CN103613753B - 一种无添加有机溶剂分离提纯聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无添加有机溶剂分离提纯聚谷氨酸的方法，通过降低发酵液粘度后，采用硅藻土和红土混合进行板框过滤除菌，并采用加热与中空纤维膜超滤结合的方式除杂蛋白及大分子活性有机物，活性炭脱色后经纳滤膜重复过滤去除大部分氨基酸及盐离子，采用10kDa和100kDa超滤膜对经上述处理的清液进行加压循环超滤-稀释-超滤-浓缩步骤，最终得到杂质很少的γ-PGA浓溶液，经真空冷冻干燥，得到精制白色γ-PGA。本发明方法除杂效果显著，能够实现γ-PGA的有效提纯，制得γ-PGA的纯度高达90%以上，省去了传统工艺中醇析这一必需提取手段，降低了工业成本和危险度，并节省了能源。
Description
技术领域:
本发明属于生物法合成及提纯技术领域，特别涉及一种不添加有机溶剂分离提纯生物发酵液中生物可降解高分子材料——聚谷氨酸的方法。
背景技术:
γ-聚谷氨酸（γ-Polyglutamicacid，简写γ-PGA）是一种天然存在的多聚合物，是一种非常有潜力的可降解生物高分子材料，在环境日益恶劣、资源日益匮乏的今天，高效开发生产γ-PGA就显得尤为重要。γ-PGA是由L型和D型谷氨酸两种单体通过γ-酰胺键连接起来的均聚氨基酸，是某些芽孢杆菌（Bacillus）合成的一种细胞外高分子聚合化合物，γ-PGA在体内被酶分解为谷氨酸,进入三羧酸循环,无毒副作用,在自然环境中,γ-PGA彻底分解或燃烧后,生成二氧化碳和水，对环境没有任何污染。作为一种极具潜力的高分子材料，利用γ-PGA制成的水凝胶不仅保留了普通水凝胶材料的基本特性，还具有结构可控性、高吸水性、较高机械强度、生物可降解性等特性。特别是通过芽孢杆菌发酵生产获得的γ-PGA，其分子链上有大量活性较高的侧链羧基，具有良好的高吸水性（1：3500，m/v）、生物相容性、生物降解性、无毒无害等优点，可作为化妆品添加剂、保水剂、高吸水树脂、重金属吸附剂、食品添加剂、医药载体、组织工程材料等广泛应用于化妆品、食品、农业、医药、合成纤维和涂膜等领域。
20世纪90年代以来，日本、美国等一些发达国家对γ-PGA制备和应用的研究十分活跃，利用微生物发酵法生产γ-PGA的技术也处在世界的前列，以味之素株式会社、明治制果公司和广崎大学为代表的国外单位对γ-PGA的性能、合成和应用做了较深入地研究，γ-PGA已有商业产品，但我国在这方面研究的相对较少，分离提取工艺的不成熟更是制约了γ-PGA的高效生产。
全程采用膜分离法处理γ-PGA发酵液的方法未有报道，此方法既能降低现有技术的能量损耗，减少有机溶剂的的使用，又能达到提取γ-PGA的目的，更符合工业生产要求。膜分离技术利用膜对混合物中各组分的选择透过性来分离、提取、和浓缩目的产物，膜分离过程在常温下进行，无相变，能耗低，设备简单，操作控制方便，已在化工、医药、轻工、食品、纺织、电子、冶金等多个领域得到应用。适用于发酵液处理的膜分离技术有微滤、超滤、纳滤和反渗透。微滤截留0.01～10um以上的粒子，如菌体、细胞、不溶物等，常用于超滤预处理过程；超滤膜截留分子量5000～500000，膜孔径1～20nm，可以截留病毒、蛋白质、酶、多糖等大分子物质；反渗透只允许溶剂分子通过，盐、氨基酸等小分子物质也被截留；纳滤膜平均孔径2nm，截留组分可小到抗生素、合成药、染料、二糖等，允许水、无机盐、有机物等小分子物质通过，截留性能介于超滤和反渗透之间。膜材料可分为高分子膜、无机膜和液体膜，常用的是高分子膜，其次是无机膜。膜结构可分为对称膜和非对称膜，超滤通常为非对称膜，非对称膜中起截留作用的是致密的表面皮层，其厚度仅0.1～15um，在皮下有多孔网状结构和支撑层，支撑层厚度在50～250um，这样既保证对大分子物质的有效截留，又降低分离操作时膜对阻力。提高了膜通量，也具有了一定的机械强度。
γ-PGA是一种胞外产物，其发酵液很黏，用一般的离心法去除菌体很难，且不适用于工业大规模应用。提取γ-PGA通常有三种方法：膜分离沉淀法、化学沉淀法和有机溶剂沉淀法，因为膜分离沉淀法工艺相对较复杂，对杂质含量较为复杂的发酵液提取效果并不理想，经常造成堵膜现象而清洗膜又较为繁琐，在工业γ-PGA提取工艺中受到限制，化学沉淀法用无机盐进行沉淀，后续除盐步骤较为繁琐，同时γ-PGA中含有游离的羧基，可以大量结合众多无机盐离子，增加了去除离子的难度，故工业上提取γ-PGA都是采用的有机溶剂沉淀法。为了降低去除菌体的能量消耗和节省用于沉淀的有机溶剂用量，DO.J.H等对原工艺进行优化，提出了一种高效分离γ-PGA的方法。该方法由两步组成：首先调PH至3.0使粘度为原发酵液的1/6，再离心除菌体，这样使得离心能量降为原来的17%；然后将去菌液回调至PH5.0，用中空纤维膜进行超滤，使得发酵液中的γ-PGA由原来的20g/L，浓缩至60g/L，提取所需的乙醇用量减少为原来的1/4，降低了提取γ-PGA的成本。但是这种方法，没有经过除杂步骤，在截留过程中对纤维膜的要求较高，而且离心除菌能耗大，工业生产难以放大生产。南京工业大学对γ-PGA提取方面在此基础上进行了调整，在一篇《γ-聚谷氨酸提取的发酵液预处理及分离纯化工艺》中提到，除菌方法用三氯乙酸调PH降低粘度，抽滤去除菌体，然后利用超滤和醇析相结合的方法对γ-PGA进行提取，最终实现了γ-PGA提取，但最终还是用了有机溶剂乙醇进行醇析。也有文章报道，用异丙醇和丙酮代替乙醇提取γ-PGA，但收益也不乐观，并且有机溶剂的应用增加了工业化大生产的危险性和成本。
因此，降低发酵液粘度，同时后续分离中减少有机溶剂的使用，高效提取γ-PGA，一直是困扰地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）发酵制备γ-PGA的主要问题之一，需高度重视。
发明内容
本发明的目的是提供一种从γ-PGA发酵液中高效提取γ-PGA的方法，所用菌种为地衣芽孢杆菌，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC3336。具体见天津北洋百川生物技术有限公司申请号为200910228297的发明专利《惰性载体固态发酵法生产γ-聚谷氨酸的方法》，采用的发酵方法为该公司发明的一种高效低耗的发酵方法，具体见申请号201210219500.5的发明专利《一种生产聚谷氨酸的方法》。本发明的发酵液中，杂质被控制的较为单一，除杂过后的膜分离过程中，不容易造成堵膜现象，完全可以采用膜分离方法进行有效提取γ-PGA，主要杂质有大分子蛋白、多糖、小分子色素以及一些氨基酸、盐类和其他小分子有机杂质等，其分子量(Mw)分布在2×105-8×105之间。本发明针对发酵液特性及杂质分布，结合现代膜分离技术，提供一种高效且无有机溶剂提取γ-PGA的方法，过程中没有应用任何有机溶剂，实现了膜分离法提取γ-PGA，γ-PGA总收率率在90%以上，与目前文献最高报道90.6%相持平，提取工艺中无有机溶剂使用，降低了成本和工业生产的危险性。
一种无添加有机溶剂分离提纯聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：
一、发酵液制备：
将编号CGMCC3336的地衣芽孢杆菌发酵培养，得发酵液；
二、发酵液提取
（1）除菌体
将发酵液PH调至4.5～5.5，降低粘度，硅藻土和红土按2：1比例混合，加入量为2%-3%(m：v)，800目滤布，板框过滤除菌体，压力为0.22MPa。
（2）除杂蛋白及大分子活性有机物
上述去除菌体的发酵液调PH6.5～7.5，加热升温至90℃保温20min,除去热变形蛋白，冷却至室温，过0.45um中空纤维膜进行超滤，除掉80%以上杂蛋白。
（3）脱色
上述处理过后发酵液加入活性炭进行常温慢速搅拌脱色，抽滤，至液体基本澄清无色，脱色效果显著。
（4）除小分子氨基酸、离子杂质
上述发酵液稀释后过纳滤膜，再重复此过程，经检测，能去除大部分氨基酸及盐离子。
（5）超滤-浓缩-超滤提纯
采用10kDa和100kDa超滤膜对经上述处理的清液进行加压循环超滤-稀释-超滤-浓缩步骤，最终得到杂质很少的γ-PGA浓溶液，将上述溶液真空冷冻干燥，得到精制白色γ-PGA。
作为上述技术方案的优选方案，本发明无添加有机溶剂分离提纯聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：
一、菌种活化：
将编号CGMCC3336的地衣芽孢杆菌在固体培养基斜面上于37℃培养16个小时，制备成熟的斜面种子。
二、种子培养：
将活化后的斜面种子接入一环至50ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，37℃，220rpm，培养16个小时到对数生长期。
三、发酵培养：
将种子培养液接入发酵培养液中，接种量为10%，220rpm下培养72h，下罐γ-PGA产量为30g/L～45g/L。
四、发酵液提取
（1）除菌体
将发酵液PH调至4.5～5.5，降低粘度，硅藻土和红土按2：1比例混合，加入量为2%-3%(m：v)，800目滤布，板框过滤除菌体，压力为0.22MPa，流速20～30ml/min。
（2）除杂蛋白及大分子活性有机物
上述去除菌体的发酵液用氢氧化钠调PH6.5～7.5，加热升温至90℃保温20min,除去热变形蛋白，冷却至室温，过0.45um中空纤维膜进行超滤，除掉80%以上杂蛋白。
（3）脱色
上述处理过后发酵液加入1%～1.5%活性炭进行常温慢速搅拌脱色90min，抽滤，液体基本澄清无色，脱色效果显著。
（4）除小分子氨基酸、离子杂质
上述发酵液稀释2～3倍后过纳滤膜，再重复此过程，经检测，能去除大部分氨基酸及盐离子。
（5）超滤-浓缩-超滤提纯
采用10kDa和100kDa超滤膜对经上述处理的清液进行加压循环超滤-稀释-超滤-浓缩步骤，最终得到杂质很少的γ-PGA浓溶液，将上述溶液真空冷冻干燥，得到精制白色γ-PGA，纯度在90%以上。
培养基配制方法如下：
（1）斜面培养基：酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaCl5.0，琼脂20，上述组分单位为g/L，pH7.2±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。
(2)种子培养基：酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K2HPO4·H2O0.5，MgSO4·7H2O0.5，上述组分单位为g/L，pH7.2±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。
（3）发酵培养基：葡萄糖80、味精90.55、NH4NO318、NaCl15、MgSO4·7H2O1.1894、CaCl2·6H2O2.0、FeSO4·7H2O0.02；121℃高压蒸汽灭菌20min。精氨酸0.272、组氨酸0.52、亮氨酸0.33、苏氨酸0.5、甲硫氨酸0.481、谷氨酰胺0.3173、氯化胆碱0.13和吡哆醇0.002，膜过滤除菌，上述组分单位为g/L。
有益效果：
本发明与现有技术相比：第一，适当降低发酵液粘度，引入较少盐离子，将硅藻土和红土混合加入发酵液中，板框过滤除菌时，有效形成滤饼层，进行菌体去除；第二，对发酵液中杂质进行有目的的去除，达到很好的除杂效果；第三，按照本发明方法生产出来的γ-PGA分子量分布在2×105-8×105之间，利用纳滤超滤膜结合除杂，采用10kDa和100kDa超滤膜循环稀释-浓缩，对γ-PGA进行有效提纯，最后进行真空冷冻干燥，纯度高达90%以上，省去了传统工艺中醇析这一必需提取手段，降低了工业成本和危险度，并节省了能源。
具体实施方式
实施例1
一、培养基配制：
（1）斜面培养基：酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaCl5.0，琼脂20；上述组分单位为g/L，pH7.2±0.1，121℃高压蒸汽灭菌20min。
(2)种子培养基：酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K2HPO4·H2O0.5，MgSO4·7H2O0.5，上述组分单位为g/L，pH7.2±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。
（3）发酵培养基：葡萄糖80、味精90.55、NH4NO318、NaCl15、MgSO4·7H2O1.1894、CaCl2·6H2O2.0、FeSO4·7H2O0.02；121℃高压蒸汽灭菌20min。精氨酸0.272、组氨酸0.52、亮氨酸0.33、苏氨酸0.5、甲硫氨酸0.481、谷氨酰胺0.3173、氯化胆碱0.13和吡哆醇0.002，上述组分单位为g/L，膜过滤除菌。
二、菌种活化：
将编号CGMCC3336的菌种在富含固体培养基斜面上于37℃培养16个小时，制备成熟的斜面种子。
三、种子培养：
将活化后的斜面种子接入一环转入50ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，共接14瓶，37℃，220rpm，培养16个小时到对数生长期。
四、发酵培养：
将长好的种子培养液接入发酵培养液中，10L发酵罐进行发酵，接种量为10%，装液量为7L，转速220rpm，培养72h，下罐γ-PGA产量为45g/L。
五、发酵液提取
（1）除菌体：将发酵液PH调至4.5，粘度由71.4mPa·s降低至33.9mPa·s，硅藻土和红土按2：1混合，加入量为2%质量体积百分比，800目滤布，0.22MPa压力，板框过滤除菌体，流速25ml/min。
（2）除杂蛋白及大分子活性有机物
上述去除菌体的发酵液用氢氧化钠调PH6.5，加热升温至90℃保温20min，冷却至室温，过0.45um中空纤维膜进行超滤，除掉80%以上杂蛋白。
（3）脱色
上述处理过后发酵液加入1%活性炭进行常温慢速搅拌脱色90min，抽滤，液体基本澄清无色，脱色效果显著，得发酵液4L。
（4）除小分子氨基酸、离子杂质
上述发酵液稀释至10L过0.01um孔径纳滤膜，透过液定容至10L，再次过0.01um孔径纳滤膜，经检测，能去除大部分氨基酸及盐离子，得清液8.2L。
（5）超滤-浓缩-超滤提纯
上述8.2L清液，进行100kDa超滤，进口压30Pis，出口压10Pis，得保留液4L，透过液3.8L，检测，透过液中，无γ-PGA，但含有Glu、离子、多糖及少量小分子色素等，将保留液定容到8.2L，继续100kDa超滤，进口压30Pis，出口压10Pis，得保留液4.1L，透过液3.8L，经检测透过液含有少量Glu和离子，将4.1L保留液进行100kDa超滤膜循环超滤，最终得到3.0L保留液，稀释1.5倍至4.5L，进行10kDa超滤膜超滤，进口压30Pis，出口压10Pis，得到3.2L保留液和0.8L透过液，检测透过液中含有微量杂质，将3.2L保留液进行循环浓缩至2.8L，为最终浓缩样，γ-PGA含量为62.4g/L。真空冷冻干燥后，样品为白色片絮状，纯度92.4%。
实施例2
一、培养基配制：
（1）斜面培养基：酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaCl5.0，琼脂20；上述组分单位为g/L，pH7.2±0.1，121℃高压蒸汽灭菌20min。
(2)种子培养基：酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K2HPO4·H2O0.5，MgSO4·7H2O0.5，上述组分单位为g/L，pH7.2±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。
（3）发酵培养基：葡萄糖80、味精90.55、NH4NO318、NaCl15、MgSO4·7H2O1.1894、CaCl2·6H2O2.0、FeSO4·7H2O0.02；121℃高压蒸汽灭菌20min。精氨酸0.272、组氨酸0.52、亮氨酸0.33、苏氨酸0.5、甲硫氨酸0.481、谷氨酰胺0.3173、氯化胆碱0.13和吡哆醇0.002，上述组分单位为g/L，膜过滤除菌。
二、菌种活化：
将编号CGMCC3336的菌种在富含固体培养基斜面上于37℃培养16个小时，制备成熟的斜面种子。
三、种子培养：
将活化后的斜面种子接入一环转入50ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，共接14瓶，37℃，转速220rpm，培养16个小时到对数生长期。
四、发酵培养：
将长好的种子培养液接入发酵培养液中，10L发酵罐进行发酵，接种量为10%，装液量为7L，转速220rpm，培养72h，下罐产量为32g/L。
五、发酵液提取
（1）除菌体：将发酵液PH调至5.0，粘度由66.4mPa·s降低至36.1mPa·s，硅藻土和红土按2：1混合，加入量为2.5%，800目滤布，0.22MPa压力，板框过滤除菌体，流速30ml/min。
（2）除杂蛋白及大分子活性有机物
上述去除菌体的发酵液用氢氧化钠调PH7.1，加热升温至90℃保温20min，冷却至室温，过0.45um中空纤维膜进行超滤，除掉80%以上杂蛋白。
（3）脱色
上述处理过后发酵液加入1.5%活性炭进行常温慢速搅拌脱色90min，抽滤，液体基本澄清无色，脱色效果显著，得发酵液3.8L。
（4）除小分子氨基酸、离子杂质
上述发酵液稀释至10L过0.01um孔径纳滤膜，透过液定容至10L，再次过0.01um孔径纳滤膜，经检测，能去除大部分氨基酸及盐离子，得清液7.25L。
（5）超滤-浓缩-超滤提纯
上述7.25L清液，进行100kDa超滤，进口压30Pis，出口压10Pis，得到保留液3.1L，透过液3.8L，检测，透过液中，无γ-PGA，但含有Glu、离子、多糖及少量小分子色素等，将保留液定容到7.25L，继续进行100kDa超滤，进口压30Pis，出口压10Pis，得到保留液3.7L，透过液3.0L，经检测透过液含有少量Glu和离子，将3.7L保留液进行100kDa超滤膜循环超滤，最终得到2.6L保留液，稀释1.5倍至3.9L，进行10kDa超滤，进口压30Pis，出口压10Pis，得到3.73L保留液和0.85L透过液，检测透过液中含有微量杂质，将3.73L保留液进行循环浓缩至2.3L，为最终浓缩样，γ-PGA含量为54.8.g/L。真空冷冻干燥后，样品为白色片絮状，纯度93.0%。
实施例3
一、培养基配制：
（1）斜面培养基：酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaCl5.0，琼脂20，上述组分单位为g/L，pH7.2±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。
(2)种子培养基：酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K2HPO4·H2O0.5，MgSO4·7H2O0.5，上述组分单位为g/L，pH7.2±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。
（3）发酵培养基：葡萄糖80、味精90.55、NH4NO318、NaCl15、MgSO4·7H2O1.1894、CaCl2·6H2O2.0、FeSO4·7H2O0.02；121℃高压蒸汽灭菌20min。精氨酸0.272、组氨酸0.52、亮氨酸0.33、苏氨酸0.5、甲硫氨酸0.481、谷氨酰胺0.3173、氯化胆碱0.13和吡哆醇0.002，有机膜过滤除菌；上述组分单位为g/L。
二、菌种活化：
将编号CGMCC3336的菌种在固体培养基斜面上于37℃培养16个小时，制备成熟的斜面种子。
三、种子培养：
将活化后的斜面种子接入一环至50ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，共接14瓶，37℃，转速220rpm，培养16个小时到对数生长期。
四、发酵培养：
将长好的种子培养液接入发酵培养液中，10L发酵罐进行发酵，接种量为10%，装液量为7L，转速220rpm，培养72h，下罐产量为39g/L。
五、发酵液提取
（1）除菌体：将发酵液PH调至5.2，粘度由75.2mPa·s降低至32.8mPa·s，硅藻土和红土按2：1混合，加入量为3%，800目滤布，0.22MPa压力，板框过滤除菌体，流速26ml/min。
（2）除杂蛋白及大分子活性有机物
上述去除菌体的发酵液用氢氧化钠调PH7.0，加热升温至90℃保温20min，冷却至室温，过0.45um中空纤维膜进行超滤，除掉80%以上杂蛋白。
（3）脱色
上述处理过后发酵液加入1.5%活性炭进行常温慢速搅拌脱色90min，抽滤，液体基本澄清无色，脱色效果显著，得发酵液4.5L。
（4）除小分子氨基酸、离子杂质
上述发酵液稀释至10L过0.01um孔径纳滤膜，透过液定容至10L，再次过0.01um孔径纳滤膜，经检测，能去除大部分氨基酸及盐离子，得清液8.1L。
（5）超滤-浓缩-超滤提纯
上述8.1L清液，进行100kDa超滤，进口压30Pis，出口压10Pis，得到保留液3.7L，透过液3.9L，检测，透过液中，无γ-PGA，但含有Glu、离子、多糖及少量小分子色素等，将保留液定容到8.1L，继续进行100kDa超滤，进口压30Pis，出口压10Pis，得到保留液3.4L，透过液4.1L，经检测透过液含有少量Glu和离子，将3.4L保留液进行100kDa超滤膜循环超滤，最终得到2.4L保留液，稀释1.5倍至3.6L，进行10kDa超滤膜超滤，进口压30Pis，出口压10Pis，得到2.8L保留液和0.61L透过液，检测透过液中含有微量杂质，将2.8L保留液进行循环浓缩至2.5L，为最终浓缩样，γ-PGA含量为60.1g/L。真空冷冻干燥后，样品为白色片絮状，纯度96.2%。
实施例4
一、培养基配制：
（1）斜面培养基：酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaCl5.0，琼脂20；上述组分单位为g/L，pH7.2±0.1，121℃高压蒸汽灭菌20min。
(2)种子培养基：酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K2HPO4·H2O0.5，MgSO4·7H2O0.5，上述组分单位为g/L，pH7.2±0.1。121℃高压蒸汽灭菌20min。
（3）发酵培养基：葡萄糖80、味精90.55、NH4NO318、NaCl15、MgSO4·7H2O1.1894、CaCl2·6H2O2.0、FeSO4·7H2O0.02；121℃高压蒸汽灭菌20min。精氨酸0.272、组氨酸0.52、亮氨酸0.33、苏氨酸0.5、甲硫氨酸0.481、谷氨酰胺0.3173、氯化胆碱0.13和吡哆醇0.002，上述组分单位为g/L，膜过滤除菌。
二、菌种活化：
将编号CGMCC3336的菌种在富含固体培养基斜面上于37℃培养16个小时，制备成熟的斜面种子。
三、种子培养：
将活化后的斜面种子接入一环转入50ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，共接14瓶，37℃，转速220rpm，培养16个小时到对数生长期。
四、发酵培养：
将长好的种子培养液接入发酵培养液中，10L发酵罐进行发酵，接种量为10%，装液量为7L，转速220rpm，培养72h，下罐产量为30g/L。
五、发酵液提取
（1）除菌体：将发酵液PH调至5.5，粘度由58.2mPa·s降低至27.1mPa·s，硅藻土和红土按2：1混合，加入量为2%，800目滤布，0.22MPa压力，板框过滤除菌体，流速20ml/min。
（2）除杂蛋白及大分子活性有机物
上述去除菌体的发酵液用氢氧化钠调PH7.3，加热升温至90℃保温20min，冷却至室温，过0.45um中空纤维膜进行超滤，除掉80%以上杂蛋白。
（3）脱色
上述处理过后发酵液加入1.5%活性炭进行常温慢速搅拌脱色90min，抽滤，液体基本澄清无色，脱色效果显著，得发酵液4.5L。
（4）除小分子氨基酸、离子杂质
上述发酵液稀释倍至10L过0.01um孔径纳滤膜，透过液定容至10L，再次过0.01um孔径纳滤膜，经检测，能去除大部分氨基酸及盐离子，得清液7.13L。
（5）超滤-浓缩-超滤提纯
上述7.13L清液，进行100kDa超滤，进口压30Pis，出口压10Pis，得到保留液3.3L，透过液3.5L，检测，透过液中，无γ-PGA，但含有Glu、离子、多糖及少量小分子色素等，将保留液定容到7.13L，继续进行100kDa超滤膜超滤，进口压30Pis，出口压10Pis，得到保留液3.4L，透过液3.2L，经检测透过液含有少量Glu和离子，将3.4L保留液进行100kDa超滤膜循环超滤，最终得到2.2L保留液，稀释1.5倍至3.3L，进行10kDa超滤膜超滤，进口压30Pis，出口压10Pis，得到2.24L保留液和0.76L透过液，检测透过液中含有微量杂质，将2.24L保留液进行循环浓缩至2L，为最终浓缩样，γ-PGA含量为58.2g/L。真空冷冻干燥后，样品为白色片絮状，纯度90.6%。
Claims (6)
1.一种无添加有机溶剂分离提纯聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：
发酵液制备：
将编号CGMCC3336的地衣芽孢杆菌发酵培养，得发酵液；
培养基配制如下：
(1)斜面培养基：酵母粉5.0，胰蛋白胨10，NaCl5.0，琼脂20，上述组分单位为g/L，pH7.2±0.1；121℃高压蒸汽灭菌20min；
(2)种子培养基：酵母膏7.0，胰蛋白胨10，葡萄糖30，K2HPO4·H2O0.5，MgSO4·7H2O0.5，上述组分单位为g/L，pH7.2±0.1；121℃高压蒸汽灭菌20min；
(3)发酵培养基：葡萄糖80、味精90.55、NH4NO318、NaCl15、MgSO4·7H2O1.1894、CaCl2·6H2O2.0、FeSO4·7H2O0.02；121℃高压蒸汽灭菌20min；精氨酸0.272、组氨酸0.52、亮氨酸0.33、苏氨酸0.5、甲硫氨酸0.481、谷氨酰胺0.3173、氯化胆碱0.13和吡哆醇0.002，膜过滤除菌，上述组分单位为g/L；
发酵液提取
(1)除菌体
将发酵液pH调至4.5～5.5，降低粘度，硅藻土和红土按2：1比例混合，加入量为发酵液的2％-3％，上述为质量体积百分比；800目滤布，板框过滤除菌体，压力为0.22MPa；
(2)除杂蛋白及大分子活性有机物
上述去除菌体的发酵液调pH6.5～7.5，加热升温至90℃保温20min,除去热变形蛋白，冷却至室温，过0.45μm中空纤维膜进行超滤，除掉80％以上杂蛋白；
(3)脱色
上述处理过后发酵液加入活性炭进行常温慢速搅拌脱色，抽滤，至液体基本澄清无色，得发酵液；
(4)除小分子氨基酸、离子杂质
上述发酵液稀释后过纳滤膜，再重复此过程，经检测，能去除大部分氨基酸及盐离子；
(5)超滤-浓缩-超滤提纯
采用10kDa和100kDa超滤膜对经上述处理的清液进行加压循环超滤-稀释-超滤-浓缩步骤，最终得到杂质很少的γ-PGA浓溶液，将上述溶液真空冷冻干燥，得到精制白色γ-PGA。
2.根据权利要求1所述无添加有机溶剂分离提纯聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：
菌种活化：
将编号CGMCC3336的地衣芽孢杆菌在固体培养基斜面上于37℃培养16个小时，制备成熟的斜面种子；
种子培养：
将活化后的斜面种子接入一环至50mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，37℃，220rpm，培养16个小时到对数生长期；
发酵培养：
将种子培养液接入发酵培养液中，接种量为10％，220rpm下培养72h；
发酵液提取：
(1)除菌体
将发酵液pH调至4.5～5.5，硅藻土和红土按2：1比例混合，加入量为发酵液的2％-3％，上述为质量体积百分比；800目滤布，板框过滤除菌体，压力为0.22MPa，流速20～30mL/min；
(2)除杂蛋白及大分子活性有机物
上述去除菌体的发酵液用氢氧化钠调pH6.5～7.5，加热升温至90℃保温20min,除去热变形蛋白，冷却至室温，过0.45μm中空纤维膜进行超滤，除掉80％以上杂蛋白；
(3)脱色
上述处理过后发酵液加入1％～1.5％活性炭进行常温慢速搅拌脱色90min，抽滤，得发酵液；
(4)除小分子氨基酸、离子杂质
上述发酵液稀释2～3倍后过纳滤膜，再重复此过程，经检测，能去除大部分氨基酸及盐离子；
(5)超滤-浓缩-超滤提纯
采用10kDa和100kDa超滤膜对经上述处理的清液进行加压循环超滤-稀释-超滤-浓缩步骤，最终得到杂质很少的γ-PGA浓溶液，将上述溶液真空冷冻干燥，得到精制白色γ-PGA，纯度在90％以上。
3.根据权利要求1或2所述无添加有机溶剂分离提纯聚谷氨酸的方法，其特征在于，发酵液提取步骤如下：
(1)除菌体：将发酵液pH调至4.5，粘度由71.4mPa·s降低至33.9mPa·s，硅藻土和红土按2：1混合，加入量为发酵液的2％,上述为质量体积百分比；800目滤布，0.22MPa压力，板框过滤除菌体，流速25mL/min；
(2)除杂蛋白及大分子活性有机物
上述去除菌体的发酵液用氢氧化钠调pH6.5，加热升温至90℃保温20min，冷却至室温，过0.45μm中空纤维膜进行超滤，除掉80％以上杂蛋白；
(3)脱色
上述处理过后发酵液加入1％活性炭进行常温慢速搅拌脱色90min，抽滤，得发酵液；
(4)除小分子氨基酸、离子杂质
上述发酵液稀释至10L过0.01μm孔径纳滤膜，透过液定容至10L，再次过0.01μm孔径纳滤膜，经检测，能去除大部分氨基酸及盐离子，得清液；
(5)超滤-浓缩-超滤提纯
上述清液，进行100kDa超滤，进口压30psi，出口压10psi，得到保留液4L，透过液3.8L，检测，透过液中，无γ-PGA，但含有Glu、离子、多糖及少量小分子色素等，将保留液定容到8.2L，继续100kDa超滤，进口压30psi，出口压10psi，得到保留液4.1L，透过液3.8L，经检测透过液含有少量Glu和离子，将4.1L保留液进行100kDa超滤膜循环超滤，最终得到3.0L保留液，稀释至4.5L，进行10kDa超滤膜超滤，进口压30psi，出口压10psi，得到3.2L保留液和0.8L透过液，检测透过液中含有微量杂质，将3.2L保留液进行循环浓缩至2.8L，γ-PGA含量为62.4g/L，真空冷冻干燥。
4.根据权利要求1或2所述无添加有机溶剂分离提纯聚谷氨酸的方法，其特征在于，发酵液提取步骤如下：
(1)除菌体：将发酵液pH调至5.0，粘度由66.4mPa·s降低至36.1mPa·s，硅藻土和红土按2：1混合，加入量为发酵液的2.5％，上述为质量体积百分比；800目滤布，0.22MPa压力，板框过滤除菌体，流速30mL/min；
(2)除杂蛋白及大分子活性有机物
上述去除菌体的发酵液用氢氧化钠调pH7.1，加热升温至90℃保温20min，冷却至室温，过0.45μm中空纤维膜进行超滤，除掉80％以上杂蛋白；
(3)脱色
上述处理过后发酵液加入1.5％活性炭进行常温慢速搅拌脱色90min，抽滤，得发酵液；
(4)除小分子氨基酸、离子杂质
上述发酵液稀释至10L过0.01μm孔径纳滤膜，透过液定容至10L，再次过0.01μm孔径纳滤膜，经检测，能去除大部分氨基酸及盐离子，得清液；
(5)超滤-浓缩-超滤提纯
上述清液，直接过100kDa超滤膜进行超滤，进口压30psi，出口压10psi，最终得到保留液3.1L，透过液3.8L，检测，透过液中，无γ-PGA，但含有Glu、离子、多糖及少量小分子色素等，将保留液定容到7.25L，继续进行100kDa超滤膜超滤，进口压30psi，出口压10psi，得到保留液3.7L，透过液3.0L，经检测透过液含有少量Glu和离子，将3.7L保留液进行100kDa超滤膜循环超滤，最终得到2.6L保留液，稀释1.5倍至3.9L，进行10kDa超滤膜超滤，进口压30psi，出口压10psi，得到3.73L保留液和0.85L透过液，检测透过液中含有微量杂质，将3.73L保留液进行循环浓缩至2.3L，γ-PGA含量为54.8.g/L，真空冷冻干燥。
5.根据权利要求1或2所述无添加有机溶剂分离提纯聚谷氨酸的方法，其特征在于，发酵液提取步骤如下：
(1)除菌体：将发酵液pH调至5.2，粘度由75.2mPa·s降低至32.8mPa·s，硅藻土和红土按2：1混合，加入量为发酵液的为3％，上述为质量体积百分比；800目滤布，0.22MPa压力，板框过滤除菌体，流速26mL/min；
(2)除杂蛋白及大分子活性有机物
上述去除菌体的发酵液用氢氧化钠调pH7.0，加热升温至90℃保温20min，冷却至室温，过0.45μm中空纤维膜进行超滤，除掉80％以上杂蛋白；
(3)脱色
上述处理过后发酵液加入1.5％活性炭进行常温慢速搅拌脱色90min，抽滤，得发酵液；
(4)除小分子氨基酸、离子杂质
上述发酵液稀释至10L过0.01μm孔径纳滤膜，透过液定容至10L，再次过0.01μm孔径纳滤膜，经检测，能去除大部分氨基酸及盐离子，得清液；
(5)超滤-浓缩-超滤提纯
上述清液，直接过100kDa超滤膜进行超滤，进口压30psi，出口压10psi，最终得到保留液3.7L，透过液3.9L，检测，透过液中，无γ-PGA，但含有Glu、离子、多糖及少量小分子色素等，将保留液定容到8.1L，继续进行100kDa超滤膜超滤，进口压30psi，出口压10psi，得到保留液3.4L，透过液4.1L，经检测透过液含有少量Glu和离子，将3.4L保留液进行100kDa超滤膜循环超滤，最终得到2.4L保留液，稀释1.5倍至3.6L，进行10kDa超滤膜超滤，进口压30psi，出口压10psi，得到2.8L保留液和0.61L透过液，检测透过液中含有微量杂质，将2.8L保留液进行循环浓缩至2.5L，γ-PGA含量为60.1g/L，真空冷冻干燥。
6.根据权利要求1或2所述无添加有机溶剂分离提纯聚谷氨酸的方法，其特征在于，发酵液提取步骤如下：
(1)除菌体：将发酵液pH调至5.5，粘度由58.2mPa·s降低至27.1mPa·s，硅藻土和红土按2：1混合，加入量为发酵液的2％，上述为质量体积百分比；800目滤布，0.22MPa压力，板框过滤除菌体，流速20mL/min；
(2)除杂蛋白及大分子活性有机物
上述去除菌体的发酵液用氢氧化钠调pH7.3，加热升温至90℃保温20min，冷却至室温，过0.45μm中空纤维膜进行超滤，除掉80％以上杂蛋白；
(3)脱色
上述处理过后发酵液加入1.5％活性炭进行常温慢速搅拌脱色90min，抽滤，得发酵液；
(4)除小分子氨基酸、离子杂质
上述发酵液稀释至10L过0.01μm孔径纳滤膜，透过液定容至10L，再次过0.01μm孔径纳滤膜，经检测，能去除大部分氨基酸及盐离子，得清液；
(5)超滤-浓缩-超滤提纯
上述清液，直接过100kDa超滤膜进行超滤，进口压30psi，出口压10psi，最终得到保留液3.3L，透过液3.5L，检测，透过液中，无γ-PGA，但含有Glu、离子、多糖及少量小分子色素等，将保留液定容到7.13L，继续进行100kDa超滤膜超滤，进口压30psi，出口压10psi，得到保留液3.4L，透过液3.2L，经检测透过液含有少量Glu和离子，将3.4L保留液进行100kDa超滤膜循环超滤，最终得到2.2L保留液，稀释1.5倍至3.3L，进行10kDa超滤膜超滤，进口压30psi，出口压10psi，得到2.24L保留液和0.76L透过液，检测透过液中含有微量杂质，将2.24L保留液进行循环浓缩至2L，γ-PGA含量为58.2g/L，真空冷冻干燥。
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