CN101701238B

CN101701238B - 一种由甜菊糖苷制备甜茶甙的方法

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Publication number: CN101701238B
Application number: CN2009100359210A
Authority: CN
Inventors: 陈育如; 姜中玉; 刘虎
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2009-10-14
Filing date: 2009-10-14
Publication date: 2011-11-16
Anticipated expiration: 2029-10-14
Also published as: CN101701238A

Abstract

本发明涉及一种甜茶甙的制备原料和制备方法，属于食品添加剂领域。甜菊糖经黄杆菌JH(Chryseobacterium sp.JH)CCTCC NO：M 209202或其所产的β-葡萄糖苷酶的催化转化为甜茶甙。具体为将甜菊糖制成菌培养液或酶转化液，加入适量菌或酶后，在适当装液量、转化温度、pH、时间等条件下，甜菊糖被转化为甜茶甙，转化后的粗转化液经进一步的分离和纯化后得到高纯度的甜茶甙。本发明提供了一种新的制备甜茶甙的原料，拓展了原料来源，具有较强的实用价值。

Description

一种由甜菊糖苷制备甜茶甙的方法

技术领域

本发明涉及一种制备甜茶甙的新原料和新方法，特别是微生物或酶转化甜菊糖苷获得甜茶甙的方法。属于食品添加剂应用领域。

背景技术

甜茶(Rubus suavissimus)为蔷薇科悬钩子属多年生落叶有刺灌木，主产于广西柳州、桂林、梧州等地区，是广西特有的一种野生珍稀甜味植物，与罗汉果、甜叶菊并称广西三大甜味植物，其叶可入药入茶(陈全斌，沈钟苏，张巧云等.甜茶中黄酮甙元的分离提纯及其表征.林业科技.2005，30(1)：45-48.)。

甜茶叶的主要甜味成分是甜茶甙(Rubusoside，简称RS)，占甜茶干叶重的2.0％左右。为斯替维醇(Steviol)和葡萄糖结合而成的四环二萜甙，分子式C₃₂H₅₀O₁₃，在化学结构上与甜菊苷(Stevioside，简称SS)相似。其甜度是蔗糖的300倍，口味被认为最易被人体接受，是一种低热值、甜度高、耐高温、食用极为安全的天然甜味物质，对肥胖症、糖尿病、心血管病、高血压、动脉硬化等有一定的辅助疗效，并能促进新陈代谢，治疗胃酸过多等疾病(何伟平.天然甜味剂-甜茶甙的工业化试验.广西轻工业，1999，(1)：1-5.)。

1980年日本保健学部高级甜味专家田中三郎等到广西考察甜茶时就说：“罗汉果、甜叶菊、甜茶，在这三种甜味植物中，甜茶的味觉是人们最容易接受，是目前世界上发现甜味植物中最理想的”。甜茶是目前世界上天然的无毒、高甜度、低热能和具有保健功能最全最好的甜味植物，是世界上发达国家正在大力寻找的一种糖类替代品，对因长期过量吃糖引发的各种疾病具有良好辅助疗效，符合现代人要求回归大自然的心理。

在甜茶甙的分离纯化方面，陈全斌等人以甜茶叶为原料经提取、除杂、结晶等一系列步骤获得高纯度的甜茶甙(纯度大于90％)(陈全斌，义祥辉，何星存，苏小建，张巧云.高纯度甜茶甙的制备方法，公开号：CN 101003552A.)。何伟平以甜茶叶为原料对甜茶甙进行了工业化试验，在甜茶甙的纯化上选用絮凝沉淀和树脂分离相结合的方法，使甜茶甙的回收率达到80％以上，其含量在70％以上，产品达到美国EPA标准(何伟平，天然甜味剂-甜茶甙的工业化试验.广西轻工业，1999，(1)：1-5.)。

制取甜茶甙的原料为甜茶叶，但是甜茶叶的来源相对有限，产量不高，这就制约了甜茶甙的大量生产。

甜菊糖苷为白色、无嗅的粉末，熔点198-202℃，耐高温，在空气中会迅速吸湿。微溶于乙醇，对热、酸、碱稳定，在pH4-10的范围的溶液内加热到120℃不发生变化，不褐变，在人体内大都不被代谢，为非发酵性糖，因此在体内产生的热量极低。甜菊糖苷(纯度90％以上)是白色粉未，次纯品(纯度50％)呈淡棕色。易溶于水，室温下的溶解度超过40％(王一凡，任岱，周风贤等.甜菊糖食品中营养成分的研究.中国现代医学杂志，1997，7(3)：63-64.)。

表1 甜叶菊总糖甙中各组份结构及相对于叶含量

甜菊糖苷是八种双萜糖甙的混合物，结构通式见表1，R1和R2位可连接不同种类和数量的单糖构成不同成分，其八种成分分别为：甜菊苷、甜菊醇双糖甙(steviolbioside)、莱包迪甙A(rebaudioside A，RA)、莱包迪甙B(rebaudioside B，RB)、莱包迪甙C(rebaudioside C，RC)、莱包迪甙D(rebaudioside D，RD)、莱包迪甙E(rebaudioside E，RE)、杜尔可甙A(dulcoside A，Dul-A)。其不同种类的糖甙在甜度和味质上存在较大的差异。其中以RA口感最好，其甜度超过蔗糖的300倍，且甜味纯正无后味，是非常理想的天然甜味剂。而SS的甜度为蔗糖的200倍并带有一定的后苦味道，且呈味比蔗糖慢，SS和RA是甜菊叶中主要甜菊糖苷成分，约占总甜菊糖含量的90％(曹强译，甜菊糖的特征与有效利用.杭州食品科技，1993，29(2)：8-11.)。

1996年我国甜菊糖产销量突破千吨大关。1997年产销量达到1400吨左右，其中80％左右出口。目前在江苏、福建、山东、新疆、河南、安徽等地都有大量种植，总面积达100万亩以上，现已成为世界上最大的甜菊糖生产国和出口国(倪军明，李军平.甜菊糖工业发展现状与前景.广州食品工业科技，2004，3(20)：156-158)。

利用特定微生物或特异性酶对甜菊糖苷的糖基进行选择性切除，使之结构发生改变，即可获得大量甜茶甙，从而扩大甜茶甙生产的原料来源。

日本Kaneda等人在实验室用淀粉酶(Takadiast Y)对甜菊苷糖转化80h，使之选择性水解为中间产物甜茶甙，然后进行后续实验使甜茶苷转变为莱鲍迪苷A(Norito Kaneda.Chemical Studies on Sweet Diterpene-Glycosides of Steviarebaudiana：Conversion of Stevioside into Rebaudioside A.Ryoji Kasai Chem Pharmbull，1977，25(9)：2466.)。甜茶甙作为一种中间代谢产物当时并没有引起注意和作为一种产品，并且只是在实验室水平探讨了可行性。该实验底物单一(SS)，且转化过程时间较长，程序复杂，不利于工业化生产。

发明人筛选的黄杆菌JH(Chryseobacterium sp.JH)对甜菊甙的转化效率极高，且条件温和，操作简便，可得到纯度很高的甜茶甙产品。该方法可以解决甜茶甙制备的原料不足、产品纯度低，价格偏高的问题。可增加甜叶菊及甜菊苷的用途，提高甜菊产品的附加值。

发明内容

本发明旨在提供一种从甜菊糖制备甜茶甙的新方法，该方法成本低、设备简单、产品易于获得，并且转化产物纯度高。

本发明所说的制备甜茶甙的方法，是

将黄杆菌JH(Chryseobacterium sp.JH)CCTCC NO：M209202菌种接种到含有甜菊糖苷底物的溶液中，进行生物转化；得到的转化液经分离除杂处理后，得到高纯度甜茶甙；

或者是：

将黄杆菌JH(Chryseobacterium sp.JH)CCTCC NO：M209202菌粉加入到含有甜菊糖苷底物的溶液中，进行生物转化，得到的转化液经分离除杂处理后，得到高纯度甜茶甙；

或者是：

将从黄杆菌JH(Chryseobacterium sp.JH)CCTCC NO：M209202中得到的转化酶液或酶粉加入到含有甜菊糖苷底物的溶液中，进行生物转化，得到的转化液经分离除杂处理后，得到高纯度甜茶甙。

上述方法中所说的甜菊醇糖苷是甜菊苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙或它们的混合物。

上述方法中所说的转化底物是甜菊浸提液或是由甜菊糖苷或甜菊糖粗品配制的转化底物液。转化底物中甜菊糖苷的浓度可为0.01～15％(W/W)，优选0.05～5％(W/W)，最好为0.5～3％(W/W)。

上述方法中转化体系中接菌量为转化底物体积的0.1～20％，优选5～15％(V/)，最好8～12％(V/V)；或者加入菌粉量为底物重量的0.01％～10％，或者加入的酶量为底物重量的0.01％～10％.

上述方法中转化时间为12～80h，优选24～72h；转化温度为25～37℃，优选28～32℃；转化体系的pH值为3.5～7.5。

本发明将甜菊糖制成转化液，接入相应的菌液或菌粉或酶粉，在适当的温度和pH下转化，即可获得甜茶甙转化液，经除杂和分离纯化后获得高纯度的甜茶甙产品。或者取一定量的甜菊叶，按一定的固液比用水充分浸提后，过滤得到甜菊浸提液，接入微生物转化到得甜茶甙溶液，再经分离纯化即可得到高纯度的甜茶甙。

将选育的降解菌(JH菌)按常规的液体或固体发酵培养后接入甜菊浸提液或含有一定甜菊糖浓度(0.05～15％)(W/W)的体系中，接菌量为0.5～10％(V/V)，培养12-80h。甜菊糖转化原液HPLC见图1，其中主要含SS、RA和RC等3种成分：SS和RA的纯度分别约为72％和25％。甜菊浸提液转化过程中的HPLC如图2所示，SS已部分降解为甜茶甙。转化完全的HPLC见图3所示。

本发明的优点：

将来源丰富、成分复杂的甜菊糖产品经黄杆菌JH CCTCC NO：M209202所产的β-葡萄糖苷酶转化后得到高纯度的甜茶甙，提高了产品的附加值，同时解决了甜茶甙制备中原料来源有限的问题，使甜茶甙生产可以不受地域限制。

附图说明

图1：1％(W/W)甜菊糖苷溶液HPLC图

图2：转化过程中的甜菊浸提液HPLC图

图3：转化完全的甜菊浸提液HPLC图

图4：流程示意图

具体实施方式

从江苏省植物叶片中经富集培养分离得到几十株菌，分别对甜菊糖转化液进行转化，转化条件如实施例1所述。HPLC方法检测结果，选择转化效果最好的一株作为目的菌株。

该菌株在含0.2％SS的马铃薯培养基上生长较好，30℃温箱培养一天长出菌落，菌落形态为黄色湿润，圆形凸起，边缘齐整，直径2-5mm。光镜下观察为短杆状，单生或呈双杆状，形体微小，革兰氏阴性。经16SrDNA序列测定及进化树构建得出该菌为黄杆菌属。

该菌株于2009年9月13日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：武汉大学；保藏菌株分类命名为：黄杆菌JH(Chryseobacterium sp.JH)，保藏编号为CCTCC NO：M209202。

黄杆菌JH CCTCC NO：M209202性质温和，培养条件简单，斜面保藏培养基可以是肉汤或PDA，菌种活化可以使用液体肉汤或PDA，在25-35℃，150-220r/min的条件下都可以获得大量菌体即为菌液。通过进一步产酶培养所得酶液可直接用于转化。

黄杆菌JH CCTCC NO：M209202菌粉或酶粉的制备使用常规的液体或固体发酵培养和酶的分离方法即可得到菌粉或酶粉。

例如，菌粉的制备包括菌的发酵培养、发酵液的分离、菌泥乳化和乳化液真空冷冻干燥。即黄杆菌JH CCTCC NO：M209202菌经0.2％SS PDA液体培养基于30℃、200rpm培养24h得到的菌液经8000rpm、5min离心收集菌体得到菌泥，然后按照菌泥∶菌泥保护剂＝1∶0.1的比例将菌泥与菌泥保护剂混合乳化，菌泥保护剂的配方为谷氨酸钠2％、乳糖1％、海藻糖3％、甘氨酸0.5％、甘油0.5％。乳化后的菌泥在-60℃、真空度1～5pa条件下真空冷冻干燥30h，即得到JH菌的菌粉。将JH菌产酶发酵的酶液经冷冻后在真空度1～5pa条件下真空干燥30h左右即可得到酶粉。

本发明制备的流程如图4，下面结合具体的实验和数据为本发明进一步说明，举例是为说明本发明的过程而非仅限于实施例。以下实施例中所说的菌液、菌粉、酶粉或酶液均指黄杆菌JH CCTCC NO：M209202的菌液、菌粉、酶粉或酶液。

实施例1：

配制1％(W/W)、pH 7.5甜菊糖(SS占72％，RA占25％)转化底物，接入10％(V/V)JH菌液，30℃，200r/min动态培养3天。培养结束后，5000rpm离心去除菌体，上清液经絮凝沉淀除杂、大孔树脂吸附分离、洗脱液结晶纯化获得高纯度的甜茶甙，纯度约为95％，甜菊糖的转化率为90％。

实施例2：

在500mL三角瓶中装0.01％(W/W)、pH 3.5甜菊糖底物，加0.01％(W/W)菌粉，30℃培养1天。分离纯化获得高纯度的甜茶甙。

实施例3：

500mL转化瓶装0.05％(W/W)、pH 5.5甜菊糖底物，加1％(W/W)菌粉，30℃培养12h。结束后分离纯化获得高纯度的甜茶甙。

实施例4：

500mL转化瓶装0.5％(W/W)、pH 7.5甜菊糖底物，加0.01％(W/W)酶粉，30℃转化2天。结束后分离纯化获得95％的高纯度的甜茶甙。

实施例5：

500mL转化瓶装3％(W/W)、pH 7.0甜菊糖转化底物液(SS纯度约为70％)，加5％(V/V)菌液，25℃培养2天。结束后，分离纯化获得高纯度的甜茶甙。

实施例6：

500mL转化瓶5％(W/W)、pH 6.0甜菊糖转化底物液(SS纯度约为70％)，加0.6％(W/W)菌粉，30℃培养2天。结束后分离纯化获得高纯度的甜茶甙。

实施例7：

500mL转化瓶装15％(W/W)、pH 5.0甜菊糖转化底物液(SS纯度约为70％)，加20％(V/V)菌液，32℃培养3天。结束后分离纯化获得高纯度的甜茶甙。

实施例8：

500mL转化瓶装1％(W/W)、pH 5.0甜菊糖转化底物液(SS纯度约为70％)，加0.1％(V/V)菌液，28℃培养3天。结束后分离纯化获得高纯度的甜茶甙。

实施例9：

在500L的工业反应器中加10％(W/W)、pH 7.0甜菊糖转化底物液(SS纯度约为78％)，加15％(V/V)菌液，32℃培养80h。结束后分离纯化获得高纯度的甜茶甙。

实施例10：

在1500L的工业反应器中加1.5％(W/W)、pH 7.5甜菊糖转化底物液(SS纯度约为70％)，加10％(W/W)菌粉，30℃培养3天。结束后，分离纯化获得高纯度的甜茶甙。

实施例11：

在100L的工业反应器中加1％、pH 6.0(W/W)甜菊糖转化液(SS纯度约为72％)，加12％(V/V)菌液，37℃培养2天。结束后，分离纯化获得高纯度的甜茶甙。

实施例12：

800mL转化瓶装200mL 10％(W/W)、pH 5.5甜菊糖转化液(SS纯度约为78％)，加8％(V/V)菌液，30℃培养3天。结束后，分离纯化获得高纯度的甜茶甙。

实施例13：

500mL转化瓶装1％(W/W)、pH6.5甜菊糖底物，加10％(W/W)酶液，30℃转化2天。结束后分离纯化获得95％的高纯度的甜茶甙。

实施例14：

与实施例1基本相同，所不同的是用酶粉转化。

实施例15：

与实施例1基本相同，所不同的是用酶液转化。

实施例16：

与实施例1基本相同，所不同的是用菌液与酶液协同转化。

Claims

1.一种由甜菊糖苷制备甜茶甙的方法，包括：

将黄杆菌JH（Chryseobacterium sp.）CCTCC NO:M209202菌种接种到含有甜菊糖苷底物的溶液中，进行生物转化；得到的转化液经分离除杂处理后，得到高纯度甜茶甙；

或者是：

将黄杆菌JH（Chryseobacterium sp.）CCTCC NO:M209202菌粉加入到含有甜菊糖苷底物的溶液中，进行生物转化，得到的转化液经分离除杂处理后，得到高纯度甜茶甙；

或者是：

将从黄杆菌JH（Chryseobacterium sp.）CCTCC NO:M209202中得到的转化酶液或酶粉加入到含有甜菊糖苷底物的溶液中，进行生物转化，得到的转化液经分离除杂处理后，得到高纯度甜茶甙。

2.根据权利要求1所述的由甜菊糖苷制备甜茶甙的方法，其特征在于，转化底物中甜菊糖苷的浓度为0.01~15%（W/W）。

3.根据权利要求2所述的由甜菊糖苷制备甜茶甙的方法，其特征在于，转化底物中甜菊糖苷的浓度为0.05~5%（W/W）。

4.根据权利要求1所述的由甜菊糖苷制备甜茶甙的方法，其特征在于，转化体系中接菌量为转化底物体积的0.1~20%；或者加入菌粉量为底物重量的0.01%~10%；或者加入的酶量为底物重量的0.01%~10%。

5.根据权利要求1所述的由甜菊糖苷制备甜茶甙的方法，其特征在于，转化时间为12~80 h，转化温度为25~37℃，转化体系的pH值为3.5-7.5。