン処理物に２．４−ジニトロフェニルヒドラジンを反
応させた場合と同様の操作により反応させたところ、上
記式（３）と全く同一の化合物が得られた。このことよ
り、１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素の生成物式（１）の化合
物は、水和物式（２）となって存在しているものと推定
された。

そこで、ガスクロマトグラフィーにより、１．５−ＡＧ
酸化酵素の生成物と化学合成した水和物式（２）の同定
を行った。固化合物をトリメチルシリル（ＴＭＳ）化し
カラムにより分析したところ、両者は全く同一の保持時
間に検出された。また、ガスクロマトグラフィー・マス
スペクトロメトリー（ＧＣ−ＭＳ）により、ピーク化合
物のフラグメントパターンを分析したところ、全く同一
のパターンであった。

以上のことから上記の推定は正しいものと考えられた。

従って本発明で用いられる酵素あるいは膜画分サスペン
ションは下の反応を触媒していると考えられる。

又、本発明における反応は前記（ａｌの反応式で示され
る反応をおこなうと考えられる。

なお、化学的に合成した水和物式（２）の物理化学的性
状は次の通りである。

１、熱分析（窒素気流中） ・脱水温度　　８６°Ｃ（水１分子の重量減少有り）・
融　　点　　６３〜７４°Ｃ ２、分子量　１８０ （マススペクトル） ３、分子式　Ｃ６Ｈ１２Ｏ６ マススペクトルによる実測値 計算値 ４．　　　ＩＲスペクトル ａｍ”−’　。

ＫＢｒ　、３４００，２９５０，２８７５゜１０９０．
１０４０，８４０ ５、　　　ＣＮＭＲ（］、　ＯＯＭＨｚ　）７２．５６
（ｔｌ、　　６９．８５（ｄｌ、　　６２．０３ｆｔ＋
６、　　’ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ　）’　　ｄ）、３
．６７（ＩＨ，ｄｄ）、３．５６（ＩＨ。

ｄ）、３．４５（ＩＨ，ｄ）、３．４４ＣＩＨ。

ｔ）、３．４０（ＩＨ，ｍ） ７、結晶形　無定形白色粉本 式（１）及び式（２）の化合物は新規化合物であり、又
１，５−ＡＧが脱水素され式（１）の化合物を与える反
応も新規反応である。

本発明の１．５−　Ａ　Ｇの測定法は上の反応に基づい
ており、反応課程あるいは反応生成物を利用して各種の
測定法が可能であり次にその内容を説明する。

（１）酸素消費に基づく方法 密閉型反応容器に０．０５　Ｍト’Ｊスー塩酸緩衝液（
ｐＨ７）１ｍｌ、３０　ｍＭフェナジンメトサルフェー
ト２０μｍ、１．５−ＡＧ酸化硼素又は膜画分サスペン
ジミンあるいは１．５−ＡＧ酸化酵素抽出液０．３　ｍ
ｌを加え酸素電極を挿入し反応容器内を３４℃で攪拌し
ながらこれに１．５−　Ａ　Ｇ溶液５０μＩを加えて反
応を開始し経時的に酸素の消費量をオキシゲンモニター
で測定する。既知濃度の１゜５−ＡＧ浴溶液検量線を作
成しておき試料の酸素消費量から１．５−　Ａ　Ｇの濃
度を算出する。

（２）電子受容体の着色度変化を利用する方法トリス−
塩酸緩衝液（０，０５Ｍ　ｐＨ７）０．７ｍｌ、０．１
Ｍフェリシアン化カリウム溶！　０．１　ｍｌ、シュー
ドモナス属に属する倣生物より得られる１、　５−　Ａ
　Ｇ酸化辱素又はその抽出液Ｑ、　ｌ　ｍｌ及び１．５
−　Ａ　Ｇ溶液０．１　ｍｌを容器に入れ３４℃で１０
分間反応させた後、硫酸茅二鉄τデュバノール試薬（硫
酸第二鉄５ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム３ｇ、８５％リ
ン酸９５ｍ１．蒸留水９００ｍ１）０、５　ｍｌ、蒸留
水’３．５　ｍｌを加え１０分開放置して６６０　ｎｍ
における吸光度を測定する。

既知濃度の１．５−ＡＧ浴溶液検量線を作成しておき試
料の吸光度より１．５−　Ａ　Ｇの濃度を算出する。

電子受容体としては上記のフェリシアン化カリウムやフ
ェリシアン化ナトリウム、フェリシアン化アンモニウム
などのフェリシアニドの他ジクロルフェノールインドフ
ェノールなどが利用出来る。

（３）　　Ｈ２Ｏ２を検出する方法 リン酸ナトリウム緩衝液（１／１５Ｍ、Ｉ）Ｈ５，６）
０．３ｍｌ、４　ｍＭ、２．２′−アジノジ〔３−エチ
ルベンツチアゾリンスルホネイト（６）〕（ＡＢＴＳ）
と１２ｕ／ｍ１ｃｙ）ホースラディツシュペルオキシダ
ーゼを含む発色液Ｑ、　５　ｍｌ、１．５−ＡＧ酸化酵
素又はその抽出ｉ　ｏ、　１ｍｌ及びｌ、　５−　Ａ　
Ｇ溶Ｈａ、　１ｍ１を容器に入れ、定する。既知濃度の
１．５−ＡＧ浴溶液検量線を作成しておき、試料の吸光
度より１，５−ＡＧの濃度を算出する。

ホースラディツシュペルオキシダーゼの基質としては、
ＡＢＴＳの外、５−アミンサリチル酸、４−アミノアン
チピリンとフェノール、ｏ−トルイジン等の発色基質や
、ｐ−ヒドロキシ酢酸、ｐ−ヒドロキシプロピオン酸等
のケイ光基質が利用できろ。

また、１．５−　Ａ　Ｇの酸化反応により生成したＨ２
Ｏ２の検出法としては、この他に、■モ０２電極を用い
て直接測定する方法や、ルミノール化合物、ルシゲニン
、アリルシュウ酸エステル類゛のＨ２Ｏ２酸化による化
学発光を利用する方法なども利用し得る。

（４）式（１）又は式（２）の化合物を分析する方法１
、５−　Ａ　Ｇ溶液にシー−トモナス菌由来の膜画分サ
スペンションを加え３０℃、１６時間反応する。反応終
了後超遠心により膜画分を除き、上澄液で凍結直空乾燥
して白色粉本を得る。この粉本をカルボニル基のラベル
化剤又は水酸基の保護剤で処理することにより、分析す
ることができる。

たとえばカルボニル基のラベル化剤として２．４−ジニ
トロフェニルヒドラジンを用いる場合には、凍結乾燥し
た粉本を少量のエタノールに溶解し、不溶物を除去した
ｐ液へ２，４−ジニトロフェニルヒドラジン飽和エタノ
ール溶液と微量の濃塩酸を添加し熱湯中で加熱反応させ
る。この生成物を逆相系のＨＰＬＣＣｉ体りロマトグラ
フィー）により分析することにより、生成物式（１）を
検出することができる。また、水酸基の保護剤としてト
リメチルシリルクロライド（ＴＭＳ）を用いる場合には
、凍結乾燥した粉本を少量のピリジンに溶解後、ＴＭＳ
を添加し、室温下に攪拌することにより、生成物式（２
）の全ての水酸基を保護した化合物にすることができる
。このｍＷの一部を、ガスクロマトグラフィーで分析す
れば式（２）の化合物を検出することができる。

〔効果〕

次に本発明の効果について説明する。

実験例１．　　（基質特異性） 後記参考例】で得られる１、　５−　Ａ　Ｇ酸化酵素抽
出液を用い前記フェリシアニド法のうち基質を糖及び糖
アルコールに置きかえて反応させ基質特異性を調べた結
果、シュードモナス属に属する微生物の産生する１、５
−ＡＧ！化啼素は第−表に示される如（１，５−ＡＧに
対し高い特異性を示す。

第−表基質特異性 実験例２．（反応至適［）Ｈ１温度条件）後記参考例１
で得られろ抽出液を用いて、シュードモナス属に属する
微生物の産生する１、５−ＡＧ酸化酵素の１．５−　Ａ
　Ｇ変換反応における至適ｐｒ−を及び至適温度を調べ
第１図及び第２図に示される結果を得る。これらの図よ
り至適ｒ＋ＨはｐＨ６〜ｐＨ７，５至適温度は２５〜４
　］　’Ｃ程度である。

又ｐＨ安定性を調べる為異ったｐＨ値を有す、るリン酸
バッファー（ｐＨ６〜７）トリス−塩酸バッファー（ｐ
Ｈ７，２〜９）中へ抽出液を加え４℃で一日保存した後
変換活性を調べたところｐＨ６，５〜８の範囲で安定で
あった。

実験例３．　　（１，５−ＡＧの測定）（］）　　酸素
電極法の検量線 後記参考例１で得た抽出液（■白質譲度５■／ｍ］）を
用いた。

酸素濃度計（米国ギルツル社製オキシグラフ）の反応容
器中へ次の反応液を加え攪拌しつつ３４℃とした。

トリス−塩酸緩衝液（０，０５Ｍ　ｐＨ７）　１　　ｍ
ｌ可溶化液（蛋白量５　ｍｇ／ｍｌ　）　　　　　　　
０．３ｍ１３０ｍＭフェナジンメトサルフェート　２０
　μｍ反応器に栓をして密閉した後マイクロシリンジを
用いて既知濃度の１．５−　Ａ　Ｇ浴ｔＬ５０μｍを反
応器中へ注入して酸素、消費速度を記録した。その結果
第３図に示ｊ如＜１．５−Ａ０１度と酸素消費速度の間
に比例μｓ係が認められた。

（２）　　フェリシアニドを電子受容体として用いろ方
法の検量線 後記参考例１で得た抽出液（蛋白量５■／ｍｌ　）を用
いる。次の組成の反応液を試験管中で３４℃１０分間反
応させる。

トリス−塩酸緩衝ｉ（０，０５Ｍ、ｐＨ８）　　０．７
ｍｌフェリシアン化カリウム溶液（０，］Ｍ）　　Ｏ，
１ｍｌ抽出液　　　　　　　０．１ｍ１ ）．５−ＡＧ浴液　　　　　　　　　　　　０．１ｍ１
（ブランクには蒸留水を使用） 反応後硫酸第二鉄−デエバノール試薬Ｑ、　５　ｍｌ及
び蒸留水３．５　ｍｌ　ｖ加えて反応を停止させる。

１０分間放置すると緑色に呈色するので６６０ｎｍで吸
光度を測定する。既知濃度の１．５−ＡＧ浴溶液つき試
験すると１．５−ＡＧＪＩ度と６６０　ｎｍにおける吸
光度の間には第四図に示す如く比例関係が認められた。

（３）　　ジクロルフェノールインドフェノール（ＤＣ
ＩＰ）ラミ子受容体として用し・ろ方法の検量線 後記参考例１で用いた抽出液（蛋白質５■／ｍ１）を用
いる。次の組成の反応０．を分光光度計のセル中へ入れ
３４°Ｃに保つ トリス−塩酸緩衝液（０，０５Ｍ、ｐＨ８）１．８−Ｔ
ＩＪ］　ｍＭＤＣＩ　Ｐ　　　　　　　　　　Ｏ，３ｍ
ｌ］　ＯｍＭＫＣＮ　　　　　　　　　　０．３ｍｌ抽
出液　　　　　　　Ｑ、３　ｍ１ ３４℃に保温した１、　５−　Ａ　Ｇ溶液をセル中に添
加し攪拌して６００　ｎｍにおける吸光度を経時的に記
録する。

既知（輝度の１．５−　Ａ　Ｇにつき試験すると１．５
−ＡＣ６度と６００　ｎｍにおける吸光度変化速度、即
ちＤＣＩＰの還元速度には第五図に示す如く比例関係が
認められた。

（４）　　Ｈ２Ｏ２を発色により検出する方法の検量線
後記参考例６で得た酵素（３，２ｕ／ｍｌ）を用いる。

次の組成の反応液を試験管中で３７°Ｃ２時間反応させ
る。

・リン酸ナトリウム緩衝液（］　／１５Ｍ、　ｐＨ５，
６）　　０．３ｍｌ・発色試薬　　　　　　　　　　　
　　　　　　　０．５　ｍｌ・酵素　　　　　　　　　
　　　　　０．１ｍ１−１．ｓ−Ａａｍ＊　　　　　　
　　　　　　　　　　ｏ、１ｍ１（ブランクには蒸留水
を使用） 反応後、氷冷して反応を止め、４０５　ｎｍにおける吸
光度を測定する。既知濃度の１，５ＡＧ浴液につき試験
すると、１．５−ＡＧｉｌｉ１度と４０５　ｎｍにおけ
る吸光度の間には、第６図に示す如く比例関係が認めら
れた。

（５１Ｈ２Ｏ２をケイ光により検出する方法の検量線後
記参考例６で得た１猪素（１，５ｕ／ｍｌ）を用いる。

次の組成の反応液を試験管中で３７℃２時間反応させる
。

・ケイ光試薬　　　　　　　　　　　　　　　　　０・
２ｍｌ酢酸ナトリウム緩衝液（０，０５Ｍ、　　ｐＩ−
１５，０）・酵　累　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　０．　］　ｍｌ・Ｉ、５ＡＧ溶液　　　　　　　
　　　　　　　Ｑ、　Ｉ　Ｉｔ’ｌｌ（ブランクには蒸
留水を使用） 反応後、グリシン・ナトリウム緩衝液（０，１Ｍ、　ｐ
Ｈ１０，３）を２．５　ｍｌ　７ｉ［］えて反反応器め
、レイ起波長３　］　５　ｎｍ、ケイ光波長４５０　ｎ
ｍで相対ケイ光強度？：測定する。

既知１度の１．５−　Ａ　Ｇ溶液につき試、験すると１
．５−ＡＣ３度と相対ケイ光強度の開には、第７図に示
す如く比例関係が認められた。

（６）　　１ｈｏｚ電極法の検量線 後記参考例７で得た１、　５−　Ａ　Ｇ酸化酵素固定化
カラムの上流にポンプ、インジェクター）下流にＨ２ｑ
２電極（石川製作所、Ｂ　Ｈ型）を接続する。Ｈ２Ｏ２
電極には過酸化水素計（石川製作所、モデルＡｌ−１０
０６型）とレコーダーをセットする。１．５−　Ａ　Ｇ
固定化カラムと■−１２０２に極部を３７℃に保った恒
温槽に漬ける。

ポンプから１ｍ１／分の流速でリン酸緩衝液（］／１５
Ｍ、　ｐＨ５，６−）を流し、安定化させる。

この流路系へインジエクターカＩ−）　１．５．−Ａ　
Ｇ溶液５０ｍ１を流し、１．５−　Ａ　Ｇ酸化反応によ
って生じたレコーダー上のピーク面積を測定する。既知
濃度の１．５−　Ａ　Ｇ溶液につき試験ｆると、１．５
−ＡＧ濃度とピーク面積の間には、第８図に示す様な検
量線が得られた。

以上から明らかなように本発明の方法によると１．５−
　Ａ　Ｇが極めて簡便に定量しつる。

実施例１゜ 次の組成の試料を実験例３に示した３種の方法で１．５
−　Ａ　Ｇの含量を測定したところ下に示す如（それぞ
れの方法で１．５−ＡＧの測定が可能であった。

実施例２゜ ヒト血清Ｑ、　４　ｍｌ　ヘ過塩素酸水溶１（６０％ｗ
／ｖ）３０局を加え、振盪の後遠心分離して得た上澄液
０．２　ｍｌをホウ酸型強塩基性樹脂ＡＧＩ−Ｘ８（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社製）Ｑ、３ｍｌ’ｉ光填した前処理カラ
ムへ通し、水３ｍ１で洗浄して通過液３　ｍｌ　？：得
た。

このカラム通過液３　ｍｌを濃縮乾固してから、蒸留水
を加え、正確に０．５　ｍｌに調整した。この様にして
得られた除タンパク質と前処理を施した資料を、前記、
実験例３に示した３種のＩ（２０２を検出する方法で測
定したところ下に示す如く、それぞれの方法で、血清中
の１．５−　Ａ　Ｇの測定が可能であった。なお、検量
線は、既知濃度の１、５−　Ａ　Ｇを含む標準溶液を用
いて前記と全く同一の処珂を施し、それぞれの方法で測
定して参考例１．（シー−トモナス属に属する微生物由
来の１．５−　Ａ　Ｇ変換活性微生物処理物の取得） カザミノ酸１％、１．５−　Ａ　Ｇ　０．２％、（Ｎル
）２ＳＯ４０，１％、Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、ＮａＣｌ
０．１％、ＭｇＳＯ４・７８２００．０２％、啼母エキ
ス０．１％、ｐＨ７蒸留水から成る培地１００ｍ１宛を
５００ｍ１容三角フラスコに分注し１）５℃、１５分間
殺菌しＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ−ＮＫ　　８５０
０　］　（微工研菌寄第８１００号（Ｆｅｒｍ　ｐ　　
８１００　）　）の斜面培養物の一白金耳を接種し３０
°Ｃで回転振盪培養機（２２０ｒｐｍ　）上で１６時間
培養する。培養液から遠心分離により菌体を分離しトリ
ス・塩酸緩衝ｆｆ（０，０５Ｍ、　ｐＨ７）で洗浄して
出発液量の１／ＩＯ容の菌体げんだく液とする。この菌
体けんだく液を冷却してフレンチプレスにより菌体破壊
液を得、これを１０分間遠心分離（１０，０００×ｇ）
して、沈澱する細胞壁を除去した後、さらに１時間遠心
分離（１００，０００Ｘｇ）して沈澱物を得、トリス塩
酸緩衝液（０，０５Ｍ、　ｐＨ７）で洗浄し、同緩衝液
中に懸濁して膜画分懸濁液を得る。この）曹濁液にトリ
トンＸ−１００を１％（ｗ／ｖ）となるように添加し、
４°Ｃで１時間攪拌した後、不溶物を遠心分離（１００
，ＯＯＯＸｇ）して除去し、１．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素
抽出液を得る。

参考例２゜ 参考例１で得られる活性成分可溶化液を冷却しつつ硫酸
アンモニウム粉本を加え析出する蛋白質を遠心分離（１
０，ＯＯＯＸｇ、Ｉ　０分）で分離し本文記載のフェリ
シアニド法で活性を測定すると活性は硫酸アンモニウム
４０％飽和区分に抽　　出　　ｉ　　　　　　　　　　
　　　　　　０．４７４０％硫安飽和画分　　　　０．
８５ ６０％　　　　　　　　　　０ ８０％　　　　　　　　　　０ ＊酵素一単位をフェリシアニド２μｍｏｌｅｓ　を１０
分間に還元する活性とし、蛋白１ｍｇ当りに換算した値 参考例３．　　（ビクノポラスＩＦ０４９２３由来の１
．５−　Ａ　Ｇ酸化酵素の取得） １、５−　Ａ　Ｇ　０．３％、酵母エキス０．４％、麦
芽エキス０．５％、水道水からなる培地１００ｍ１宛を
５００　ｍｌ容三角フラスコに分注し、１）５℃、１５
分間殺菌しビクノポラス・コクシネウス（ＩＦＯ４９２
３）の斜面培養物の一白金耳を接種し２７℃で回転振盪
培養機（２２０ｒｐｍ）上で６日間培養する。培養液か
ら遠心分離により菌体を分離し、リン酸ナトリウム緩衝
ｉ　（０，１Ｍ。

ｐＨ６）で洗浄して、湿菌体重量の７．５倍容の菌体け
んだく液とする。この固体けんだく液を冷却してフレン
チプレスにより菌体破壊液を得、冷却下にこれを１０分
間遠心分離（１０，０００Ｘｇ）して、沈澱する細胞壁
を除去した後、さらに１時間遠心分離（］００．ＯＯＯ
Ｘｇ）して膜画分を除き、細胞質上清を得る。冷却下、
この上清に硫酸アンモニウム粉本を加えて攪拌しながら
溶解する。この時析出するタンパク質を遠心分離（１０
，０００Ｘｇ、１０分）で分離し、各硫酸アンモニウム
画分を本文記載の■−１２０２を検出する方法（１，５
−ＡＧ浴溶液して１％濃度のものを使用〕で１．５−　
Ａ　Ｇ酸化活性を測定すると、活性は、主に４０〜６０
％飽和画分に存在する。酵素一単位を、１分間当り１．
５−　Ａ　Ｇを酸化して）１２０２１μｍｏｌｅを発生
する量と定義すると、この硫安画分の比活性は４．０で
ある。湿菌体１ｇ当りからＩ】単位の酵素を得る。

参考例４゜ 参考例３において、菌株をピクノポラス・コクシネウス
（ＩＦＯ６４９０）に変え、参考例３と同じ培地組成を
有する培地で４日間培養する。

参考例３と同様の精製操作をへて、比活性３．６の１．
５−ＡＧ酸化醪素を得る。

参考例５．　　（コリオラス・コンソルス（ＩＦＯ９０
７８）由来１．５−　Ａ　Ｇ酸化ｇ素の取得） 参考例３において菌株をコリオラス・コンソルス（ＩＦ
Ｏ９０７８）に変え、参考例３と同じ培地組成を有する
培地で１０日間培養する。参考例３と同様の精製操作を
へて、比活性２．８の１、５−　Ａ　Ｇ酸化酵素を得る
。

参考例６．（高純度酵素の取得） 参考例３で得られた１、　５−　Ａ　Ｇ酸化酵素の６０
％飽和硫安沈澱物を蒸留水に溶解したものを用い、全操
作を４℃に冷却下にＤＥＡＥ−トヨパール（東洋ソーダ
社製）クロマトを行い精製した。酵素４１００単位／　
２０　ｍｌ溶液を１００倍容のリン酸緩衝液（０，０１
Ｍ、　ｐＨ６，０）で透析し、同緩衝液で平衝化された
Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−Ｔｏｙｏｐｅａｒ　ｌカラム（２，
５ｃｍＸ　４０　ｃｍ　）にチャージする。カラムをリ
ン酸緩衝液（０，０１Ｍ、　ｐＨ６，０）で十分洗浄の
後、リン酸緩衝液で０．ＯＩＭから０．５Ｍ（ｐＨ６，
０）の濃度勾配を付は溶出する。活性は０．１Ｍから０
．２　Ｍ濃度の間に溶出されるので、活性フラクション
を集めｐＭ−１０限外濾過膜（アミコン社製ンを用いて
濃縮すると、比活性１８の酵素溶液（３６０単位／ｍｌ
ン５．５　ｍｌが得られろ。

参考例７．（固定化カラムの製法） 多孔質ガ７スＣＰＧ　　］　Ｏ（２００／４００メ７シ
ユ、平均ポアサイズ５００Ａ、エレクトロヌクレオニッ
ク社ｆｆ）０．５ｇをγ−アミノプロピルトリエトキシ
シラン０．５ｇにて、常法によリカツブリング処理し、
続いて無水コハク酸０．５ｇにてカルボキシル化を行５
゜乾燥した多孔質ガラスは、クロロホルム中で、過剰の
チオニルクロライドにてカルボキシル基を酸クロライド
とする。得られた酸クロライド化多孔質ガラス１ｇに前
記参考例６で作成した１、　５−　Ａ、　Ｇ酸化慴素溶
液２゜５　ｍｌを加え、ｐＨを６〜７に保ちながら２５
℃にて１２時間ゆっくり攪拌しながら反応させ、縮合反
応を完結させる。得られた１、　５−　Ａ　Ｇ酸化酵素
固定化多孔質ガラスを内径２、３　ｍｍ　Ｘ長さ７０　
ｍｍＯカラム（１ｍｌの注射筒）に充填する。１Ｍ食塩
を含有するリン酸緩衝液（１／１５Ｍ、　ｐＨ５，６）
　２０　ｍｌを流し、共有結合していない酵素を除き、
さらにリン酸緩衝液（］／１５Ｍ、　ｐＨ５，６）を流
して洗浄し、１．５−　Ａ　Ｇ酸化實素固定化カラムを
得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で使用する酵素の至適ｐｕを示す曲線で
あり、第２図は該酵素の至適温度を示す曲線であり、第
３図は酸素電極法における検量線を、第４図はフェリシ
アニド法における検ｔｉを、第５図はジクロルフェノー
ルインドフェノール法における検量線を、第６図ハ）ｈ
０２（７）発色法による検量線を、第７図はＨ２Ｏ２の
ケイ先広による検量線を、第８図はＨ２Ｏ２電極法によ
る検量線をそれぞれ示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）試料中の１，５−アンヒドログルシトールに電子
   受容体の存在下、１，５−アンヒドログルシトール酸化
   能を有する酵素を作用させ、試料中の酸素の消費量を測
   定するか、又は生成する過酸化水素電子受容体の還元体
   もしくは下記式（１）又は（２）で示される化合物を定
   量することを特徴とする１，５−アンヒドログルシトー
   ルの定量法。 ▲数式、化学式、表等があります▼（１）▲数式、化学
   式、表等があります▼（２） （２）下記特性を有する１，５−アンヒドログルシトー
   ル酸化能を有する酵素 １、基質特異性 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２、至適ｐＨ ｐＨ６〜７．５ ３、至適温度 ２５〜４１℃ ４、安定ｐＨ ６．５〜８ （３）１，５−アンヒドログルシトール酸化能を有する
   酵素を産生する微生物を培地中で培養し培養物から１，
   ５−アンヒドログルシトール酸化能を有する酵素を採取
   することを特徴とする１，５−アンヒドログルシトール
   酸化能を有する酵素の製造方法。