KR890002412B1 - L-글루타민산 옥시다아제의 제조법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

L-글루타민산 옥시다아제의 제조법

제1도는 본원 발명 효소(실선)와 공지효소(점선)의 작용 pH범위를 나타내는 그래프.

제2도는 본원 발명 효소(실선)와 공지효소(점선)의 안정 pH범위(37℃, 60분간 유지)를 나타내는 그래프.

제3도는 본원 발명 효소의 안정 pH범위(45℃, 15분간 유지)를 나타내는 그래프.

제4도는 본원 발명 효소의 안정 pH범위(60℃, 15분간 유지)를 나타내는 그래프.

제5도는 본원 발명 효소의 작용 적은 범위를 나타내는 그래프.

제6도는 본원 발명 효소(실선)와 공지효소(점선)의 안정 온도 범위를 나타내는 그래프.

제7도는 본원 발명 효소의 자외선 흡수 스펙트럼을 나타내는 그래프.

제8도 및 제9도는 실시예 B1의 키트에 있어서, 시약 B로서 페놀용액 또는 디메틸아닐린용액을 사용한 경우의 L-글루타민산의 검량선을 나타내는 그래프.

제10도는 실시예 B2에 있어서의 L-글루타민산의 검량선을 나타내는 그래프.

제11도는 실시예 B3에 있어서의 L-글루타민산의 검량선을 나타내는 그래프.

제12도는 실시예 B4에 있어서의 GOT활성의 검량선을 나타내는 그래프.

제13도는 실시예 B4에 있어서의 GPT활성의 검량선을 나타내는 그래프.

제14도는 실시예 B5에 있어서의 L-글루타민산의 검량선을 나타내는 그래프.

제15도는 실시예 B6의 효소전극을 사용해서 얻어진 L-글루타민산의 검량선을 나타내는 그래프.

제16도는 실시예 B7에 있어서의 글루타미나아제활성의 검량선을 나타내는 그래프.

제17도는 본원 발명에 의한 L-글루타민산 센서를 나타내는 개략도.

제18도는 제17도의 L-글루타민산 센서를 사용한 L-글루타민산 분석장치를 나타내는 개략도.

제19도는 제18도의 장치를 사용할때의 L-글루타민산나트륨 농도와 전류감소치와의 관계를 나타내는 그래프.

제20도는 제18도의 장치를 사용할때의 각 온도에 있어서의 응답성을 나타내는 그래프.

제21도는 제18도의 장치를 사용할때의 각 pH에 있어서의 응답성을 나타내는 그래프.

제22도는 실시예 C2의 L-글루타민산 분석장치를 사용할때의 L-글루타민산 나트륨농도와 전류치와의 관계를 나타내는 그래프.

제23도는 제18도의 장치를 사용할때의 L-글루타민산 나트륨의 첨가량과 회수량과의 관계를 나타내는 그래프.

제24도는 실시예 C2의 L-글루타민산 분석장치를 사용할때의 L-글루타민산 나트륨의 첨가량과 회수량과의 관계를 나타내는 그래프.

본원 발명은 신규의 효소 L-글루타민산 옥시다아제의 제조방법에 관한 것이다.

좀 더 구체적으로 설명하면, 본원 발명은 L-글루타민산에 대하여 강력한 친화성과 고도의 기질특이성을 가지고, 다른 아미노산에 대하여 실질적으로 거의 작용하지 않으며, 안정성이 높은 L-글루타민산 옥시다아제, 그 미생물에 의한 제조법, 이 효소를 사용하는 분석시료중의 L-글루타민산의 분석법, 이 효소를 함유하는 L-글루타민산의 분석용 시약, 이 효소를 이용하는 L-글루타민산의 분석용 키트, 및 이 효소를 사용하는 바이오센서 (biosensor)에 관한 것이다.

종래, L-글루타민산의 분석법으로서 크로마토그라피법(chromatographic method), 미생물 정량법, 전기영동법(電氣永動法)및 효소법이 알려져 있으나, 일반적으로는 크로마토그라피법 및 효소법이 사용되고 있다.

크로마토그라피법으로서는 아미노산 자동분석계를 사용하는 방법이 일반적이다. 이 방법은 정밀도와 신뢰도가 높고 우수한 방법이지만, 장치가 고가이며, 시료에 따라서는 단백질 제거가 필요하며, 시료 조제법이 복잡해지는 등의 문제점이 있다.

효소법으로서는 (1) L-글루타민산 탈탄산효소를 사용하는 방법 및(2) L-글루타민산 탈수소효소를 사용하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 이들 공지의 효소를 사용하는 방법은 다음과 같은 문제점이 있다.

(1) L-글루타민산 탈탄산효소를 사용하는 방법에 있어서는 반응의 측정은 반응생성물인 탄산가스를 검출하므로써 행해지고 있으며, 통상 (가)와르브르크(Warburg) 검압계(檢壓計)를 사용하는 방법, 또는 (나)자동 분석장치를 사용하는 방법이 채용되고 있다.

(가)의 와르브르크 검압계를 사용하는 방법은 정밀도는 높으나, 상당한 숙련을 요하는 방법이며, 측정에 긴시간을 요하며, 샘플처리 능력이 낮다. 또한, (나)의 자동분석장치를 사용하는 방법은 탄산가스를 페놀프탈레인의 탄산나트륨용액에 흡수시켜서, 감색도(感色度)에서 발생한 탄산가스량을 측정하는 방법이므로, 미리 효소액과 완충액중의 탄산가스 및 산소의 탈기를 냉각하면서 행하는 등, 예비조작이 필요하며, 반응 후에 기액분리가 필요하며, 장치가 복잡화되는 문제점이 있다.

또한, 글루타민산 탈탄산효소로서는 일반적으로 호박 또는 대장균유래(由來)의 효소가 사용되지만, 호박유래의 효소는 우레아제활성을 가지고 있으며, 요소를 함유하는 시료를 대상으로 하는 경우에는 요소유래의 탄산가스에 의해서 측정오차를 발생할 염려가 있으며, 또한 이 효소는 아세트산 등의 유기산의 저해를 받기 때문에 유기산을 많이 함유한 샘플에서는 효소활성이 저해되어서 정확한 결과를 얻지 못하는 결점이 있다. 또한 대장균유래의 효소는 L-아르기닌 및 L-글루타민에 대해서 활성을 나타내므로, 이들 아미노산을 많이 함유한 시료를 대상으로 할 경우에는 정확한 결과가 얻어지지 않는다. 또한, 효소 자체의 보존율도 좋지 않다.

(2) L-글루타민산 탈수소효소는 L-글루타민산을 NAD(산화형 니코틴아미드 아데닌디누클레오티드)의 존재하에 반응시켜서 α-케토글루타르산, 암모니아 및 NADH(환원형 니코틴아미드아데닌디누클레오티드)를 생성하는 반응을 촉매하지만, 이 효소를 사용하는 방법에 있어서는 반응의 측정은 NADH의 생성량은 340nm에 있어서의 흡광도의 증가를 검출하므로써 이루어진다. 그러나, 이 효소반응의 평형은 L-글루타민산 형성으로 기울어져 있고, 이 효소를 사용해서 L-글루타민산을 분석하기 위해서는 반응의 평형을 α-케토글루타르산을 생성하는 쪽으로 기울어져야 하며, 이 때문에 여러가지 연구가 필요해진다. 이 목적으로 통상 α-케토글루타르산의 포착제가 반응계에 첨가되지만, 농도를 엄밀하게 조절하지 않으면 반응을 저해할 수도 있다. 그리고 NAD농도도 엄밀하게 조절하지 않으면 안된다. 또한, 간장 등 측정파장에 있어서 흡수를 나타내는 물질을 함유하는 시료를 대상으로 하는 경우, 블랭크(blank) 시험의 값을 사용해서 반응에 의해서 얻어진 값을 보정하지 않으면 안된다. 그리고, 사용하는 효소에 유산탈수소효소 활성이 존재하는 경우가 있으므로, 이와 같은 효소활성의 영향도 고려하지 않으면 안된다.

최근, L-글루타민산에 대한 기질특이성이 높은 L-아미노산 옥시다아제가 스트렙토마이세스(Streptomyces : 이하 "S"라고 약칭하는 경우도 있음)속에 속하는 미생물, 구체적으로는 스트렙토마이세스바이오라센스(Streptomyces violascens)의 배양에 의해서 생산되는 것이 발견되었다.(일본국 특개소 57(1982)-43685호 공보 참조). 이 글루타민산 옥시다아제(이하 "공지효소"라고 약칭하는 경우도 있음)의 단백질로서의 이화학적 성질을 확실하지는 않으나 효소학적 성질로서 기재되어 잇는 성질을 들면 다음과 같다.

(1) 기질특이성

L-글루타민산에 대한 활성을 100으로 한 경우, L-글루타민에 대해서 8.4, L-히스티딘에 대해서 6.8의 상대활성을 나타내고, 다른 아미노산에 대해서는 실질적인 활성을 나타내지 않는다.

(2) 최적 pH

pH5-6

(3) pH안정성

pH3.5-6.5의 범위(37℃, 1시간 유지)에서 안정이다.

(4) 온도안정성

50℃까지(10분간 유지)안정이다.

(5) 저해제의 영향

수은이온, 동이온 및 디에틸디티오카르바메이트에 의해서 거의 완전하게 저해된다.

상기와 같은 공지효소를 L-글루타민산의 분석에 이용하기 위해서는 여러가지 문제점이 있다.

공지효소는 종래 알려져 있던 L-아미노산 옥시다아제와 비교하면 L-글루타민산에 대한 기질특이성은 높지만, 상기와 같이 여전히 다른 아미노산에 명백히 활성을 나타내는 것이며, 이들 아미노산의 존재하에 있어서의 L-글루타민산의 특이적 정량(特異的定量)에는 사용할 수 없다. 또한, 공지효소는 안정성이 높지는 않으며, 분석용 시약으로서의 보존안정성 및 사용안정성도 반드시 좋다고는 생각되지 않는다. 그리고, 분석시료중에 동이온이 존재하는 경우, 공지효소 활성은 현저하게 저해되며, 분석이 곤란해진다고 생각된다. 또한, 여러가지 임상 생화학 검사분석, 특히 혈액내의 효소활성의분석에 있어서 사용되는 반응액의 pH는 보통 중성이며, 공지의 효소는 한시간 37℃에서 처리될 때 pH7.5에서 그 활성을 완전히 잃게 되므로, 중성 pH범위에 있어서 공지의 효소분석에 사용하기가 곤란하다,

그리고, 종래 L-아미노산 옥시다아제를 사용하는 L-아미노산의 분석법은 알려져 있었으나, 공지의 L-아미노산 옥시다아제는 L-글루타민산에 대해서는 작용하기 어렵고, 이와 같은 효소를 사용하는 방법으로는 L-글루타민산의 특이적인 분석은 할 수 없었다.

한편, L-글루타민산의 다른 분석법으로서 바이오센서를 사용하는 방법이 알려져 있다.

종래, L-글루타민산을 분석하기 위한 바이오센서로서는 (1) L-글루타민산 탈수소효소를 L-글루타민산의 레셉터부로서 사용하고, 트랜스듀서부로서 양이온전극을 사용하는 효소전극(Anal.Chim.Acta,56,333(1971)), 및 (2) L-글루타민산탈탄산효소활성을 나타내는 대장균(E.coli)의 동결건조균체를 L-글루타민산의 리셉터부로서 사용하고, 트랜스 듀서부로서 탄산가스 전극을 사용하는 미생물전극(Anal.Chim.Acta,116,61(1980))이 알려져 있다.

(1)의 효소전극은 효소의 안정성이 극단적으로 나쁘며(2일), 양이온전극을 사용하고 있기 때문에, 나트륨이온, 칼륨이온 등이 공존하는 양이온의 영향을 받기 쉬우며, 실용적은 아니다. (2)의 미생물 전극은 고정화 미생물균체를 사용하고 있으므로 안정성은 뛰어나지만(3주간, 1500회 이상), 호기적조건에서는 균체의 호흡작용에 의해서 탄산가스가 생성되고, 측정에 영향을 준다. 이와 같은 영향을 제거하기 위해 질소가스의 취임등으로 균체의 호흡작용을 저해하는 동시에 시료중의 탄산가스를 제거할 필요가 있다. 또한, 이 미생물 전극은 기질특이성이 높지 않으므로, 발효의 프로세스제어 등 개략적인 측정에만 사용할 수 있다고 생각된다.

그리고, 레셉터부로서 L-아미노산 옥시다아제를 사용하는 효소전극도 알려져 있다(Anal.Chem.47,1359(1975)). 그러나, 이와같은 효소전극에 사용되고 있는 종래의 L-아미노산옥시다아제는 L-글루타민산에 대해서는 작용하기 어렵고, 상기 효소전극을 사용해도 L-글루타민산의 특이적인 분석을 할 수 없었다.

상기와 같은 공지효소를 L-글루타민산을 특이적으로 분석하기 위한 바이오센서에 이용될 수 있는지의 여부에 대해서 상기 일본국 공개특허공보에는 아무런 개시도 되어 있지 않으나, 가령 바이오센서의 레섭터부에 공지효소를 이용했다하더라도 여러가지 문제점이 고려된다. 즉, 공지효소는 종래 알려져 있던 L-아미노산 옥시다아제와 비교하면 L-글루타민산에 대한 기질특이성은 높지만, 상기와 같이 여전히 다른 아미노산에 명확한 활성을 나타내는 것이며, 이들 아미노산의 공존하에 있어서의 L-글루타민산의 특이적 분석을 행하기 위한 바이오센서로서는 이용할 수 없다. 또한, 공지효소는 안정성은 높지 않으며, 바이오센서의 레셉터부에 이용하는 경우에도 보존안정성 및 사용안정성이 반드시 좋다고 생각되지 않는다.

또한, 공지효소는 pH7이상에서는 극히 불안정하므로, 임상분야에서 여러가지 생화학분석이 행하여지는 중성 pH에서는 공지효소의 바이오센서를 사용하는 것이 곤란한 경우도 있다. 그리고, 분석 시료중에 동이온이 존재하는 경우, 공지효소는 현저하게 저해되며 분석이 곤란해진다고 생각된다.

상기와 같이, 종래 L-글루타민산을 특이적으로 식별하기 위한 리셉터부로서 옥시다아제를 이용한 L-글루타민산 분석용이 바이오센서는 존재하지 않고, 이와 같은 목적을 충분히 달성할 수 있는 L-아미노산 옥시다아제도 존재하지 않았었다.

본원 발명자들은 미생물의 배양물에 대해서 L-아미노산을 산화적으로 탈아미노하는 효소를 검색한 바, 자연계에게 새로 분리된 방선균(放線菌)의 배양물중에 L-글루타민산에 대한 기질특이성이 매우 높은 L-아미노산 옥시다아제가 존재하는 것을 발견하고, 이와 같은 미생물의 배양불중에서 본원 발명 효소를 단일의 효소단백질로서 정제 단리하여, 본원 발명을 완성하였다.

본원 발명른 L-글루타민산의 a-아미노기를 물과 산소의 존재하에서 산화적으로 탈아미노해서 a-캐토글루타니산, 암모니아 및 과산화수소를 생성하는 작용을 가지며, L-글루타민 및 L-히스티딘에는 실질적으로 전혀 작용을 가지며, L-글루타민산에 대한 기질특성이 매우 높고, L-글루타민 및 L-히스티딘에는 실질적으로 전혀 작용하지 않고, 안정성이 높은 L-아미노산 옥시다아제인 L-글루타민산 옥시다아제를 제공하는 것이다.

그리고, 본원 발명은 스트렙토마이세스 속에 속하고, 상기 L-글루타민산 옥시다아제 생산능을 가진 미생물을 이 미생물을 이 미생물이 생육될 수 있는 배지에 배양하고, 배양물에서 상기 L-글루타민산 옥시다아제를 채취하는 것을 특징으로 하는 L-글루타민산 옥시다아제의 제조법을 제공하는 것이다.

본원 발명 효과는 L-글루타민산에 특이적으로 작용하고, 다른 아미노산에는 실질적으로는 작용하지 않으므로 다종류의 아미노산을 함유하는 계에 있어서의 L-글루타민산의 정량에 적합하다. 예를 들면 간장, 에키스류, 액체 조미료 등의 식품중에 있어서의 글루타민산 함량의 측정, 글루타민산 발효 또는 간장의 제조 등의 분야에 있어서의 공정관리 또는 공정분석 또는 글루타민산 생산균의 스크리닝등에 사용할 수 있다. 또, 글리타미나아제, 굴루타민산-옥살로 아세트산 트란스 아미나아제(GOT), 글루타민산-피루빈산 트란스 아미나아제(GPT), γ-글루타밀 트란스펩티다아제(γ-GTP)등 글루타민산을 생성물로 하는 효소의 활성측정을 본원 발명 효소를 사용하여 용이하게 행할 수 있으므로, 임상검사 또는 생화학 분야에 있어서도 유용하다.

또한, 본원 발명 효소는 이 효소반응이 임상검사 또는 식품분석등에 있어서도 가장 널리 실용화 되어 있는 옥시다아제 반응이므로, 그 효소반응의 검출도 옥시다아제반응의 검출수단으로서 널리 사용되고 있는 공지의 방법을 그대로 전용할 수 있는 이점이 있다.

그리고, 본원 발명 효소는 공지효소를 비롯해서 일반 분석용 효소와 비교해도 안정성이 높으므로, 글루타민산 센서용 효소전극으로서 이용할 수 있으며, 효소면역 측정에 있어서의 표지효소로서의 이용(일본국 특개소 57(1982)-37261호 공보 참조)도 기대되며, 본원 바명의 분석용 시약은 보존 및 사용에 있어서 안정되며, 높은 범용성과 경제성을 구비하고 있다.

또한, 본원 발명은 L-글루타민산 옥시다아제를 산소와 물의 존재하에 L-글루타민산과 작용시키고, 반응에 따르는 산소의 소비 또는 과산화수소, 암모니아 또는 α-케토글루타르산의 생성을 검출하는 것을 특징으로 하는 L-글루타민산의 분석법을 제공하는 것이다.

그리고, 본원 발명은 L-글루타민산과 함께 실질적으로 본원 발명의 L-글루타민산의 분석에 영향을 줄 정도의 다량의 L-아스파라긴산을 함유하는 분석시료중의 L-글루타민산에 대해서, 상기 L-글루타민산 옥시디아제를 산소와 물의 존재하에 작용시킬때 pH5-6에 있어서 반응시키고, 반응에 따르는 산소의 소비 또는 과산화수소, 암모니아 또는 α-케토글루타르산의 생성을 검출하는 것을 특징으로 하는 L-글루타민산의 분석법을 제공하는 것이다.

또한, 본원 발명은 상기 L-글루타민산 옥시다아제를 함유하여 이루어진 L-글루타민산의 분석용 시약을 제공하는 것이다.

또한, 본원 발명은 상기 L-글루타민산 옥시다아제와 이 효소에 의한 반응의 검출시약으로 이루어진 L-글루타민산의 분석용 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본원 발명은 피검지물질의 레셉터부로서의 효소와 이 효소의 작용에 의한 분석시료중의 화학적 또는 물리적 변화를 검출하고, 전기신호로 변환하는 트랜스듀서부로 이루어진 바이오센서에 있어서, 효소로서 L-글루타민산에 대한 기질특이성이 매우 높고, L-글루타민산 이외의 아미노산에는 실질적으로 작용하지 않고, 안정성이 높은 L-글루타민산 옥시다아제를 사용하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 제공하는 것이다.

본원 발명의 바이오센서는 공지의 L-글루타민산 분석용 바이오센서와 다르며, 바이오센서의 레셉터부로서 가장 널리 사용되고 있는 옥시다아제를 사용하므로, 그 제작이 용이하다. 그리고, 효소반응의 검출수단도 기질인 산소의 감소를 검출하는 수단 또는 반응생성물인 과산화수소 또는 암모니아의 증가를 검출하는 수단 등 공지의 수단중에서 목적에 따라 선택할 수 있으며, 다양성이 있다.

그리고, 본원 발명의 바이오센서는 공지의 바이오센서와 비해서 L-글루타민산에 대한 특이성이 각별히 높고, 다종류의 아미노산을 함유하는 함유하는 시료라도 다른 아미노산에 방해되는 일없이 L-글루타민산만을 선택적을 분석할 수 있다.

이상과 같이 본원 발명의 바이오센서를 사용하므로써 식품, 발효액 등 그 본래의 성분으로서 L-글루타민산을 함유하는 분석시료중의 L-글루타민산을 선택적으로 분석할 수 있을 뿐만이 아니고, L-글루타민산이 관여하는 반응계, 예를 들면 글루타미나아제, 글루타민산 라세마아제, 굴루타민산-옥살로아세트산 트란스아미나아제(GOT), 글루타민산-피루빈산 트란스아미나아제(GTP), γ-글루타밀 트란스펩티다아제(γ-GTO)등 L-글루타민산이 관여하는 효소의 반응계에 있어서의 효소활성 또는 반응에 관여하는 다른 물질을 분석할 수도 있다.

(Ⅰ) 본원 발명 효소

본원 발명 효소 L-글루타민산에 대한 기질특이성이 매우 높고, L-글루타민산 이외의 아미노산에는 실질적으로 작용하지 않고, 안정성이 높은 L-글루타민산 옥시다아제이면 되며, 그 기원·유래를 불문하고, 그 제조법도 불문에 붙인다.

다음에 스트렙토마이세스에 속하는 미생물의 배양에 의해 얻어진 효소를 들고, 이 예시 효소에 대해서 구체적 성질 및 제조법을 설명한다.

(A) 본원 발명의 효소학적 및 이화학적 성질

뒤에 기재된 실시예 A1의 방법으로 제조한 L-글루타민산 옥시다아제의 정제효소표품의 효소학적 및 이화학적 성질은 다음과 같다.

(1) 작용

본원 발명 효소는 L-글루타민산을 기질로 한 경우, 하기 반응식과 같이 L-글루타민산 1몰의 산소와 1몰의 물을 요하고, 1몰의 α-케토글루타르산, 1몰의 암모니아 및 1몰의 과산화수소를 생성한다.

(2) 기질특이성

여러가지의 아미노산에 대해서 본원 발명 효소의 정제표품을 작용시킨 결과가 제1표이다. 각 기질의농도는 10mM이며, 반응은 pH7.4(0.1M 인산칼륨완충액) 및 pH6.0(0.1M 아세트산완충액)으로 행하였다. 효소활성은 후술하는 산소전극법에 의해 측정하고, L-글루타민산에 대한 활성의 상대치로서 표시했다.

[제1표]

상기와 같이 본원 발명 효소는 L-글루타민산에 대한 기질 특이성이 높고, 다른 아미노산에 대해서는 pH7.4에 있어서 L-아스파라긴산에 약간의 활성(0.6%)을 나타낼 뿐이고, L-글루타민산 및 L-히스티딘을 함유한 다른 L-아미노산 및 D-글루타민산에는 실질적으로 전혀 활성을 나타내지 않으며, pH6.0에 있어서는 L-아스파라긴산에 대해서도 실질적으로 활성을 나타내지 않는다.

상기 본원 발명 효소에 대해서, 상기와 같이 공지효소는 L-아스파라긴산에 대해서는 활성을 나타내지 않으나(0.1%이하), L-글루타민에 대해서 8.4%, L-히스티딘에 대해서 6.8%의 활성을 각각 나타내는 효소이며, 기질 특이성에 있어서 양자는 다르다.

또한, 본원 발명 효소의 L-글루타민산에 대한 km치는 pH7.4에 있어서 2.1×10^-4M이며, L-아스파라긴산에 대한 Km치는 pH7.4에 있어서 2.9×10^-2M이다.

(3) 역가(力價)의 측정

본원 발명 효소의 역가의 측정은 산소전극법으로 행하였다. 즉 10mM의 L-글루타민산나트륨을 함유하는 0.1M 인산칼륨완충액(pH7.4) 1ml를 산소전극셀에 넣고, 10μl의 효소액을 첨가해서 산소 소비속도을 측정하였다. 30℃에서 1분간에 1μ몰의 산소를 소비하는 효소량을 1단위(Unit : 본 명세서에 있어서, "U"라 약칭함)로 하였다.

그리고, 반응액의 용존산소 농도는 온도의 상승과 함께 감소하므로 높은 반응온도에서의 역가 측정에는 상기 방법은 사용할 수 없다.

이와 같은 경우에는 MBTH법(Anal.Biochem.,25,228(1968)참조)에 의해 행한다. 즉, L-글루타민산나트륨, 카탈라아제 및 본원 발명 효소를 함유하는 반응액을 적당한 온돌 20분간 인큐베이트하고, 트리클로로 아세트산(TCA)를 가해서 반응을 정지하고, 이 반응정지액에 아세트산완충액(pH5.0) 및 3-메틸-2-벤조티아졸리논히드라존하이드로클로라이드(MBTH)를 가해서, 50℃에서 30분간 인큐베이트한 후 실온까지 냉각해서 316nm의 흡광도를 측정하고, 검량선에서 생선된 α-케토글루타르산을 정량한다.

(4) 최적pH

최적pH는 제 1 도에 도시된 바와 같이 pH7-8.5부근이다. 각 pH에 있어서의 효소활성의 측정은 기질로서 L-글루타민산나트륨을 사용하고, 완충액으로서 0.2M 아세트산완충액(pH3.5-6.0), 0.2M 인산칼륨완충액(pH6.0-8.5) 및 0.2M 글리신-염화나트륨-수산화나트륨완충액(pH8.5-12.0)을 사용하여 30℃에서 행하였다.

또한, 제1도에는 본원 발명 효소와 공지효소의 적당한 pH의 비교를 위해 본원 발명 효소(실선)와 공지효소(점선 : 일본국 특개소 57(1982)-43685호 공보의 제1도에 인용하였음)의 pH활성곡선을 병기하였다.

제1도에서 명백한 바와 같이 본원 발명 효소는 최적 pH에 있어서도 공지효소와는 다르다,

그리고, 아스파라긴산을 기재로 한 경우의 작용 pH범위는 좁고, 최적 pH는 7-8이지만, PH6.0이하 및 PH10.0이상에 있어서는 L-아르파라긴산에 대해서 거의 작용하지 않는다(pH6.0에 있어서 글루타민산에 대한 활성의 0.1%이하).

(5) pH안정성

pH3.5-11.5의 각 pH에 있어서 37℃에서 60분간, 45℃에서 15분간 및 60℃에서 15분간의 각 조건으로 유지한 후, pH7.4에 있어서 글루타민산에 대한 효소활성을 측정하였다.

그 결과, 37℃에서 60분간 유지한 조건에서는 pH5.5-10.5의 범위에 있어서 안정되어 있으며(제2도의 실선), 45℃에서 15분간 유지의 조건이라도 pH5.5-9.5의 범위에 있어서 안정되어 있으며(제3도), 60℃에서 2분간 유지의 조건에서는 pH5.5-7.5의 범위에 있어서 안정되어 있다(제4도).

또한, 제2도에는 본원 발명 효소와 공지효소의 pH안정성의 비교를 위해, 공지효소의 pH안정곡선(일본국 특개소 57(1982)-43685호 공보의 제2에서 인용하여 점선으로 표시함)를 본원 발명의 것과 병기하였다.

상기 제2도, 제3도 및 제4도에서 명백한 바와 같이, 본원 발명효소와 공지효소의 안정 pH범위를 비교하면, 양자는 명백하게 다르며, 전자의 쪽이 후자에 비해서 넓은 pH범위에 있어서 안정되어 있다.

(6) 적당한 작용온도의 범위

30℃-80℃의 각 온도에 있어서 L-글루타민산나트륨을 기질로 해서 20분간 반응시키고, 상기 MBTH법으로 효소활성을 측정하였다.

그 결과, 본원 발명 효소의 적당한 작용온도의 범위는 30-60℃이며, 작용에 최적 온도는 50℃부근이었다(제5도).

(7) 열안정성

40℃-90℃의 각 온도에 있어서 pH5.5, pH7.5 및 pH9.5의 각 조건으로 15분간 유지한후, pH7.4에 있어서 글루타민산에 대한 효소활성을 측정하였다.

그 결과, pH5.5에 있어서는 65℃까지 안정되어 있고, 85℃에서 약 50%의 잔존활성을 나타낸다(제6도, ▲-▲).

pH7.5에 있어서는 50℃까지 안정되어 있고, 75℃에서 약 60%의 잔존활성을 나타낸다(제6도, ●-●). pH9.5에 있어서도 45℃까지 안정되어 있고, 70℃에서 약 50%의 잔존활성을 나타낸다(제6도, ■-■).

그리고, 본원 발명 효소와 공지효소의 열안정성을 비교를 위해, 공지효소의 온도안정곡선(일본국 특개소 57(1982)-43685호 공보의 제3도에서 인용하고, 점선으로 표시함)을 본원 발명 효소의 것과 병기하였다.

제6도에서 명백한 바와 같이, 본원 발명 효소는 공지효소보다 온도안정성이 높다.

(8) 저해, 활성화 및 안정화

본원 발명 효소에 대한 여러가지 첨가물질의 영향을 조사하기 위해, 제2표에 나타내는 각 물질 1mM을 함유하는 반응액(pH7.4)중에서 효소반응을 행하였다.

그 결과는 제2표와 같다.

[제2표]

1) EDTA : 에틸렌디아민 4 아세트산

2) NEM : N-에틸말레이미드

3) PCMB : 파라클로로머쿠리벤조에이트

4) DDTC : 디에틸디티오카르바메이트

5) 티론(Tiron) : 4, 5-디히드록시-1,3-벤젠디술폰산 2 나트륨염

제2표에서 명백한 바와같이 본원 발명 효소는 파라클로로머쿠리벤조에이트에 의해서 약 45% 저해되지만, 염화 제2동 및 디에틸디티오카르바메이트에는 전혀 저해되지 않는다. 한편, 공지효소는 염화 제2동 및 디에틸디티오카르바메이트에 의해서 완전히 저해된다. 따라서, 양 효소는 저해제에 의한 영향이라는 점에 있어서도 서로 다르다. 또한, 본원 발명 효소의 활성화제 및 안정화제는 아직 발견되어 있지 않다.

(9) 자외선 흡수 스펙트럼(제7도 참조)

λ_max: 273nm,385nm,465nm

숄더 : 290nm부근, 490nm부근

(10) 보(補) 효소

본원 발명 효소를 열처리 또는 트리클로로아세트산(TCA)처리하고, 원침(遠枕)해서 얻어진 상증액은 그 흡수가 플라빈아데닌 디누클레오티드(FAD)와 일치하고, D-아미노산 옥시다아제의 아포효소를 활성화하였으므로, 본원 발명 효소의 보효소가 FAD인 것이 판명되었다. 또한, 박층 크로마토그라피에 있어서의 Rf치로부터도 FAD라고 동정(同定)된다.

FAD는 본원 발명효소 1몰에 대해서 2몰 존재하는 것으로 추정된다.

(11) 폴리아크릴아미드겔 전기영동

정제된 본원 발명 효소는 단일 밴드를 나타냈다.

(12) 분자량

본원 발명 효소의 분자량은 세파덱스(Sephadex) G-200(Pharmacia Fine Chemicals사 제품)에 의한 겔여과법에서는 135,000±10,000으로 측정되었다.

(13) 등전점(等電點)

암포라인(Ampholine)(LKB사 제품)을 사용한 등전점 전기영동에 의해 측정한 바, pI는 6.2였다.

(14) 결정구조 및 원소분석

본원 발명 효소는 결정화 되어 있지 않으므로 측정하지 않았다.

(15) 정제방법

본원 발명 효소의 제법은 염석법(鹽析法), 등전점 침전법, 유기용매에 의한 침전법, 규조토, 활성탄 등에 의한 흡착법, 각종 크로마토그래피법 등을 적당히 조합해서 행할 수 있다. 정제방법의 구체예는 실시예 Al 나타내는 바와같다.

(B) 본원 발명 효소의 조제

다음에, 본원 발명 효소를 미생물의 배양에 의해서 제조하는 방법을 구체적으로 기술한다.

[사용 미생물]

본원 발명 효소의 제법에 사용되는 미생물은 스트렙토마이세스속에 속하며, 본원 발명 효소를 생산하는 능력을 가진 미생물이다.

이와같은 미생물의 구체적 예로서는 일본국 지바켄 가토리군 도노쇼마찌의 토양에서 분리되어, 단일 균주로서 단리(單離) X-119-6주를 들 수 있다. 이 균주의 균학적 성질은 다음과 같다.

A. 현미경적 관찰

기균사(氣菌絲)는 직선형상이며, 그 폭은 0.9-1.0μ이고, 단순 분지(分枝)를 나타낸다. 포자병(胞子柄)은 다수의 포자의 연쇄로 이루어져 있으며, 2-5회전의 나선(螺旋)을 형성한다. 포자는 약간 타원형이며, 그 크기는 0.9-1.0×1.1×1.2μ이고, 전자현미경에 의해서 표면은 가시형상 구조임이 관찰된다. 기균사의 분단은 관측되지 않았다.

B. 육안적 관찰

각종 배지(培地)에 있어서의 생육(30℃ 16일간 배양)의 육안적 관찰의 결과는 다음과 같다.

(1) 슈크로스질산염 한천배지

그 생육은 불량하다. 기균사는 회갈색이며, 한천 속에 침입하지 않고, 기균사는 가루모양으로 한천 위에 방사상으로 얇게 퍼진다. 색은 회각색이며, 회색의 포자를 형성한다. 배지 속으로의 색소의 생성은 보이지 않았다.

(2) 글루코오스 아스파라긴 한천배지

그 생육은 양호하다. 기균사는 백황색이며, 한천속으로 침입하는 동시에, 약간 솟아 오른다. 기균사는 백색으로 빈약하며, 배지속으로의 색소의 생성은 보이지 않았다.

(3) 글리세린 아스파라긴 한천배지

그 생욱은 양호하다. 기균사는 백황색이며, 한천 속으로 침입하는 동시에 솟아오른다. 기균사는 형성되지 않으며, 배지로의 색소의 생성도 보이지 않았다.

(4) 전분무기염 한천배지

그 생육은 양호하다. 기균사는 백황색이며, 한천 속으로 침입하는 동시에 솟아 오른다. 기균사는 백색이고 풍부하며, 회색의 포자를 착생(着生)한다. 배지속으로의 색소의 생성은 보이지 않았다.

(5) 티로신 한천배지

그 생육은 양호하다. 기군사는 백황색이다. 기균사는 백색으로 풍부하며, 회색의 포자를 착생한다. 배지속으로의 색소의 생성은 보이지 않았다.

(6) 영양한천배지

그 생육은 매우 양호하다. 기균사는 백황색이며, 한천속으로 침입하는 동시에 솟아 오른다. 기균사는 백색이며, 포자의 착생은 보이지 않는다. 배지 속으로의 색소의 생성도 보이지 않는다.

(7) 이스트 맥아한천배지

그 생육은 매우 양호하다. 기균사는 백황색이며, 한천 속에 침입하는 동시에 솟아 오른다. 기균사는 백색이며 풍부하고, 회색의 포자를 착생한다. 배지 속으로의 색소의 생성은 보이지 않는다.

(8) 오트밀 한천배지

그 생육은 매우 양호하다. 기균사는 백색이며, 한천 속에 침입하지만, 배지 위로 솟아 오르지 않는다. 기균사는 백색이고 풍부하며, 회색의 포자를 착생한다. 배지 속으로의 색소의 생성은 보이지 않는다.

C. 생리적 성질

생육온도범위는 8-40℃이며, 35℃근처가 적당하다. 티로신 한천배지 및 펩톤-이스트-철-한천배지에서는 모두 메라닌과 같은 색소는 생성되지 않고, 젤라틴을 약간 액화하고, 전분을 가수분해한다.

D. 각종 탄소원의 동화성

프리드햄-고트리프(Pridham-Gottrib) 한천배지 위에서의 각종 탄소원의 이용성은 제3표와 같다.

[제3표]

^*＋ : 이용함

- : 이용하지 않음

이상의 성상을 요약하면 다음과 같다. 즉, 기균사는 나선형이며, 포자의 표면은 가시모양이다. 배지 위에서의 발육으로는 백황색 또는 회갈색을 나타내고, 기균사는 백색 내지 회갈색이며, 용해성의 색소 및 메라닌과 같은 색소의 생성은 보이지 않았다. 또한, 전분 수해성(水解性)은 강한 편이다.

이들의 결과와 제3표에 나타낸 탄소원의 동화성을 기준으로 버지스 마뉴얼 오브 디터미네이티브 박테리올리지(Bergey's Manual of Deteminative Bacteriology) 제8판 (1974년)에 있어서의 분류체계에 따라서 본 균주의 동정(同定)을 행하였던 바, 본 균주는 스트렙토마이세스속에 속하지만, 본 균주의 특징에 충분히 일치되는 공지의 종은 발견되지 않고, 본 균주를 신균주라고 동정하고, 스트렙토마이세스 에스피 X-119-6(Streptomyces sp X-119-6)이라고 명령하였다.

본 균주에 대해서, 1982년 6월 5일자로 일본국 이바라키켄 쓰쿠바군 야타베마찌 1죠메 1-3 공업기술원 미생물 공업기술 연구소(FRI)에 수탁되어, 기탁번호로서 FERM P-6560이 부여되어 있다. 또한, 이 균주는 상기 일본국 FRI에서 직접 미합중국 메릴랜드 록빌 파크론 드라이브 12301, 미합중국 종균협회(American Type Culture Collection)로 송달되고, 이 미생물이 수탁되어서 1983년 4월 26일 기탁번호 ATCC 39343를 부여받았다. 그리고, 또 이 스트렙토마이세스 에스피 X-119-6균주는 상기 일본국 공업기술원 미생물공업기술연구소에서 직접 한국 과학기술원으로 송달되어 수탁되어서 1983년 9월 5일자로 한국 과학기술원의 기탁번호 KAIST 830905-10715로서 기탁되어 있다.

상기 균주는 본원 발명 효소의 생산능이 높은 균주의 일예이며, 본원 발명의 사용 미생물은 이것에 한정되는 것은 아니다. 그리고, 이와같은 본원 발명 효소생산균을 통상의 미생물 돌연변이 유도법, 예를들면 자외선, X선, γ선 조사 등의 물리적처리, 니트로소구아니딘 등의 약제에 의한 화학적 처리 등이 처리법에 의해서 변이시켜서 얻어진 본원 발명 효소의 고생산성 돌연변이 균주의 어느 것이나 적당하게 사용할 수 있다. 그리고, 본원 발명의 제조법의 목적은 기본적으로는 상기 미생물의 본원 발명 효소의 생산에 관한 유전정보를 담당하는 유전자 DNA에 의한 효소단백의 합성기능을 이용하는데 있다. 따라서, 이와같은 유전자 DNA를 적당한 벡타로 넣고, 상기 이외의 속의 미생물에 형질 전환에 의해 옮겨 넣던가, 또는 유전자 DNA를 프로토플라스트(protoplast)법에 의한 세포융합에 의해서 타속미생물에 들어가게 하는 등 유전자 조작적수법에 의해서 얻은 미생물에 의한 본원 발명 효소의 제조법도 본원 발명의 범위에 포함된다.

[배양 방법 및 조건]

상기 사용 미생물의 배양방법 및 조건은 이 미생물을 양호하게 생육하고, 본원 발명 효소가 충분히 생산되는 방법 및 조건이면 특히 한정되지 않으나, 고체 배양법 또는 그것에 준하는 방법이 적당하다.

고체배양에 사용하는 고체배지는 통상 사용되는 것과 다르지 않다. 즉, 고체배지로서는 밀기울, 탈지 대두, 쌀겨, 옥수수, 채종박(彩種粕), 밀, 쌀, 왕겨 등의 천연고체의 단독 또는 2종 이상을 조합한것을 주체로 하고, 필요에 따라 본원 발명의 사용 미생물이 자화(資化) 가능한 영양원, 예를들면 글루코오스, 슈크로오스, 아라비노오스, 프룩토오스, 만니톨, 이노시톨, 가용성 전분, 에탄올 등의 탄소원, 각종 아미노산, 펩톤, 대두분, 단백질, 가수분해물, 콘스팁리커, 고기에키스, 효모에키스, 각종 암모늄염, 각종 질산염, 요소 등의 질소원, 각종 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 망간염, 마그네슘염, 아연염, 철염, 인산염, 황산염 등의 염류, 다이아민, 리보플라빈, 니코틴산, 판토텐산, 비오틴 p-아미노안식향산, 시아노코발라민 등의 발육소를 적당히 첨가한 배지, 또는 이들을 적당한 배합, 크기, 형상의 입자로 만든 배지 등이다. 이와같은 고체배지는 통상의 방법에 의해 멸균 또는 변성 처리하고, 종균은 접종해서 고체배양을 행한다.

그리고, 상기 이외의 배양법, 예를들면 스폰지 등의 적당한 담체에 액체배지를 흡수 또는 피복하여(일본국 특개소 49(1974)-14679호 공보 참조), 종균을 접종해서 배양하는 방법이라도 사용미생물이 번식하고, 본원 발명 효소를 양호하게 생산하는 한 채용할 수 있다.

배양조건은 사용 미생물의 종류에 따라 효소의 생산에 가장 적합한 조건을 선택하면 되며, 특히 한정되어 있지 않다. 통상, 예를들면 20-30℃, pH 5-7로 5-15일간 배양하면 된다.

[본원 발명 효소의 채취]

사용 미생물의 배양에 의해 생산된 본원 발명 효소는 적당한 추출법에 의해 배양물, 즉 배지 및/또는 배양균체에서 추출 분리되어, 그대로 조효소액(粗酵素液)으로서 사용하거나, 또는 상기한 바와같이 통상의 효소 정제법에 따라서 사용 목적에 맞는 정제단계로 정제된다.

추출법은 특히 한정되지 않으며, 통상의 방법에 의해 행해진다. 예를들면, 고체배양물로부터의 추출은 통상, 물 또는 완충액에 의해 행해진다. 또한, 균체내의 본원 발명 효소는 통상의 방법에 의해 균체를 파쇄하고, 가용화해서 추출한다.

(Ⅱ) L-글루타민산의 분석

1) 분석시표

본원 발명에 있어서 "분석시료"라는 용어는 (A) 그 함유성분으로서 L-글루타민산을 함유하고, 또는 함유할 것이 예상되는 시료이며, L-글루타민산 함량 또는 그 유무를 분석할 시료, 또는 (B) L-글루타민산을 유리(遊離)하고, 또는 유리하는 것이 예상되는 반응계를 함유하는 시료이며, 그 계의 L-글루타민산 함량의 변화를 측정하므로써, 그 계에 관여하는 효소활성 또는 그 계에 있어서 L-글루타민산으로 변환하는 물질의 함유량 또는 이들 물질의 유무를 분석하기 위한 시료를 의미한다.

상기 (A)로 분류되는 시료로서는 식품(예를들며, 간장, 아미노산 조미료, 각종 에키스류, 액체 스프맛나니 등의 액체 조미식품, 청주, 감주 등이 알콜 함유식품, 수산연제품, 소세지, 햄등의 고형식품의 추출액 등), 생체시료(오줌, 혈액등), 기타를 들 수 있으며, (B)로 분류되는 시료로서는 글루타미나아제, 글루타민산 라세마아제, GOT, GPT, γ-GTP등 L-글루타민산을 반응생성물로 하는 효소와 그 기질을 함유하는 계, 또는 상기 계와 다른 1종 또는 2종 이상의 다른 공역(共役) 효소계를 함유하는 계를 들 수 있다.

2) L-글루타민산의 분석

본원 발명에 있어서의 L-글루타민산의 분석법은 시료중의 L-글루타민산의 본원 발명 효소에 의한 효소반응계에 있어서는 pH 5-9, 특히 다량의 L-아스파라긴산이 공존하는 시료중의 L-글루타민산에 대해서는 pH5-6에 있어서의 효소반응계와, 이에 따라서 소비 또는 생성되는 시표(示標) 물질의 정량적 또는 정성적인 검출을 행하는 시표물질의 검출계로 이루어진다.

[효소반응]

L-글루타민산의 분석에 있어서의 효소반응 조건은 다음과 같다.

즉, 반응 pH는 본원 발명 효소가 실활(失活)하지 않고, L-글루타민산에 대해서 충분하게 작용하는 pH이면 되며, 또한 시표물질의 검출계가 pH에 의존하는 것이면 이와같은 조건도 고려해서 pH를 설정하는 것이 바람직하다. 통상, pH 5-9의 범위에서 효소반응은 행하여진다. 그리고, 시료중에 실질적으로 본원 발명에 의한 L-글루타민산의 분석에 영향을 주는 정도의 다량의 L-아스파라긴산이 함유되는 경우, 본원 발명 효소는 적당한 pH부근에서는 L-아스파라긴산에 대해서 다소 작용하므로, L-글루타민산에 대해서는 시표물질의 검출에 충분한 정도로 작용하고, L-아스파라긴산에 대해서는 작용하지 않는 조건을 선택해서 반응을 행하므로써 이와같은 시료라도 L-글루타민산을 특이적으로 분석할 수 있다. 이와같은 조건으로서는 pH 5-6의 반응 조건이 적당하다.

그리고, 효소반응의 pH를 적당한 범위로 유지할 목적으로, 반응매질(媒質)로서 각종 완충액을 사용하는 것이 바람직하다. 완충액으로서는 상기 pH범위를 유지할 수 있으며, 또한 본원 발명 효소를 저해하지 않는 것이며, 시표물질의 검출계에 영향을 주지 않는 것이면 된다. 예를들면 인산완충액, 트리스염산완충액, 아세트산 완충액, 구연산완충액, 벨로날완충액 등이 예시된다.

반응온도는 특히 한정되지 않는다. 본원 발명 효소의 최적온도, 안정온도 및 사용하는 시표물질의 검출계등을 감안해서 이 기술분야에 숙련된 사람이면 용이하게 결정할 수 있다.

그리고, 반응에 있어서 본원 발명 효소는 가용성 효소 또는 포괄법, 흡착법, 가교법, 공유결합법 등의 일반적인 방법에 의해서 고정화 된 고정화 효소로서 사용된다.

고정화의 상태는 특히 한정되지 않는다("고정화 효소", 지하타 이치로 편집, 1975년 3월 20일(주) 고단샤 발행 참조). 예를들면, 고정화 담체의 소재로서는 셀룰로오스(셀로판, 필터 페이퍼), 아세틸셀룰로오스 유도체를 포함한 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스(클로디온), 각종 이온교환 셀룰로오스유도체(DEAE-셀룰로오스, TEAE-셀룰로오스, ECTEOLA-셀룰로오스, CM-셀룰로오스, p-셀룰로오스), 전분, 텍스트린유도체(Sephadex(상호)), 아가로오스, 만난(콘작만나), 치토산, 카라기난, 알긴산, 크산탄검, 한천 등의 다당류, 콜라겐, 겔라틴, 피브로인, 케라틴, 알부민, 굴텐 등이 단백질 폴리아크릴아미드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜 등의 중합겔류, 폴리염화비닐, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리아크릴로니트릴, 폴리스티렌, 폴리아미노스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리우레탄, 폴리카보네이트, 폴리아미드(나일론, 폴리아미노산), 플루오르수지(Teflon(상호)), 실리콘수지, 감광성수지, 흡착수지, 이온교환수지 등의 합성유기고분자, 유리, 실리카, 세라믹, 알루미나, 카올리나이트, 벤토나이트, 인산칼슘, 히드록시아파타이트, 활성탄등의 무기고분자 등이 사용되며, 이들 물질은 그대로 또는 효소단백과 반응할 수 있는 기능군의 도입 또는 상기 기능군의 활성화후에 사용할 수 있다.

상기 효소는 고분자성 겔, 셀룰로오스 유도체, 다당류 또는 단백질류 등에 의한 포괄, 마이크로캡슐의 경우 유기고분자물질 또는 셀룰로오스 유도체등에 의한 다공성막에 의한 코팅, 담체결합법의 경우 디아조화법, 펩티드법, 알킬화법 또는 가교법(글루타르알데히드, 헥사메틸렌 디이소시아네이트 등으로)등에 의한 담체에의 공유결합, 이온교환군을 가진 담체에의 이온결합 또는 물리흡착에 의하여 고정화할 수 있다. 또, 상기 가교법에 의하면 글루타르알데히드, 이소시아네이트 유도체류(헥사메틸렌 디이소시아네이트, 톨루엔 디이소시아네트등), 이소티오시아네이트 유도체류(헥사메틸렌디이소티오시아네이트등), N,N'-에틸렌비스말레인이미드, N,N'-(1,2-페닐렌)비스말레인이미드, N,N'-(1,4-페닐렌)비스말레인이미드 및 N,N'-폴리메틸렌-비스이오도아세트아미드와 같은 2이상의 기능군을 가진 시약을 사용하여 효소 사이에 가교함으로써 고정화 할 수 있다. 또한, 고정화 효소는 상기 방법의 두가지 또는 그 이상을 결합하여 제조할 수 있다.

상기 방법에 의하면 본원 발명 효소를 고정화 할 수 있으며, 박막, 겔, 과립, 분말, 마이크로캡슐, 튜브, 파이버, 중공파이버 및 용기 등과 같은 적당한 형태로 제조할 수 있다.

[시표물질의 검출계]

본원 발명 방법에 의해서, L-글루타민산을 분석하기 위한 시표물질은 효소반응에 의해서 소비되는 산소와 생성되는 과산화수소, 암모니아 및 α-케토글루타르산이다.

각 시표물질의 검출은 각각 임의의 방법에 의해서 행해지고, 본원 발명은 그 검출방법에는 한정되지 않는다. 즉, 검출방법은 통상 공지의 방법이 채용되지만, 금후 더욱 개발될 여러가지 방법도 채용가능하다고 생각된다.

다음에, 각 시표물질의 검출방법에 대해서 설명한다.

(1) 산소의 검출

소비된 산소를 검출하는 방법으로서는 와르부르크검압법(생화학 실험 강좌 5, 효소연구법 제35-41페이지, (주) 도쿄가가쿠도진, 1975년 8월 20일 발행)과 산소전극법(전극법에 의한 산소측정, 하기와라 분지편, (주) 고단샤, 1977년 11월 20일 발행)이 알려져 있으며, 본원 발명에 있어서는 어느 방법을 채용해도 된다.

산서전극법에 사용하는 전극으로서는 작용전극으로서 백금, 금, 이리듐 등의 귀금속전극을 사용하고, 대조전극으로서 은, 은/염화은계, 포화칼로멜, 연, 아연, 알루미늄 등의 전극을 사용하고, 이들 전극 및 전해액(수산화칼륨, 수산화나트륨 등의 알칼리용액)의 피검액을 기본 구성으로 한다. 클라크형 전극 등 복합형 전극(제17도) 또는 분리형 전극이 사용된다. 그 방식은 폴라로그래프방식이라도 갈바니 전지방식이라도 된다.

산소전극에 의해서 산소를 측정하는데 있어서는 효소반응 혼합물의 용존산소를 통상의 방법으로 측정하면 된다. 또한, 효소전극을 사용해서 측정해도 된다.

(2) 과산화수소의 검출

생성되는 과산화수소를 검지하는 방법으로서는 전기화학적 분석법, 분광학적 분석법, 형광분석법, 화학발광 분석법 등이 알려져 있고, 본원 발명에 있어서는 어느 방법도 채용해도 된다.

전기화학적 분석법으로서는 상기 산소전극과 같은 구조의 과산화수소 검지형 전극을 사용하여, 전류법에 의해 측정하는 방법이 일반적이다. 예를들면, 백금 등의 귀금속전극으로 이루어지는 작용전극과 은전극 등으로 이루어진 대조전극과 과산화수소 투과성막으로 이루어지는 클라크형 과산화수소 전극을 사용하는 방법은 본원 발명에 적합하게 사용된다. 또한, 산소전극과 같이 효소전극으로서 사용해도 된다. 그리고, 상기 방법외에 전기화학 분석법으로서 본원 발명 효소와 함께 퍼옥시다아제 또는 몰리브덴산염 등의 과산화수소 분해용 촉매를 사용하여, 과산화수소와 요오드이온을 반응시켜서, 전극 표면에 있어서의 요오드이온의 활량 감소를 요오드 이온전극으로 측정하는 방법도 사용할수 있다. 또한, 이 방법은 본원 발명 효소와 퍼옥시다아제 또는 촉매를 함유하는 고정화 효소를 요오드이온전극으로 장착한 효소전극으로서 적합하게 사용된다.

분광학적 분석법으로서는 (1) 피산화성 발색제를 퍼옥시다아제 또는 같은 활성을 나타내는 물질의 존재하에 과산화수소와 반응시켜서 생성색도의 흡광도 측정을 행하는 퍼옥시다아제법, (2) 알콜을 카탈라아제의 존재하에 과산화수소와 반응시켜서 생성되는 알데히드를 발색계에 유도하고, 생성색도의 흡광도 측정을 하던가, 또는 알데히드 알데히드 탈수소효소를 NAD의 공존하에 작용시켜서 환원형 NAD(NADH)의 생성을 측정하는 카탈라아제법, 및 (3) Ti(IV)/크실레놀오렌지계, Ti(IV)/4-(2-피리딜아조)레소르시놀계, V(V)/크실레놀 오렌지계 등을 사용하는 화학적 방법이 있다. (1)의 퍼옥시다아제법에 있어서 정색(呈色)반응은 발색제 단독의 산화반응 또는 발색제와 커플러(coupler)와의 산화 축합반응이다. 전자의 방법으로는 발색제로서 o-디아니시딘, o-톨리딘, o-톨루이딘, o-아미노페놀, 2,4-디클로로인도페놀, 벤지딘, 3,3',5,5'-테트라알킬벤지딘(3,3'5,5'-테트라메틸벤지딘등), 4-메톡시-1-나프톨, 2,2'-아지노-디(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산), 구아이아쿰수지(구아이아콜), N-(4-안티피릴)-아닐린 유도체(N-(4'-안티피릴)-2-카르복실-4-히드록시아닐린등), p-히드록시페닐 아세트산, N,N-디메틸-p-페닐렌디아민 등을 사용할 수 있다.

또한, 후자의 방법으로는 발색제로서 4-아미노안티피린, 4-아미노안티피린 아미드 등의 4-아미노안티피린유도체 ; 4-아미노페나존, 4-아미노-N,N-디메틸 아닐린, p-페닐렌디아민, 4-아미노-N,N-디에틸-m-톨루이딘 등의 페닐렌디아민유도체 ; 3-메틸-2-벤조티아졸리논 히드라존(MBTH) 등이 사용되고, 커플러로서는 페놀, 카테콜, 레소르신, 히드로퀴논, 크레졸, 구아이아콜, 피로갈롤, 오르시놀, p-클로로페놀, p-브로모페놀, 2,4-디클로로페놀, 2,4-디브로모페놀, 2,4,6-트리브로모페놀, 아닐린, N,N-디메틸아닐린, N,N-디에틸아닐린, N-에틸-(N-3-메틸페닐)-N-아세틸렌디아민, 3-아세트아미노-N,N-디에틸아닐린, N,N-디에틸-m-톨리이딘, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필-m-톨루이딘, N-글리실-N-에틸-m-톨루이딘, p-디메틸아미노페놀, o-아미노페놀, m-아미노페놀, p-메틸아미노페놀, 2-클로로-6-메틸페놀, 4-클로로-3-메틸페놀, 3,5-디클로로-2-히드록시벤젠술폰산 등의 페놀계, 아닐린계 또는 톨루이딘계 화합물 ; 4-할로게노-1-나프톨-2-술폰산(4-클로로-1-나프톨-2-술폰산 등), 1-나프톨-2-술폰산, 2-아미노-5-나프톨-7-술폰산, 2,4-디클로로-1-나프톨, 1-히드록시-2-나프토산, 4,5-디히드록시 나프탈렌-2,7-디술폰산 등의 나프톨계 화합물 ; 나프탈아민 또는 그 유도체 ; 히드록시퀴놀린, 아미노퀴놀린 등의 퀴놀린계 화합물 등을 사용할 수 있다.

발색제와 커플러의 적합한 조합예로서는 4-아미노안티피린과 페놀, N,N-디메틸아닐린, N,N-디에틸아닐린 또는 N-디에틸-m-톨루이딘과의 조합 또는 3-메틸-2-벤조티아졸리논히드라존과 N,N-디메틸아닐린과의 조합을 들 수 있다. 본원 발명은 이들 발색제 또는 발색제와 커플러의 종류에는 한정되지 않고, 정량적으로 산화되어서 색조변화를 나타낼 수 있는 것이라면 모두 사용 가능하다. 또한, 퍼옥시다아제는 통상서양겨자(horseradish) 또는 고구마유래의 효소가 사용되지만, 퍼옥시다아제 모양의 활성을 나타내는 것이면 되고, 특히 한정되지 않는다. 그리고 퍼옥시다아제와 같은 활성을 나타내는 촉매라도 된다. (2)의 카탈라아제법에 있어서, 발색계를사용하는 방법에는 통상 알콜로서 메탄올이 사용되고, 과산화수소와의 반응으로 생성한 포름알데히드를 산화제(예를들면 과요오드사나트륨, 칼륨시아노페놀 레이트, 염화제2철 등)의 존재하에서 히드라존(예를들면 3-메틸-2-벤조티아졸리논히드라존, 4-아미노-3-히드라지노-5-메르캅토-1,2,4-트리아졸(AHMT)등)과 반응시켜서 발색시키는 방법, 포름알데히드를 아세틸아세톤 및 암모늄염과 반응시켜서 발색하는 방법 등이 채용된다.

그리고, 과산화수소와 글루타티온퍼옥시다아제에 의해 산화형 글루타티온으로 유도하여, 이것을 NADPH의 존재하에 글루타티온 레둑 타아제에 의해 환원하고, NADPH의 산화량을 측정하는 방법(Anal. Biochem, 76, 184-191(1976), 동이온-히스타민계로 인디고카르민을 산화 탈색하고, 그 색도의 감량으로 정량하는 방법 등도 있다.

형광분석법으로서는 호모바닐린산을 퍼옥시다아제의 존재하에 과산화수소와 반응시켜서 형광성의 2,2'-디히드록시-3,3'-디메톡시비페닐-5,5'-디아세트산으로 변환하고, 형광강도를 측정하는 방법을 들 수 있다. 같은 방법으로, 호모바닐린산 대신 p-히드록시페닐아세트산, 디아세틸플루오레스신유도체(디아세틸플루오레스신, 디아세틸디클로로플루오레스신 등)등을 발형광 시약으로서 사용해도 된다. 또한, 스코폴레틴, 3,5-디아세틸-1,2-디히드로루티딘 등의 형광물질을 과산화수소/퍼옥시다아제에 의해 산화해서 비형광성 물질로 변환하고, 형광의 감소를 측정하는 방법도 있다.

광학발광분석법으로서는 루미놀을 퍼옥시다아제의 존재하에 과산화수소와 반응시켜서 산화하고, 발광량을 측정하는 방법(일본국 특개소 57(1982)-71399호, 특개소 57(1982)-71400호 참조)가 있다. 같은 방법으로 루미놀 대신 이소루미놀, 피로갈롤, 비스(2,4,6-트리클로로페닐)옥살레이트 등을 사용해도 되며, 퍼옥시다아제 대신 헤모글로빈, 헤마틴, 헤민, 시안화철(Ⅲ)칼륨, 염화코발트 등을 촉매로서 사용해도 된다.

(3) 암모니아의 검출

암모니아는 미크로켈달(micro-kjeldahl)법, 네슬러(Nessler)법, 인도페놀법, 닌히드린법, 페노사프라닌법 등의 방법에 의해 분석할 수 있다. 또한, 양이온 선택성 전극에 의해서 암모늄이온을 분석하는 방법 또는 소수성(疎水性)의 가스투과성 막을 장착한 유리전극으로 이루어지는 암모니아가스전극에 의해 암모니아가스로서 분석하는 방법 등, 전기화학적 분석법에 의해서 분석해도 된다. 그리고, 이들 전극과 본원 발명 효소를 조합한 효소전극에 의해 암모니아를 검출하고, L-글루타민산을 분석해도 된다.

(4) α-케토글루타르산의 검출

α-케토글루타르산은 3-메틸-2-벤조티아졸리논히드라존(NBTH)와 반응시켜서 생성물의 흡광도를 측정하는 방법, 2,4-디니트로페닐히드라진과 반응시켜서 생성물의 흡광도를 측정하는 방법, o-페닐렌디아민과 반응시켜서 생성물의 흡광도를 측정하는 방법, 기타 공지의 방법을 사용할 수 있다.

3. 분석용 시약

본원 발명의 분석용 시약은 최소한 본원 발명 효소를 함유하는 시약이다. 즉, 그 형태는 한정되지 않으며, 용액, 분말 또는 과립의 가용성 효소라도 되며, 그리고 상기와 같이 각종 방법에 의해서 박막, 겔, 과립, 분말, 마이크로캡슐, 튜브, 파이버, 중공파이버 또는 용기의 담체에 고정화 된 고정화 효소라도 된다. 그리고, 본원 발명 효소 외에 액상 또는 분말상의 인산완충제, 트리스염산완충제, 아세트산완충제, 구연산완충제, 벨로날완충제 등의 완충제, 염류(염화나트륨 등), 당류(자당 등), 다가 알콜류(글리세롤, 프로필렌글리콜, 소르비틀 등), 기타 적당한 안정화제, 계면활성제등을 첨가해도 된다.

L-글루타민산의 분석에 있어서, 상기 분석용 시약은 상기 각종 검출법에 따라서, 필요한 효소활성이 얻어지도록 사용한다. 또한, 미리 각 검출법에 맞는 양을 시약병, 앰플 등의 용기에 봉입해도 된다.

4) 분석용 키트

분석용 키트는 상기 본원 발명 효소를 함유하는 분석용 시약과 본원 발명 효소에 의한 반응을 검출하는 수단인 검출용 시약으로 구성된다. 검출용 시약이란 상기 시표물질의 검출에 필요한 시약이다. 즉, 과산화수소를 시표물질로 할 경우, 검출용 시약으로서는 예를들면 퍼옥시다아제 또는 퍼옥시다아제와 같은 활성물과 발색제 또는 발색제 및 커플러와의 조합, 카탈라제 또는 카탈라제와 같은 활성물과 알콜과 발색계에 필요한 시약 또는 공역효소계에 필요한 시약과의 조합, 퍼옥시다아제 또는 퍼옥시다아제와 같은 활성물과 발형광제와의 조합, 퍼옥시다아제 도는 퍼옥시다아제와 같은 활성물과 발광시약과의 조합 등이 예시된다. 이들 시약의 구체예는 상기 "과산화수소의 검출"의 기재에서 명백하다.

그리고, 암모니아 또는 α-케토글루타르산을 시표물질로 할 경우도 마찬가지로 필요한 검출시약을 본원 발명 효소를 함유하는 분석용 시약과 조합하고, 분석용 키트로서 구성할 수도 있다.

또한, 본원 발명 효소를 함유하는 분석용 시약과 상기 검출용 시약은 전부를 혼합해서 단일 시약으로 해도되며, 상호 간섭하는 성분이 조재하는 경우에는 각 성분을 적당한 조합이 되도록 분할해도 된다. 그리고, 이들은 용액상 또는 분말상 시약으로서 조제해도 되며, 그리고 이들을 여과지 또는 필름 등의 적당한 지지체에 함유시켜 시험지 또는 분석용 필름으로서 조제해도 된다.

그리고, 본원 발명의 분석용 키트에는 상기 조합시약 외에, L-글루타민산의 일정량을 함유하는 표준시약을 첨가해도 된다.

본원 발명의 분석용 키트의 적합한 일예로서는 과산화수소의 분광학적인 검출에 의해서 L-글루타민산을 분석하는 키트를 들 수 있다. 예를들면, 퍼옥시다아제법에 의한 키트의 경우, 통상 본원 발명 효소 0.02단위(U)이상 테스트, 퍼옥시다아제 1-10U/테스트, 발색제로서 4-아미노 안티피린과 페놀 또는 N,N-디메틸아닐란을 사용하는 경우, 이들의 시약은 생성하는 과산화수소에 대해서 1몰이상, 바람직하게는 2몰이상 사용된다.

(Ⅲ) 바이오센서

1) 센서의 구성

본원 발명에 있어서 "바이오센서"란 피검지물질을 식별하는 레셉터부로서의 효소와 이 효소의 작용에 의한 분석시료중의 화학적 또는 물리적 변화를 검출하고, 전기신호를 변환하는 신호변환부위인 트랜스듀서부로 구성되고 전기신호를 전류의 변화 또는 전위의 변화로서 측정하고, 분석시료중에 있어서의 피검지물질의 존재량 또는 그 존부를 분석하기 위한 장치를 의미하는("화학의 영역, 중간 134호, Biomaterial Science 제1집" 페이지 69-79, 1982년 4월 20일, (주)난꼬도 발행 및 "화학공업" 1982년 6월호, 페이지 491-496 참조). 상기와 같이 레셉터부로서 사용하는 바이오센서는 "효소센서"라고도 하며, 특히 트랜스듀서부로서 전기화학 디바이스를 사용하는 효소센서는 "효소전극"이라고도 불리운다("이온전극과 효소전극", 스즈키 슈이치편, 페이지 65-106, 1981년, 11월 1일, (주)고단샤 발행 및 "화학의 영역" 제36권 제5호, 페이지 343-349(1982년)참조). 또한 효소센서에는 레셉터부와 트랜스듀서부가 밀착 또는 근접해서 구성되는 전극장착형 효소전극 및 레셉터부와 트랜스듀서부가 분리해서 구성되는 리액터형 효소센서가 있다.

본원 발명에 의한 바이오센서는 상기 공지의 바이오센서에 있어서 레셉터부로서 신규 효소인 특정의 L-글루타민산 옥시다아제를 사용하므로써 신규의 바이오센서를 구성하고, 종래 기술에 비해서 각별한 효과를 달성해서 이루어진 것이다. 따라서 본원 발명 효소를 사용하는 외에는 공지의 기술을 채용할 수 있으며, 그리고 금후 개발된 기술도 본원 발명의 목적에 부합되는 것이라면 채용할 수 있다.

2) 리셉터부

상기의 본원 발명 효소를 바이오센서의 레셉터부로서 사용하기 위해서는 본원 발명 효소와 피검지물질인 L-글루타민산의 접촉이 용이하게 행해지고, 효소반응이 원활하게 진행되는 동시에, 본원 발명 효소가 분석 시료용액중에 실질적으로 용출하지 않는 상태로 레셉터부를 구성하지 않으면 안된다. 따라서, 본원 발명은 통상 고정화되거나 또는 반투막(半透膜) (예를들면 투석막(透析膜), 한외(限外)여과막 등)에 의해 피복되어 사용된다.

고정하는 레셉터부의 바이오센서에 있어서의 사용의 목적에 적합한 상태로 이루어지고, 본원 발명 효소가 실질적으로 실활(失活.)되지 않고, 효소반응이 저해되지 않는 상태로 되면 좋고, 특히 한정되지 않는다("고정화 효소", 지하타 이치로편 1975년 3월 20일, (주)고단샤 발해 및 "이온전극과 효소전극"(동시 발행) 페이지 65-77, 참조).

즉, 고정화 방법은 포괄법(격자법, 마이크로캡술형 등), 담체결합법(공유결합법, 이온결합법, 물리적 흡착법 등), 가교법 등의 공지의 방법에 의해 레셉터부로서 사용하는 고정화 효소의 조제법으로서 적당한 방법을 선택하면 된다. 구체적으로는 담체 또는 지지체의 소재로서 적당한 물질은 상기한 바와 같다.

얻어진 고정화 효소를 바이오센서의 레셉터부로서 사용하는 형태는 다음과 같다. 즉, 전극장착형 효소전극의 경우 통상 막상, 겔상, 분말상 또는 마이크로캡슐상의 고정화 효소를 측정전극의 작용면에 밀착 또는 근접해서 장착하고, 또한 바람직하게는 기질투과성 다공질막(예를들면 투석막, 한외여과막)을 피복하여 구성된다. 그리고, 전극막, 고정화 효소층 및 시료액과 접하는 피복막의 3가지 모두가 일체로 된 적층막 또는 불균질막 또는 앞의 2자 또는 후의 2자가 일체로 된 적층막 또는 불균질막으로 하여 구성되어도 좋다. 또, 리액터형 효소센서의 경우 통상 입상 또는 분말상의 고정화 효소를 콜럼으로 충진하고 또는 튜브상 또는 섬유상(홀로우화이버상)의 고정화 효소를 리액터로서 구성하고, 레셉터부로서 사용할 수 있다.

3) 트랜스듀서부

상기의 레셉터부에 있어서 분석시료중의 기질을 본 발명 효소에 의해 산화하고, 이 반응에 의한 화학적 또는 물리적 변화를 검출하여 전기신호로 변환하는 부위가 트랜스듀서부이다. 본원 발명에 있어서는 화학적 변화를 검출하는 경우를 예시하지만, 물리적 변화 예를들면 열의 수지를 서미스터 등에 의해 검출해도 된다.

본원 발명 효소에 의한 반응에 수반하는 화학적 변화는 분석 시료중의 산소 및 L-글루타민산의감소 및 과산화수소, 암모니아 및 α-케토글루타르산의 증가이지만, 트랜스듀서부에 의해 검출되는 것은 통상 산소의 흡수, 과산화수소의 증가 또는 암모니아의 증가이다.

산소의 흡수를 검출하여 전기신호로 변환하는 트랜스듀서로서는 산소전극이 사용된다.

과산화수소를 검출하여 전기신호로 변환하는 트랜스듀서로서는 과산화수소 검지형 전극이 사용된다. 구체적으로는 상기의 산소전극과 같은 구조의 전극을 사용할 수 있다.

또, 레셉터부로서 본원 발명 효소와 함께 퍼옥시다아제 또는 몰리브덴산염 등의 과산화수소 분해용 촉매를 사용하고, 과산화수소와 요오드이온의 활량(活量)감소를 검출하는 방법에 의해 과산화수소를 검출할 수도 있고, 이 경우에는 요오드이온전극을 사용할 수 있다.

암모니아를 검출하여 전기신호로 변환하는 트랜스듀서로서는 암모니아를 암모늄이온으로서 분석하는 경우는 양이온 선택성 전극을 사용할 수 있고, 암모니아가스로서 분석하는 경우에는 소수성(疎水性)의 가스투과성막을 장착한 유리전극으로 이루어지는 암모니아 가스전극을 사용할 수 있다.

본원 발명에 의한 전극장착형 효소전극은 상기 레셉터부로서의 본원 발명 효소가 이상 예신한 각종 전극의 전극 감응물질 투과성 막위 또는 이와 같은 막과 일체와 해서 장착되어 구성된다.

또 본원 발명에 의한 리액터형 효소전극은 상기의 레셉터부로서의 본원 발명 효소를 고정화 한 리액터와, 효소반응부분과 분리해서 설치된 이상의 예시한 각종 전극으로 구성된다.

그리고, 본원 발명은 트랜스듀서 검지물질 및 트랜스듀 서방식에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 A1]

500ml용 에르렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에 밀기울20g 및 물 16ml를 넣고, 120℃, 30분간 가압 멸균해서 조제한 밀기울 배지에 스트렙토마이세스 에스피 X-119-6(KAIST 830905-10715, FERM P-6560, ATCC 39343)을 식균하여, 28℃, 7일간 배양해서 종균을 조제하였다.

51용 에르렌마이어 플라스크 25개에 각각 밀기울 200g 및 물 160ml를 넣고, 120℃, 30분간 가압 멸균한 다음, 상기 종균을 무균적으로 접종하고, 28℃에서 2일간 배양 후, 온도를 20℃로 내려서 다시 2주간 배양하였다.

얻어진 배양물을 37.5ℓ의 물에 1시간 담근 다음 여과하고, 다시 규조토를 통과시켜서 조효소액 약 34ℓ를 얻었다. 이 조효소액에 황산암모늄을 50%포화까지 가하고, 생성된 침전을 원침 채취하여 0.02M 아세트산 완충액(pH 5.5)3.9ℓ에 용해하고, 57℃로 30분간 가열하였다. 이 열처리한 효소액을 5℃이하로 냉각 후, 2배의 양의 미리 내악한 에탄올을 가하여, 생성된 침전을 원침 채취해서 0.02M 인산완충액(pH 7.4)에 용해하고, 동일 완충액으로 하루밤 투석하였다.

투석중에 생성된 침전을 원침 제거하고, 상증액을 동일 완충액으로 평형화 한 DEAE(디에틸아미노에틸)-셀룰로오스콜럼(3.5×50cm)에 통과시키고, 흡착된 효소를 염화나트륨 0.35M을 함유한 동일 완충액을 사용해서 용출하였다. 용출된 활성 구분을 모아, 0.05M의 식염을 함유한 0.05M 아세트산 완충액(pH 5.5)으로 하루밤 투석하였다. 이 투석내액을 동일 완충액으로 평형화 한 DEAE-세파로오스 CL-6B(Pharmacia Fine Chemicals 사 제품) 콜럼(2×10cm)에 통과시키고, 흡착된 효소를 식염 0.05-0.75M의 리니어그라디엔트(linear gradient)법으로 용출하였다.

용출된 활성구분을 모아 투석 농축 후, 세파덱스 G-200(Pharmacia Fine Chemicals 사제품) 콜럼(2.5×120cm)를 사용해서 겔 여과를 행하고, 활성 구분을 모아서 농축 후, 0.02M 인산칼륨 완충액(pH 7.4)으로 투석하였다. 이 투석내액을 원침하여, 상증액을 정밀 여과한 다음, 동결건조해서 L-글루타민산 옥시다아제의 정제표품(비활성(比活性) 55.1U/㎎ 단백, 수율 18.4%) 30㎎을 얻었다.

[실시예 B1]

(1) 키트의 조제

시약A : l-글루타민산 옥시다아제 1㎎(10U/㎎), 퍼옥시다아제 5㎎(100U/㎎ : 서양 겨자 유래 : 도요보세키(주) 제품) 및 4-아미노안티피린 40㎎이 1개의 시약병에 포함되도록 0.2M 인산칼륨완충액(pH 6.5) 2ml에 용해하고, 통상의 방법에 의해 동결 건조하였다.

시약B : (1)페놀 40㎎을 0.1M 인산완충액(pH 6.5)에 용해하고, 100ml로 해서 시약병에 넣고, 또는 (2)디메틸아닐린 100㎎을 0.1M 인산칼륨완충액(pH 6.5)에 용해하고, 100ml로 해서 시약병에 넣었다.

(2) 조작법

시험관에 L-글루타민산나트륨의 표준액 및 물을 각각 0.1ml나누어 넣고, 상기 시약A의 동결 건조물을 시약B의 (1) 또는 (2)중 하나의 용액 100ml에 용해한 것을 상기 각 시험관에 각각 0.9ml첨가하고, 37℃에서 호기적으로 진탕(振 t7 )하면서 20분간 인큐베이트 하였다. 물에서의 블라인드테스트(blind test)를 대조해서 상기(1)을 사용하는 경우는 500nm의 흡광도를 측정하고, 상기 (2)를 사용하는 565nm의 흡광도를 측정하였다.

이들의 검량선을 제8도(시약B이 (1)의 경우) 및 제9도(시약B가 (2)인 경우)에 나타난다.

[실시예 B2]

(1) 시약의 조제

발색시약 : 페놀 20㎎, 4-아미노안티피린 20㎎ 및 서양겨자 퍼옥시다아제 3㎎(100U/㎎)을 50ml의 0.2M 인산칼륨완충액(pH 7.4)에 용해하였다.

L-글루타민산 옥시다아제 : 정제효소 300㎍(55U/ml)을 30ml의 0.02M 인산칼륨완충액(pH 7.4)에 용해했다(0.05U/ml).

(2) 조작법

시험관에 발색시약 0.8ml를 나누어 넣고, L-글루타민산 옥시다아제 용액 0.1ml을 가하고, 37℃항온조에 넣어서 5분간 가온하였다. 표준 L-글루타민산나트륨용액(0-2μ몰/ml) 또는 시료용액(각종 제품 간장을 물로 150배로 희석한 용액) 0.1ml을 가하여 잘 섞어서, 37℃에서 호기적으로 진탕하면서 20분간 인큐베이트하였다. 블라이드 테스트를 대조로 해서 500nm의 흡광도를 측정하고, 제10도에 나타내는 검량선을 작성하였다. 이 검량선에서 구한 상기 시료중의 L-글루타민산 정량치를 L-글루타민산효소를 사용한 종래법(Technicon 자동분석장치에 의해 페놀프탈레인의 감색도를 측정하는 방법)에 의한 동 시료중의 L-글루타민산 정량치와 비교해서 제4표(실시예 B3의 뒤에 나타냄)에 나타냈다. 또한, 상관계수 r=0.997, 회귀식 y=1,005x-0.575였다.

[실시예 B3]

시험관에 0.1M 인산칼륨완충액(pH 7.4) 0.7ml, 카탈라아제(100U/ml : 소의 간 유래, Sigma Chemical사 제품)용액 0.1ml 및 L-글루타민산 옥시다아제(0.6U/ml)의 용액 0.1ml를 취하고, 37℃에서 5분간 가온하였다. 이에 표준 L-글루타민산 나트륨용액(0-5mM) 0.1ml 또는 시료용액(실시예 B2와 동일한 제품 간장희석액) 0.1ml을 가해서 반응을 개시하였다. 37℃에서 20분간 호기적으로 진탕하면서 언큐베이트한 후, 25% 트리클로로아세트산 0.1ml을 가해서 반응을 정지시켰다. 반응정지액에 1M 아세트산완충액(pH 5.0) 1.9ml와 0.1% 3-메틸-2-벤조티아졸리노히드라존 염산염용액 0.8ml을 가하여 섞은 후, 50℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 실온까지 냉각 후, 블라인드 테스트를 대조로 하여 316nm의 흡광도를 측정하고, 제11도에 나타내는 검량선을 작성하였다. 이 검량선에서 구한 시료용액중의 L-글루타민산 정량치를 L-글루타민산 탈탄산효소를 사용한 종래법에 의한 시료용액중의 L-글루타민산 정량치와 비교하여, 제4표에 나타냈다. 상관계수 r=0.966, 회귀식 y=1.026x-3.122였다.

[제4표]

[실시예 B4]

(1) 시약의 조제

발색시약 : 페놀 30㎎, 4-아미노안티피린 30㎎, 서양겨자 퍼옥시다아제 4㎎(100U/㎎) 및 L-글루타민산 옥시다아제 1㎎(10U/㎎)dmf 0.2M 인산칼륨완충액(pH 6.5) 50ml에 용해하였다.

기질용액A : L-아스파라긴산 나트륨 200㎎ 및 α-케토글루타르산 15㎎을 0.1M 인산칼륨완충액(pH 7.0) 10ml에 용해하였다.

기질용액B : L-알라닌 140㎎ 및 α-키토글루타르산 15㎎을 0.1M 인산칼륨완충액(pH 7.0) 10ml에 용해하였다.

(2) 조작법

1)글루타민산-옥살로아세트산 트란스 아미나아제(GOT)의 활성측정 시험관에 기질용액A 0.2ml를 취하고, 표준 효소액(베링거 야마노우치사 제품, 380U/㎎) 0.1ml를 가하고, 37℃에서 30분간 인큐베이트한 후, 25% 트리클로로아세트산 0.1ml을 가해서 반응을 정지시켰다. 반응정지액에 1M 인산칼륨완충액(pH 6.5) 0.1ml 및 L-글루타민산 옥시다아제를 발색시약 0.5ml를 가해서 37℃에서 20분간 인큐베이트하였다. 블라인드테스트를 대조로 해서 500nm의 흡광도를 측정하여 제12도에 나타내는 검량선을 작성하였다.

2) 글루타민산-피루빈산 트란스 아미나아제(GPT)의 활성 측정시험관에 기질용액B 0.2ml을 취하고, 표분효소액(베링거 야마노우치사 제품, 140U/㎎) 0.1ml을 가하고, 37℃에서 30분간 인큐베이트한 후, 25%트리클로로 아세트산 0.1m를 가해서 반응을 정지시켰다. 반응정지액중의 L-글루타민산 함량을 1)과 같이 측정하고, 제13도에 나타내는 검량선을 작성하였다.

[실시예 B5]

L-글루타민산 옥시다아제(0.5U/ml)를 함유하는 0.1M 아세트산완충액(pH 5.5) 1ml를 30℃의 항온수가 순환되고 있는 클라크(Clark)방식의 산소전극의 큐베트(cuvette)에 밀봉하고, 50ml의 L-글루타민산 표준액(0-2mM)을 주입해서 산소소비량을 측정하고, 제14도에 나타내는 검량선을 작성했다. 이 검량선에서 구한시료(각종 간장)중의 L-글루타민산 정량치를 L-글루타민산 탈탄산효소를 사용한 종래법에 의한 시료중의 L-글루타민산 정량치와 비교해서 제5표에 나타냈다. 상관계수 r=0.953, 회귀식 y=0.930x+6.11였다.

[제5표]

[실시예 B6]

L-글루타민산 옥시다아제(12.5U/ml)용액 0.5ml를 다공성 니트로 셀룰로오스막(도요가가쿠 산교사 제품, TM-5 : 구멍지름 0.1㎛, 직경 25㎜, 막두게 140㎛)위에 적하·흡인하므로써 흡착 고정하고, L-글루타민산 옥시다아제막 조제물을 얻었다.

상기 고정화 효소막을 원형으로 재단(직경 5.0㎜)한 후 격막산소전극(이시카와세이사쿠쇼사 제품 U-2형)의 가스투과성막(디플론막, 막두께 10㎛)위에 장착하고, 다시 고정화 효소에 셀룰로오스 투석막을 장착해서 L-글루타민산 센서를 제작하였다. 이 센서를 사용해서 공지 농도(0.05-1.0mM)의 L-글루타민산나트륨 표준용액에 대한 전류감소치를 측정하고, 제15도에 나타내는 검량선을 작성하였다.

[실시예 B7]

L-글루타민산 옥시다아제 2U와 L-글루타민산 20μ몰을 함유하는 0.1M 아세트산완충액(pH 5.5) 1ml을 항온수가 30℃에서 순환되는 클라크형 산소전극의 규베트내에 밀봉되었고, 글루타미나아제 표준액(4-20mU. 대장균에서 얻음)의 20μl을 산소소비량을 측정하기 위하여 주입하여 제16도에 도시된 검량선을 작성하였다.

마찬가지로, 간장(5분간 1000r.p.m으로 0.1M 인산완충액(pH 7.0) 50ml내에 간장 10g을 동질화 한 다음이 완충액을 첨가하여 310ml을 얻음)의 현탁액 50μl을 산소소비량을 측정하기 위하여 주입하였다. 간장 1g당 글루타미나아제 활성은 3.7U로 측정되었다.

[실시예 C1]

L-글루타민산 옥시다아제(448U/ml)용액 0.1ml을 30㎜×30㎜ 사방의 셀로판막(막두께 30㎛)에 적하·건고(乾固)하여, 이것에, 2.5% 글루타르알데히드용액 0.1ml을 침윤시키고, 4℃에서 하루밤 건조하고, 280nm에 있어서의 흡수물질이 용출하지 않을때까지 물로 세정하고, L-글루타민산 옥시다아제 고정화 셀로판막을 얻었다.

상기 고정화 효소막을 원형의 소편으로 재단하여, 격막산소전극(이시카와세이사쿠쇼사 제품)의 산소투과성막(데플론막, 막두께 10㎛)위에 장착하고, 다시 이 고정화 효소막 위에 셀룰로오스 투석막(막두께 50㎛, 비스킹사 제품)을 장착해서 L-글루타민산센서를 제작하였다(제17도).

제17도에 있어서, 격막산소전극은 음극은 백금전극(1), 양극은 연(鉛)전극(2)이며, 수산화칼륨용액을 내부액(전해액)(3)으로 해서 백금음극 표면에 산소투과성의 테플론막(4)이 장착되어 있다. 이 테플론막 위에 상기 고정화 효소막(5)이 장착되고, 다시 셀룰로오스 투석막(6)으로 피복되어 0링(7)으로 고정되어 있다.

상기의 L-글루타민산 센서를 사용하여, 제18도에 나타내는 L-글루타민산 분석장치를 제작하였다. 제18도에 있어서 시료용액 주입구(1)에서 주입된 시룡용액(2)은 용존산소포화완충액(3)과 함께 페리스태틱펌프(4)에 의해서 셀(5)에 송입된다. 이때 L-글루타민산 센서(6)에 의해서 측정된 전류감소치는 기록계(7)에 기록된다.

상기 장치에 L-글루타민산 나트륨 표준액을 연속적으로 주입하여 전류감소치를 측정하고, L-글루타민산 나트륨 농도와의 상관을 구하고, 결과를 제19도에 타나냈다.

이 장치를 사용하여 각 온도에 있어서의 응답성을 측정하며, 결과를 제20도에 나타냈다. 단, 측정은 0.8mM L-글루타민산 나트륨용액을 사용하여 20℃, 30℃ 및 40℃의 각 온도로 행하였다.

마찬가지로 각 pH의 L-글루타민산 나트륨용액(0.8mM)에 대한 응답성(30℃)을 측정하고, 결과를 제21도에 나타냈다. 또한, 마찬가지로 각종 아미노산에 대한 응답성을 측정하고, 결과를 제6표에 나타냈다. 또한, 각 아미노산 용액의 농도는 2.0mM이며, L-글루타민산용액의 농도는 0.4mM이고, 반응은 30℃에서 pH 5.5(0.1M 아세트산 나트륨완충액)으로 행하였다.

[제6표]

상기 센서가 0.02M 인산완충액내에 3℃에서 보존되고, L-글루타민산 나트륨용액에 대한 반응이 각 경과일에 대하여 상기와 같이 측정되었을때, 최초의 반응은 1개월간 유지되었다. 이리하여 상기 고정화 효소막은 3℃에서 최소한 1개월간 안정하다.

[실시예 C2]

실시예 C1과 같이 얻어진 L-글루타민산 옥시다아제의 고정화 셀로판막을 재단한 다음, 과산화수소전극(이시카와세이사쿠쇼사 제품)의 전극 위에 장착하고, 다시 고정화 효소막을 셀룰로오스 투석막에 피복하여 실시예 C1에서 제조된 센서의 구조와 동일한 구조를 가진 L-글루타민산 센서를 제조하였다. 상기 센서를 사용하여 실시예 C1의 장치와 같은 L-글루타민산 분석장치가 제조되었다.

전류치를 측정하기 위하여 L-글루타민산나트륨 표준액이 상기 장치로 주입되었고, 여기서 L-글루타민산 나트륨농도와 전류치 사이의 상호관계는 제22도에와 같이 얻어졌다.

[실시예 C3]

시판 간장을 0, 1M 인산완충액(pH 7.0)으로 10배로 희석해서 공기를 바블링하여 용존산소를 포화상태로 한 시료액을 조제하였다. 49ml의 0.1M 인산완충액(pH 0.7)에 상기 시료액 1ml를 주입하고, 실시예 C1에서 제작한 장치에 의해서 상기 간장중의 L-글루타민산 농도를 산출한 바, 이 값은 L-글루타민산 탈탄산효소를 이용해서 비색법(比色法)에 의해 측정하는 시판의 L-글루타민산 자동분석장치(Technicon Instruments 사 제품)에 의한 정량치와 잘 일치하고 있었다.

또, 시판 간장에 실시예 C1 및 실시예 C2의 장치를 사용하여 L-글루타민산 나트륨의 소정량(5-100mM)을 가하여 회수시험을 하였다. 각 장치에 대한 검량선에 의하여 회수된 L-글루타민산 나트륨의 야을 산출하였다. 이 산출량은 제23도(실시예 C1의 장치)와 제24도(실시예 C2의 장치)에 나타낸 바와 같이 첨가된 L-글루타민산 나트륨의 양과 실질적으로 비례하였다.

Claims (1)

1. 스트렙토마이세스(Streptomyces)속에 속하고, 하기의 특성을 가지는 L-글루타민산 옥시다아제를 생산하는 능력을 가진 미생물을 이 미생물이 생육할 수 있는 배지에 배양하고, 배양물로부터 상기 L-글루타민산 옥시다아제를 채취하는 것을 특징으로 하는 L-글루타민산 옥시다아제를 채취하는 것을 특징으로 하는 L-글루타민산 옥시다아제의 제조법.

   A. 작용

   하기 일반식과 같은 L-글루타민산 1몰에 대해 1몰의 산소와 1몰의 물을 요하고. 1몰의 α-케토글루타르산, 1몰의 암모닌아 및 1몰의 과산화수소를 생성한다.

   

   L-글루타민산 α-케토글루타르산

   B. 기질특이성

   L-글루타민산에 대한 기질특이성이 높고, L-글루타민 및 L-히스티딘에는 전혀 작용하지 않는다.

   C. 최적 pH

   최적 pH는 pH 7-8.5 부근이다.

   D. pH안정성

   37℃, 60분간 유지의 조건에서는 pH 5.5-10.5의 범위에 있어서 안정이다.

   E. 열안정성

   pH 5.5, 15분간 유지의 조건에 있어서 65℃까지 안정이다.

   F. 분자량

   겔여과법(세파덱스 G-200(파르마시아 파인 케미칼사 제품))으로 측정한 분자량이 135,000±10,000이다.

   G. 보효소

   보효소는 플라빈아데닌디누클레오티드(FAD)이다.

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