CN106148433A - 制备a‑酮戊二酸的转化培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备a‑酮戊二酸的转化培养方法，在pH为8.5的磷酸缓冲液中，添加L‑谷氨酸氧化酶或者L‑谷氨酸氧化酶的粗酶液、H2O2酶和MnCl2以及底物L‑谷氨酸钠，37℃，200r/min 转化 24 h，即得含a‑酮戊二酸的转化液。本发明克服了L‑谷氨酸氧化酶转化法生产a‑酮戊二酸的瓶颈，价格低廉易得，工艺简单，产品纯度高。

Description

制备a-酮戊二酸的转化培养方法
技术领域
本发明涉及制备a-酮戊二酸的转化培养方法，属于微生物技术领域。
背景技术
L-谷氨酸氧化酶（EC 1.4.3.11，L-glutamate oxidase，GLOD）是以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅酶的一种L-氨基酸氧化酶，是80年代初开始发现的一种新酶，最早从蛇的毒液、鼠的肾脏、无脊椎动物和微生物等生物体中分离纯化得到。L-谷氨酸氧化酶能在不添加外源性辅助因子的条件下氧化L-谷氨酸脱氨，生成α-酮戊二酸和过氧化氢。GLOD 对催化反应底物有高度的立体异构选择性，催化效率高，反应条件温和，已被广泛用于食品、轻工、化工、医药、环保、能源和科研等各个领域。该酶自 20 世纪 80 年代被发现以来，一直是工具酶研究的热点之一。现阶段酶的主要研究集中在，一是借由现代的观察及测定手段研究酶的结构以及作用机制，二是利用酶的特性以及工程学的方法研究如何利用酶来服务于人类的生产、生活。
近年来，国内外科学家先后分别从土壤中分离到能产生 GLOD 的链霉菌、放线菌，并建立了较完善的液体发酵产酶体系，制备了 GLOD 粗品，通过对其酶学性质进行研究，纯化得到的该酶都具有以下特性： 能专一性地催化L-谷氨酸生成过氧化氢、氨和a-酮戊二酸。目前，GLOD 发酵生产距工业化生产还有很大距离，这在很大程度上限制了其应用。因此需要进一步研究其发酵工艺，通过工艺优化，改进发酵培养基成分和发酵条件，创造适合菌体生长和生物代谢的最佳条件，充分发挥菌种的生产潜力，显著提高发酵产量。
L-谷氨酸氧化酶一方面可以应用到测定 L-谷氨酸及其偶联反应；另一方面则可以用于a-酮戊二酸的制备，进而制备L-谷氨酸-a-酮戊二酸。国内目前为止还没有厂家对其进行生产，国外也只有一家生产重组于大肠杆菌的 L-谷氨酸氧化酶。价格的昂贵、来源的单一，严重制约着 L-谷氨酸氧化酶的应用和发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备a-酮戊二酸的转化培养方法，本发明克服了L-谷氨酸氧化酶转化法生产a-酮戊二酸的瓶颈，转化效率过，价格低廉易得，工艺简单，产品纯度高。
制备a-酮戊二酸的转化培养方法，在pH为8.5的磷酸缓冲液中，添加L-谷氨酸氧化酶或者L-谷氨酸氧化酶的粗酶液、H2O2酶和MnCl2以及底物L-谷氨酸钠，37℃，200r/min 转化 24 h，即得含a-酮戊二酸的转化液。优选的，磷酸缓冲液的终浓度为50mmol，L-谷氨酸氧化酶的终浓度为15U/ml, H2O2酶的终浓度为20U/ml、MnCl2的终浓度为5mmol，L-谷氨酸钠的终浓度为10%（质量分数）。
本发明中，利用菌株 MQO-160 制备L-谷氨酸氧化酶粗酶液的方法，具体如下：
（1）斜面培养：将菌株 MQO-160 在无菌条件下接种到斜面培养基上进行倒置培养，培养温度为28℃，培养时间为48h；
斜面培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g ，琼脂20g，加纯净水至 1L，用 NaOH 调 pH 至7.4-7.6，灭菌温度115℃，15min。
（2）种子扩大培养：从步骤（1）的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，将菌体溶液接种到种子培养基上进行扩大培养，接种量为 10%（v/v），扩大培养的温度为28℃，摇床转速 120r/min，培养时间为12h。
种子培养基：蔗糖30g、酵母浸膏6g、(NH4)2SO4 6g、CaCO3 30g、CaCl2 3g、MgCl2·6H2O 1g、KCl 1g，加纯净水至 1L，用 NaOH 调 pH 至 7.0，灭菌温度 115℃，15min。
（3）发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10%（v/v），扩大培养温度30℃，摇床转速150r/min，发酵周期36h。
发酵培养基：葡萄糖30g，玉米浆干粉20g，蔗糖30g，酵母膏 1g， (NH4)2SO410g，谷氨酸钠 10g，MgCl2 0.5g，KCl 0.5g，NaH2PO40.5g，用自来水配成 1L 溶液，用 NaOH 调 pH至 7.0，灭菌温度 121℃，灭菌时间 20min。
（4）30L 发酵罐培养：将步骤（3）中发酵培养后的发酵液接种到 30L
发酵罐的发酵培养基中，接种量为10%（v/v），控制罐压强为0.05MPa，在28℃条件下培养 48 小时，搅拌转速为400rpm，风量为10 L/min，发酵后得含有L-谷氨酸氧化酶的发酵液。
（5）将L-谷氨酸氧化酶的发酵液先经过陶瓷膜过滤，去除菌体，上清液再经过反渗透膜浓缩50倍，即得L-谷氨酸氧化酶的粗酶液。
本发明经过对Streptomyces sp.206（土壤分离）进行紫外诱变和化学诱变，筛选到一株谷氨酸酶活性较高的菌株，经分离纯化后获得菌株MQO-160，其保藏编号为：CGMCCNo.12892；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为：2016 年8月22日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路 1 号院3 号。
菌株 MQO-160 的生物特性为：该菌株基内和气生菌丝均为乳白色，菌丝有较多的隔膜，气生菌丝有较多的枝状分支，部分菌丝处于旺盛的生长期，有芽状结构，该菌株产生金黄色或紫红色可溶性色素。该菌株孢子卵圆形、球形或柱形，表面光滑，孢子丝呈螺旋状。菌株MQO-160分类命名为链霉菌Streptomyces sp.。
本发明采用一步酶促反应，转化液中添加过氧化氢酶，避免了转化过程过氧化氢对L-谷氨酸氧化酶的抑制作用，从而影响a-酮戊二酸的转化合成，使a-酮戊二酸可以积累到较高的浓度。
本发明还包括将含a-酮戊二酸的转化液的分离纯化，具体步骤如下：
离子交换：将转化液经D301大孔弱碱性阴树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈，用0.25N 盐酸溶液洗脱，洗脱收率达到95%；
纳滤：采用600-800分子量纳滤膜过滤a-酮戊二酸洗脱液纯化液得到a-酮戊二酸纳滤清液，用3倍浓缩液体积的去离子水分3次清洗浓缩液后，弃去浓缩液，收集含a-酮戊二酸产品的纳滤透析液，该步骤收率达到97%；
活性炭脱色：pH 3.0，用活性炭进行脱色，活性炭的用量为a-酮戊二酸纳滤清液的1%（质量分数），脱色温度为50℃，脱色时间为30min，用0.22μm滤膜过滤得脱色液，脱色液透光率≥99%，脱色收率达到99%；
反渗透浓缩：将a-酮戊二酸脱色液经反渗透膜浓缩至原体积一半得到a-酮戊二酸预浓缩液，反渗透收率达到99%；
浓缩结晶：将预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下浓缩至含量≥80%的浓缩液，将浓缩液搅拌冷却至20℃结晶5h。
干燥：结晶结束后，抽滤获得晶体，将结晶晶体50℃真空干燥，得到a-酮戊二酸成品。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
（1）筛选到了一株MQO-160，解决了酶转化工艺酶来源和酶成本高的限制；
（2）采用L-谷氨酸发酵纯化液作为转化原料，克服了L-谷氨酸氧化酶转化法生产a-酮戊二酸的瓶颈，价格低廉易得，工艺简单，产品纯度高；
（3）采用膜分离、纳滤脱色、膜浓缩等先进处理工艺节省了能耗，节省了活性炭的用量，减少了对环境的污染，降低了生产成本，提高了产品质量。
（4）本发明L-谷氨酸氧化酶转化法生产a-酮戊二酸中底物转化率87%，转化液中产物浓度可达105g/L，a-酮戊二酸的一次性提取收率50%。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
菌株MQO-160，其保藏编号为：CGMCC No.12892；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为：2016 年8月22日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路 1 号院3 号。
实施例1 制备a-酮戊二酸的转化培养方法
在pH为8.5的磷酸缓冲液中，添加L-谷氨酸氧化酶或者L-谷氨酸氧化酶的粗酶液、H2O2酶和MnCl2以及底物L-谷氨酸钠，37℃，200r/min 转化 24 h，即得含a-酮戊二酸的转化液；磷酸缓冲液的终浓度为50mmol，L-谷氨酸氧化酶的终浓度为15U/ml, H2O2酶的终浓度为20U/ml、MnCl2的终浓度为5mmol，L-谷氨酸钠的终浓度为10%（质量分数）。
实施例2利用菌株 MQO-160 制备L-谷氨酸氧化酶粗酶液的方法
具体如下：
（1）斜面培养：将菌株 MQO-160 在无菌条件下接种到斜面培养基上进行倒置培养，培养温度为28℃，培养时间为48h；
斜面培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g ，琼脂20g，加纯净水至 1L，用 NaOH 调 pH 至7.4-7.6，灭菌温度115℃，15min。
（2）种子扩大培养：从步骤（1）的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，将菌体溶液接种到种子培养基上进行扩大培养，接种量为 10%（v/v），扩大培养的温度为28℃，摇床转速 120r/min，培养时间为12h。
种子培养基：蔗糖30g、酵母浸膏6g、(NH4)2SO4 6g、CaCO3 30g、CaCl2 3g、MgCl2·6H2O 1g、KCl 1g，加纯净水至 1L，用 NaOH 调 pH 至 7.0，灭菌温度 115℃，15min。
（3）发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10%（v/v），扩大培养温度30℃，摇床转速150r/min，发酵周期36h。
发酵培养基：葡萄糖30g，玉米浆干粉20g，蔗糖30g，酵母膏 1g， (NH4)2SO410g，谷氨酸钠 10g，MgCl2 0.5g，KCl 0.5g，NaH2PO40.5g，用自来水配成 1L 溶液，用 NaOH 调 pH至 7.0，灭菌温度 121℃，灭菌时间 20min。
（4）30L 发酵罐培养：将步骤（3）中发酵培养后的发酵液接种到 30L
发酵罐的发酵培养基中，接种量为10%（v/v），控制罐压强为0.05MPa，在28℃条件下培养 48 小时，搅拌转速为400rpm，风量为10 L/min，发酵后得含有L-谷氨酸氧化酶的发酵液。
（5）将L-谷氨酸氧化酶的发酵液先经过陶瓷膜过滤，去除菌体，上清液再经过反渗透膜浓缩50倍，即得L-谷氨酸氧化酶的粗酶液。
实施例3 菌株 MQO-160 的生物特性
菌株 MQO-160的基内和气生菌丝均为乳白色，菌丝有较多的隔膜，气生菌丝有较多的枝状分支，部分菌丝处于旺盛的生长期，有芽状结构，该菌株产生金黄色或紫红色可溶性色素。该菌株孢子卵圆形、球形或柱形，表面光滑，孢子丝呈螺旋状。
实施例4含a-酮戊二酸的转化液的分离纯化
具体步骤如下：
离子交换：将转化液经D301大孔弱碱性阴树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈，用0.25N HCl溶液洗脱，洗脱收率达到95%；
纳滤：采用600-800分子量纳滤膜过滤a-酮戊二酸洗脱液纯化液得到a-酮戊二酸纳滤清液，用3倍浓缩液体积的去离子水分3次清洗浓缩液后，弃去浓缩液，收集含a-酮戊二酸产品的纳滤透析液，该步骤收率达到97%；
活性炭脱色：pH 3.0，用活性炭进行脱色，活性炭的用量为a-酮戊二酸纳滤清液的1%（质量分数），脱色温度为50℃，脱色时间为30min，用0.22μm滤膜过滤得脱色液，脱色液透光率≥99%，脱色收率达到99%；
反渗透浓缩：将a-酮戊二酸脱色液经反渗透膜浓缩至原体积一半得到a-酮戊二酸预浓缩液，反渗透收率达到99%；
浓缩结晶：将预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下浓缩至含量≥80%的浓缩液，将浓缩液搅拌冷却至20℃结晶5h。
干燥：结晶结束后，抽滤获得晶体，将结晶晶体50℃真空干燥，得到a-酮戊二酸成品。
试验例1 a-酮戊二酸的转化条件的确定
（1）反应温度的确定 反应温度对a-酮戊二酸产量的影响，在25℃-42℃范围内的不同温度下，转化反应l0h的情况，温度越高a-酮戊二酸产率越高，37℃达到最高，超过37℃则产率下降。
（2）pH的确定 pH对a-酮戊二酸产量的影响，配制不同pH条件下的底物溶液(pH6.0-10.0)，在37℃下反应10h，考察pH对酶活(产物量)的影响，pH为8.5时目的产物浓度最高，即相对酶活最高。
（3）转速的确定 转速对a-酮戊二酸产量的影响，当转速为200r/min时a-酮戊二酸产量最大。
（4）底物浓度和反应时间的确定 底物浓度和反应时间对a-酮戊二酸产量的影响，随着L-谷氨酸浓度的增大，a-酮戊二酸浓度达到最大所需要的时间逐渐延长。当L-谷氨酸浓度为10%时，转化24h a-酮戊二酸浓度达到最大，延长时间产物浓度不再增加而趋于稳定；当L-谷氨酸浓度继续增加时，产物a-酮戊二酸的产量不再增加而趋于稳定，此时增加底物浓度已没有意义，故而选择底物L-谷氨酸浓度为10%，转化时间为24h。
试验例2 a-酮戊二酸摩尔转化率的测定
将菌体接种到50mL 液体培养基中于28 ℃培养48 h。培养好的含有谷氨酸氧化酶的发酵液4 ℃下4000 r/min 离心30min，去除菌体，上清液再经过反旋转蒸发浓缩50倍即为酶转化使用的L-谷氨酸氧化酶的粗酶液。在pH为8.5的磷酸缓冲液中，添加L-谷氨酸氧化酶的粗酶液、H2O2酶和MnCl2以及底物L-谷氨酸钠，37℃，200r/min 转化 24 h，即得含a-酮戊二酸的转化液；磷酸缓冲液的终浓度为50mmol，L-谷氨酸氧化酶的终浓度为15U/ml, H2O2酶的终浓度为20U/ml、MnCl2的终浓度为5mmol，L-谷氨酸钠的终浓度为10%（质量分数）。6000 r/min 离心10 min， 测定上清液中的a-酮戊二酸浓度， 并计算底物谷氨酸的摩尔转化率y，以此表示谷氨酸氧化酶的活力。本发明测得谷氨酸摩尔转化率为87%。
y=nA/nB
其中nA为转化液中a-酮戊二酸的物质的量（mol）；nB为转化液中原始的谷氨酸的物质的量（mol）。

Claims (8)

1.制备a-酮戊二酸的转化培养方法，其特征在于，转化培养方法为：在pH为8.5的磷酸缓冲液中，添加L-谷氨酸氧化酶或者L-谷氨酸氧化酶的粗酶液、H2O2酶和MnCl2以及底物L-谷氨酸钠，37℃，200r/min 转化 24 h，即得含a-酮戊二酸的转化液。
2.根据权利要求1所述的转化培养方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液的终浓度为50mmol，L-谷氨酸氧化酶的终浓度为15U/ml, H2O2酶的终浓度为20U/ml、MnCl2的终浓度为5mmol，L-谷氨酸钠的终浓度为10%。
3.根据权利要求1所述的转化培养方法，其特征在于，L-谷氨酸氧化酶粗酶液的制备方法，具体步骤如下：
（1）斜面培养：将菌株 MQO-160 在无菌条件下接种到斜面培养基上进行倒置培养，培养温度为28℃，培养时间为48h；
（2）种子扩大培养：从步骤（1）的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，将菌体溶液接种到种子培养基上进行扩大培养，接种量为 10%（v/v），扩大培养的温度为 28℃，摇床转速 120r/min，培养时间为12h；
（3）发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10%（v/v），扩大培养温度30℃，摇床转速150r/min，发酵周期36h；
（4）30L 发酵罐培养：将步骤（3）中发酵培养后的发酵液接种到 30L
发酵罐的发酵培养基中，接种量为10%（v/v），控制罐压强为0.05MPa，在28℃条件下培养 48 小时，搅拌转速为400rpm，风量为10 L/min，发酵后得含有L-谷氨酸氧化酶的发酵液；
（5）将L-谷氨酸氧化酶的发酵液先经过陶瓷膜过滤，去除菌体，上清液再经过反渗透膜浓缩50倍，即得L-谷氨酸氧化酶的粗酶液；
所述菌株MQO-160的保藏编号为：CGMCC No.12892；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为：2016 年8月22日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路 1 号院3 号。
4.根据权利要求3所述的转化培养方法，其特征在于，所述斜面培养基的配制：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g ，琼脂20g，加纯净水至 1L，用 NaOH 调 pH 至7.4-7.6，灭菌温度115℃，15min。
5.根据权利要求3所述的转化培养方法，其特征在于，所述种子培养基的配制：蔗糖30g、酵母浸膏6g、(NH4)2SO46g、CaCO3 30g、CaCl2 3g、MgCl2·6H2O 1g、KCl 1g，加纯净水至1L，用 NaOH 调 pH 至 7.0，灭菌温度 115℃，15min。
6.根据权利要求3所述的转化培养方法，其特征在于，所述发酵培养基的配制：葡萄糖30g，玉米浆干粉20g，蔗糖30g，酵母膏 1g， (NH4)2SO410g，谷氨酸钠 10g，MgCl2 0.5g，KCl0.5g，NaH2PO40.5g，用自来水配成 1L 溶液，用 NaOH 调 pH 至 7.0，灭菌温度 121℃，灭菌时间 20min。
7.根据权利要求3所述的转化培养方法，其特征在于，所述菌株 MQO-160 的生物特性为：菌株MQO-160的基内和气生菌丝均为乳白色，菌丝有较多的隔膜，气生菌丝有较多的枝状分支，部分菌丝处于旺盛的生长期，有芽状结构，菌株MQO-160产生金黄色或紫红色可溶性色素，菌株MQO-160的孢子卵为圆形、球形或柱形，表面光滑，孢子丝呈螺旋状。
8.如权利要求1-7任一项所述转化培养方法制备的含a-酮戊二酸的转化液的分离纯化方法，具体步骤如下：
离子交换：将含有a-酮戊二酸转化液经D301大孔弱碱性阴树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈，用0.25N 盐酸溶液洗脱；
纳滤：采用600-800分子量纳滤膜过滤a-酮戊二酸洗脱液纯化液得到a-酮戊二酸纳滤清液，用3倍浓缩液体积的去离子水分3次清洗浓缩液后，弃去浓缩液，收集含a-酮戊二酸产品的纳滤透析液，该步骤收率达到97%；
活性炭脱色：pH 3.0，用活性炭进行脱色，活性炭的用量为a-酮戊二酸纳滤清液的1%（质量分数），脱色温度为50℃，脱色时间为30min，用0.22μm滤膜过滤得脱色液；
反渗透浓缩：将a-酮戊二酸脱色液经反渗透膜浓缩至原体积一半得到a-酮戊二酸预浓缩液；
浓缩结晶：将预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下浓缩至含量≥80%的浓缩液，将浓缩液搅拌冷却至20℃结晶5h；
干燥：结晶结束后，抽滤获得晶体，将结晶晶体50℃真空干燥，得到a-酮戊二酸成品。
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