JPS592687A - Ｌ−グルタミン酸オキシダ−ゼおよびその製造法 - Google Patents
Ｌ−グルタミン酸オキシダ−ゼおよびその製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（１） 発明の背景
技術分野
本発明は、新規酵素Ｌ−グルタミン酸オキソダーゼ（以
下、「本発明酵素」と略すこともある。）およびその製
造法に関するものである。さらに詳しくはＬ−グルタミ
ン酸に対して強い親和性と高い基質特異性を示し、他の
アミノ酸に対しては実質的にはほとんど作用せず、安定
性の高いＬ−グルタミン酸オキシダーゼおよびその微生
物による製造法に関するものである。
下、「本発明酵素」と略すこともある。）およびその製
造法に関するものである。さらに詳しくはＬ−グルタミ
ン酸に対して強い親和性と高い基質特異性を示し、他の
アミノ酸に対しては実質的にはほとんど作用せず、安定
性の高いＬ−グルタミン酸オキシダーゼおよびその微生
物による製造法に関するものである。
本発明酵素は、Ｌ−グルタミン酸に特異的に作用し、他
のアミノ酸には実質的には作用しないので多種類のアミ
ノ酸を含有する系におけるＬ−グルタミン酸の定量に適
している。例えば、醤油、エキス類なとの食品中におけ
るグルタミン酸含量の測定、グルタミン酸発酵もしくは
醤油の製造などの分野における工程管理もしくは工程分
析またはグルタミン酸生産菌のスクリーニングなどに使
用することができる。また、クルタミナーゼ、グルタミ
ン酸・オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ） 、
グルタミン酸・ピルビン酸トランスアミナーゼなどグル
タミン酸を生成物とする酵素の活性測定を本発明酵素を
使用して容易に行えるので臨床検査もしくは生化学の分
野においても有用である。さらに、本発明酵素は安定性
が高いので酵素電極としてグルタミン酸センサーに利用
スることかでき、酵素免疫測定における標識酵素として
の利用（特開昭５７−８７２６１号公報参照）も期待さ
れる。
のアミノ酸には実質的には作用しないので多種類のアミ
ノ酸を含有する系におけるＬ−グルタミン酸の定量に適
している。例えば、醤油、エキス類なとの食品中におけ
るグルタミン酸含量の測定、グルタミン酸発酵もしくは
醤油の製造などの分野における工程管理もしくは工程分
析またはグルタミン酸生産菌のスクリーニングなどに使
用することができる。また、クルタミナーゼ、グルタミ
ン酸・オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ） 、
グルタミン酸・ピルビン酸トランスアミナーゼなどグル
タミン酸を生成物とする酵素の活性測定を本発明酵素を
使用して容易に行えるので臨床検査もしくは生化学の分
野においても有用である。さらに、本発明酵素は安定性
が高いので酵素電極としてグルタミン酸センサーに利用
スることかでき、酵素免疫測定における標識酵素として
の利用（特開昭５７−８７２６１号公報参照）も期待さ
れる。
従来技術
従来、Ｌ−グルタミン酸に対する基質特異性の高いし一
アミノ酸オキシダーゼとしてはストレプト７ イセス（
３ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ；以下、「Ｓ」と略すこ
ともある。）属に属する微生物、具体的にはストレプト
マイセス・バイオレツセンス（Ｓ。
アミノ酸オキシダーゼとしてはストレプト７ イセス（
３ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ；以下、「Ｓ」と略すこ
ともある。）属に属する微生物、具体的にはストレプト
マイセス・バイオレツセンス（Ｓ。
ｖｉｏｌａｓｃｅｎｓ ）によって生産されるＬ−グル
タミン酸オキシダーゼ（特開昭５７−４８６８５号公報
参照；以下、「公知酵素」と略すこともある。）が知ら
れている。この酵素の蛋白質としての理化学的性質は明
らかではないが、酵素学的性質として記載されている特
徴を挙げると次のとおりである。
タミン酸オキシダーゼ（特開昭５７−４８６８５号公報
参照；以下、「公知酵素」と略すこともある。）が知ら
れている。この酵素の蛋白質としての理化学的性質は明
らかではないが、酵素学的性質として記載されている特
徴を挙げると次のとおりである。
（１） 基質特異性
Ｌ−グルタミン酸に対する活性を１００とした場合、Ｌ
−グルタミンに対して８．４、Ｌ−ヒスチジンに対して
６．８の相対活性を示し、他のアミノ酸に対しては実質
的な活性は示さない。
−グルタミンに対して８．４、Ｌ−ヒスチジンに対して
６．８の相対活性を示し、他のアミノ酸に対しては実質
的な活性は示さない。
（２） 至適ｐＨ
ｐＨ５〜 ６
（８）ｐＨ安定性
ｐＨ８，５〜６．５の範囲（３７°Ｃ，１時間保持）で
安定である。
安定である。
（４） 温度安定性
５０°Ｃまて（１０分間保持）安定である。
（５）阻害剤の影響
水銀イオン、銅イオンおよびジエチルジチオカルバメイ
トによってほぼ完全に阻害される。
トによってほぼ完全に阻害される。
本発明酵素は、公知酵素とは以上の酵素学的性質の全て
の点において異る新規な酵素である。
の点において異る新規な酵素である。
また、前記特許出願公開明細書によれば、公知酵素の生
産には前記微生物を液体培養する方法が好適である旨が
記載されているが、本発明酵素の生産には固体培養法か
好適である。
産には前記微生物を液体培養する方法が好適である旨が
記載されているが、本発明酵素の生産には固体培養法か
好適である。
（Ｉｔ） 発明の概要
！遣
本発明者らは微生物の培養物についてＬ−アミノ酸を酸
化的に脱アミノする酵素を検索したところ、自然界より
新たに分離された放線菌の培養物中にＬ−グルタミン酸
に対する基質特異性が極めて高いし一アミノ酸オキシダ
ーゼが存在することを見出し、このような微生物の培養
物中より本発明酵素を単一の酵素蛋白質として精製単離
し、本発明を完成した。
化的に脱アミノする酵素を検索したところ、自然界より
新たに分離された放線菌の培養物中にＬ−グルタミン酸
に対する基質特異性が極めて高いし一アミノ酸オキシダ
ーゼが存在することを見出し、このような微生物の培養
物中より本発明酵素を単一の酵素蛋白質として精製単離
し、本発明を完成した。
本発明は、Ｌ−グルタミン酸のα−アミノ基を水と酸素
の存在下で酸化的に脱アミノしてα−ケトグルタル酸、
アンモニアおよび過酸化水素を生成する作用を有し、Ｌ
−グルタミン酸に対する基質特異性がきわめて高く、Ｌ
−グルタミンおよびＬ−ヒスチジンには実質的に全く作
用せす、安定性の高いし一アミノ′酸オキシダーゼであ
るし一グルタミン酸オキンダーゼを提供するものである
。
の存在下で酸化的に脱アミノしてα−ケトグルタル酸、
アンモニアおよび過酸化水素を生成する作用を有し、Ｌ
−グルタミン酸に対する基質特異性がきわめて高く、Ｌ
−グルタミンおよびＬ−ヒスチジンには実質的に全く作
用せす、安定性の高いし一アミノ′酸オキシダーゼであ
るし一グルタミン酸オキンダーゼを提供するものである
。
さらに本発明は、ストレプトマイセス（３ｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ）属に属し、前記のＬ−グルタミン酸オキ
シダーゼ生産能を有する微生物を該微生物が生育しうる
培地に培養し、培養物より前記のし一グルタミン酸オキ
シダーゼを採取することを特徴とするＩ、−グルタミン
酸オキノダーゼの製造法をも提供するものである。
ｍｙｃｅｓ ）属に属し、前記のＬ−グルタミン酸オキ
シダーゼ生産能を有する微生物を該微生物が生育しうる
培地に培養し、培養物より前記のし一グルタミン酸オキ
シダーゼを採取することを特徴とするＩ、−グルタミン
酸オキノダーゼの製造法をも提供するものである。
りし限
本発明酵素はＬ−グルタミン酸に特異的に作用し、他の
アミノ酸には実質的にはとんと作用しないので、複数種
のアミノ酸を含有する食品中のＬ−グルタミン酸たけを
特異的に定量する際に有用である。
アミノ酸には実質的にはとんと作用しないので、複数種
のアミノ酸を含有する食品中のＬ−グルタミン酸たけを
特異的に定量する際に有用である。
食品、・特に醤油、各種エキス−類などの液体調味料は
、含有するＬ−グルタミン酸の量がその品質評価の重要
な指標になるが、従来知られている定量法は簡便性、実
用性などの点に難点がある。すなわち、Ｌ−グルタミン
酸を定量する方法としてはクロマトグラフィー法、微生
物定量法、電気泳動法および酵素法か知られているが、
Ｌ−グルタミン酸脱水素酵、素あるいはＬ−クルタミン
酸脱炭酸酵素を用いる酵素法が一般的である。しかし、
これらの既知酵素を用いた方法は厳密な測定条件あるい
は煩雑な操作が要求されることから簡便な方法とはいえ
ない。
、含有するＬ−グルタミン酸の量がその品質評価の重要
な指標になるが、従来知られている定量法は簡便性、実
用性などの点に難点がある。すなわち、Ｌ−グルタミン
酸を定量する方法としてはクロマトグラフィー法、微生
物定量法、電気泳動法および酵素法か知られているが、
Ｌ−グルタミン酸脱水素酵、素あるいはＬ−クルタミン
酸脱炭酸酵素を用いる酵素法が一般的である。しかし、
これらの既知酵素を用いた方法は厳密な測定条件あるい
は煩雑な操作が要求されることから簡便な方法とはいえ
ない。
本発明酵素は特異性が高く、また酵素反応が臨床検査あ
るいは食品分析等において最も広く実用化されているオ
キシダーゼ反応であることから反応生成物の定量も、た
とえば過酸化水素の発色法あるいは酸素電極法などによ
って容易に行える利点かある。
るいは食品分析等において最も広く実用化されているオ
キシダーゼ反応であることから反応生成物の定量も、た
とえば過酸化水素の発色法あるいは酸素電極法などによ
って容易に行える利点かある。
また、本発明酵素は安定性が高いので、酵素電極として
利用することができ、Ｌ−グルタミン酸センサーとして
食品、発酵、臨床検査、生化学などの各種の分野に応用
することもてきる。
利用することができ、Ｌ−グルタミン酸センサーとして
食品、発酵、臨床検査、生化学などの各種の分野に応用
することもてきる。
〔■〕 発明の詳細な説明
後に示す実施例の方法で製造したし一グルタミン酸オキ
ンダーゼの精製酵素標品の酵素学的および理化学的性質
は下記のとおりである。
ンダーゼの精製酵素標品の酵素学的および理化学的性質
は下記のとおりである。
（１） 作用
本発明酵素はＬ−グルタミン酸を基質とした場合、下記
反応式のことくし一グルタミン酸１ｍｏｌにつき、１ｍ
０１の酸素と１ ｍｏｌの水を要求し、１ｍ０１のａ−
ケトグルタル酸、１ｍｏｌのアノモニアおよび１ｍ０１
の過酸化水素を生成する。
反応式のことくし一グルタミン酸１ｍｏｌにつき、１ｍ
０１の酸素と１ ｍｏｌの水を要求し、１ｍ０１のａ−
ケトグルタル酸、１ｍｏｌのアノモニアおよび１ｍ０１
の過酸化水素を生成する。
Ｃ０ＯＨＣ０ＯＨ
ｌ
ＣＨ２ＣＨ２
１
ＣＨ２＋ ０２ ＋ Ｈ２０→ＣＨ２’＋ ＮＨ３＋
Ｈ２Ｏ２Ｉ ＣＨＮＨ２Ｃ＝Ｏ Ｉ Ｃ０ＯＨＣ００Ｈ Ｌ−グルタミン酸 α−ケトグルタル酸（２
）基質特異性 種々のアミノ酸に対して本発明酵素の精製標品を作用さ
せた結果が第１表である。各基質の濃度は１０ ｍＭ
であり、反応はｐＨ７，４（０，１Ｍりん酸カリウム緩
衝液）で行った。酵素活性は後述する酸素電極法により
測定し、Ｌ−グルタミン酸に対する活性の相対値として
表わした。
Ｈ２Ｏ２Ｉ ＣＨＮＨ２Ｃ＝Ｏ Ｉ Ｃ０ＯＨＣ００Ｈ Ｌ−グルタミン酸 α−ケトグルタル酸（２
）基質特異性 種々のアミノ酸に対して本発明酵素の精製標品を作用さ
せた結果が第１表である。各基質の濃度は１０ ｍＭ
であり、反応はｐＨ７，４（０，１Ｍりん酸カリウム緩
衝液）で行った。酵素活性は後述する酸素電極法により
測定し、Ｌ−グルタミン酸に対する活性の相対値として
表わした。
以上のとおり本発明酵素はＬ−グルタミン酸に対する基
質特異性か高く、他のアミノ酸に対してはＬ−アスパラ
ギン酸にわすかな活性（０，６％）を示すたけて、Ｌ−
グルタミンおよびＬ−ヒスチジンを含む他のＬ−アミノ
酸およびＤ−グルタミン酸には実質的には全く活性を示
さない。
質特異性か高く、他のアミノ酸に対してはＬ−アスパラ
ギン酸にわすかな活性（０，６％）を示すたけて、Ｌ−
グルタミンおよびＬ−ヒスチジンを含む他のＬ−アミノ
酸およびＤ−グルタミン酸には実質的には全く活性を示
さない。
以上の本発明酵素に対し、前記のとおり公知酵素はＬ−
アスパラギン酸に対しては活性を示さなｕｌ （０’、
１％以下）が、Ｌ−グルタミンに対して８．４％、Ｌ
−ヒスチジンに対して６８％の活性をそれぞれ示す酵素
であり基質特異性において両者は異る。
アスパラギン酸に対しては活性を示さなｕｌ （０’、
１％以下）が、Ｌ−グルタミンに対して８．４％、Ｌ
−ヒスチジンに対して６８％の活性をそれぞれ示す酵素
であり基質特異性において両者は異る。
なお、本発明酵素のし一グルタミン酸に対するｈ値は２
．ｌＸ１０’Ｍて、Ｌ−アスパラギン酸に対するｉ値は
２．９ ｘ １０−２Ｍ である。
．ｌＸ１０’Ｍて、Ｌ−アスパラギン酸に対するｉ値は
２．９ ｘ １０−２Ｍ である。
（３） 力価の測定
本発明酵素の力価の測定は、酸素電極法で行った。すな
わち、１０ｍＭ のし−グルタミン酸ナトリウムを含む
０．１ Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ７、４） １
ｍｌを酸素電極セルに入れ、１０ ｕｌ！ の酵素液
を添加して酸素消費速度を測定した。８０°Ｃで１分間
に１μｍｏ＋ の酸素を消費する酵素量を１単位（ｌ
ＪｎｉｔＨ本明細書においてｒＵＪと略称する。）とし
た。
わち、１０ｍＭ のし−グルタミン酸ナトリウムを含む
０．１ Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ７、４） １
ｍｌを酸素電極セルに入れ、１０ ｕｌ！ の酵素液
を添加して酸素消費速度を測定した。８０°Ｃで１分間
に１μｍｏ＋ の酸素を消費する酵素量を１単位（ｌ
ＪｎｉｔＨ本明細書においてｒＵＪと略称する。）とし
た。
なお、反応液の溶存酸素濃度は温度の上昇とともに減少
するので高い反応温度での活性測定には上記方法は使用
できない。このような場合にはＭＢＴＨ法（アナリテイ
カル・バイオケミストリー（，４ｎａ１． Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、） 、 ２５ 、２２８ （１９６８）参照）に
よって行う。すなわちＬ−グルタミン酸ナトリウム、カ
タラーゼおよび本発明酵素を含有する反応液を適当温度
で２０分間インキュベートし、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ
）を加えて反応を停止し、この反応停止液に酢酸緩衝
液（１）Ｈ５，Ｏ＋および３−メチル−２−ベンゾチア
ゾロンヒドラゾンハイドロクロライド（ＭＢＴＨ）を加
えて５０°Ｃて３０分間インキュベートした後、室温ま
で冷却して８１６ ｎｍ の吸光度を測定し、検量線か
ら生成したａ−ケトグルタル酸を定量する。
するので高い反応温度での活性測定には上記方法は使用
できない。このような場合にはＭＢＴＨ法（アナリテイ
カル・バイオケミストリー（，４ｎａ１． Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、） 、 ２５ 、２２８ （１９６８）参照）に
よって行う。すなわちＬ−グルタミン酸ナトリウム、カ
タラーゼおよび本発明酵素を含有する反応液を適当温度
で２０分間インキュベートし、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ
）を加えて反応を停止し、この反応停止液に酢酸緩衝
液（１）Ｈ５，Ｏ＋および３−メチル−２−ベンゾチア
ゾロンヒドラゾンハイドロクロライド（ＭＢＴＨ）を加
えて５０°Ｃて３０分間インキュベートした後、室温ま
で冷却して８１６ ｎｍ の吸光度を測定し、検量線か
ら生成したａ−ケトグルタル酸を定量する。
（４） 至適ｐＨ
至適ｐＨは第１図に示すとおり、ｐＨ７〜８．５付近で
ある。各ｐＨにおける酵素活性の測定は、基質としてＬ
−グルタミン酸ナトリウムを使用し、緩衝液として０．
２ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ８，５〜６．０）、０．２Ｍり
ん酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，０〜８５）および０．２
Ｍグリシン−塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液（ｐＨ８，５〜１２．０ ）を使用し、３０°Ｃて行
った。
ある。各ｐＨにおける酵素活性の測定は、基質としてＬ
−グルタミン酸ナトリウムを使用し、緩衝液として０．
２ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ８，５〜６．０）、０．２Ｍり
ん酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，０〜８５）および０．２
Ｍグリシン−塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液（ｐＨ８，５〜１２．０ ）を使用し、３０°Ｃて行
った。
なお、第１図には本発明酵素と公知酵素の至適ｐ）（の
比較のため、本発明酵素（実線）と公知酵素（点線；特
開昭５７−４８６８５号公報の第１図より引用した。）
のｌ）Ｈ活性曲線を併記した。
比較のため、本発明酵素（実線）と公知酵素（点線；特
開昭５７−４８６８５号公報の第１図より引用した。）
のｌ）Ｈ活性曲線を併記した。
第１図から明らかなように本界明酵素は至適ｐＨにおい
ても公知酵素とは相異する。
ても公知酵素とは相異する。
＋５１ ｐ）（安定性
ｐＨ８，５〜１１．５の各ｐＨにおいて８７°０．６０
分間、４５°０．１５分間および６０°Ｃ，１５分間の
各条件で保持した後、 ｐＨ７，４においてグルタミン
酸に対する酵素活性を測定した。
分間、４５°０．１５分間および６０°Ｃ，１５分間の
各条件で保持した後、 ｐＨ７，４においてグルタミン
酸に対する酵素活性を測定した。
その結果、８７°Ｃ３６０分間保持の条件ではｐＨ５．
５〜１０．５の範囲において安定であり（第２図。
５〜１０．５の範囲において安定であり（第２図。
実線）、４５°Ｃ１１５分間保持の条件でもｐＨ５，５
〜 ９．５ の範囲において安定であり（第３図）、６
０°Ｃ１１５分間保持の条件ではｐＨ５，５〜７．５の
範囲において安定であった（第４図）。
〜 ９．５ の範囲において安定であり（第３図）、６
０°Ｃ１１５分間保持の条件ではｐＨ５，５〜７．５の
範囲において安定であった（第４図）。
なお、第２図には本発明酵素と公知酵素のｌ）Ｈ安定性
の比較のため、公知酵素のｐＨ安定曲線（特開昭５７−
４８６８５号公報の第２図より引用し、点線で示した。
の比較のため、公知酵素のｐＨ安定曲線（特開昭５７−
４８６８５号公報の第２図より引用し、点線で示した。
〕を本発明酵素のものと併記した。
以上の第２〜４図から明らかなように、本発明酵素と公
知酵素の安定ｐ）（範囲を比較すると、両者は明らかに
異り、前者の方か後者に比べて広いｐＨ範囲において安
定である。
知酵素の安定ｐ）（範囲を比較すると、両者は明らかに
異り、前者の方か後者に比べて広いｐＨ範囲において安
定である。
（６） 作用適温の範囲
８０°Ｃ〜８０°Ｃの各温度においてＬ−グルタミン酸
ナトリウムを基質として２０分間反応し、前記ＭＢＴＨ
法で酵素活性の測定を行った。
ナトリウムを基質として２０分間反応し、前記ＭＢＴＨ
法で酵素活性の測定を行った。
その結果、本発明酵素の作用適温の範囲は８０〜６０°
Ｃてあり、作用至適温度は５０℃付近であつた（第５図
〕。
Ｃてあり、作用至適温度は５０℃付近であつた（第５図
〕。
（７）熱安定性
４０°Ｃ〜９０°Ｃの各温度においてｐＨ５，５、ｐＨ
７，６およびｐＨ，９，５の各条件で１５分間保持した
後、ｐＨ７，４においてグルタミン酸に対する酵素活性
を測定した。
７，６およびｐＨ，９，５の各条件で１５分間保持した
後、ｐＨ７，４においてグルタミン酸に対する酵素活性
を測定した。
その結果、ｐＨ５，５においては６５°Ｃまて安定てあ
り、８５°Ｃで約５０％の残存活性を示す（第６図、ム
ーム）。ｐＨ７，５においては５０°Ｃまて安定てあり
、７５°Ｃて約６０９６の残存活性を示す（第６図、・
−・）。ｐＨ９，５においても４５°Ｃまて安定であり
、７０°Ｃて約５０％の残存活性を示す（第６図、■−
■）。
り、８５°Ｃで約５０％の残存活性を示す（第６図、ム
ーム）。ｐＨ７，５においては５０°Ｃまて安定てあり
、７５°Ｃて約６０９６の残存活性を示す（第６図、・
−・）。ｐＨ９，５においても４５°Ｃまて安定であり
、７０°Ｃて約５０％の残存活性を示す（第６図、■−
■）。
なお、本発明酵素と公知酵素の熱安定性の比較のため、
公知酵素の温度安定曲線（特開昭５７−４８６８５号公
報の第８図より引用し、点線で示した。）を本発明酵素
のものと併記した。
公知酵素の温度安定曲線（特開昭５７−４８６８５号公
報の第８図より引用し、点線で示した。）を本発明酵素
のものと併記した。
第６図より明らかなように、本発明酵素は公知酵素より
も温度安定性が高い。
も温度安定性が高い。
（８） 阻害、活性化および安定化
本発明酵素に対する種々の添加物質の影響を調べるため
に、第２表に示す各物質１ ｍＭ を含む反応液（ｐＨ
７，４）中で酵素反応を行った。
に、第２表に示す各物質１ ｍＭ を含む反応液（ｐＨ
７，４）中で酵素反応を行った。
その結果は第２表ｉと示すとおりである。
第２表
１）ＥＩｙＴＡ：エチレンジアミン四酢酸２）ＮＥＭ：
Ｎ−エチルマレイミド ８３ ＰＣＭＢ：パラクロロマーキュリベンゾエイト
４）ＤＤＴＣニジエチルジチオカルバメイト５）チロン
：４．５−デヒドロキン−ｍ−ベンゼンンスルホン酸二
ナトリウム 第′２表より明らかなように本発明酵素は、パラクロロ
マーキュリベンゾエイトによって約４５９６阻害される
が、塩化第二銅およびジエチルジチオカルバメイトには
全く阻害されない。一方、公知酵素は塩化第二銅および
ジエチルジチオカルバメイト−こよって完全に阻害され
る。したがって両酵素は阻害剤による影響という点にお
いても相異する。
Ｎ−エチルマレイミド ８３ ＰＣＭＢ：パラクロロマーキュリベンゾエイト
４）ＤＤＴＣニジエチルジチオカルバメイト５）チロン
：４．５−デヒドロキン−ｍ−ベンゼンンスルホン酸二
ナトリウム 第′２表より明らかなように本発明酵素は、パラクロロ
マーキュリベンゾエイトによって約４５９６阻害される
が、塩化第二銅およびジエチルジチオカルバメイトには
全く阻害されない。一方、公知酵素は塩化第二銅および
ジエチルジチオカルバメイト−こよって完全に阻害され
る。したがって両酵素は阻害剤による影響という点にお
いても相異する。
なお、本発明酵素の活性化剤および安定化剤はまだ見出
されていない。
されていない。
（９）紫外線吸収スペクトル（第７図参照）λｍａｘ：
２７８ ｎｍ、８８５ ｎｍ、４６５ ｎｍ肩 ：２
９Ｏｎｍ 付近、４９０１ｍ付近α０）補酵素 本発明酵素を熱処理またはトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）処
理し、遠沈して得られた上清は、その吸収がフラビンア
デニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）と一致し、Ｄ−アミノ
酸オキシダーゼのアポ酵素を活性化したので、本発明酵
素の補酵素がＦＡＤであることが判明した。
２７８ ｎｍ、８８５ ｎｍ、４６５ ｎｍ肩 ：２
９Ｏｎｍ 付近、４９０１ｍ付近α０）補酵素 本発明酵素を熱処理またはトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）処
理し、遠沈して得られた上清は、その吸収がフラビンア
デニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）と一致し、Ｄ−アミノ
酸オキシダーゼのアポ酵素を活性化したので、本発明酵
素の補酵素がＦＡＤであることが判明した。
また、薄層クロマトグラフィーにおけるＲｒ値からもＦ
ＡＤであると同定された。
ＡＤであると同定された。
ＦＡＤは本発明酵素１ｍ０１につき２ｍｏｌ存在するも
のと推定された。
のと推定された。
（１１） ポリアクリルアミドゲル電気泳動および５
ＤＳ−ポリアクリルアミドケル電気泳動 精製された本発明酵素はいずれの方法においても単一バ
ンドを示した。
ＤＳ−ポリアクリルアミドケル電気泳動 精製された本発明酵素はいずれの方法においても単一バ
ンドを示した。
（１２）分子量
本発明酵素の分子量は、セファデックスＧ−２００（フ
ァルマンア・ファインケミカルズ社製）によるゲル濾過
法では１８５，０００± １０，０００と測定された。
ァルマンア・ファインケミカルズ社製）によるゲル濾過
法では１８５，０００± １０，０００と測定された。
（１３） 等電点
アンフオライン（ＬＫＢ社製）を用いた等電点電気泳動
により測定したところ、Ｉ）Ｉは ６２ ててあった。
により測定したところ、Ｉ）Ｉは ６２ ててあった。
（１４１結晶構造および元素分析
本発明酵素は結晶化されていないので測定していない。
（１５） 精製方法
本発明酵素の精製は塩析法、等電点沈澱法、有機溶媒に
よる沈澱法、けいそう土、活性炭なとｉこよる吸着法、
各種クロマトグラフ法等を適宜に組合せて行うことかで
きる。精製方法の具体例は実施例に示すとおりである。
よる沈澱法、けいそう土、活性炭なとｉこよる吸着法、
各種クロマトグラフ法等を適宜に組合せて行うことかで
きる。精製方法の具体例は実施例に示すとおりである。
次に本発明酵素を微生物の培養によって製造する方法を
具体的に示す。
具体的に示す。
使用微生物
本発明酵素の製造に使用される微生物は、ストレプトマ
イセス（３ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）属に属し、本発
明酵素を生産する能力を有する微生物である。
イセス（３ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）属に属し、本発
明酵素を生産する能力を有する微生物である。
このような微生物の具体例としては、千葉県香取郡東庄
町の土壌より分離され、単一の菌株として単離されたＸ
−１１９−６株を挙けることができる。この菌株の菌学
的性質を以下に記載する。
町の土壌より分離され、単一の菌株として単離されたＸ
−１１９−６株を挙けることができる。この菌株の菌学
的性質を以下に記載する。
Ａ 顕微鏡的観察
気菌糸は、直線状でその幅は０，９〜１０μであり、単
純分枝を示す。胞子柄は、多数の胞子の連鎖よりなって
おり、２〜５回転の螺旋を形成する。
純分枝を示す。胞子柄は、多数の胞子の連鎖よりなって
おり、２〜５回転の螺旋を形成する。
胞子はやや惰円形で、その大きさは０９〜１０×１、Ｉ
Ｘｌ、２μであり、電子顕微鏡によって表面はとげ状構
造であることか観察される。基菌糸の分断は認められな
い。
Ｘｌ、２μであり、電子顕微鏡によって表面はとげ状構
造であることか観察される。基菌糸の分断は認められな
い。
Ｂ 肉眼的観察
各種培地における生育（３０℃、１６日間培養）の肉眼
的観察の結果は次のとおりである。
的観察の結果は次のとおりである。
（１）シュークロース 硝酸塩寒天培地その生育は不良
である。基菌糸は灰褐色で寒天中に侵入せず、気菌糸は
粉状で寒天上に放射状に薄く広がる。色は灰褐色で、灰
色の胞子を形成する。培地中への色素の生成は認められ
ない。
である。基菌糸は灰褐色で寒天中に侵入せず、気菌糸は
粉状で寒天上に放射状に薄く広がる。色は灰褐色で、灰
色の胞子を形成する。培地中への色素の生成は認められ
ない。
（２）グルコース・アスパラギン寒天培地その生育は良
、好である。基菌糸は白黄色で寒天中に侵入するととも
に わずかに盛り上る。気菌糸は白色で、貧弱であり、
培地中への色素の生成は認められない。
、好である。基菌糸は白黄色で寒天中に侵入するととも
に わずかに盛り上る。気菌糸は白色で、貧弱であり、
培地中への色素の生成は認められない。
（３）グリセリン アスパラギン寒天培地その生育は良
好である。基菌糸は白黄色で、寒天中に侵入するととも
に 盛り上る。気菌糸は形成されず、培地への色素の生
成も認められない。
好である。基菌糸は白黄色で、寒天中に侵入するととも
に 盛り上る。気菌糸は形成されず、培地への色素の生
成も認められない。
（４）澱粉・無機塩寒天培地
その生育は良好である。基菌糸は白黄色で、寒天中に侵
入するとともに 盛り上る。気菌糸は白色で、豊富であ
り、灰色の胞子を着生する。培地中への色素の生成は認
められない。
入するとともに 盛り上る。気菌糸は白色で、豊富であ
り、灰色の胞子を着生する。培地中への色素の生成は認
められない。
（５）チロシン寒天培地
その生育は良好である。基菌糸は白黄色である。
気菌糸は白色で、豊富であり、灰色の胞子を着生する。
培地中への色素の生成は認められない。
（６）栄養寒天培地
その生育は極めて良好である。基菌糸は白黄色で寒天中
に侵入するとともに 盛り上る。気菌糸は白色で、胞子
の着生は認められない。培地中への色素の生成も認めら
れない。
に侵入するとともに 盛り上る。気菌糸は白色で、胞子
の着生は認められない。培地中への色素の生成も認めら
れない。
（７）イースト 麦芽寒天培地
その生育は極めて良好である。基菌糸は白黄色で、寒天
中に侵入するとともに 盛り上る。気菌糸は白色で、豊
富であり、灰色の胞子を着生する。
中に侵入するとともに 盛り上る。気菌糸は白色で、豊
富であり、灰色の胞子を着生する。
培地中への色素の生成は認められない。
（８）オートミール寒天培地
その生育は極めて良好である。基菌糸は白色で、寒天中
に侵入するか、培地上には盛り上らない。
に侵入するか、培地上には盛り上らない。
気菌糸は白色で、豊富であり、灰色の胞子を着生する。
培地中への色素の生成は認められない。
Ｃ生理的性質
が最適である。
チロシン寒天培地およびペプトン・イースト・鉄寒天培
地では、共にメラニン様色素は生成せず、ゼラチンをわ
ずかに液化し、澱粉を加水分解する。
地では、共にメラニン様色素は生成せず、ゼラチンをわ
ずかに液化し、澱粉を加水分解する。
Ｄ、各種炭素源の同化性
プリドハム・ゴドリーブ寒天培地上での各種炭素源の利
用性は第８表のとおりである。
用性は第８表のとおりである。
第３表
※ ＋（利用、する。）−（利用しない。）以上の性状
を要約すると次のとおりである。すなわち、気菌糸は螺
旋状で、胞子の表面はとげ状である。培地上での発育て
は白黄色または灰褐色を呈し、気菌糸は白色〜灰褐色で
、溶解性の色素およびメラニン様色素の生成は認められ
ない。また、スターチ氷解性は強い方である。
を要約すると次のとおりである。すなわち、気菌糸は螺
旋状で、胞子の表面はとげ状である。培地上での発育て
は白黄色または灰褐色を呈し、気菌糸は白色〜灰褐色で
、溶解性の色素およびメラニン様色素の生成は認められ
ない。また、スターチ氷解性は強い方である。
これらの結果と第３表に示した炭素源の同化性を基準に
バージニーズ マニュアル オブ・ディタミネーテイブ
バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ ’ｓＭａｎｕａｌ
ｏｆ Ｏｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ １３ａｃｉｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ ） 第８版（１９７４年）における分
類体系に従って本菌株の同定を行ったところ、本菌株は
ストレプトマイセス属に属するか、本菌株の特徴に十分
に合致する公知の種は見出せず、本菌株を新菌株である
と同定し、ストレプトマイセス エスピー Ｘ−１１９
−６（ＳｌｒｅｐｔｏｍｙｃｅＳ Ｓｐ、 Ｘ −１１
９−６）と命名した。
バージニーズ マニュアル オブ・ディタミネーテイブ
バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ ’ｓＭａｎｕａｌ
ｏｆ Ｏｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ １３ａｃｉｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ ） 第８版（１９７４年）における分
類体系に従って本菌株の同定を行ったところ、本菌株は
ストレプトマイセス属に属するか、本菌株の特徴に十分
に合致する公知の種は見出せず、本菌株を新菌株である
と同定し、ストレプトマイセス エスピー Ｘ−１１９
−６（ＳｌｒｅｐｔｏｍｙｃｅＳ Ｓｐ、 Ｘ −１１
９−６）と命名した。
本菌株について、昭和５６年通商産業省告示第１７８号
に従って工業技術院微生物工業技術研究所に対して寄託
申請を行い、昭和５７年６月５日付けで受託され、受託
番号として微工研菌寄第６５６０号（ＦＥＲＭ Ｐ−
６５６０）か付与されている。
に従って工業技術院微生物工業技術研究所に対して寄託
申請を行い、昭和５７年６月５日付けで受託され、受託
番号として微工研菌寄第６５６０号（ＦＥＲＭ Ｐ−
６５６０）か付与されている。
上記菌株は本発明酵素の生産能の高い菌株の一例であり
、本発明の使用微生物はこれに限定されるものではない
。また、このような本発明酵素生産菌を通常の微生物突
然変異誘導法、たとえば紫外線、Ｘ線、ｒ線照射なとの
物理的処理、ニトロソグアニジンなとの薬剤による化学
的処理な、との処理法によって変異させて得られた本発
明酵素の高生産性突然変異株のいずれをも好適に使用で
きる。さらに本発明の製造法の目的は基本的には、前記
微生物の本発明酵素の生産に関する遺伝情報を担う遺伝
子デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）による酵素蛋白の合成機
能を利用することにある。したかって、このような遺伝
子ＤＮＡを適当なベクターに組み込み、前記以外の属の
微生物へ形質転換により移入させるか、または遺伝子Ｄ
ＮＡをプロトプラスト法による細胞融合によって他属微
生物に取り込ませるなと遺伝子操作的手法によって得た
微生物による本発明酵素の製造法も本発明の範囲番こ包
含される。
、本発明の使用微生物はこれに限定されるものではない
。また、このような本発明酵素生産菌を通常の微生物突
然変異誘導法、たとえば紫外線、Ｘ線、ｒ線照射なとの
物理的処理、ニトロソグアニジンなとの薬剤による化学
的処理な、との処理法によって変異させて得られた本発
明酵素の高生産性突然変異株のいずれをも好適に使用で
きる。さらに本発明の製造法の目的は基本的には、前記
微生物の本発明酵素の生産に関する遺伝情報を担う遺伝
子デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）による酵素蛋白の合成機
能を利用することにある。したかって、このような遺伝
子ＤＮＡを適当なベクターに組み込み、前記以外の属の
微生物へ形質転換により移入させるか、または遺伝子Ｄ
ＮＡをプロトプラスト法による細胞融合によって他属微
生物に取り込ませるなと遺伝子操作的手法によって得た
微生物による本発明酵素の製造法も本発明の範囲番こ包
含される。
培養方法および条件
前記使用微生物の培養方法および条件は、該微生物が良
好に生育し、本発明酵素が十分に生産される方法および
条件であれば特に限定されないが、固体培養法もしくは
それに準する方法が好適である。
好に生育し、本発明酵素が十分に生産される方法および
条件であれば特に限定されないが、固体培養法もしくは
それに準する方法が好適である。
固体培養に使用する固体培地は通常使用されるものと何
ら変らない。すなわち、固体培地とはフスマ、脱脂大豆
、米ヌカ、トウモロコシ、菜種粕小麦、米、もみがら等
の天然固体原料の単独あるいは二種以上の組合せたもの
を主体とし、さらに必要に応じて本発明の使用微生物が
資化可能な栄養源、たとえばグツ−コース、シュークロ
ース、アラビノース、フラクトース、マンニトール、イ
ノシトール、 可溶性澱粉、エタノール等の炭素源、各
種アミノ酸、ペプトン、大豆粉、蛋白質加水分解物、コ
ーンステイープリカー、肉エキス、酵母エキス、各種ア
ンモニウム塩、各種硝酸塩、尿素等の窒素源、各種のナ
トリウム塩、カリウム塩。
ら変らない。すなわち、固体培地とはフスマ、脱脂大豆
、米ヌカ、トウモロコシ、菜種粕小麦、米、もみがら等
の天然固体原料の単独あるいは二種以上の組合せたもの
を主体とし、さらに必要に応じて本発明の使用微生物が
資化可能な栄養源、たとえばグツ−コース、シュークロ
ース、アラビノース、フラクトース、マンニトール、イ
ノシトール、 可溶性澱粉、エタノール等の炭素源、各
種アミノ酸、ペプトン、大豆粉、蛋白質加水分解物、コ
ーンステイープリカー、肉エキス、酵母エキス、各種ア
ンモニウム塩、各種硝酸塩、尿素等の窒素源、各種のナ
トリウム塩、カリウム塩。
カルシウム塩、マンガン塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、
鉄塩、りん酸塩、硫酸塩等の塩類、サイアミン、リボフ
ラビン、ニコチン酸、パントテン酸。
鉄塩、りん酸塩、硫酸塩等の塩類、サイアミン、リボフ
ラビン、ニコチン酸、パントテン酸。
ビオチン、ｐ−アミノ安息香酸、ビタミン８１２ 等の
発育素を適宜添加した培地、またはこれらを適宜な配合
、太き−さ、形状に造粒した培地などである。このよう
な固体培地は常法により滅菌あるいは変性処理し、種菌
を接種して固体培養を行う。
発育素を適宜添加した培地、またはこれらを適宜な配合
、太き−さ、形状に造粒した培地などである。このよう
な固体培地は常法により滅菌あるいは変性処理し、種菌
を接種して固体培養を行う。
また、上記以外の培養法、たとえばスポンジ等の適宜の
担体に液体培地を吸収または被覆しく特開昭４９〜１４
６７９号公報参照）、種菌を接種して培養する方法であ
っても使用微生物が繁殖し、本発明酵素を良好に生産す
る限り採用できる。
担体に液体培地を吸収または被覆しく特開昭４９〜１４
６７９号公報参照）、種菌を接種して培養する方法であ
っても使用微生物が繁殖し、本発明酵素を良好に生産す
る限り採用できる。
培養条件は使用微生物の種類に応して酵素の生産に最適
の条件を選択すればよく、特に限定されない。通常、た
とえば２０〜８０°Ｃ，１）Ｈ５〜７て５〜１５日間培
養すればよい。
の条件を選択すればよく、特に限定されない。通常、た
とえば２０〜８０°Ｃ，１）Ｈ５〜７て５〜１５日間培
養すればよい。
本発明酵素の採取
使用微生物の培養により生産された本発明酵素は、適当
な抽出法により培養物、すなわち培地および／または培
養菌体から抽出分離され、そのまま粗酵素液として使用
するか、あるいは前記したとおり通常の酵素精製法に従
って使用目的に応じた精製段階に精製される。
な抽出法により培養物、すなわち培地および／または培
養菌体から抽出分離され、そのまま粗酵素液として使用
するか、あるいは前記したとおり通常の酵素精製法に従
って使用目的に応じた精製段階に精製される。
抽出法は、特に限定されず、常法により行われる。たと
えば、固体培養物からの抽出は、通常、水または緩衝液
多こより行われる。また、菌体内の本発明酵素は常法に
より菌体を破砕し、可溶化して抽出する。
えば、固体培養物からの抽出は、通常、水または緩衝液
多こより行われる。また、菌体内の本発明酵素は常法に
より菌体を破砕し、可溶化して抽出する。
以下、本発明における培養法および培養条件ならびに酵
素の抽出法および精製法の具体的−例を実施例として示
す。たたし、本発明はこの実施例に限定されるものでは
ない。
素の抽出法および精製法の具体的−例を実施例として示
す。たたし、本発明はこの実施例に限定されるものでは
ない。
実施例
５００ｍ１容三角フラスコにフスマ２０ｇおよび水１６
ｍ１を入れ、１２０°Ｃ１８０分間加圧滅菌して調製し
たフスマ培地にストレプトマイセス・エスピー Ｘ−１
１９−６（微工研菌第６５６０号）を植菌し、２８°Ｃ
，７日間培養して種菌を調製した。
ｍ１を入れ、１２０°Ｃ１８０分間加圧滅菌して調製し
たフスマ培地にストレプトマイセス・エスピー Ｘ−１
１９−６（微工研菌第６５６０号）を植菌し、２８°Ｃ
，７日間培養して種菌を調製した。
５／容三角フラスコ２５本にそれぞれフスマ２００９お
よび水１６０肩ｔを入れ、１２０’Ｃ，８０分間加圧滅
菌した後、前記の種菌を無菌的に接種し、２８°Ｃて２
日間培養後、温度を２０°Ｃに下げてさらに２週間培養
した。
よび水１６０肩ｔを入れ、１２０’Ｃ，８０分間加圧滅
菌した後、前記の種菌を無菌的に接種し、２８°Ｃて２
日間培養後、温度を２０°Ｃに下げてさらに２週間培養
した。
得られた培養物を８７．５１の水に１時間浸漬した後、
濾過し、さらにけいそう土を通過させて粗酵素液約８４
ｆｆを得た。この粗酵素−液に硫酸アンモニウムを５０
９６飽和まで加え、生成した沈澱を遠沈採取して０．０
２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）３９１に溶解し、５７°
Ｃで３０分間加熱した。この熱処理した酵素液を５６Ｃ
以下に冷却後、２倍量の予め冷却したエタノールを加え
、生成した沈澱を遠沈採取してＯ，０，２Ｍりん酸緩衝
液（ｐＨ７，４）２１に溶解し、同一緩衝液で一夜透析
した。透析中に生成した沈澱を遠沈除去し、上清液を同
一緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ （ジエチルアミノエチ
ル）−セルロースカラム（８，５ｘ５０ｚ）に通し、吸
着した酵素を食塩０．８５ Ｍを含む同一緩衝液を用い
て溶出した。溶出された活性区分を集め、０．０５Ｍの
食塩を含ム０．０５ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）で−
夜透析した。この透析内液を同一緩衝液て平衝化したＤ
ＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア・ファ
インケミカルズ社製）カラム（２Ｘ１０α）に通し、吸
着した酵素を食塩０．０５〜０７５Ｍのリニアグラジェ
ット法で溶出した。溶出された活性区分を集め、透析濃
縮後、セファデックスＧ−２００（ファルマノア・ファ
インケミカルズ社製）カラム（２，５ｘ １２０ＱＩ＋
）を用いてゲル濾過を行い、活性区分を集めて濃縮後、
００２Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）で透析し
た。この透析内液を遠沈し１、上清液を精密濾過した後
、凍結乾燥してＬ−グルタミン酸オキノダーゼの精製標
品（比活性５５．ＩＵ／■蛋白。
濾過し、さらにけいそう土を通過させて粗酵素液約８４
ｆｆを得た。この粗酵素−液に硫酸アンモニウムを５０
９６飽和まで加え、生成した沈澱を遠沈採取して０．０
２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）３９１に溶解し、５７°
Ｃで３０分間加熱した。この熱処理した酵素液を５６Ｃ
以下に冷却後、２倍量の予め冷却したエタノールを加え
、生成した沈澱を遠沈採取してＯ，０，２Ｍりん酸緩衝
液（ｐＨ７，４）２１に溶解し、同一緩衝液で一夜透析
した。透析中に生成した沈澱を遠沈除去し、上清液を同
一緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ （ジエチルアミノエチ
ル）−セルロースカラム（８，５ｘ５０ｚ）に通し、吸
着した酵素を食塩０．８５ Ｍを含む同一緩衝液を用い
て溶出した。溶出された活性区分を集め、０．０５Ｍの
食塩を含ム０．０５ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）で−
夜透析した。この透析内液を同一緩衝液て平衝化したＤ
ＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア・ファ
インケミカルズ社製）カラム（２Ｘ１０α）に通し、吸
着した酵素を食塩０．０５〜０７５Ｍのリニアグラジェ
ット法で溶出した。溶出された活性区分を集め、透析濃
縮後、セファデックスＧ−２００（ファルマノア・ファ
インケミカルズ社製）カラム（２，５ｘ １２０ＱＩ＋
）を用いてゲル濾過を行い、活性区分を集めて濃縮後、
００２Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）で透析し
た。この透析内液を遠沈し１、上清液を精密濾過した後
、凍結乾燥してＬ−グルタミン酸オキノダーゼの精製標
品（比活性５５．ＩＵ／■蛋白。
収率１８．４％）８（１＋ｇを得た。
第１図は本発明酵素（実線）と公知酵素（点線）の作用
ｐＨ範囲を示す。 第２図は本発明酵素（実線）と公知酵素（点線）の安定
ｐＨ範囲（３７°Ｃ１６０分間保持）を示す。 第３図は本発明酵素の安定ｐＨ範囲（４５°Ｃ１５分間
保持）を示す。 第４図は本発明酵素の安定ｐＨ範囲（６０°０゜１５分
間）を示す。 第５図は本発明酵素の作用適温範囲を示す。 第６図は本発明酵素（実線）と公知酵素（点線２０−○
）の安定温度範囲を示す。第６図においてムームはｐＨ
５，５、・−・はｐＨ７，５、−一一はｐＨ９，５の各
条件における温度安定曲線を示す。 第７図は本発明酵素の紫外線吸収スペクトルを示す。 特許出願人 （６７７）ヤマサ醤浦株式会社第１図 第２図 第７図 第５図 第６図 １ 噴 手続補正書（自発） 昭和５７年７月７日 特許庁長官 若 杉和夫 殿 １、 事件の表示 昭和５７年６月２９日提出の特許願 ２、発明の名称 Ｌ−グルタミン酸オキンダーゼおよびその製造法３、補
正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 （郵便番号 ２８８〕 千葉県銚子市新生町２丁目１０番地の１電話 ０４７
９（２２）００９５（代表）４、 補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ５ 補正の内容 １）明細書第１１頁上から第１〜８行目に「各基質の濃
度は１０ ｍＭであり、反応はｐＨ７，４（（１，’Ｉ
Ｍりん酸、カリウム緩衝液）およびｐＨ６，０＜０．１
Ｍ酢酸緩衝液）で行った。」と訂正する。 ２）明細書第１１頁の「第１表」を次のとおり訂正する
。 ３）明細書第１２頁上から第２〜６行目に「他のアミノ
酸に対してはＬ−アスパラギン酸−−−−−−−−〜−
−−全く活性を示さない。」とあるのを次のとおり訂正
する。 「他のアミノ酸に対しては、ｐＨ７，４においてＬ−ア
スパラギン酸にわすかな活性（０６％）を示すたけて、
Ｌ−グルタミン酸およびＬ−ヒスチジンを含む他のし一
アミノ酸およびＤ−グルタミン本番こけ実質的には全く
活性を示さす、ｐＨ６，０においてはＬ−アスパラギン
酸に対しても実質的に活性を示さない。」 ４）明細書第１２頁下から第７行目の１２１×１０−４
Ｍ−’−”’ｉの前および同頁下から第一６行目のｒ
２．９ Ｘ １０−２ Ｍ−−−ｉの前にそれぞれｒ
ｐＨ７，４において」を加入する。 ５）明細書第１４頁下から第７行目のｒ−一−−−−−
−公知酵素とは相違する。」と同頁下から第６行目の１
１５１ ｐＨ安定性」の間に次の文章を加入する。 「 また、アスパラギン酸を基質とした場合の作用１）
Ｈ範囲は狭く、至適１）Ｈは７〜８であるが、ｐＨ６，
’ｏ以下および ｌ）Ｈ１０，０以上においてはＬ−ア
スパラギン酸に対してほとんど作用しない（ｐＨ６，０
においてグルタミン酸に対する活性の０．１％以下）。 」 手続補正書（自発） １、事件の表示 昭和５７年特許願第１１２２７１号 ２、 発明の名称 Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼおよびその製造法３、
補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 （郵便番号 ２８８） 千葉県銚子市新生町２丁目１０番地の１電話 ０４７
９ （２２）００９５ （代表）ｒ ｆｉｌｌ ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動およびＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動精製された本発明酵素はいずれの
方法においても単一バンドを示した。」とあるのを ｒ ｆｉｌｌ ポリアクリルアミドゲル電気泳動精製
された本発明酵素は単一バンドを示した。」と訂正する
。
ｐＨ範囲を示す。 第２図は本発明酵素（実線）と公知酵素（点線）の安定
ｐＨ範囲（３７°Ｃ１６０分間保持）を示す。 第３図は本発明酵素の安定ｐＨ範囲（４５°Ｃ１５分間
保持）を示す。 第４図は本発明酵素の安定ｐＨ範囲（６０°０゜１５分
間）を示す。 第５図は本発明酵素の作用適温範囲を示す。 第６図は本発明酵素（実線）と公知酵素（点線２０−○
）の安定温度範囲を示す。第６図においてムームはｐＨ
５，５、・−・はｐＨ７，５、−一一はｐＨ９，５の各
条件における温度安定曲線を示す。 第７図は本発明酵素の紫外線吸収スペクトルを示す。 特許出願人 （６７７）ヤマサ醤浦株式会社第１図 第２図 第７図 第５図 第６図 １ 噴 手続補正書（自発） 昭和５７年７月７日 特許庁長官 若 杉和夫 殿 １、 事件の表示 昭和５７年６月２９日提出の特許願 ２、発明の名称 Ｌ−グルタミン酸オキンダーゼおよびその製造法３、補
正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 （郵便番号 ２８８〕 千葉県銚子市新生町２丁目１０番地の１電話 ０４７
９（２２）００９５（代表）４、 補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ５ 補正の内容 １）明細書第１１頁上から第１〜８行目に「各基質の濃
度は１０ ｍＭであり、反応はｐＨ７，４（（１，’Ｉ
Ｍりん酸、カリウム緩衝液）およびｐＨ６，０＜０．１
Ｍ酢酸緩衝液）で行った。」と訂正する。 ２）明細書第１１頁の「第１表」を次のとおり訂正する
。 ３）明細書第１２頁上から第２〜６行目に「他のアミノ
酸に対してはＬ−アスパラギン酸−−−−−−−−〜−
−−全く活性を示さない。」とあるのを次のとおり訂正
する。 「他のアミノ酸に対しては、ｐＨ７，４においてＬ−ア
スパラギン酸にわすかな活性（０６％）を示すたけて、
Ｌ−グルタミン酸およびＬ−ヒスチジンを含む他のし一
アミノ酸およびＤ−グルタミン本番こけ実質的には全く
活性を示さす、ｐＨ６，０においてはＬ−アスパラギン
酸に対しても実質的に活性を示さない。」 ４）明細書第１２頁下から第７行目の１２１×１０−４
Ｍ−’−”’ｉの前および同頁下から第一６行目のｒ
２．９ Ｘ １０−２ Ｍ−−−ｉの前にそれぞれｒ
ｐＨ７，４において」を加入する。 ５）明細書第１４頁下から第７行目のｒ−一−−−−−
−公知酵素とは相違する。」と同頁下から第６行目の１
１５１ ｐＨ安定性」の間に次の文章を加入する。 「 また、アスパラギン酸を基質とした場合の作用１）
Ｈ範囲は狭く、至適１）Ｈは７〜８であるが、ｐＨ６，
’ｏ以下および ｌ）Ｈ１０，０以上においてはＬ−ア
スパラギン酸に対してほとんど作用しない（ｐＨ６，０
においてグルタミン酸に対する活性の０．１％以下）。 」 手続補正書（自発） １、事件の表示 昭和５７年特許願第１１２２７１号 ２、 発明の名称 Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼおよびその製造法３、
補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 （郵便番号 ２８８） 千葉県銚子市新生町２丁目１０番地の１電話 ０４７
９ （２２）００９５ （代表）ｒ ｆｉｌｌ ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動およびＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動精製された本発明酵素はいずれの
方法においても単一バンドを示した。」とあるのを ｒ ｆｉｌｌ ポリアクリルアミドゲル電気泳動精製
された本発明酵素は単一バンドを示した。」と訂正する
。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １） Ｌ−グルタミン酸のα−アミノ基を水と酸素の
存在下で酸化的に脱アミノしてα−ケトグルタル酸、ア
ンモニアおよび過酸化水素を生成するイ乍用を有し、Ｌ
−グルタミン酸に対する基質特異ｆ生がきわめて高く、
Ｌ−グルタミンおよびＬ−ヒスチジンには実質的に全く
作用せす、安定性の高（ＮＬ−アミノ酸オキシダーゼで
あるし一グルタミン酸オキシダーゼ。 ２）安定ｐＨ範囲が、３７°Ｃ９６０分間の保持条件に
おいてｐＨ５，５〜１０．５の範囲である特許請求の範
囲第１項記載のし一グルタミン酸オキシダーゼ。 ８）安定温度範囲が、ｐＨ５，５，１５分間の保持条件
において６５°Ｃまでである特許請求の範囲第１または
２項記載のし一グルタミン酸オキシダーゼ。 ４）至適ｐＨがｐＨ７〜８，５付近である特許請求の範
囲第１〜８項のいずれかに記載のし一グルタミン酸オキ
シダーゼ。 ５）塩化第二銅およびジエチルジチオカルバメイトによ
って阻害されない特許請求の範囲第１〜４項のいずれか
に記載のし一グルタミン酸オキシダーゼ。 ６）補酵素がフラビンアデニンジ゛ヌクレオチドである
特許請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のＬ−グル
タミン酸オキシダーゼ。 ７）ゲル濾過法て測定した分子量が１８５，０００±１
０．０００ である特許請求の範囲第１〜６項のいず
れかに記載のし一グルタミン酸オキシダーゼ。 ８）ストレプトマイセス馬番と属し、Ｌ−グルタミン酸
に対する基質特異性がきわめて高く、Ｌ−グルタミンお
よびＬ−ヒスチジンには実質的に全く會 作用せず、安定性が高いという特徴を有するし一グルタ
ミン酸オキシダーゼを生産する能力を有する微生物を、
該微生物が生育しうる培地に培養し、培養物より前記Ｌ
−グルタミン酸オキシダーゼを採取することを特徴とす
るし一グルタミン酸オキンダーゼの製造法。
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57112271A JPS592687A (ja) | 1982-06-29 | 1982-06-29 | Ｌ−グルタミン酸オキシダ−ゼおよびその製造法 |
| AU16215/83A AU565635B2 (en) | 1982-06-29 | 1983-06-24 | L-glutamic acid oxidase |
| AT83106258T ATE41674T1 (de) | 1982-06-29 | 1983-06-27 | L-glutaminsaeure-oxidase, ihre gewinnung und ihre verwendung. |
| DE8383106258T DE3379467D1 (en) | 1982-06-29 | 1983-06-27 | L-glutamic acid oxidase, its production, and its use |
| EP83106258A EP0097949B1 (en) | 1982-06-29 | 1983-06-27 | L-glutamic acid oxidase, its production, and its use |
| ES523668A ES8500991A1 (es) | 1982-06-29 | 1983-06-28 | Un acido l-glutamico oxidasa. |
| US06/509,226 US4623626A (en) | 1982-06-29 | 1983-06-28 | L-glutamic acid oxidase and its production |
| KR1019830002917A KR890002412B1 (ko) | 1982-06-29 | 1983-06-28 | L-글루타민산 옥시다아제의 제조법 |
| CA000431424A CA1208581A (en) | 1982-06-29 | 1983-06-29 | L-glutamic acid oxidase, its production, and its use |
| KR1019890005399A KR890003087B1 (ko) | 1982-06-29 | 1989-04-24 | L- 글루타민산의 분석용 키드 및 바이오센서 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57112271A JPS592687A (ja) | 1982-06-29 | 1982-06-29 | Ｌ−グルタミン酸オキシダ−ゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS592687A true JPS592687A (ja) | 1984-01-09 |
| JPS6126357B2 JPS6126357B2 (ja) | 1986-06-20 |
Family
ID=14582521
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57112271A Granted JPS592687A (ja) | 1982-06-29 | 1982-06-29 | Ｌ−グルタミン酸オキシダ−ゼおよびその製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4623626A (ja) |
| JP (1) | JPS592687A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61209129A (ja) * | 1985-03-01 | 1986-09-17 | Tokuyama Soda Co Ltd | 部分的に微多孔性を有するシ−トの製造方法 |
| JPH03501393A (ja) * | 1987-09-30 | 1991-03-28 | ダナクロン アクティーゼルスカブ | 強化用繊維と該強化用繊維の製造方法 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10023836B2 (en) * | 2012-08-24 | 2018-07-17 | Yamaguchi University | Medium for yeasts |
| GB201412131D0 (en) | 2014-07-08 | 2014-08-20 | Ucl Business Plc | Diagnostics |
| CN106337039A (zh) * | 2016-08-27 | 2017-01-18 | 山东民强生物科技股份有限公司 | 利用菌株mqo‑160制备l‑谷氨酸氧化酶的方法 |
| CN106148434A (zh) * | 2016-08-27 | 2016-11-23 | 山东民强生物科技股份有限公司 | 一种微生物酶法生产a‑酮戊二酸的方法 |
| CN106148433A (zh) * | 2016-08-27 | 2016-11-23 | 山东民强生物科技股份有限公司 | 制备a‑酮戊二酸的转化培养方法 |
| JP6349452B1 (ja) | 2017-11-29 | 2018-06-27 | ヤマサ醤油株式会社 | Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物 |
| CN109576237A (zh) * | 2019-01-04 | 2019-04-05 | 南京工业大学 | L-谷氨酸氧化酶固体酶制剂及其制备方法 |
-
1982
- 1982-06-29 JP JP57112271A patent/JPS592687A/ja active Granted
-
1983
- 1983-06-28 US US06/509,226 patent/US4623626A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61209129A (ja) * | 1985-03-01 | 1986-09-17 | Tokuyama Soda Co Ltd | 部分的に微多孔性を有するシ−トの製造方法 |
| JPH0329250B2 (ja) * | 1985-03-01 | 1991-04-23 | Tokuyama Soda Kk | |
| JPH03501393A (ja) * | 1987-09-30 | 1991-03-28 | ダナクロン アクティーゼルスカブ | 強化用繊維と該強化用繊維の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6126357B2 (ja) | 1986-06-20 |
| US4623626A (en) | 1986-11-18 |
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