CN110106212B - 一种化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种化妆品级γ‑聚谷氨酸的制备方法，包括以下步骤：微生物发酵、离心除菌、过滤浓缩和干燥。本发明通过微生物发酵、离心除菌、膜过滤浓缩和干燥等4个相对简单的工艺完成了化妆品级γ‑聚谷氨酸的制备，简化了常规γ‑聚谷氨酸的生产工艺流程，降低了生产成本，并且所得产品分子量为800‑1200kDa，性状为白色或淡白色粉末，固体样品中聚谷氨酸含量>90％，能够满足化妆品级γ‑聚谷氨酸的需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸是一种由D-谷氨酸单体和L-谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基之间形成的肽键连接形成的一种中性高分子聚合物，分子量通常介于 100KD-1000KD之间。多由微生物发酵合成得到，常用的微生物主要为地衣芽孢杆菌属和枯草芽孢杆菌属。γ-聚谷氨酸具有多种独特的物理、化学及生物学特性，如良好的水溶性、超强的吸附能力及具有生物降解性，并且其降解产物对人体和环境无毒害性等。可作为增稠剂、保水剂、缓释剂、药物载体等应用于工业、农业、食品及医学等领域。
γ-聚谷氨酸具有超强的保湿能力，其保湿能力是透明质酸、玻尿酸的数倍，应用在化妆品中，可起到防止皮肤结缔组织疏松引起的皮肤失去弹性和产生皱纹，起到保湿、美白、抗皱的作用。添加到化妆品中的γ-聚谷氨酸要求较高(分子量>700kDa，纯度>90％)，高分子量的γ-聚谷氨酸因其黏度较大，后期提纯难度较大，目前所采取的提纯、制备工艺主要包括板框过滤除菌、乙醇或异丙醇反复沉淀、结晶、冷冻干燥等方法，工艺复杂，需要大量的乙醇或异丙醇，生产成本高，为工业化生产带来许多不便。
目前，还没有化妆品级γ-聚谷氨酸制备的相关专利。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明拟提供一种化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，简化后处理工艺，降低生产成本，为化妆品级γ-聚谷氨酸的工业化生产提供可能。
本发明提供了如下技术方案：
一种化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)微生物发酵：转接菌种至发酵罐中进行发酵，得到发酵液，发酵过程中维持发酵温度、通气量、搅拌速度和发酵PH值；
(2)离心除菌：将所得发酵液添加水，混合均匀后，离心，收集上清液；
(3)膜过滤浓缩：将所得上清液用膜过滤浓缩，得到浓缩液；
(4)干燥：将所得浓缩液加热后，干燥。
作为优选，所述步骤(1)中菌种为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis PG1-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15718。
作为优选，所述步骤(1)中菌种以5％的体积比接种到发酵培养基中。
作为优选，所述步骤(1)中维持发酵温度35-50℃，通气量1.0-2.0vvm，搅拌速度150-250rpm，发酵pH 6.5-7.0，发酵60-72h后停止发酵；其中发酵前期，通气量和搅拌速度分别控制在1.0vvm和150rpm，发酵后期随着发酵液黏度增加，需要增加通气量和搅拌速度；发酵后期，调整发酵温度为50℃至发酵结束。
作为优选，所述步骤(1)中通过添加氨水或柠檬酸维持发酵过程中的pH 值。
作为优选，所述步骤(2)中发酵液添加10-15倍体积的水，离心速度为 12000rpm，离心1h。
作为优选，所述步骤(3)中上清液用中空纤维膜过滤，浓缩至原体积的 1/2-1倍。
作为优选，所述中空纤维膜截留分子量为300-500kDa，过膜压力 0.1-0.3Mpa。
作为优选，所述步骤(4)中浓缩液加温至90℃，进行喷雾干燥；喷雾干燥进风温度为150℃，出风温度110℃。
作为优选，喷雾干燥时浓缩液中聚谷氨酸含量调整为20-40g/L；喷雾干燥所得产品为白色或淡黄色粉末，无丝状物出现。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过微生物发酵、离心除菌、膜过滤浓缩和干燥等4个相对简单的工艺完成了化妆品级γ-聚谷氨酸的制备，简化了常规γ-聚谷氨酸的生产工艺流程，降低了生产成本。
(2)本发明所得产品分子量为800-1200kDa，性状为白色或淡白色粉末，固体样品中聚谷氨酸含量＞90％，能够满足化妆品级γ-聚谷氨酸的需求。
保藏信息说明
贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis PG1-2，保藏编号为CGMCC No.15718，保藏日期为2018年5月2日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明实施例中菌种为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis PG1-2；菌种液体培养基为(g/L)：葡萄糖40，酵母粉5，蛋白胨5，KH2PO4 1，K2HPO4 1， MgSO4-7H2O 0.2，初始pH7.0-7.2；发酵培养基(g/L)：蔗糖120，酵母粉20，蛋白胨5，谷氨酸钠80，KH2PO4 1，K2HPO4 1，CaCl2 0.2，初始pH 7.0-7.2。
实施例1
一种化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)微生物发酵：从菌株保存平板挑选菌株转接至液体培养基中，37℃， 200rpm震荡培养16h至对数生长中期；菌种以5％接种量转接至装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，维持发酵pH 6.5；发酵前期：0-24h，维持发酵温度35℃，通气量1.0vvm，搅拌速度150rpm；发酵中期：24-48h，维持发酵温度35℃，通气量调整为1.5vvm，搅拌速度调整为200rpm，发酵后期：48-72h，调整发酵温度为50℃，通气量维持1.5vvm，搅拌速度维持200rpm，发酵至72h停止；
(2)离心除菌：放出发酵液，添加300L水，离心机12000rpm，离心 1h，收集上清；
(3)膜过滤浓缩：将所得上清液用中空纤维膜过滤，浓缩至30L停止过滤，得到浓缩液；其中中空纤维膜截留分子量为300kDa，过膜压力0.2Mpa；
(4)干燥：将所得浓缩液加热至90℃，进行喷雾干燥；喷雾干燥进风温度为150℃，出风温度110℃；收集干燥所得粉末，检测聚谷氨酸含量和分子量，固体粉末中聚谷氨酸含量91.3％，聚谷氨酸分子量介于865kDa。
实施例2
一种化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)微生物发酵：从菌株保存平板挑选菌株转接至液体培养基中，37℃， 200rpm震荡培养16h至对数生长中期；菌种以5％接种量转接至装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，维持发酵pH 6.5；发酵前期：0-24h，维持发酵温度40℃，通气量1.0vvm，搅拌速度150rpm；发酵中期：24-60h，维持发酵温度40℃，通气量调整为1.5vvm，搅拌速度调整为200rpm，发酵后期： 60-72h，调整发酵温度为50℃，通气量维持1.5vvm，搅拌速度维持200rpm，发酵至72h停止；
(2)离心除菌：放出发酵液，添加300L水，离心机12000rpm，离心 1h，收集上清；
(3)膜过滤浓缩：将所得上清液用中空纤维膜过滤，浓缩至30L停止过滤，得到浓缩液；其中中空纤维膜截留分子量为500kDa，过膜压力0.3Mpa；
(4)干燥：将所得浓缩液加热至90℃，进行喷雾干燥；喷雾干燥进风温度为150℃，出风温度110℃；收集干燥所得粉末，检测聚谷氨酸含量和分子量，固体粉末中聚谷氨酸含量92.4％，聚谷氨酸分子量介于1160kDa。
实施例3
一种化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)微生物发酵：从菌株保存平板挑选菌株转接至液体培养基中，37℃， 200rpm震荡培养16h至对数生长中期；菌种以5％接种量转接至装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，维持发酵pH 6.5；发酵前期：0-24h，维持发酵温度37℃，通气量1.0vvm，搅拌速度150rpm；发酵中期：24-48h，维持发酵温度37℃，通气量调整为1.5vvm，搅拌速度调整为200rpm，发酵后期： 48-60h，调整发酵温度为50℃，通气量维持1.5vvm，搅拌速度维持200rpm，发酵至60h停止；
(2)离心除菌：放出发酵液，添加450L水，离心机12000rpm，离心 1h，收集上清；
(3)膜过滤浓缩：将所得上清液用中空纤维膜过滤，浓缩至30L停止过滤，得到浓缩液；其中中空纤维膜截留分子量为300kDa，过膜压力0.3Mpa；
(4)干燥：将所得浓缩液加热至90℃，进行喷雾干燥；喷雾干燥进风温度为150℃，出风温度110℃；收集干燥所得粉末，检测聚谷氨酸含量和分子量，固体粉末中聚谷氨酸含量90.8％，聚谷氨酸分子量介于960kDa。
实施例4
一种化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)微生物发酵：从菌株保存平板挑选菌株转接至液体培养基中，37℃， 200rpm震荡培养16h至对数生长中期；菌种以5％接种量转接至装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，维持发酵pH 6.5；发酵前期：0-24h，维持发酵温37℃，通气量1.0vvm，搅拌速度150rpm；发酵中期：24-48h，维持发酵温度37℃，通气量调整为1.5vvm，搅拌速度调整为200rpm，发酵后期：48-72 h，调整发酵温度为50℃，通气量维持1.5vvm，搅拌速度维持200rpm，发酵至72h停止；
(2)离心除菌：放出发酵液，添加450L水，离心机12000rpm，离心 1h，收集上清；
(3)膜过滤浓缩：将所得上清液用中空纤维膜过滤，浓缩至30L停止过滤，得到浓缩液；其中中空纤维膜截留分子量为500kDa，过膜压力0.3Mpa；
(4)干燥：将所得浓缩液加热至90℃，进行喷雾干燥；喷雾干燥进风温度为150℃，出风温度110℃；收集干燥所得粉末，检测聚谷氨酸含量和分子量，固体粉末中聚谷氨酸含量95.6％，聚谷氨酸分子量介于1085kDa。
在实施例1-4中均能实现化妆品级γ-聚谷氨酸的顺利制备，固体粉末中聚谷氨酸含量均＞90％，聚谷氨酸分子量介于800kDa-1200kDa。说明本发明制备化妆品级γ-聚谷氨酸方法简化了生产工艺，降低了生产成本，提高了生产效率，为化妆品级γ-聚谷氨酸的工业化生产提供了可能。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (5)
1.一种化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）微生物发酵：从菌株保存平板挑选菌株转接至液体培养基中，37 ℃，200 rpm震荡培养16 h至对数生长中期；转接菌种至发酵罐中发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，发酵过程中维持发酵温度、通气量、搅拌速度和发酵PH值；
（2）离心除菌：将所得发酵液添加水，混合均匀后，离心，收集上清液；
（3）过滤浓缩：将所得上清液用膜过滤浓缩，得到浓缩液；
（4）干燥：将所得浓缩液加热后，干燥；
步骤（1）中所述的菌种液体培养基为（g/L）：葡萄糖40，酵母粉5，蛋白胨5，KH2PO4 1，K2HPO4 1，MgSO4-7H2O 0.2，初始pH 7.0-7.2；
步骤（1）中所述的发酵培养基（g/L）：蔗糖120，酵母粉20，蛋白胨5，谷氨酸钠 80，KH2PO41，K2HPO4 1，CaCl2 0.2，初始pH 7.0-7.2；
所述步骤（1）中菌种为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis PG1-2，已保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.15718；
所述步骤（1）中菌种以5%的体积比接种到发酵培养基中；
所述步骤（1）中维持发酵温度35-50 ℃，通气量1.0-2.0 vvm，搅拌速度150-250rpm，发酵pH 6.5-7.0，发酵60-72 h后停止发酵；其中发酵前期，通气量和搅拌速度分别控制在1.0vvm和150 rpm，发酵后期随着发酵液黏度增加，需要增加通气量和搅拌速度；发酵后期，调整发酵温度为50 ℃至发酵结束；
所述步骤（1）中通过添加氨水或柠檬酸维持发酵过程中的pH值；
所述步骤（2）中发酵液添加10-15倍体积的水，离心速度为12000 rpm，离心1 h。
2.根据权利要求1所述的化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中上清液用中空纤维膜过滤，浓缩至原体积的1/2-1倍。
3.根据权利要求2所述的化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，所述中空纤维膜截留分子量为300-500 kDa，过膜压力0.1-0.3 Mpa。
4.根据权利要求1所述的化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中浓缩液加温至90 ℃，进行喷雾干燥；喷雾干燥进风温度为150 ℃，出风温度110 ℃。
5.根据权利要求4所述的化妆品级γ-聚谷氨酸的制备方法，其特征在于，喷雾干燥时浓缩液中聚谷氨酸含量调整为20-40 g/L；喷雾干燥所得产品为白色或淡黄色粉末，无丝状物出现。
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