CN109161492A - 一种γ-聚谷氨酸产生菌及高效合成γ-聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种γ‑聚谷氨酸产生菌，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis hzy‑1），已保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号CCTCC M 2018226,保藏日期为2018年5月3日。同时还公开了一种高效合成γ‑聚谷氨酸的方法。和现有生产γ‑聚谷氨酸技术相比，本发明使用的枯草芽孢杆菌菌株可以高效地发酵生产γ‑聚谷氨酸，且生产的γ‑聚谷氨酸的分子量在1000KDa以上，通过对枯草芽孢杆菌菌株培养条件的优化，可使发酵液中的γ‑聚谷氨酸含量达40‑60g/L，从而提供一种高效廉价制备γ‑聚谷氨酸的方法。本发明所生产的γ‑聚谷氨酸可应用在农业、化妆品等领域。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种γ-聚谷氨酸的合成菌株以及高效制备大分子γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，以下简称γ-PGA）是由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体通过γ-酰胺键连接而成的一类均聚氨基酸，可由微生物发酵合成。由于γ-PGA具有极佳的成膜性、成纤维性、可塑性、粘合性、保湿型、可降解性等优异的理化和生物学特性，在工农业、化妆品与医药等领域极具应用潜力。
聚谷氨酸的制备方法有化学合成、提取和微生物发酵三种方法。微生物发酵法比前两种方法的生产成本低，生产过程对环境的污染小，产量高等优势，所以现在主要采用微生物发酵法生产γ-PGA。国内外对γ-PGA的发酵工艺进行了广泛的研究，主要以液体深层发酵的培养基配方和培养工艺为主。南京工业大学筛选得到一种γ-PGA高产菌株BacillusSubtilis NX-2，并对液体发酵生产γ-PGA做了比较全面的研究，并申请了专利，专利公开号为CN1346891.华中农业大学也进行了γ-PGA产生菌的筛选和工艺的研究，其菌种和液体生产工艺也已经申请了专利，专利公开号为CN1536071.Kubota在Osaka City University土壤中分离得到一种Bacillus Subtilis F201，该菌株在最佳发酵条件下可达到50g/L的最高产量，这是文献报道的最高产量（Kubota H.Biosci Biotec Biochem，1993:1212-1213）。
虽然γ-PGA的发酵生产取得了较大的进展，但是仍然存在生产周期较长，生产效率低下的问题。因此，高产量、高效率、低成本生产γ-PGA仍有待进一步研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种γ-聚谷氨酸高产菌，该菌株能够高效合成高分子量的γ-聚谷氨酸。
本发明还要解决的技术问题是提供利用上述γ-聚谷氨酸生产菌制备γ-聚谷氨酸的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
申请人从盐碱地土壤中筛选得到一种γ-聚谷氨酸产生菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis hzy-1），该菌株已保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号CCTCC M 2018226,保藏日期为2018年4月23日。其性状特征如下所述：
（1）形态特征
在LB琼脂培养基上营养细胞为0.6-1.2X1.2-4um大小的杆菌，37℃培养2-3天形成芽孢，芽孢大小为0.3-0.7X1.0-2.0um，为椭圆形。
（2）培养性质
1）葡萄糖、酵母膏、琼脂培养基平板培养：30-35℃培养12h可大量生长，菌落呈圆形，边缘整齐湿润、粘稠、半透明状。
2）葡萄糖、酵母膏液体培养基：在液体表面形成白色的菌膜，培养液浑浊。
3)葡萄糖、酵母膏穿刺培养：菌体在表面生长，底部不生长。
（3）生理生化性质：如表1所示
表1 Bacillus Subtilis hzy-1的生理生化性质
（4）16S rDNA序列分析
测得16S rDNA大部分序列，长度1426bp，具体如SEQ ID NO.1所示。将所测序列与GenBank数据库中的相关种进行比较，构建以16S rDNA全序列为基础的系统发育树，具体如SEQ ID NO.2所示。结果表明该菌株与枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）同源性为99%。结合形态、细胞化学成分及16s rDNA全序列分析的系统发育研究结果，可以将其分类定位为枯草芽孢杆菌，具体为枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）W84的一个亚种.
菌株Bacillus Subtilis W84可采用如下防水剂保藏：将Bacillus Subtilis W84接于固体平板培养基，30-37℃培养10-24h，可用于4℃短期保藏。或将培养好的BacillusSubtilis W84接入20-40%（v/v）无菌甘油冻存管中，-50—-80℃冷冻长期保藏。
γ-聚谷氨酸产生菌可用于生产γ-聚谷氨酸。
利用上述的γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：
（1）种子培养：将活化后的Bacillus Subtilis W84菌种接种于含有碳源、氮源、谷氨酸钠、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床温度30-37℃，转速150-220rpm振荡培养8-14h至对数生长期中期。
（2）发酵培养：将种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸钠、无机盐和水的无菌发酵培养基中，接种量1-10%（v/v），摇瓶装液量50-500mL/1000mL，摇床温度30-37℃，转速180-220rpm下培养24-36h；或者接入含有碳源、氮源、谷氨酸钠、无机盐和水的无菌发酵罐中，接种量1-10%（v/v），通气量0.4-3.0vvm，30-37℃下培养24-40h。
（3）γ-PGA的提取与纯化：①发酵液的酸化处理：调发酵液pH至2.0-4.5；②发酵液除菌：采用微滤膜滤除菌体；③超滤浓缩：加入3-10倍体积的纯净水稀释，采用超滤膜对稀释后的无菌发酵液进行浓缩除杂，并重复稀释浓缩步骤3-5次，直至浓缩后的体积为原发酵液的15-50%；④γ-聚谷氨酸的分离纯化：将超滤浓缩后的液体调pH3.0-7.5后，直接采用低级醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-聚谷氨酸成品；或将超滤浓缩后的液体调pH至5.0-7.5后，加入钠盐后，在采用低级醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-聚谷氨酸盐的成品。
其中，种子培养基或发酵培养基中，碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、柠檬酸钠和糖蜜中的任意一种或几种任意比例的组合；优选葡萄糖、蔗糖、柠檬酸钠中的任意一种或几种任意比例的组合；最优选葡萄糖。氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母膏、玉米浆、尿素、氯化铵、硫酸铵中的任意一种或几种任意比例的组合；优选蛋白胨、酵母膏和硫酸铵中的任意一种或几种任意比例的组合。无机盐为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰和氯化钙中的一种或几种任意比例的组合。
其中，种子培养基包含如下浓度的组分：碳源20-100g/L、氮源5-50g/L、谷氨酸钠10-100g/L、无机盐0.5-50g/L,其余为水，pH 6.0-7，5；优选的方式是种子培养基包含如下浓度的组分:碳源20-40g/L、氮源15-40g/L、谷氨酸钠10-50g/L、无机盐4-50g/L,其余为水，pH 6.5-7，5。
其中，发酵培养基包含如下组分碳源20-100g/L、氮源5-50g/L、谷氨酸钠10-160g/L、无机盐0.5-50g/L,其余为水，pH 5.5-7.5。优选的方式是发酵培养基包含如下浓度的组分:碳源40-100g/L、氮源15-40g/L、谷氨酸钠50-150g/L、无机盐10-50g/L,其余为水，pH6.5-7，5。
步骤（2）中要分批补加碳源。
步骤（2）中要分批补加谷氨酸钠。
步骤（2）中要适时调节培养基的pH值。
步骤（3）中微滤除菌所使用的微滤膜孔径为0.1-0.5um。
步骤（3）中超滤浓缩所使用的超滤膜截留分子量为200-1500KDa。
步骤（3）中所述的低级醇为甲醇或乙醇。
步骤（3）中所用于调节pH值的物质为硫酸、盐酸、磷酸、氢氧化钠、氢氧化钾或氨水。
步骤（3）中γ-聚谷氨酸的分离和纯化时加入的钠盐为氯化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠或谷氨酸钠中的一种或几种任意比例的组合。
步骤（3）中分离和纯化γ-聚谷氨酸时加入的钠盐的含量为0.5-20%。
本发明方法获得的γ-PGA产品理化性质如下：
本产品能溶于水，不溶于甲醇、乙醇和丙酮等有机溶剂；本产品经高温酸水解后与茚三酮显色反应呈阳性；水解产物经氨基酸分析仪检测只出现一个谷氨酸峰。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有以下优势：
1）本发明使用的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）W84对碳源和氮源的利用较为广泛，且可以直接利用谷氨酸钠。这对于实现γ-PGA的工业化生产是极其有利的条件。
2）通过对培养条件的优化，本发明使用的枯草芽孢杆菌微生物菌株BacillusSubtilis W84可以高效的发酵生产γ-PGA，产量可达60-120g/L。
3）本发明使用的枯草芽孢杆菌微生物菌株Bacillus Subtilis W84制备的γ-PGA的分子量主要集中于1000KDa以上。这一特性使得本发明所生产的γ-聚谷氨酸可广泛应用在农业、化妆品等领域。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应该也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
一种γ-聚谷氨酸产生菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis hzy-1），该菌株已保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号CCTCC M 2018226,保藏日期为2018年4月23日。其性状特征如下所述：
（1）形态特征
在LB琼脂培养基上营养细胞为0.6-1.2X1.2-4um大小的杆菌，37℃培养2-3天形成芽孢，芽孢大小为0.3-0.7X1.0-2.0um，为椭圆形。
（2）培养性质
1）葡萄糖、酵母膏、琼脂培养基平板培养：30-35℃培养12h可大量生长，菌落呈圆形，边缘整齐湿润、粘稠、半透明状。
2）葡萄糖、酵母膏液体培养基：在液体表面形成白色的菌膜，培养液浑浊。
3)葡萄糖、酵母膏穿刺培养：菌体在表面生长，底部不生长。
（3）生理生化性质：如表1所示
表1 Bacillus Subtilis hzy-1的生理生化性质
（4）16S rDNA序列分析
测得16S rDNA大部分序列，长度1426bp，具体如SEQ ID NO.1所示。将所测序列与GenBank数据库中的相关种进行比较，构建以16S rDNA全序列为基础的系统发育树，具体如SEQ ID NO.2所示。结果表明该菌株与枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）同源性为99%。结合形态、细胞化学成分及16s rDNA全序列分析的系统发育研究结果，可以将其分类定位为枯草芽孢杆菌，具体为枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）W84的一个亚种.
菌株Bacillus Subtilis W84可采用如下防水剂保藏：将Bacillus Subtilis W84接于固体平板培养基，30-37℃培养10-24h，可用于4℃短期保藏。或将培养好的BacillusSubtilis W84接入20-40%（v/v）无菌甘油冻存管中，-50—-80℃冷冻长期保藏。
γ-聚谷氨酸产生菌可用于生产γ-聚谷氨酸。
利用上述的γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：
（1）种子培养：将活化后的Bacillus Subtilis W84菌种接种于含有碳源、氮源、谷氨酸钠、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床温度30-37℃，转速150-220rpm振荡培养8-14h至对数生长期中期。
（2）发酵培养：将种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸钠、无机盐和水的无菌发酵培养基中，接种量1-10%（v/v），摇瓶装液量50-500mL/1000mL，摇床温度30-37℃，转速180-220rpm下培养24-36h；或者接入含有碳源、氮源、谷氨酸钠、无机盐和水的无菌发酵罐中，接种量1-10%（v/v），通气量0.4-3.0vvm，30-37℃下培养24-40h。
（3）γ-PGA的提取与纯化：①发酵液的酸化处理：调发酵液pH至2.0-4.5；②发酵液除菌：采用微滤膜滤除菌体；③超滤浓缩：加入3-10倍体积的纯净水稀释，采用超滤膜对稀释后的无菌发酵液进行浓缩除杂，并重复稀释浓缩步骤3-5次，直至浓缩后的体积为原发酵液的15-50%；④γ-聚谷氨酸的分离纯化：将超滤浓缩后的液体调pH3.0-7.5后，直接采用低级醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-聚谷氨酸成品；或将超滤浓缩后的液体调pH至5.0-7.5后，加入钠盐后，在采用低级醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-聚谷氨酸盐的成品。
其中，种子培养基或发酵培养基中，碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、柠檬酸钠和糖蜜中的任意一种或几种任意比例的组合；优选葡萄糖、蔗糖、柠檬酸钠中的任意一种或几种任意比例的组合；最优选葡萄糖。氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母膏、玉米浆、尿素、氯化铵、硫酸铵中的任意一种或几种任意比例的组合；优选蛋白胨、酵母膏和硫酸铵中的任意一种或几种任意比例的组合。无机盐为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰和氯化钙中的一种或几种任意比例的组合。
其中，种子培养基包含如下浓度的组分：碳源20-100g/L、氮源5-50g/L、谷氨酸钠10-100g/L、无机盐0.5-50g/L,其余为水，pH 6.0-7，5；优选的方式是种子培养基包含如下浓度的组分:碳源20-40g/L、氮源15-40g/L、谷氨酸钠10-50g/L、无机盐4-50g/L,其余为水，pH 6.5-7，5。
其中，发酵培养基包含如下组分碳源20-100g/L、氮源5-50g/L、谷氨酸钠10-160g/L、无机盐0.5-50g/L,其余为水，pH 5.5-7.5。优选的方式是发酵培养基包含如下浓度的组分:碳源40-100g/L、氮源15-40g/L、谷氨酸钠50-150g/L、无机盐10-50g/L,其余为水，pH6.5-7，5。
步骤（2）中要分批补加碳源。
步骤（2）中要分批补加谷氨酸钠。
步骤（2）中要适时调节培养基的pH值。
步骤（3）中微滤除菌所使用的微滤膜孔径为0.1-0.5um。
步骤（3）中超滤浓缩所使用的超滤膜截留分子量为200-1500KDa。
步骤（3）中所述的低级醇为甲醇或乙醇。
步骤（3）中所用于调节pH值的物质为硫酸、盐酸、磷酸、氢氧化钠、氢氧化钾或氨水。
步骤（3）中γ-聚谷氨酸的分离和纯化时加入的钠盐为氯化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠或谷氨酸钠中的一种或几种任意比例的组合。
步骤（3）中分离和纯化γ-聚谷氨酸时加入的钠盐的含量为0.5-20%。
下面结合具体的实施例，详细描述本发明的γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法。
实施例1：
斜面培养基组分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/l，琼脂15g/L，PH7.0,121℃灭菌20分钟。
种子培养基的配制：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，PH7.0，121℃灭菌20分钟。
发酵培养基配制：葡萄糖40g/L，蛋白胨5 g/L，谷氨酸钠30 g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MgSO4 0.25 g/L，硫酸铵 3 g/L，硫酸锰0.1g/L,PH7.0，115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）W84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量为20mL/250mL,摇床转速200rpm，37℃培养24h。
发酵结束后，检测发酵液γ-PGA含量约达65g/L。硫酸调发酵液pH至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量500KDa）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调pH至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-PGA。
实施例2：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖 20 g/L；谷氨酸钠 5 g/L；磷酸氢二钾 2 g/L；硫酸镁2.5 g/L；酵母膏 5 g/L；硫酸锰 0.2 g/L，pH 7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：葡萄糖40g/L，蛋白胨5 g/L，谷氨酸钠50 g/L，磷酸氢二钾 8g/L，硫酸镁 0.5 g/L，硫酸铵 3 g/L，硫酸锰0.1g/L,PH7.0，115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）W84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量为20mL/250mL,摇床转速200rpm，37℃培养20h。
发酵结束后，检测发酵液γ-PGA含量约达80g/L。硫酸调发酵液pH至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量500KDa）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调pH至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-PGA。
实施例3：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖 20 g/L；谷氨酸钠 5 g/L；磷酸氢二钾 2 g/L；硫酸镁2.5 g/L；酵母膏 5 g/L；硫酸锰 0.2 g/L，pH 7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：蔗糖40g/L，蛋白胨5 g/L，谷氨酸钠50 g/L，磷酸氢二钾 8 g/L，硫酸镁 0.5 g/L，硫酸铵 3 g/L，硫酸锰0.1g/L,PH7.0，115℃灭菌15分钟。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）W84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量为20mL/250mL,摇床转速200rpm，37℃培养20h。
发酵结束后，检测发酵液γ-PGA含量约达70g/L。硫酸调发酵液pH至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量500KDa）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调pH至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-PGA。
实施例4：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖 20 g/L；谷氨酸钠 5 g/L；磷酸氢二钾 2 g/L；硫酸镁2.5 g/L；酵母膏 5 g/L；硫酸锰 0.2 g/L，pH 7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：糖蜜40g/L，蛋白胨5 g/L，谷氨酸钠50 g/L，磷酸氢二钾 8 g/L，硫酸镁 0.5 g/L，硫酸铵 3 g/L，硫酸锰0.1g/L,PH7.0，115℃灭菌15分钟。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）W84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量为20mL/250mL,摇床转速200rpm，37℃培养20h。
发酵结束后，检测发酵液γ-PGA含量约达78g/L。硫酸调发酵液pH至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量500KDa）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调pH至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-PGA。
实施例5：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖 20 g/L；谷氨酸钠 5 g/L；磷酸氢二钾 2 g/L；硫酸镁2.5 g/L；酵母膏 5 g/L；硫酸锰 0.2 g/L，pH 7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：葡萄糖40g/L，酵母膏5 g/L，谷氨酸钠50 g/L，磷酸氢二钾 8g/L，硫酸镁 0.5 g/L，硫酸铵 3 g/L，硫酸锰0.1g/L,PH7.0，115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）W84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量为20mL/250mL,摇床转速200rpm，37℃培养20h。
发酵结束后，检测发酵液γ-PGA含量约达87g/L。硫酸调发酵液pH至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量500KDa）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调pH至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-PGA。
实施例6：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖 20 g/L；谷氨酸钠 5 g/L；磷酸氢二钾 2 g/L；硫酸镁2.5 g/L；酵母膏 5 g/L；硫酸锰 0.2 g/L，pH 7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：葡萄糖40g/L，酵母粉5 g/L，谷氨酸钠50 g/L，磷酸氢二钾 8g/L，硫酸镁 0.5 g/L，硫酸铵 3 g/L，硫酸锰0.1g/L,PH7.0，115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）W84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量为20mL/250mL,摇床转速200rpm，37℃培养20h。
发酵结束后，检测发酵液γ-PGA含量约达89g/L。硫酸调发酵液pH至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量500KDa）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调pH至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-PGA。
实施例7：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖 20 g/L；谷氨酸钠 5 g/L；磷酸氢二钾 2 g/L；硫酸镁2.5 g/L；酵母膏 5 g/L；硫酸锰 0.2 g/L，pH 7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：葡萄糖40g/L，玉米浆5 g/L，谷氨酸钠50 g/L，磷酸氢二钾 8g/L，硫酸镁 0.5 g/L，硫酸铵 3 g/L，硫酸锰0.1g/L,PH7.0，115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）W84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量为20mL/250mL,摇床转速200rpm，37℃培养20h。
发酵结束后，检测发酵液γ-PGA含量约达75g/L。硫酸调发酵液pH至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量500KDa）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调pH至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-PGA。
实施例8：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖 20 g/L；谷氨酸钠 5 g/L；磷酸氢二钾 2 g/L；硫酸镁2.5 g/L；酵母膏 5 g/L；硫酸锰 0.2 g/L，pH 7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：葡萄糖45g/L，蛋白胨5 g/L，谷氨酸钠45g/L，磷酸氢二钾12g/L，磷酸二氢钾 2g/L，硫酸镁 2.5 g/L，硫酸铵 5 g/L，硫酸锰0.1g/L,PH7.0，115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）W84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量2%（v/v），摇瓶装液量为20mL/250mL,摇床转速200rpm，37℃培养20h。
发酵结束后，检测发酵液γ-PGA含量约达97g/L。硫酸调发酵液pH至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量500KDa）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调pH至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-PGA。
实施例9：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖 20 g/L；谷氨酸钠 5 g/L；磷酸氢二钾 2 g/L；硫酸镁2.5 g/L；酵母膏 5 g/L；硫酸锰 0.2 g/L，pH 7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：葡萄糖45g/L，蛋白胨5 g/L，谷氨酸钠45g/L，磷酸氢二钾12g/L，磷酸二氢钾 2g/L，硫酸镁 2.5 g/L，硫酸铵 5 g/L，硫酸锰0.1g/L,PH7.0，115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）W84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入6L发酵罐中培养基中，接种量5%（v/v），发酵罐装液量4L,转速280rpm，33℃培养24h。
发酵过程中根据发酵液中残糖量和谷氨酸量，及时补加葡萄糖和谷氨酸钠，使其维持适当浓度。
发酵结束后，检测发酵液γ-PGA含量约达118g/L。硫酸调发酵液pH至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量800KDa）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调pH至6.5，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-PGA。
实施例10：
菌种的斜面活化：同实施例1。
种子培养基配制：葡萄糖 20 g/L；谷氨酸钠 5 g/L；磷酸氢二钾 2 g/L；硫酸镁2.5 g/L；酵母膏 5 g/L；硫酸锰 0.2 g/L，pH 7.0。115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
发酵培养基的配制：葡萄糖45g/L，蛋白胨5 g/L，谷氨酸钠45g/L，磷酸氢二钾12g/L，磷酸二氢钾 2g/L，硫酸镁 2.5 g/L，硫酸铵 5 g/L，硫酸锰0.1g/L,PH7.0，115℃灭菌15分钟（葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
将低温保存的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）W84菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h。将经斜面活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速200rpm，37℃培养12h。
将上步活化的种子液接入6L发酵罐中培养基中，接种量5%（v/v），发酵罐装液量4L,转速280rpm，33℃培养24h。
发酵过程中根据发酵液中残糖量和谷氨酸量，及时补加葡萄糖和谷氨酸钠，使其维持适当浓度。
发酵结束后，检测发酵液γ-PGA含量约达118g/L。硫酸调发酵液pH至3.0，采用滤膜孔径0.22um微滤膜滤除菌体，再加入15倍蒸馏水稀释，采用超滤膜（截留分子量800KDa）对稀释去菌液进行浓缩，重复稀释-浓缩步骤2-4次，对最终浓缩液用氢氧化钠调pH至6.5，加入2%的碳酸氢钠或碳酸钠固体，采用2.5倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到白色粉末晶体γ-PGA。
实施例11
一种γ-聚谷氨酸产生菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis hzy-1），该菌株已保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号CCTCC M 2018226,保藏日期为2018年4月23日。
实施例12
γ-聚谷氨酸产生菌的用途，可用于生产γ-聚谷氨酸。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
核苷酸或氨基酸序列表
SEQUENCE LISTING
1 CTAATACATG CAAGTCGAGC GGACAGATGG GAGCTTGCTC CCTGATGTTA GCGGCGGACG
61 GGTGAGTAAC ACGTGGGTAA CCTGCCTGTA AGACTGGGAT AACTCCGGGA AACCGGGGCT
121 AATACCGGAT GGTTGTCTGA ACCGCATGGT TCAGACATAA AAGGTGGCTT CGGCTACCAC
181 TTACAGATGG ACCCGCGGCG CATTAGCTAG TTGGTGAGGT AACGGCTCAC CAAGGCGACG
241 ATGCGTAGCC GACCTGAGAG GGTGATCGGC CACACTGGGA CTAGGACACG GCCCAGACTC
301 CTACGGGAGG CAGCAGTAGG GAATCTTCCG CAATGGACGA AAGTCTGACG GAGCAACGCC
361 GCGTGAGTGA TGAAGGTTTT CGGATCGTAA AGCTCTGTTG TTAGGGAAGA ACAAGTGCCG
421 TTCAAATAGG GCGGCACCTT GACGGTACCT AACCAGAAAG CCACGGCTAA CTACGTGCCA
481 GCAGCCGCGG TAATACGTAG GTGGCAAGCG TTGTCCGGAA TTATTGGGCG TAAAGGGCTC
541 GCAGGCGGTT TCTTAAGTCT GATGTGAGAG CCCCCGGCTC AACCGGGGAG GGTCATTGGA
601 AACTGGGGAA CTTGAGTGCA GAAGAGGAGA GTGGAATTCC ACGTGTAGCG GTGAAATGCG
661 TAGAGATGTG GAGGAACACC AGTGGCGAAG GCGACTCTCT GGTCTGTAAC TGACGCTGAG
721 GAGCGAAAGC GTGGGGAGCG AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCACGC CGTAAACGAT
781 GAGTGCTAAG TGTTAGGGGG TTTCCGCCCC TTAGTGCTGC AGCTAACGCA TTAAGCACTC
841 CGCCTGGGGA GTACGATCGC AAGACTGAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG
901 CGGTGGAGCA TGTGGTTTAA TTCGAAGCAA CGCGAAGAAC CTTACCAGGT CTTGACATCC
961 TCTGACAATC CTAGAGATAG GACGTCCCCT TCGGGGGCAG AGTGACAGCT GGTGCATGGT
1021 TGTCGTCAGC TCGTGTCGTG AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTTGAT
1081 CTTAGTTGCC AGCATTCAGT TGGGCACTCT AAGGTGACTG CCGGTGACAA ACCGGAGGAA
1141 GGTGGGGATG ACGTCAAATC ATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACAC GTGTCACAAT
1201 GGACAGAACA AAGGGCAGCG AAACCGCGAG GTTAAGCCAA TCCCACAAAT CTGTTCTCAG
1261 TTCGGATCGC AGTCTGCAAC TCGACTGCGT GAAGCTGGAA TCGCTAGTAA TCGCGGATCA
1321 GCATGCCGCG GTGAATACGT TCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACA CCACGAGAGT
1381 TTGTAACACC CGAAGTCGGT GAGGTAACCT TTAGGAGCCA GCCGCC
序列表
<110> 南京卉之源生物科技有限公司
<120> 一种γ-聚谷氨酸产生菌及高效合成γ-聚谷氨酸的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1426
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis hzy-1)
<400> 1
ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg 60
ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct 120
aataccggat ggttgtctga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac 180
ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg 240
atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctaggacacg gcccagactc 300
ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc 360
gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg 420
ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 480
gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc 540
gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgagag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga 600
aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg 660
tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag 720
gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780
gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc 840
cgcctgggga gtacgatcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900
cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc 960
tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacagct ggtgcatggt 1020
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat 1080
cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa 1140
ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgtcacaat 1200
ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag 1260
ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1320
gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt 1380
ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttaggagcca gccgcc 1426
Claims (18)
1.一种γ-聚谷氨酸产生菌，其特征在于：其分类命名为枯草芽孢杆菌BacillusSubtilis hzy-1 ，已保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号CCTCC M2018226,保藏日期为2018年5月3日。
2.如权利要求1所述的一种γ-聚谷氨酸产生菌，其特征在于：所述γ-聚谷氨酸产生菌具有序列表NO.1的DNA序列。
3.如权利要求1所述的一种γ-聚谷氨酸产生菌，其特征在于：所述γ-聚谷氨酸产生菌株是从盐碱地土壤中筛选得到，在固体平板上表现为：菌落呈圆形、边缘整齐湿润、粘稠、半透明状且菌落斑点大。
4.一种γ-聚谷氨酸产生菌的应用，其特征在于：γ-聚谷氨酸产生菌用于生产γ-聚谷氨酸。
5.如权利要求4所述的一种γ-聚谷氨酸产生菌，其特征在于：所述γ-聚谷氨酸产生菌所制得的γ-聚谷氨酸分子量为1000Kd及以上。
6.一种γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）菌种活化：划线接种枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis hzy-1至LB固体培养基，35℃恒温倒置培养12小时；
（2）种子培养：将经固体平板活化的枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis hzy-1菌种接种于含有碳源、氮源、谷氨酸钠、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床温度30-35℃，转速150-220rpm振荡培养8-14h至对数生长期中期；
（3）发酵培养：将种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸钠、无机盐和水的无菌发酵培养基中，接种量2-5%（v/v），摇瓶装液量50-300mL/1000mL，摇床温度30-35℃，转速180-220rpm下培养24-36h；或者接入含有碳源、氮源、谷氨酸钠、无机盐和水的无菌发酵罐中，接种量2-5%（v/v），通气量0.4-2.0vvm，30-35℃下培养24-30h；
（4）γ-聚谷氨酸的提取与纯化：①发酵液的酸化处理：调发酵液pH至2.0-4.5；②发酵液除菌：采用微滤膜滤或板框除菌体；③超滤浓缩：加入3-10倍体积的纯净水稀释，采用超滤膜对稀释后的无菌发酵液进行浓缩除杂，并重复稀释浓缩步骤3-5次，直至浓缩后的体积为原发酵液的15-50%；④γ-聚谷氨酸的分离纯化：将超滤浓缩后的液体调pH3.0-7.5后，直接采用低级醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-聚谷氨酸成品；或将超滤浓缩后的液体调pH至5.0-7.5后，加入钠盐后，再采用低级醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终得到γ-聚谷氨酸钠的成品。
7.如权利要求6所述的一种γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所制得的γ-聚谷氨酸分子量为大于等于1000KDa。
8.如权利要求6所述的一种γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：无菌种子培养基或无菌发酵培养基中，碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、柠檬酸钠和糖蜜中的任意一种或几种任意比例的组合；氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母膏、玉米浆、尿素、氯化铵、硫酸铵中的任意一种或几种任意比例的组合；无机盐为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰和氯化钙中的一种或几种任意比例的组合。
9.如权利要求6所述的一种一种γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：无菌种子培养基包含如下浓度的组分：碳源20-100g/L、氮源5-50g/L、谷氨酸钠10-100g/L、无机盐0.5-50g/L,其余为水，pH 6.0-7，5；发酵培养基包含如下组分碳源20-100g/L、氮源5-50g/L、谷氨酸钠10-160g/L、无机盐0.5-50g/L,其余为水，pH 5.5-7.5。
10.如权利要求6所述的一种一种γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：步骤（3）中要分批补加碳源。
11.如权利要求6所述的一种一种γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：步骤（3）中要分批补加谷氨酸钠。
12.如权利要求6所述的一种一种γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：步骤（3）中要适时调节培养基的pH值。
13.如权利要求6所述的一种一种γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：步骤（4）中微滤除菌所使用的微滤膜孔径为0.1-0.5um。
14.如权利要求6所述的一种一种γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：步骤（4）中超滤浓缩所使用的超滤膜截留分子量为200-1500KDa。
15.如权利要求6所述的一种一种γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的低级醇为甲醇或乙醇。
16.如权利要求6所述的一种一种γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：步骤（4）中所用于调节pH值的物质为硫酸、盐酸、磷酸、氢氧化钠、氢氧化钾或氨水。
17.如权利要求6所述的一种一种γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：步骤（4）中γ-聚谷氨酸的分离和纯化时加入的钠盐为氯化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠或谷氨酸钠中的一种或几种任意比例的组合。
18.如权利要求6所述的一种一种γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：步骤（4）中γ-聚谷氨酸的分离和纯化时加入的钠盐的含量为0.5-20%。
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Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110042129A (zh) * | 2019-04-16 | 2019-07-23 | 广西鼎好农业科技有限公司 | 一种农业用γ-聚谷氨酸的制备方法 |
| CN110106212A (zh) * | 2019-04-16 | 2019-08-09 | 广西鼎好农业科技有限公司 | 一种化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法 |
| CN110129225A (zh) * | 2019-05-14 | 2019-08-16 | 山东汉泰生物科技有限公司 | γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法 |
| CN110229852A (zh) * | 2019-06-20 | 2019-09-13 | 东莞理工学院 | 一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN110373346A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-10-25 | 上海市农业科学院 | 枯草芽孢杆菌Bacillus sp.A-5及其用途 |
| CN110734938A (zh) * | 2019-11-11 | 2020-01-31 | 四川轻化工大学 | 枯草芽孢杆菌YB18及其在发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用 |
| CN110904012A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-03-24 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一株枯草芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的应用 |
| CN110951798A (zh) * | 2020-01-07 | 2020-04-03 | 广东丸美生物技术股份有限公司 | γ-聚谷氨酸的生物发酵方法及其应用 |
| CN111226528A (zh) * | 2020-01-14 | 2020-06-05 | 浙江工业大学 | 一种利用枯草芽孢杆菌延缓土壤盐结晶的方法 |
| CN114752522A (zh) * | 2022-04-11 | 2022-07-15 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一株高产γ-聚谷氨酸的耐盐芽孢杆菌及其发酵条件优化 |
| CN114774488A (zh) * | 2022-05-13 | 2022-07-22 | 山东福瑞达生物科技有限公司 | 一种含低内毒素γ-聚谷氨酸的生产方法 |
| CN114854635A (zh) * | 2022-05-18 | 2022-08-05 | 四川生力源生物工程有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌的发酵培养基与一种生产γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN115058352A (zh) * | 2022-03-28 | 2022-09-16 | 四川师范大学 | 一种枯草芽孢杆菌及其生产农用γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN115259958A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-11-01 | 四川师范大学 | 一种生物炭吸附聚谷氨酸的微生物颗粒肥及其制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101948785A (zh) * | 2010-08-31 | 2011-01-19 | 南京医科大学 | 一株γ-聚谷氨酸产生菌及利用其制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法 |
| WO2011108809A2 (ko) * | 2010-03-05 | 2011-09-09 | Park Hae-Sung | 보존성이 향상된 프로테아제 및 그 제조방법 |
| CN107828707A (zh) * | 2017-11-08 | 2018-03-23 | 河南慧宝源生物医药科技有限公司 | 一种高产大分子量γ‑聚谷氨酸的基因工程菌及其构建方法 |
-
2018
- 2018-08-06 CN CN201810887277.9A patent/CN109161492A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011108809A2 (ko) * | 2010-03-05 | 2011-09-09 | Park Hae-Sung | 보존성이 향상된 프로테아제 및 그 제조방법 |
| CN101948785A (zh) * | 2010-08-31 | 2011-01-19 | 南京医科大学 | 一株γ-聚谷氨酸产生菌及利用其制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法 |
| CN107828707A (zh) * | 2017-11-08 | 2018-03-23 | 河南慧宝源生物医药科技有限公司 | 一种高产大分子量γ‑聚谷氨酸的基因工程菌及其构建方法 |
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110042129B (zh) * | 2019-04-16 | 2022-09-13 | 广西多得乐生物科技有限公司 | 一种农业用γ-聚谷氨酸的制备方法 |
| CN110106212A (zh) * | 2019-04-16 | 2019-08-09 | 广西鼎好农业科技有限公司 | 一种化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法 |
| CN110042129A (zh) * | 2019-04-16 | 2019-07-23 | 广西鼎好农业科技有限公司 | 一种农业用γ-聚谷氨酸的制备方法 |
| CN110106212B (zh) * | 2019-04-16 | 2022-10-25 | 广西多得乐生物科技有限公司 | 一种化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法 |
| CN110129225A (zh) * | 2019-05-14 | 2019-08-16 | 山东汉泰生物科技有限公司 | γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法 |
| CN110373346A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-10-25 | 上海市农业科学院 | 枯草芽孢杆菌Bacillus sp.A-5及其用途 |
| CN110373346B (zh) * | 2019-06-10 | 2023-05-23 | 上海市农业科学院 | 枯草芽孢杆菌Bacillus sp.A-5及其用途 |
| CN110229852A (zh) * | 2019-06-20 | 2019-09-13 | 东莞理工学院 | 一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN110229852B (zh) * | 2019-06-20 | 2021-02-23 | 东莞理工学院 | 一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN110734938A (zh) * | 2019-11-11 | 2020-01-31 | 四川轻化工大学 | 枯草芽孢杆菌YB18及其在发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用 |
| CN110904012A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-03-24 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一株枯草芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的应用 |
| CN110951798A (zh) * | 2020-01-07 | 2020-04-03 | 广东丸美生物技术股份有限公司 | γ-聚谷氨酸的生物发酵方法及其应用 |
| CN111226528B (zh) * | 2020-01-14 | 2022-02-08 | 浙江工业大学 | 一种利用枯草芽孢杆菌延缓土壤盐结晶的方法 |
| CN111226528A (zh) * | 2020-01-14 | 2020-06-05 | 浙江工业大学 | 一种利用枯草芽孢杆菌延缓土壤盐结晶的方法 |
| CN115058352A (zh) * | 2022-03-28 | 2022-09-16 | 四川师范大学 | 一种枯草芽孢杆菌及其生产农用γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN115058352B (zh) * | 2022-03-28 | 2023-08-11 | 四川师范大学 | 一种枯草芽孢杆菌及其生产农用γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN114752522A (zh) * | 2022-04-11 | 2022-07-15 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一株高产γ-聚谷氨酸的耐盐芽孢杆菌及其发酵条件优化 |
| CN114752522B (zh) * | 2022-04-11 | 2023-08-04 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一株高产γ-聚谷氨酸的耐盐芽孢杆菌及其发酵条件优化 |
| CN114774488A (zh) * | 2022-05-13 | 2022-07-22 | 山东福瑞达生物科技有限公司 | 一种含低内毒素γ-聚谷氨酸的生产方法 |
| CN114854635A (zh) * | 2022-05-18 | 2022-08-05 | 四川生力源生物工程有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌的发酵培养基与一种生产γ-聚谷氨酸的方法 |
| CN115259958A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-11-01 | 四川师范大学 | 一种生物炭吸附聚谷氨酸的微生物颗粒肥及其制备方法 |
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