CN105017086B - 一种l‑瓜氨酸分离纯化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种L‑瓜氨酸分离纯化的方法，包括以下步骤：(1)鸟氨酸纯化液的获得；(2)瓜氨酸纳滤透析液的获得；(3)瓜氨酸脱色液的获得；(4)瓜氨酸脱氨后的预浓缩液的获得；(5)瓜氨酸结晶物质的过得。本发明采用膜分离、纳滤脱色、膜浓缩等先进处理工艺节省了能耗，节省了活性炭的用量，减少了对环境的污染，降低了生产成本，提高了产品质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种L-瓜氨酸分离纯化的方法，属于生物技术领域。
背景技术
1914年右贺太郎等从西瓜榨汁中第一次分离得到了瓜氨酸，此后由和田光德认出它是一种氨基酸。瓜氨酸以游离态存在于葫芦科植物的种子中，至今为止，人们已成功从西瓜榨汁中，野西瓜叶中，核桃仁，核桃幼苗及种子中分离得到了瓜氨酸H1。瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸，国外科学家在瓜氨酸方面的研究较多，尤其是在日本、美国和欧洲。在国内，对瓜氨酸的研究却还只是处于认识阶段，生产方法没有相应的报道对其检测方法和生理功能研究的也不多，只有少量的文献报道。岳瑞等用双波长薄层扫描法测定天花粉中瓜氨酸的含量。在研究粗糙孢霉突变株诱导与培养时，发现了瓜氨酸对此突变株有明显的促生长作用。郑春福等研究发现增加细胞外源的L瓜氨酸可明显提高活化巨噬细胞诱生的NO产量，进而降低活化巨噬细胞的感染率，并抑制细胞内弓形虫速殖子的增殖。曾小峰等”“发现抗环瓜氨酸肽抗体在类风湿关节炎的诊断中有重要的作用。
在瓜氨酸的生理功能方面，国外科学家已研究得出瓜氨酸具有一些很重要的药理功能，如自由基清除作用，在人体的健康保健方面具有很重要的意义；血管舒张作用，这有望成为治疗内毒症、脓毒症的良药。日本一科学家已研制出一种瓜氨酸新多肽，并将该新多肽研究发展成抗艾滋病药物。同时瓜氨酸被认为是一种非常有效的抗氧化剂，这一功能已应用于化妆品、药物、保健食品等各个领域。近年来国外的众多研究表明，瓜氨酸具有很多重要的生理功能，如清除自由基，异体排斥效应指示剂，血管舒张作用，稳定血压以及诊断类风湿关节炎，抗氧化等，应用前景十分广阔。
在瓜氨酸的制备方法上主要由三种，国外主要采用发酵法和酶法生产，分离纯化多数使用离子交换等常用的分离方法。
(1)化学法:是指碱性条件下水解L-精氨酸得L-瓜氨酸，过程控制比较困难，产品中含有旋光对映体D-瓜氨酸，影响产品质量，生产过程中产生大量废水，污染环境，但化学法是国内目前L-瓜氨酸工业化生产的唯一方法。
(2)发酵法生产的难点在于单位体积L-瓜氨酸产率低，最高仅为1.7g/L，从发酵液中提取L-瓜氨酸的成本较高。发酵法的优点是成本低，产量高，产物的纯度高，在产品的生产过程中没有有毒物质的产生，给产物后加工提供了方便，降低了成本。目前，对发酵法生产瓜氨酸研究最多的国家是日本，在上世纪30年代就有这方面的研究，到了60年代达到了一定的水平。
(3)酶法：是指在精氨酸脱亚胺酶的作用下，L-精氨酸被转化为L-瓜氨酸，生产条件温和，不产生有毒物质，转化体系中杂质较少，提取工艺简单，污染少。该法是以专一性强、转化率高的微生物菌体细胞为催化剂，催化精氨酸脱亚胺基生成L瓜氨酸。利用酶法合成瓜氨酸，大多采用一步酶促反应，因而可避免瓜氨酸全合成途径中复杂的反馈调节作用，使瓜氨酸可以积累到较高的浓度。
1973年，Ichifo Chibata等‘261报道Psudomonas putidaATCC4359，Pseudomonasfluorescen IFO 3081,Pseudomons ovalis iAM 1002,Leuconostoc citrovorumATCC8081等可以生产精氨酸脱亚氨基酶，以L-精氨酸或DL精氨酸为底物，可生产瓜氨酸浓度达80班以上。酶法合成瓜氨酸的优点是产物浓度高，纯化步骤少，产品中无D-型旋光对映体，生产工艺简单、成本低。但其缺点是目前酶法很难满足工业生产的要求，原因是依靠动物内脏获得的精氨酸脱亚氨基酶的活性较低，转化率较低，同时精氨酸原料的价格高，影响了瓜氨酸的酶法生产放大。因此，廉价的精氨酸原料价格和精氨酸脱亚胺酶的获得是酶法生产能否成功的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产精氨酸脱亚胺酶的菌株MQO-153，本发明通过对粪链球菌(粪链球菌购自北京微生物菌种保藏中心)多次的化学诱变、紫外诱变，以及经过大量的菌种筛选获得了一株产得的精氨酸脱亚氨基酶活性高的菌株MQO-153，其保藏编号为CGMCC No.10726；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为2015年4月21；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
菌株MQO-153的生物特性为：菌株MQO-153接种到斜面培养基上进行培养24h，菌形圆或椭圆，可顺链的方向延长，直径0.5-1.0μm，大多数成双或短链状排列，在丰富培养基上菌落大而光滑，直径1-2mm，全缘，无色素。菌株MQO-153的分类命名为粪链球菌(Streptococcus faecalis)。
利用菌株MQO-153制备精氨酸脱亚胺酶的方法，具体为微生物发酵方法，步骤如下：
(1)斜面培养：将菌株MQO-153在无菌条件下接种到斜面培养基上进行培养，培养温度为30℃，培养时间为24h，此时，菌落大而光滑，无色素积累；
斜面培养基：斜面培养基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂20；pH为7.0-7.3；优选为7.2；斜面培养基的灭菌温度115℃，灭菌时间15min。
(2)扩大培养：从步骤(1)的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，稀释后的浓度为3×105-5×105个/mL，将菌体溶液接种到种子培养基上置于摇床中进行扩大培养，接种量为10％(v/v)，扩大培养的温度为30℃，培养时间为18h，摇床振幅为85mm，摇床频率为0-18h，摇床转速为100r/min。
种子培养基(g/L)：一水葡萄糖30，牛肉膏5，蛋白胨10，氯化钠15，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.05，硫酸锰0.05，VB1·HCl 0.005；用氢氧化钠调节pH为7.0；250mL三角瓶装液量为20mL，1000mL三角瓶装液量为150mL；种子培养基灭菌温度为115℃，灭菌时间为15min。
(3)发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10％(v/v)，接种时菌体溶液的浓度为3×105-5×105个/mL，培养条件为：培养温度30℃，培养时间28小时，摇床振幅85mm，0-10h，摇床转速100r/min，10-20h，摇床转速120r/min，20-28h，摇床转速100r/min；
发酵培养基(g/L)：葡萄糖3，酵母膏10，牛肉膏5，蛋白胨10，玉米浆5，酵母膏1，氯化钠5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，L-精氨酸5，硫酸亚铁0.05，硫酸锰0.05，VB1·HCl 0.005；用氢氧化钠调节pH为7.2，灭菌温度121℃，灭菌时间20min。
(4)30L发酵罐培养：将步骤(3)中发酵培养后的发酵液接种到30L发酵罐的培养基中，接种量为10％(v/v)，控制罐压0.05MPa，在30℃条件下培养24小时，搅拌转速600-800rpm，风量1：0.8m3/m3·min(vvm)，控制溶氧30-40％，全程用无菌饱和氨水控制pH6.7-7.0，中途补糖控制残糖为1％，放罐残糖为0％，发酵后得到含有精氨酸脱亚胺酶菌体。
本发明通过微生物酶法生产瓜氨酸，具体为L-精氨酸精经过精氨酸脱亚胺酶的转化制备L-瓜氨酸。本发明采用一步酶促反应，避免了瓜氨酸全合成途径中复杂的反馈调节作用，使瓜氨酸可以积累到较高的浓度。具体步骤如下：
(1)底物的获得：将精氨酸陶瓷膜过滤液经732氨型树脂吸附，用2.0N氨水洗脱，得到精氨酸阳柱纯化液；
(2)转化培养：将含有精氨酸脱亚胺酶的菌体,用生理盐水洗涤1次,离心后收集菌体。将菌体转移到转化液中，转化液包括0.45mol/L的醋酸缓冲液和0.5g/L的CTAB，加入10％的L-精氨酸纯化液，37℃保温24h，即得L-瓜氨酸转化液。
(3)分离纯化：
离子交换：将转化液经氨型732树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈，用1.0N氨水洗脱，洗脱液再过流D335-OH型树脂除去阴离子杂质得到鸟氨酸纯化液，收率达到95％；
纳滤：采用600-800分子量纳滤膜过滤鸟氨酸纯化液得到瓜氨酸纳滤清液，用3倍浓缩液体积的去离子水分3次清洗浓缩液后，弃去浓缩液，收集含瓜氨酸产品的纳滤透析液，该步骤收率达到98％；
调pH、脱色：用盐酸调节瓜氨酸纳滤清液的pH至4.5，用活性炭进行脱色，活性炭的用量为瓜氨酸纳滤清液的0.5％(质量分数)，脱色温度为50℃，脱色时间为30min，用0.22μm滤膜过滤得脱色液，脱色液透光率≥99％，收率达到99％；
反渗透浓缩：将瓜氨酸脱色液经反渗透膜浓缩至原体积一半得到瓜氨酸脱氨后的预浓缩液，收率达到99％；
浓缩结晶：将预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下浓缩至浓缩度含量≥80％的浓缩液，将浓缩液放至5℃冰箱保温2h得到瓜氨酸结晶；
瓜氨酸盐酸盐的获得：将结晶的瓜氨酸经抽滤后用无水乙醇洗涤3次得到瓜氨酸盐酸盐湿品，收率达到85％；
干燥：将瓜氨酸盐酸盐湿品放入55℃真空干燥箱在≥-0.098真空度下干燥6h得到瓜氨酸盐酸盐成品。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
(1)筛选到了一株MQO-153，解决了酶转化工艺酶来源和酶成本高的限制；
(2)采用精氨酸发酵纯化液作为转化原料，克服了精氨酸酶转化法生产瓜氨酸的瓶颈，价格低廉易得，工艺简单，产品纯度高；
(3)采用膜分离、纳滤脱色、膜浓缩等先进处理工艺节省了能耗，节省了活性炭的用量，减少了对环境的污染，降低了生产成本，提高了产品质量。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1一株产精氨酸脱亚胺酶的菌株MQO-153，本发明通过对粪链球菌(粪链球菌购自北京微生物菌种保藏中心)多次的化学诱变、紫外诱变，以及经过大量的菌种筛选获得了一株产得的精氨酸脱亚氨基酶活性高的菌株MQO-153，其保藏编号为CGMCC No.10726；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为2015年4月21；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2利用菌株MQO-153制备精氨酸脱亚胺酶的方法，具体步骤如下：
(1)斜面培养：将菌株MQO-153在无菌条件下接种到斜面培养基上进行培养，培养温度为30℃，培养时间为24h，此时，菌落大而光滑，无色素积累；
斜面培养基：斜面培养基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂20；pH为7.0-7.3；优选为7.2；斜面培养基的灭菌温度115℃，灭菌时间15min。
(2)扩大培养：从步骤(1)的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，稀释后的浓度为3×105-5×105个/mL，将菌体溶液接种到种子培养基上置于摇床中进行扩大培养，接种量为10％(v/v)，扩大培养的温度为30℃，培养时间为18h，摇床振幅为85mm，摇床频率为0-18h，摇床转速为100r/min。
种子培养基(g/L)：葡萄糖30，牛肉膏5，蛋白胨10，氯化钠15，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.05，硫酸锰0.05，VB1·HCl 0.005；用氢氧化钠调节pH为7.0；250mL三角瓶装液量为20mL，1000mL三角瓶装液量为150mL；种子培养基灭菌温度为115℃，灭菌时间为15min。
(3)发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10％(v/v)，接种时菌体溶液的浓度为3×105-5×105个/mL，培养条件为：培养温度35℃，培养时间28小时，摇床振幅85mm，0-10h，摇床转速100r/min，10-20h，摇床转速120r/min，20-28h，摇床转速100r/min；
发酵培养基(g/L)：葡萄糖3，酵母膏10，牛肉膏5，蛋白胨10，玉米浆5，酵母膏1，氯化钠5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，L-精氨酸5，硫酸亚铁0.05，硫酸锰0.05，VB1HCl 0.005；用氢氧化钠调节pH为7.2，灭菌温度121℃，灭菌时间20min。
(4)30L发酵罐培养：将步骤(3)中发酵培养后的发酵液接种到30L发酵罐的培养基中，接种量为10％(v/v)，控制罐压0.05MPa，在35℃条件下培养24小时，搅拌转速600-800rpm，风量1：0.8m3/m3·min(vvm)，控制溶氧30-40％，全程用无菌饱和氨水控制pH6.7-7.0，中途补糖控制残糖为1％，放罐残糖为0％，发酵后得精氨酸脱亚胺酶菌体。
实施例3L-精氨酸精经过精氨酸脱亚胺酶的转化制备L-瓜氨酸的方法，具体步骤如下：
(1)底物的获得：将精氨酸陶瓷膜过滤液经732氨型树脂吸附，用2.0N氨水洗脱，得到精氨酸阳柱纯化液；
(2)转化培养：将含有精氨酸脱亚胺酶的菌体,用生理盐水洗涤1次,离心后收集菌体。将菌体转移到转化液中，转化液包括0.45mol/L的醋酸缓冲液和0.5g/L的CTAB，加入10％的L-精氨酸纯化液，37℃保温24h，即得L-瓜氨酸转化液。
实施例4 L-瓜氨酸转化液的分离纯化
(1)离子交换：将转化液经氨型732树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈，用1.0N氨水洗脱，洗脱液再过流D335-OH型树脂除去阴离子杂质得到鸟氨酸纯化液，收率达到95％；
(2)纳滤：采用600-800分子量纳滤膜过滤鸟氨酸纯化液得到瓜氨酸纳滤清液，用3倍浓缩液体积的去离子水分3次清洗浓缩液后，弃去浓缩液，收集含瓜氨酸产品的纳滤透析液，该步骤收率达到98％；
(3)调pH、脱色：用盐酸调节瓜氨酸纳滤清液的pH至4.5，用活性炭进行脱色，活性炭的用量为瓜氨酸纳滤清液的0.5％(质量分数)，脱色温度为50℃，脱色时间为30min，用0.22μm滤膜过滤得脱色液，脱色液透光率≥99％，收率达到99％；
(4)反渗透浓缩：将瓜氨酸脱色液经反渗透膜浓缩至原体积一半得到瓜氨酸脱氨后的预浓缩液，收率达到99％；
(5)浓缩结晶：将预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下浓缩至浓缩度含量≥80％的浓缩液，将浓缩液放至5℃冰箱保温2h得到瓜氨酸结晶。
试验例1本发明中转化条件的确定
(1)反应温度的确定反应温度对L-瓜氨酸产量的影响，在25℃-42℃范围内的不同温度下，固定化细胞和游离细胞的转化反应l0h的情况，温度越高瓜氨酸产率越高，37℃达到最高，超过37℃则产率下降。
(2)pH的确定pH对L-瓜氨酸产量的影响，配制不同pH条件下的底物溶液(pH4.0、5.0、8.0)，在37℃下反应10h，考察pH对酶活(产物量)的影响，pH为6.5时底物浓度最高，即相对酶活最高。
(3)转速的确定转速对L-瓜氨酸产量的影响，当转速为120r/min时瓜氨酸产量最大。但是转速对颗粒的强度造成很大的影响，故采用转速为l00r/min。
(4)底物浓度和反应时间的确定底物浓度和反应时间对L-瓜氨酸产量的影响，随着L-精氨酸浓度的增大，L-瓜氨酸浓度达到最大所需要的时间逐渐延长。当L-精氨酸浓度为10％时，固定化细胞转化20h瓜氨酸浓度达到最大，延长时间产物浓度不再增加而趋于稳定；当L-精氨酸浓度继续增加时，产物L-瓜氨酸的产量不再增加而趋于稳定，此时增加底物浓度已没有意义，故而选择底物L-精氨酸浓度为10％。
试验例2精氨酸摩尔转化率的测定
将菌体接种到50mL液体培养基中于30℃培养24h。培养好的发酵液4℃下4000r/min离心30min，弃去上清液。将菌体转移至10mL醋酸缓冲液，加入0.15g精氨酸，在37℃下转化24h。6000r/min离心10min，测定上清液中的L-瓜氨酸浓度，并计算底物精氨酸的摩尔转化率y，以此表示精氨酸酶的活力。本发明测得精氨酸摩尔转化率为98.2％。
y＝nA/nB
其中nA为转化液中L-瓜氨酸的物质的量(mol)；nB为转化液中原始的精氨酸的物质的量(mol)。
试验例3本发明中获得的L-瓜氨酸盐酸盐的检验
中试产品经青岛谱尼测试有限公司的第三方检验，各项指标符合美国联邦通讯委员会，L-瓜氨酸盐酸盐USP标准，主要性能指标见表1所示：
表1
Claims (5)
1.一种L-瓜氨酸分离纯化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)离子交换：将L-瓜氨酸转化液经氨型732树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈，用1.0N氨水洗脱，洗脱液再过流D335-OH型树脂除去阴离子杂质得到瓜氨酸纯化液；
(2)纳滤：采用600-800分子量纳滤膜过滤瓜氨酸纯化液得到瓜氨酸纳滤清液，用3倍浓缩液体积的去离子水分3次清洗纳滤浓缩液后，弃去浓缩液，收集含瓜氨酸产品的纳滤透析液；
(3)调pH、脱色：用盐酸调节瓜氨酸纳滤清液的pH至4.5，用活性炭进行脱色，活性炭的用量为瓜氨酸纳滤清液质量的0.5％，脱色温度为50℃，脱色时间为30min，用0.22μm滤膜过滤得脱色液；
(4)反渗透浓缩：将瓜氨酸脱色液经反渗透膜浓缩至原体积一半得到瓜氨酸脱色后的预浓缩液；
(5)浓缩结晶：将预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下浓缩至浓缩度含量≥80％的浓缩液，将浓缩液放至5℃冰箱保温2h得到瓜氨酸结晶；
所述L-瓜氨酸转化液的制备方法如下：
(1)底物的获得：将精氨酸陶瓷膜过滤液经732氨型树脂吸附，用2.0N氨水洗脱，得到精氨酸阳柱纯化液；
(2)转化培养：将含有精氨酸脱亚胺酶的菌体,用生理盐水洗涤1次，离心后收集菌体；将菌体转移到转化液中，转化液包括0.45mol/L的醋酸缓冲液和0.5g/L的十六烷基三甲基溴化铵，加入10％的L-精氨酸纯化液，37℃保温24h，即得L-瓜氨酸转化液；
所述精氨酸脱亚胺酶菌体的制备步骤如下：
(1)斜面培养：将菌株MQO-153在无菌条件下接种到斜面培养基上进行培养，培养温度为30℃，培养时间为24h；
(2)扩大培养：从步骤(1)的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，稀释后的浓度为3×105-5×105个/mL，将菌体溶液接种到种子培养基上，将种子培养基置于摇床中进行扩大培养，接种量为10％，扩大培养的温度为30℃，培养时间为18h，摇床转速为100r/min，摇床振幅为85mm；
(3)发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10％，接种时菌体溶液的浓度为3×105-5×105个/mL，培养条件为：培养温度30℃，培养时间28小时，摇床振幅85mm，0-10h，摇床转速100r/min，10-20h，摇床转速120r/min，20-28h，摇床转速100r/min；
(4)30L发酵罐培养：将步骤(3)中发酵培养后的发酵液接种到30L发酵罐的培养基中，接种量为10％，接种时菌体溶液的浓度为3×105-5×105个/mL，控制罐压强为0.05MPa，在30℃条件下培养24小时，搅拌转速600-800rpm，风量1：0.8m3/m3·min，控制溶氧量为30-40％，全程用无菌饱和氨水控制pH6.7-7.0，中途补糖控制残糖为1％，放罐残糖为0％，发酵后得含有精氨酸脱亚胺酶菌体；
所述菌株MQO-153的保藏编号为CGMCC No.10726；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为2015年4月21；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株MQO-153的分类命名为粪链球菌Streptococcus faecalis。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述斜面培养基为：以每升培养基中含有的克数计，牛肉膏5，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂20，pH为7.0-7.3，灭菌温度为115℃，灭菌时间为15min。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述斜面培养基的pH为7.2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为：以每升培养基中含有的克数计，葡萄糖30，牛肉膏5，蛋白胨10，氯化钠15，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.05，硫酸锰0.05，维生素B1的盐酸盐0.005；用氢氧化钠调节pH为7.0，灭菌温度为115℃，灭菌时间为15min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵液体培养基为：以每升培养基中含有的克数计，葡萄糖3，酵母膏11，牛肉膏5，蛋白胨10，玉米浆5，氯化钠5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，L-精氨酸5，硫酸亚铁0.05，硫酸锰0.05，维生素B1的盐酸盐0.005，用氢氧化钠调节pH为7.2，灭菌温度121℃，灭菌时间20min。
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