CN101363008B - 一株产菊糖果糖转移酶的菌株和用该酶生产双果糖酐ⅲ的方法 - Google Patents
一株产菊糖果糖转移酶的菌株和用该酶生产双果糖酐ⅲ的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一株产菊糖果糖转移酶的菌株和用该酶生产双果糖酐III的方法，属于食品生物技术领域。本发明涉及一株从土壤中筛选而来的金黄节杆菌(Arthrobacteraurescens)SK8.001，保藏编号为CCTCC NO：M208120，以此节杆菌为出发菌株，以菊糖为碳源，与氮源及无机盐组成发酵培养基，发酵生产菊糖果糖转移酶。发酵培养基以菊糖、硝酸钠为主要碳源和氮源，发酵后经检测，在发酵液中菊糖果糖转移酶酶活达2-100U/ml。将菊糖果糖转移酶催化剂添加到1％-50％菊糖溶液中生产双果糖酐III，转化3-24h，转化率达75％以上。本发明所得双果糖酐III产品安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性甜味剂。
Description
技术领域
本发明涉及能够生产菊糖果糖转移酶的一种新的微生物及其培养发酵生产菊糖果糖转移酶，并将该酶用于转化菊糖制备双果糖酐III的方法，属于食品生物技术领域。更具体地说，本发明涉及来源于土壤的金黄节杆菌(Arthrobacteraurescens)SK8.001，它能够产生菊糖果糖转移酶，并利用该菊糖果糖转移酶转化菊糖生成如下结构的双果糖酐III(α-D-fructofuranose-2’，1：2，3’-β-D-fructofuranose dianhydride)。
背景技术
近年来，功能食品成为广大消费者关注的热点，其开发更是广大食品从业者研发的焦点。糖尿病、肥胖和心血管疾病人群的逐年增加和低龄化，使得低热量，具有更多功能营养特性的功能性甜味剂成为关注的热点。
双果糖酐III(Difructose anhydride)是一种新型的非还原性双糖，在自然界中少量存在于菊苣、菊芋等植物中，少量出现于蜂蜜、咖啡等的加工过程中。其相对甜度为蔗糖的52％，而热量值却只有蔗糖的1/15(0.263kcal/g)；性质十分稳定，74％相对湿度下不吸湿，比蔗糖更难吸湿；双果糖酐III对热和酸十分稳定，在一般食品加工条件下，几乎不会出现褐变或分解现象，能耐硬糖生产时的高温熬煮而不褐变。同时双果糖酐III还具有良好的功能特性，如在消化道不吸收，且不产生能量，可作为一种甜味剂被用作减肥辅助治疗；作为一种增歧因子，可促进肠道微生物的生长，明显改善排便、利尿功能；作为促进矿物质元素吸收的功能性糖，可使得Ca、Mg、Zn、Cu等矿物质元素被人体吸收利用的程度大大提高，增进骨骼生长；在抗龋齿方面，其性质可与木糖醇、山梨醇相媲美，不被诱发蛀牙的口腔链球菌利用，不产酸。这些优点使其在食品工 业中的应用有广阔的前景。
由于双果糖酐III在自然界的含量极低，天然提取分离成本高，不适宜工业化大生产的要求，而化学催化法有许多不利的因素，例如形成许多副产物和化学污染物，而形成的众多副产物又使纯化步骤变得复杂。而生物法制备双果糖酐III的原料是菊糖，其来源广泛，价格低廉，转化率高，可达75％以上，属于天然产品，符合消费者追求天然产品的消费心理，因此采用生物转化技术生产成为双果糖酐III制备研究的热点。
用生物转化法制备双果糖酐III的研究已经有30余年的历史，1973年Uchiyama T.首次从产脲节杆菌中发现了一种新型菊糖酶(inulase II)，它将菊糖降解为双果糖酐III和少量的低聚果糖，由于此酶具有分子内转果糖基反应，因而将其命名为菊糖果糖转移酶(inulin ftructotransferase，EC2.4.1.93)。迄今为止，已发现十余种微生物可以产生此酶，主要集中在节杆菌属，包括Arthrobacterureafaciens7116、Arthrobacter ilicis OKU17B、Arthrobacter globiformis C11-1、Arthrobacter sp.H65-7、Arthrobactersp.A-6、Arthrobacter pascens T13-2、Arthrobactersp.Bu0141、Arthrobacter sp.L68-1，另外在三种其它菌属中也发现了此酶，如Flavobacteriumsp.LC-413、Bacillussp.snu-7、Leifsoniasp.T88-4。
本发明人深入调查和研究了现有技术并对各种高收率生产双果糖酐III的方法进行了研究，最终我们筛选到一株能够产生菊糖果糖转移酶的新微生物，证明了通过此酶与高浓度的菊糖反应能够得到高转化率的双果糖酐III，并通过浓缩、喷雾干燥、结晶的方法得到了糖浆、粉末或晶体三种形式的双果糖酐III。基于上述发现提出了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的微生物，它能够生产高酶活的菊糖果糖转移酶。
本发明的另一个目的是提供一种该菊糖果糖转移酶与高浓度菊糖溶液反应的方法，以得到高转化率的双果糖酐III。
本发明的再一个目的是提供一种双果糖酐III提纯与精制的方法，以得到高双果糖酐III糖浆、粉末或晶体。
为了实现上述目的，本发明提供一种来源于土壤的金黄节杆菌(Arthrobacteraurescens)SK8.001，其为能够产生菊糖果糖转移酶的菌株，并利用该菊糖果糖转移酶转化菊糖生成双果糖酐III。本发明采用的Arthrobacter aurescens SK8.001发酵生产的菊糖果糖转移酶，酶活较高，能够将菊糖转化为双果糖酐III，且双果糖酐III转化率高达75％以上，副产物少，除双果糖酐HI和未转化的菊糖外，只有少量的低聚果糖。
本发明的技术方案：一株产菊糖果糖转移酶的菌株，其分类命名为金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)SK 8.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 208120。
用所述的微生物金黄节杆菌SK 8.001，发酵生产菊糖果糖转移酶的方法，步骤为：
(1)种子培养
种子培养基：蛋白胨1-10g/L，NaCl 1-10g/L，牛肉膏1-5g/L，pH7.0，去离子水配制；
将金黄节杆菌SK 8.001于25-30℃、100-250rpm的振荡速度下在种子培养基中培养10-16h来活化该微生物；
(2)发酵培养
发酵培养基：菊糖3-30g/L，硝酸钠1-20g/L，氯化钾0.5-2g/L，磷酸二氢钾0.5-2g/L，硫酸镁0.5-3g/L，pH 6.5-8.0；
在25-30℃、搅拌速度为200-500rpm、空气流量为5-30m3/(L·h)的条件下在发酵培养基中发酵48-96h生产菊糖果糖转移酶；
(3)发酵后处理
通过离心法除去发酵液中的菌体，得到菊糖果糖转移酶粗酶液；
或菊糖果糖转移酶粗酶液进一步超滤浓缩，用3倍浓缩液体积的工业酒精沉淀蛋白质，离心和冷冻干燥得到菊糖果糖转移酶粗酶粉。
用制备的菊糖果糖转移酶转化菊糖生产双果糖酐III的方法，向质量浓度1％30％菊糖溶液中添加菊糖果糖转移酶催化转化，转化反应条件为：底物菊糖浓度范围为1％-30％，酶对底物的用量为0.01-10U/g，pH 5.5，转化反应温度为40-50℃，转化反应时间3-24h，得到含有双果糖酐III的酶反应液，用于制备双果糖酐III糖浆、双果糖酐III粉末或双果糖酐III晶体。
酶活力U定义为在温度55℃，pH5.5条件下1分钟产生1.0μmol双果糖酐III(DFAIII)所需的酶量为1个酶活力单位。
双果糖酐III糖浆的制备方法，步骤为：
(1)脱色
在含有双果糖酐III的酶反应液中添加活性炭，添加量为酶反应液的0.2％-2.0％，在80℃下温育30min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；
(2)浓缩
将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为60％-95％，即得双果糖酐III糖浆。双果糖酐III粉末的制备方法，步骤为：
(1)脱色
同权利要求4所述脱色步骤；
(2)浓缩
将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为20％-40％的浓缩液；
(3)喷雾干燥
将麦芽糊精与以固形物含量干基计的双果糖酐III浓缩液按照重量比1∶1-1∶5的比例混合，控制进风温度170-180℃、出风温度为70-80℃，喷雾干燥，得到含麦芽糊精的双果糖酐III粉末。
双果糖酐III晶体的制备方法，步骤为：
(1)脱色
同权利要求4所述脱色步骤；
(2)结晶
将脱色液浓缩至固形物含量为60％-95％，快速降温至50℃，缓慢均匀添加双果糖酐III晶种，向浓缩液中缓慢加入0.2-2倍浓缩液体积的乙醇，通过12h的缓慢降温过程温度降至10℃，得含双果糖酐III晶体的糖膏，用乙醇清洗去除晶体表面的杂质，离心分离，真空干燥至恒重，得双果糖酐III晶体。
检测双果糖酐III含量的方法：
取酶反应液离心，上清液微孔滤膜过滤(0.22μm)，滤液上HPLC分析。HPLC条件：Sugarpak1，6.5mm id×300mm钙型阳离子交换柱，纯水作流动相，示差折光检测器，85℃柱温，流速：0.4ml/min，进样量：10μL，双果糖酐III标样浓度：0.5％。
本发明的有益效果：本发明筛选到一株能够产生菊糖果糖转移酶的新微生物CCTCC No：M 208120，证明了通过菊糖果糖转移酶与高浓度的菊糖反应能够得到高转化率的双果糖酐III，并通过浓缩、喷雾干燥、结晶的方法得到了糖浆、粉末或晶体三种形式的双果糖酐III。
生物材料样品保藏
一株用于微生物转化发酵生产菊糖果糖转移酶的菌株，其分类命名为金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)SK 8.001，已保藏于中国武汉武汉大学内中国典型微生物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 208120，保藏日期为 2008年8月20日。
具体实施方式
以下是金黄节杆菌SK 8.001进行发酵生产菊糖果糖转移酶及酶法转化生产双果糖酐III的实施实例，但本发明并不限于所列出的几个实例。
实施例1发酵时间对产菊糖果糖转移酶(IFTase)的影响
按说明书所述的发酵条件，通过对Arthrobacter aurescens SK 8.001在不同发酵时间产IFTase的检测，发现发酵72h IFTase酶活最高，随着发酵时间延长，IFTase酶活稍有下降，故确定发酵时间为72h左右。发酵时间对产菊糖果糖转移酶的影响如表1所示。酶活力定义为在温度55℃，pH5.5条件下1分钟产生1.0μmol双果糖酐III(DFAIII)所需的酶量为1个酶活力单位。
表1发酵时间对产IFTase的影响
| 时间(h) | 24 | 36 | 48 | 54 | 72 | 84 | 96 |
| IFTase酶活(U/mL) | 1.2 | 2.0 | 3.4 | 4.9 | 6.2 | 6.0 | 5.9 |
实施例2菊糖浓度对酶法转化生产双果糖酐III的影响
按说明书所述的酶法转化条件，将菊糖配制成不同浓度的水溶液，40℃、pH 5.5条件下反应24h，结果发现随着菊糖浓度的增加，转化率不断下降，但在30％菊糖水溶液浓度下转化率仍可保证在75％以上。菊糖浓度对酶法转化生产双果糖酐III的影响如表2所示。
表2菊糖浓度对酶法转化生产双果糖酐III的影响
实施例3双果糖酐III糖浆的制备
(1)脱色
将含有双果糖酐III的酶反应液中添加酶反应液固形物含量0.2％-2.0％的活性炭，在80℃下温育30min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；
(2)浓缩
将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为60％-95％，即得双果糖酐III糖浆。
实施例4双果糖酐III粉末的制备
(1)脱色
将含有双果糖酐III的酶反应液中添加酶反应液固形物含量0.2％-2.0％的活性炭，在80℃下温育30min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；
(2)浓缩
将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为20％-40％的浓缩液；
(3)喷雾干燥
将麦芽糊精与以固形物含量干基计的双果糖酐III浓缩液按照重量比1∶1-1∶5的比例混合，控制进风温度170-180℃、出风温度为70-80℃，喷雾干燥，得到含麦芽糊精的双果糖酐III粉末。
实施例5乙醇添加量对双果糖酐III晶体的晶核形态的影响
对不同乙醇添加量的起晶过程的现象及晶核的描述见表3，从起晶后制备的双果糖酐III晶核的悬浮液中选取适量样液，用经双果糖酐III饱和的甘油将样液稀释至适当浓度，再取少量稀释样液，在显微镜下观察晶核形态。
表3乙醇添加量对双果糖酐III晶核形态的影响
| 乙醇添加量/(mL/g双果糖酐III浓缩液) | 对起晶过程中的现象及起晶后晶核的描述 |
| 0.4 | 晶核略有成团 |
| 0.8 | 晶核形态较好，成团减轻 |
| 1.2 | 晶核形态较好，成团减轻 |
| 1.6 | 晶核形态无明显变化，糖浆上层有较多乙醇残留， 未参与成核 |
| 2.0 | 晶核形态无明显变化，糖浆上层残留的乙醇更多 |
Claims (6)
1.一株产菊糖果糖转移酶的菌株，其分类命名为金黄节杆菌(Arthrobacteraurescens)SK 8.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.：M 208120。
2.用权利要求1所述的微生物金黄节杆菌SK 8.001，发酵生产菊糖果糖转移酶的方法，其特征在于步骤为：
(1)种子培养
种子培养基：蛋白胨1-10g/L，NaCl 1-10g/L，牛肉膏1-5g/L，pH7.0，去离子水配制；
将金黄节杆菌SK 8.001于25-30℃、100-250rpm的振荡速度下在种子培养基中培养10-16h来活化该微生物；
(2)发酵培养
发酵培养基：菊糖3-30g/L，硝酸钠1-20g/L，氯化钾0.5-2g/L，磷酸二氢钾0.5-2g/L，硫酸镁0.5-3g/L，pH 6.5-8.0；
在25-30℃、搅拌速度为200-500rpm、空气流量为5-30m3/(L·h)的条件下在发酵培养基中发酵48-96h生产菊糖果糖转移酶；
(3)发酵后处理
通过离心法除去发酵液中的菌体，得到菊糖果糖转移酶粗酶液；
或菊糖果糖转移酶粗酶液进一步超滤浓缩，用3倍浓缩液体积的工业酒精沉淀蛋白质，离心和冷冻干燥得到菊糖果糖转移酶粗酶粉。
3.用权利要求2所述方法制备的菊糖果糖转移酶转化菊糖生产双果糖酐III的方法，其特征是：
向质量浓度1％-50％菊糖溶液中添加菊糖果糖转移酶催化转化，转化反应条件为：底物菊糖浓度范围为1％-50％，酶对底物的用量为0.01-10U/g，pH 5.5，转化反应温度为40-50℃，转化反应时间3-24h，得到含有双果糖酐III的酶反应液，用于制备双果糖酐III糖浆、双果糖酐III粉末或双果糖酐III晶体；
酶活力U定义为在温度55℃，pH5.5条件下1分钟产生1.0μmol双果糖酐III所需的酶量为1个酶活力单位。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是双果糖酐III糖浆的制备方法，步骤为：
(1)脱色
在含有双果糖酐III的酶反应液中添加活性炭，添加量为酶反应液的0.2％-2.0％，在80℃下温育30min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；
(2)浓缩
将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为60％-95％，即得双果糖酐III糖浆。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征是双果糖酐III粉末的制备方法，步骤为：
(1)脱色
同权利要求4所述脱色步骤；
(2)浓缩
将脱色液真空蒸发浓缩至固形物含量为20％-40％的浓缩液；
(3)喷雾干燥
将麦芽糊精与以固形物含量干基计的双果糖酐III浓缩液按照重量比1∶1-1∶5的比例混合，控制进风温度170-180℃、出风温度为70-80℃，喷雾干燥，得到含麦芽糊精的双果糖酐III粉末。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征是双果糖酐III晶体的制备方法，步骤为：
(1)脱色
同权利要求4所述脱色步骤；
(2)结晶
将脱色液浓缩至固形物含量为60％-95％，快速降温至50℃，缓慢均匀添加双果糖酐III晶种，向浓缩液中缓慢加入0.2-2倍浓缩液体积的乙醇，通过12h的缓慢降温过程温度降至10℃，得含双果糖酐III晶体的糖膏，用乙醇清洗去除晶体表面的杂质，离心分离，真空干燥至恒重，得双果糖酐III晶体。
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