CN113584097A - 一种回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种回流式固体发酵生产γ‑聚谷氨酸的发酵方法及装置，包括以下步骤：步骤1：将枯草芽孢杆菌进行培养获得种子培养物；步骤2：将农业废弃物、工业副产物和无机盐混合为总物料，调节所述总物料的水分含量和pH，将调节后的物料用作固体培养基；步骤3：将步骤1获得的种子培养物接种至步骤2的固体培养基上，保温，通入无菌空气进行发酵，发酵后将所述固体培养基的渗滤液通过蠕动泵循环重新喷淋至固体培养基中，进行回流式固体发酵。本发明的发酵方法与传统的固体发酵相比，微生物活性更高：通过渗滤液的回流，补充了固体物料中的水分，加强了微生物与底物、水分之间的充分接触，提高了微生物生长、代谢的活性。最终产量提高了150％。

Description

一种回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法及装置

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法及装置。

背景技术

γ-聚谷氨酸是一种天然的高分子化合物，由L-或D-谷氨酸单体通过α氨基和γ羧基间的酰胺键链接而成，具有优良的水溶性、吸水性、吸附性、成膜性、无毒性、可食用性以及可生物降解等优良的性能，已成功应用于农业、医药、食品、化妆品、污水处理等多个领域。因其广泛的应用价值，近年来γ-聚谷氨酸备受关注，需求量逐年递增。现阶段，γ-聚谷氨酸是由各类芽孢杆菌通过液体深层发酵制备，其中葡萄糖、柠檬酸、L-谷氨酸等为主要原料。然而，这些原料均来源于粮食深加工的产品，价格高昂，而且大规模的使用必将威胁人类食物安全，这些因素致使γ-聚谷氨酸生产成本过高、成品售价居高不下，极大的阻碍了γ-聚谷氨酸的大范围应用。

为了降低成本，近年来多种研究尝试使用农业废弃物进行固体发酵生产γ-聚谷氨酸，例如中国专利(授权公告号CN 104673851 B)公布了一种使用食用菌的菌渣和味精粕为主要原料固体发酵制备γ-聚谷氨酸的工艺，实现了γ-聚谷氨酸的生产、减少了农业、工业废弃物对环境的污染；中国专利(CN 105420169 B)公布了以秸秆和畜禽粪便为基质固体发酵γ-聚谷氨酸的方法，通过验证发酵后的物料可作为保水保肥的有机肥直接进行施用。然而这些固体发酵工艺中γ-聚谷氨酸的产量均不高，主要是因为：固体发酵的基质含水量低，这就造成了底物传质、传热不均匀，微生物不能充分与底物接触，水分也容易蒸发、流失。虽然可以通过翻抛和补水来缓解上述缺陷，但是这会大幅增加成本，同时也极大的增加了染菌的风险。因此亟需开发一种新型的高效固体发酵工艺，改善传统固体发酵的缺陷，提高农业废弃物生产γ-聚谷氨酸的效率。

回流式固体发酵是一种新型的干式发酵方式，与传统的固体发酵相比，水分含量略高、有少量自由流动的水(渗滤液)，发酵过程中将渗滤液以喷淋的方式循环回流到固体的基质中，以此来加强传质、传热，促进微生物与物料、水分的相互作用，补充基质的水分，从而提高固体发酵的效率。回流式固体发酵已经成功应用于多个领域：在沼气的固体厌氧发酵中，可显著提高沼气生产效率及底物降解程度；在传统食醋的发酵中也被广泛应用，降低了酿醋过程中的劳动强度、提高产酸速度。

发明内容

针对现有技术中的缺陷和不足，解决固体发酵现阶段存在的技术问题，本发明提供一种回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法及装置。

为了达到上述目的，本发明采取的技术方案包括：

一种回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法，包括以下步骤：

步骤1：将枯草芽孢杆菌进行培养获得种子培养物；

步骤2：将农业废弃物、工业副产物和无机盐混合为总物料，调节所述总物料的水分含量和pH，将调节后的物料用作固体培养基；

步骤3：将步骤1获得的种子培养物接种至步骤2所述的固体培养基上，保温，通入无菌空气进行发酵，发酵后将所述固体培养基的渗滤液通过蠕动泵循环重新喷淋至固体培养基中，进行回流式固体发酵。

具体的，所述枯草芽孢杆菌保藏名称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FEP205，于2021年01月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.21731。

具体的，步骤1具体包括将冻存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FEP205接种到斜面活化培养基进行活化，将活化后的菌种接种到种子培养基中进行扩大培养，获得种子培养物。

具体的，所述的斜面活化培养基的成分包括：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5-10g/L，琼脂20g/L，pH7.0-7.4；菌种活化培养条件为30-37℃培养24-48h。

具体的，所述的种子培养基的成分包括蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5-10g/L，pH7.0-7.4；种子培养条件为：摇瓶中30-37℃、150-200rpm，培养24-48h；10-50L的种子罐中，培养温度为30-37℃、搅拌转速为150-200rpm、通气量为1.0-2.0vvm，培养24-48h。

具体的，步骤2所述的农业废弃物包括玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆、水稻秸秆、高粱秸秆、油菜秸秆、甘蔗渣、豆粕、菜籽饼和花生饼中的一种或多种混合，添加量为400-1000g/Kg；

所述的工业副产物包括味精粕、工业味精粗品和浓缩味精废水中的一种或多种混合，添加量为0-600g/Kg；

所述的无机盐包括MgSO₄·7H₂O 500-1500mg/Kg，FeCl₃·6H₂O 20-60mg/Kg，MnSO₄·H₂O 100-300mg/Kg；

所述总物料的水分含量调节至75-85％，pH为7.0-7.5。

具体的，所述的总物料重量为20-150Kg，所述种子培养物的接种量为总物料重量的5-10％。

具体的，步骤3中发酵温度为30-40℃，发酵时长为48-96h，通气量为1-50L/min；

所述的固体培养基的渗滤液每4-8h循环喷淋一次，循环流速2-20L/min，循环时间5-10min。

一种回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的装置，用于实现本发明所述的回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法，包括发酵罐体，所述的发酵罐体的内壁设置加热保温层，发酵罐体的内部水平设置多个分层隔板，分层隔板上用于放置发酵生产γ-聚谷氨酸的固体培养基，分层隔板上均匀布设若干小孔；

所述发酵罐体一侧连通设置用于鼓入外部无菌空气的气泵，发酵罐体另一侧连通设置蠕动泵，发酵罐体的内部顶端设置喷头，蠕动泵与喷头之间连通管道，蠕动泵用于将发酵罐体底层的固体培养基的渗滤液经管道输送至喷头，进而回流喷淋至发酵罐体顶层的固体培养基中，分层隔板上的小孔用于沿重力方向均匀分流各层固体培养基的渗滤液；

进一步的，所述的发酵罐体的容积为20-200L；

所述分层隔板的数量为3个，每个分层隔板上每平方英寸设置10-20个孔；

所述的气泵与蠕动泵之间连通的管道上设置气体分布器，所述的气体分布器设置于发酵罐体内底部。

与现有技术相比，其优点与积极效果在于：

(1)发酵γ-聚谷氨酸的效率提高：与传统的固体发酵相比，本发明中的回流式固体发酵γ-聚谷氨酸的最终产量提高了150％。

(2)微生物活性更高：通过渗滤液的回流，补充了固体物料中的水分，加强了微生物与底物、水分之间的充分接触，提高了微生物生长、代谢的活性。

(3)减少固体发酵生产γ-聚谷氨酸的投入：与传统的静态固体发酵相比，克服了固体发酵中传质、传热不均匀的缺点，不用在发酵过程中翻抛，节约劳力投入，同时减少了污染杂菌的风险；与罐式固体发酵相比，设备简单，不用大规模的机械搅拌，节约了大量的能源投入。

(4)实现了废弃物资源化利用：发酵后的物料含有γ-聚谷氨酸和木质纤维等，其中γ-聚谷氨酸具有保水保肥增产的作用，木质纤维素也是良好的土壤改良剂，因此固体发酵的产物可以作为高端肥料直接应用于农业种植中，实现了废弃物的高值化利用，推动绿色循环农业的发展。

附图说明：

图1为本发明γ-聚谷氨酸回流式固体发酵装置的结构示意图；

图2为γ-聚谷氨酸回流式固体发酵装置中分层隔板示意图。

其中，附图中各标记表示：

1、罐体；2、气泵；3、蠕动泵；4、加热保温层；5、分层隔板；6、喷头；7、气体分布器。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。需要说明，本发明在进行方位描述时，术语“顶端”、“顶层”、“底层”、“底部”等指示的方位或位置关系仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作。如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。

现有技术中γ-聚谷氨酸固体发酵难度较高，研究相对较少，回流式固体发酵工艺复杂，对技术要求更高，因此未应用在γ-PGA的发酵中。固体发酵现阶段主要的问题是传质传热不好、水分易散失、翻抛又困难，这些会造成固体发酵的效率偏低，而本申请的回流式固体发酵生产方法能针对性地解决这些问题，提高效率。

本发明中所用的实验试剂均为市售所得，并未做进一步处理，检测仪器设备等均为常用的仪器，检测方法也为常规检测方法。

在本发明的实施方式中，γ-聚谷氨酸含量测定的方法为：发酵结束后将渗滤液和总物料混合均匀，取样后加入所取样10-15倍体积的蒸馏水，涡旋振荡10min浸提γ-聚谷氨酸，于4800r/min下离心30min获得上清液，加入3倍体积的预冷无水乙醇，离心收集γ-聚谷氨酸沉淀，将样品溶于去离子水中，定容至500mL，使用紫外分光光度计进行检测，其中检测波长为215nm；使用梯度稀释的标准γ-聚谷氨酸样品绘制吸光度的标准曲线，通过标准曲线确定供试样品中γ-聚谷氨酸的含量。

本发明所用枯草芽孢杆菌保藏名称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FEP205，于2021年01月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.21731，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

实施例1：

本实施例给出一种回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法，包括以下步骤：

步骤1：将枯草芽孢杆菌进行培养获得种子培养物；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FEP205；

步骤2：将农业废弃物、工业副产物和无机盐混合为总物料，调节所述总物料的水分含量和pH，将调节后的物料用作固体培养基；

步骤3：将步骤1获得的种子培养物接种至步骤2所述的固体培养基上，保温，通入无菌空气进行发酵，发酵后将所述固体培养基的渗滤液通过蠕动泵循环重新喷淋至固体培养基中，进行回流式固体发酵。

在本实施例中，步骤1包括将冻存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FEP205接种到斜面活化培养基进行活化，将活化后的菌种接种到种子培养基中进行扩大培养，获得种子培养物。

斜面活化培养基的成分包括蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5-10g/L，琼脂20g/L，pH7.0-7.4；菌种活化培养条件为30-37℃培养24-48h。

种子培养基的主要成分为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5-10g/L，pH 7.0-7.4；种子培养条件为：摇瓶中30-37℃、150-200rpm，培养24-48h；10-50L的种子罐中，培养温度为30-37℃、搅拌转速为150-200rpm、通气量为1.0-2.0vvm，培养24-48h。

在本实施例中，步骤2所述的农业废弃物包括玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆、水稻秸秆、高粱秸秆、油菜秸秆、甘蔗渣、豆粕、菜籽饼和花生饼中的一种或多种混合，添加量为400-1000g/Kg；

所述的工业副产物包括味精粕、工业味精粗品和浓缩味精废水中的一种或多种混合，添加量为0-600g/Kg；

所述的无机盐包括MgSO₄·7H₂O 500-1500mg/Kg，FeCl₃·6H₂O 20-60mg/Kg，MnSO₄·H₂O 100-300mg/Kg。

所述总物料的水分含量调节至75-85％，pH为7.0-7.5。

所述的总物料重量为20-150Kg，所述种子培养物的接种量为总物料重量的5-10％。

在本实施例中，步骤3中发酵温度为30-40℃，发酵时长为48-96h，通气量为1-50L/min。通气量是指通入无菌空气的量。

所述的底层的固体培养基的渗滤液每4-8h循环喷淋一次，循环流速2-20L/min，循环时间5-10min。

本实施例所用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FEP205分离方法具体如下：

(1)平板初筛

取杨凌某地土壤样品10g加入90mL无菌水中，放入恒温振荡培养箱中振荡5min，得10^-1样品稀释液，再放入80℃水浴15min进行预处理，后取1mL上清液加入9mL无菌水中，得到10^-2稀释液、如此方法依次得到10^-3、10^-4、10^-5、10^-6梯度稀释液，每个浓度稀释液取0.1mL涂布于分离平板培养基中，一个浓度梯度三个平行，35℃倒置培养24h，然后观察平板上的菌落形态特征。

(2)菌株的分离纯化

挑取在初筛平板中菌落凸起、表面粘稠、能拉丝、生长迅速的单菌落在平板上进行四区划线进行分离培养，在37℃恒温培养48h，反复进行分离纯化，直至获得较为粘稠的单菌落，将得到的单菌进行编号，并转接到斜面培养基上37℃培养24h，并于4℃冰箱保存。

(3)摇瓶初筛

将分离纯化得到的菌株接种于摇瓶发酵培养基中，35℃，240r/min，培养2d，测定发酵液中γ-PGA的产量，选取产量较高的γ-PGA菌株，进行下一步的复筛。

(4)摇瓶复筛

将摇瓶初筛得到的高产γ-PGA的菌株再次接种于摇瓶发酵培养基中，35℃，240r/min，培养3d，测定发酵液中γ-PGA产量，得到稳定高产γ-PGA的菌株，即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FEP205。γ-PGA摇瓶产量为31.2g/L。

其中分离培养基配方为(g/L)：葡萄糖20，柠檬酸10，谷氨酸钠10，(NH₄)₂SO₄ 6，K₂HPO₄1，MgSO₄·7H₂O 0.5，FeCl₃·6H₂O 0.02，CaCl₂ 0.2，MnSO₄·H₂O 0.05，琼脂20，pH7.2-7.5，115℃灭菌30min。

发酵培养基配方为(g/L)：柠檬酸5，谷氨酸钠50，硫酸铵10，葡萄糖80，K₂HPO₄2，MgSO₄·7H₂O 1，FeCl₃·6H₂O 0.1，MnSO₄·H₂O 0.05，CaCl₂ 0.1，pH 7.0，补水至1000mL。

该枯草芽孢杆菌FEP205部分生理生化特性如下：

表1.枯草芽孢杆菌FEP205部分生理生化特性

表1的“+”表示反应为阳性，“-”表示反应为阴性。

分子生物学鉴定：提取菌株全基因组DNA，PCR扩增16S rDNA片段，测序，测序结果在NCBI中进行比对，比对结果显示该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

实施例2

本实施例以20L的发酵罐进行发酵，包括以下步骤：

步骤1：包括将冻存的γ-聚谷氨酸生产菌株接种到斜面活化培养基进行活化，将活化后的菌种接种到种子培养基中进行扩大培养，获得种子培养物。

其中，斜面活化培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌30min，冷却、制作斜面。

种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，121℃灭菌30min；

具体包括将冻存的解淀粉芽孢杆菌FEP205接种于斜面活化培养基，37℃培养24h进行活化，接种环挑取2环活化后的解淀粉芽孢杆菌FEP205，接种于种子培养基中，37℃、摇床转速150rpm，培养24h，获得种子培养物为一级种子培养物。

步骤2：将农业废弃物、工业副产物和无机盐混合为总物料，调节所述总物料的水分含量和pH，将调节后的物料用作发酵生产γ-聚谷氨酸的固体培养基；

在本实施例中，具体包括将玉米秸秆(粉碎至1cm)400g/Kg，豆粕100g/Kg，味精粕500g/Kg，MgSO₄·7H₂O 500-1500mg/Kg，FeCl₃·6H₂O 20-60mg/Kg，MnSO₄·H₂O 100-300mg/Kg；调整总含水量至80％，pH至7.0，灭菌、冷却备用。

其中，总物料为10kg，接种量为物料总重量的5％。

步骤3：将步骤1获得的种子培养物接种至步骤2所述的固体培养基上，保温，通入无菌空气进行发酵，发酵后将所述固体培养基的渗滤液通过蠕动泵循环重新喷淋至固体培养基中，进行回流式固体发酵。

其中，发酵温度为35℃，发酵时长为48h，通气量为1L/min。底层渗滤液每6h循环喷淋一次，循环流速2L/min，循环时间5min。

发酵结束后将渗滤液和总物料混合均匀，取样10g，加入10倍体积的蒸馏水，涡旋振荡10min浸提γ-聚谷氨酸，于4800r/min下离心30min获得上清液，加入3倍体积的预冷无水乙醇，离心收集γ-聚谷氨酸沉淀，将样品溶于去离子水中，定容至500mL，使用紫外分光光度计进行含量检测，经过换算γ-聚谷氨酸的含量以g/kg(固体培养基干重)来表示。

以传统固体发酵作为对照实验，传统固体发酵与步骤3中的回流式固体发酵各条件均一样，只是不进行渗滤液回流喷淋，发酵结束后，进行γ-聚谷氨酸产量比较。

结果显示：本实施例的回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法所发酵的γ-聚谷氨酸产量为150.11g/Kg，传统固体发酵的产量为98.42g/Kg，本方法相较于对照组γ-聚谷氨酸产量提高了52.52％。

实施例3

本实施例与实施例2相同，不同的是：总物料中的玉米秸秆(粉碎至1cm)800g/Kg，豆粕200g/Kg，不添加工业副产物。另，步骤3中，通气量为2L/min，底层渗滤液每4h循环喷淋一次。工业副产物主要作用是提供谷氨酸，用作聚谷氨酸合成的前体；因豆粕中蛋白含量高，经菌体降解后后提供很多各种不同的氨基酸，包括谷氨酸，因此也可以不需要再添加其他物质来提供前体。

γ-聚谷氨酸产量结果显示：本实施例的发酵方法所发酵的γ-聚谷氨酸产量为176.04g/Kg，传统固体发酵的产量为102.30g/Kg，本方法相较于对照组γ-聚谷氨酸产量提高了72.08％。

实施例4

本实施例与实施例2相同，不同的是：本实施例以200L的发酵罐进行发酵。

步骤1中，获得一级种子培养物后，进行二级种子液培养，包括将一级种子培养物接种于50L的种子罐，接种量为8％，发酵温度为37℃、搅拌转速为200rpm、通气量为1vvm，培养24h，获得二级种子培养物；

步骤2中，农业废弃物包括玉米秸秆和水稻秸秆，玉米秸秆(粉碎至1cm)300g/Kg，水稻秸秆(粉碎至1-2cm)300g/Kg，豆粕250g/Kg，工业副产物选用工业味精粗品，150g/Kg。总物料为120kg，接种量为物料总重量的5％。

步骤3中，发酵温度为35℃，发酵时长为96h，通气量为50L/min，底层渗滤液每4h循环喷淋一次，循环流速20L/min，循环时间10min。

γ-聚谷氨酸产量结果显示：本实施例的发酵方法所发酵的γ-聚谷氨酸产量为191.34g/Kg，传统固体发酵的产量为96.40g/Kg，本方法相较于对照组γ-聚谷氨酸产量提高了98.48％。

实施例5

本实施例与实施例2相同，不同的是：本实施例以100L的发酵罐进行发酵。

步骤2中，农业废弃物包括玉米秸秆、玉米芯、水稻秸秆和油菜秸秆，其中，玉米秸秆(粉碎至1cm)300g/Kg，玉米芯100g/Kg，水稻秸秆和油菜秸秆各125g/Kg，工业副产物选用浓缩味精废水，350g/Kg。总物料为60kg，接种量为物料总重量的8％。

步骤3中，发酵温度为40℃，发酵时长为72h，通气量为35L/min，底层渗滤液每8h循环喷淋一次，循环流速10L/min，循环时间8min。

γ-聚谷氨酸产量结果显示：本实施例的发酵方法所发酵的γ-聚谷氨酸产量为100.12g/Kg，传统固体发酵的产量为40.02g/Kg，本方法相较于对照组γ-聚谷氨酸产量提高了150％。

实施例6

本实施例与实施例5不同的是：步骤2中，农业废弃物包括玉米秸秆、小麦秸秆、菜籽饼和花生饼，玉米秸秆(粉碎至1cm)200g/Kg，小麦秸秆100g/Kg，菜籽饼和花生饼均为200g/Kg，工业副产物选用味精粕和工业味精粗品的混合物，质量比为1：1，共300g/Kg。总物料为60kg，接种量为物料总重量的6％。

步骤3中，发酵温度为30℃，发酵时长为84h，通气量为25L/min，底层渗滤液每6h循环喷淋一次，循环流速15L/min，循环时间8min。

γ-聚谷氨酸产量结果显示：本实施例的发酵方法所发酵的γ-聚谷氨酸产量为142.10g/Kg，传统固体发酵的产量为90.22g/Kg，本方法相较于对照组γ-聚谷氨酸产量提高了57.50％。

对比例1

本对比例与实施例2不同的是，玉米秸秆(粉碎至1cm)含量为350g/Kg时，工业味精粗品添加量为650g/Kg，此时，谷氨酸浓度过高抑制了解淀粉芽孢杆菌FEP205的生长代谢，未检测到聚谷氨酸的合成，造成原料浪费。

对比例2

本对比例与实施例2不同的是，当农业废弃物添加量为850g/Kg时，工业废弃物添加量为150g/Kg，副产物中谷氨酸钠不够发酵所消耗，则会造成发酵底物不足，最终造成发酵γ-聚谷氨酸产量较低，仅20.11g/Kg。

对比例3

本对比例与实施例1相比，通气量为60L/min，导致发酵失败，具体原因为：a水分会随通气散失，通气量过大则会造成水分大量逃逸，甚至将物料吹干，直接导致微生物死亡，发酵失败；b热量也会随通气散失，通气过大会造成热量散失严重，发酵罐无法保温，发酵失败；此外，通气耗电极大，过高的通气量会大量浪费能源，不符合国家节约环保的大政策。

对比例4

本对比例与实施例1相比，循环流速30L/min，由于物料堆叠一起，会严重阻碍液体流回发酵罐底部的速度，此时渗滤液回流速度过大，将出现上层液体堆积，而下层液体被抽干的现象，从而造成泵空转，轻则浪费能源，严重会造成回流泵毁坏。

实施例7

本实施例给出一种回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的装置，用于实现实施例1～6所述的回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法，结合图1～2，包括发酵罐体1，所述的发酵罐体1的内壁设置加热保温层4，发酵罐体1的内部水平设置多个分层隔板5，分层隔板5上用于放置发酵生产γ-聚谷氨酸的固体培养基，分层隔板5上均匀布设若干小孔；

发酵罐体1一侧连通设置用于鼓入外部无菌空气的气泵2，发酵罐体1另一侧连通设置蠕动泵3，发酵罐体1的内部顶端设置喷头6，蠕动泵3与喷头6之间连通管道，蠕动泵3用于将发酵罐体1底层的固体培养基的渗滤液经管道输送至喷头6，进而回流喷淋至发酵罐体1顶层的固体培养基中，分层隔板5上的小孔用于沿重力方向均匀分流各层固体培养基的渗滤液。

在本实施例的优选方案中，发酵罐体1的容积为20-200L；分层隔板5的数量可以为3个，均互相平行设置，每个分层隔板5上每平方英寸设置10-20个孔。气泵2与蠕动泵3之间连通的管道上设置气体分布器7，气体分布器7设置于发酵罐体1内底部，气体分布器7的形状可根据发酵罐体1的形状进行设置，例如可以为环形，均匀的将外部气泵2鼓入的无菌空气进行均匀的分布，并通向固体培养基，进而更加均匀快速的发酵生产γ-聚谷氨酸。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将枯草芽孢杆菌进行培养获得种子培养物；

步骤2：将农业废弃物、工业副产物和无机盐混合为总物料，调节所述总物料的水分含量和pH，将调节后的物料用作固体培养基；

步骤3：将步骤1获得的种子培养物接种至步骤2所述的固体培养基上，保温，通入无菌空气进行发酵，发酵后将所述固体培养基的渗滤液通过蠕动泵循环重新喷淋至固体培养基中，进行回流式固体发酵。

2.如权利要求1所述的回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌保藏名称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FEP205，于2021年01月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCCNo.21731。

3.如权利要求2所述的回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于，步骤1具体包括将冻存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FEP205接种到斜面活化培养基进行活化，将活化后的菌种接种到种子培养基中进行扩大培养，获得种子培养物。

4.如权利要求3所述的回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于，所述的斜面活化培养基的成分包括：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5-10g/L，琼脂20g/L，pH7.0-7.4；菌种活化培养条件为30-37℃培养24-48h。

5.如权利要求3所述的回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于，所述的种子培养基的成分包括蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5-10g/L，pH 7.0-7.4；种子培养条件为：摇瓶中30-37℃、150-200rpm，培养24-48h；10-50L的种子罐中，培养温度为30-37℃、搅拌转速为150-200rpm、通气量为1.0-2.0vvm，培养24-48h。

6.如权利要求2所述的回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于，步骤2所述的农业废弃物包括玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆、水稻秸秆、高粱秸秆、油菜秸秆、甘蔗渣、豆粕、菜籽饼和花生饼中的一种或多种混合，添加量为400-1000g/Kg；

所述的工业副产物包括味精粕、工业味精粗品和浓缩味精废水中的一种或多种混合，添加量为0-600g/Kg；

所述的无机盐包括MgSO₄·7H₂O 500-1500mg/Kg，FeCl₃·6H₂O 20-60mg/Kg，MnSO₄·H₂O100-300mg/Kg；

所述总物料的水分含量调节至75-85％，pH为7.0-7.5。

7.如权利要求2所述的回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于，所述的总物料重量为20-150Kg，所述种子培养物的接种量为总物料重量的5-10％。

8.如权利要求2所述的回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于，步骤3中发酵温度为30-40℃，发酵时长为48-96h，通气量为1-50L/min；

所述的固体培养基的渗滤液每4-8h循环喷淋一次，循环流速2-20L/min，循环时间5-10min。

9.一种回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的装置，其特征在于，用于实现权利要求1～8所述的回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的发酵方法，包括发酵罐体(1)，所述的发酵罐体(1)的内壁设置加热保温层(4)，发酵罐体(1)的内部水平设置多个分层隔板(5)，分层隔板(5)上用于放置发酵生产γ-聚谷氨酸的固体培养基，分层隔板(5)上均匀布设若干小孔；

所述发酵罐体(1)一侧连通设置用于鼓入外部无菌空气的气泵(2)，发酵罐体(1)另一侧连通设置蠕动泵(3)，发酵罐体(1)的内部顶端设置喷头(6)，蠕动泵(3)与喷头(6)之间连通管道，蠕动泵(3)用于将发酵罐体(1)底层的固体培养基的渗滤液经管道输送至喷头(6)，进而回流喷淋至发酵罐体(1)顶层的固体培养基中，分层隔板(5)上的小孔用于沿重力方向均匀分流各层固体培养基的渗滤液。

10.如权利要求9所述的回流式固体发酵生产γ-聚谷氨酸的装置，其特征在于，所述的发酵罐体(1)的容积为20-200L；

所述分层隔板(5)的数量为3个，每个分层隔板(5)上每平方英寸设置10-20个孔；

所述的气泵(2)与蠕动泵(3)之间连通的管道上设置气体分布器(7)，所述的气体分布器(7)设置于发酵罐体(1)内底部。

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