CN102061324A - 黄杆菌胞内酶提取和快速转化甜菊糖为甜茶甙的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用细菌胞内酶提取后由甜菊糖制备甜茶甙的方法，属于生物转化领域。具体为将黄杆菌扩大培养后，收集菌体，经过细胞破碎，制备胞内β-葡萄糖苷酶，再将甜菊糖配成转化液，加入适量酶后，在适当的温度、pH、底物浓度及转化时间等条件下，将甜菊糖以高效快速的方式转化为甜茶甙。本发明提出了提取黄杆菌所产胞内β-葡萄糖苷酶制备甜茶甙的具体方法，操作简便，转化效率高，耗时短，浓度为1%的甜菊糖溶液经提取的粗液4h转化率可达56%，15h转化率达100%，酶经分离纯化后的转化率迅速提高，4h即可达到96%。

Description

黄杆菌胞内酶提取和快速转化甜菊糖为甜茶甙的方法

技术领域

本发明涉及黄杆菌所产胞内β-葡萄糖苷酶将甜菊糖转化为甜茶甙的方法，特别是黄杆菌所产胞内酶的制备及使用该酶将甜菊糖转化为甜茶甙的方法。属于生物转化领域。

背景技术

甜菊糖是从菊科甜叶菊（Stevia rebaudiana bertoni）中提取的一种天然甜味剂，含量占甜菊叶干重的4%-20% （Geuns JMC. Stevioside. Phytochemistry, 2003, 64: 913–921.）。我国是世界上最大的甜菊糖生产国，资源量巨大（倪军明, 李军平. 甜菊糖工业发展现状与前景.广州食品工业科技, 2004, 20(3): 156-158.）。甜菊苷（Stevioside，SS）常态下为白色或微黄色松散粉末或结晶，常温下稳定，甜度约为蔗糖的300倍，味感与蔗糖相似，热量仅为蔗糖的三分之一，非酵解，热稳定性好，毒性低而且适用范围广，被称为是继蔗糖、甜菜糖之后的第三种天然糖源（李晓瑜. 甜菊糖苷的安全性研究进展. 中国食品添加剂, 2003, 2: 5-11.）。

甜菊糖主要含甜菊苷和莱鲍迪甙A（Rebaudioside A，RA）两种成份。RA甜味品质最好但含量比SS低，SS含量高但其甜味成份有一定的后苦味（Starrat AN, Kirby CW, Pocs R, Brandle JE. Rebaudioside F, a diterpene glycoside from Stevia rebaudiana. Phytochemistry, 2002, 59: 367–370.）。因此许多学者对SS进行了改性研究以期改善甜菊糖的甜味品质。

甜茶甙（Rubusoside，RS）也是一种天然甜味剂，来源于蔷薇科悬钩子属多年生植物甜茶（Rubus suavissimus），含量占甜茶干叶重的2.0%左右，化学结构与甜菊苷相似，甜度是蔗糖的300倍，但热值低、甜度高、耐高温、食用极为安全，对高血压、糖尿病等有一定的辅助疗效，并能促进新陈代谢，治疗胃酸过多等疾病（何伟平. 天然甜味剂-甜茶甙的工业化试验.广西轻工业, 1999, (1): 1–5.）。甜茶主要分布在我国南方丘陵地区，主产广西，通常生长于海拔500 m-1000 m，所以RS的来源受资源量和产地的限制（梁坚. 甜茶的研究进展.广西医学, 2004, 26(6): 845–847.）。利用甜菊苷特异转化产生甜茶甙，将大大减少甜茶种植对生态环境的压力，提高甜菊的资源利用率，并为甜菊糖的改性研究提供一条新的思路。

β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）存在于许多植物、昆虫、酵母、霉菌及细菌体内，特别是植物的种子和微生物中尤为普遍, 从黑樱桃、水稻、大豆、木薯作物中纯化出β-葡萄糖苷酶。对微生物中的β-葡萄糖苷酶的研究主要在酵母、细菌、真菌、链霉菌等（李远华. β-葡萄糖苷酶的研究进展. 安徽农业大学学报, 2002, 29(4): 421-425.）。β-葡萄糖苷酶能参与生物体的糖代谢，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用, 能够水解结合于底物末端的非还原性β-D-葡糖苷键，释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶的生物学功能使它在生产中有着广泛的应用。如作为食品风味酶应用，另外β-葡萄糖苷酶还在青梅脱苦、降解纤维素、水解大豆异黄酮方面有着应用（许晶, 张永忠, 孙艳梅. β-葡萄糖苷酶的研究进展. 食品研究与开发, 2005, 26(6): 183-186.）。

常见的细胞破壁方式主要有：物理法，如冻融法、超声法、高压破碎法等；化学法，常用化学试剂有表面活性剂、有机溶剂等；生物法(酶法)等（郑雪松, 李道棠, 杨虹. 不同破壁方法对活性污泥总DNA提取效果的影响. 上海交通大学学报,2004,38（5）: 815-818.）。高压破碎细胞的原理是在高压作用下，样品从高压室高速喷出，速度可达每秒几百米。这种高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列过程中经历了高速剪切、碰撞和空穴效应等，从而造成细胞的破碎。表面活性剂具有双亲结构，能通过其疏水基团与细胞膜脂质结合，并以其亲水基团与水互溶，在合适的浓度范围之内能达到较好的破碎效果。胆盐是一类重要的生物表面活性剂，它能够结合到类脂双层膜中并改变膜的性质。胆盐可分配到泡囊中甚至溶解泡囊，还能与脂质体作用，在脂质双分子层上形成小孔（王建国, 杨薇薇, 江黎丽, 吕慧, 孙巧花, 马勇, 姜玉春, 臧树. 胆酸钠与支撑磷脂双层膜作用的电化学研究. 高等学校化学学报,2007,28(5):859-861.）。十二烷基硫酸钠SDS、十六烷基三甲基溴代氨CTAB、Triton-100分别为阴离子、阳离子、非离子型表面活性剂，这些表面活性剂都能改变细胞膜表面通透性，从而使细胞内物质溶出。

利用黄杆菌所产的胞内β-葡萄糖苷酶对甜菊糖苷的糖基进行选择性切除，使之结构发生改变，即可获得大量甜茶甙，从而扩大甜茶甙生产的原料来源。因为甜叶菊的产量比甜茶高得多，且甜叶菊中甜菊苷含量（有的高达15%）比甜茶中甜茶苷含量（3-5%）高，故利用甜菊苷生产甜茶甙具有重要的应用价值。

利用黄杆菌直接对甜菊糖进行转化产生甜茶甙，转化效率较胞内β-葡萄糖苷酶低，1%的甜菊糖用菌液进行转化需要72 h才能达到完全转化（ 陈育如,姜中玉,刘虎. 一种由甜菊糖苷制备甜茶甙的方法. CN101701238A），而本发明的工作表明，用经分离纯化的胞内酶转化率4 h即可达到96%，具有高效快速的特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速制备甜茶甙的方法。

本发明具体的技术方案包括以下步骤：

（1）将黄杆菌活化，得到的活化菌液经4℃、12000 r/min离心12 min，弃去上清，收集菌体，并将菌体用pH4-10缓冲液洗涤两次，然后用少量缓冲液重新悬浮，将重悬菌液冰浴后采用高压细胞破碎仪或表面活性剂对菌体进行破碎，将破碎后的菌液于4℃、8000 r/min离心10 min，去除沉淀，上清用pH 7.0磷酸盐缓冲液定容，即为初始胞内酶液；

（2）取初始胞内液，用pH 4-10缓冲液定容至30 mL，加甜菊糖使其溶解制成转化液，对甜菊苷（SS）进行转化，获得甜茶甙。

上述方法中所说的菌体重悬液冰浴时间为0.05 h~5 h，优选0.5 h~2 h。

上述方法中所说的高压破碎压力为3000 KPa ~15000 KPa，优选5000 KPa~10000 KPa。重复破碎次数为2~10次，优选3~6次。

当用表面活性剂对细胞进行破碎时，表面活性剂包括胆酸钠、SDS、CTAB、Triton-100等，表面活性剂的添加量为0.01%~10%(W/W)，优选0.05%~5%(W/W)。

上述方法中所说的破碎细胞后所得胞内酶定容至10 mL ~100 mL，优选20 mL~50 mL作为初始胞内酶液。

上述方法中所说的甜菊糖是甜菊苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙或它们的混合物。

上述方法中所说的转化液是由甜菊糖直接加入经稀释的初始胞内酶液制成。转化液中甜菊糖的浓度可为0.1~10%（W/W），优选0.5~6%（W/W）。

上述方法中为防止杂菌，可在转化液中添加适量抗生素。所说的抗生素可以是利福平或青霉素或氯霉素，添加的抗生素溶液的浓度为0.01%~0.1%(V/V)，体积为0.01 mL~10 mL。

上述方法中转化体系中初始胞内酶液的添加量为1%~100%(V/V)，优选10%~70%(V/V)。

上述方法中转化时间为1 h~48 h；优选4 h~24 h；转化温度为30℃~60℃，优选37℃~50℃；转化体系的pH值为4.0~12.0，优选pH 6.0~10.0。

本发明将菌体破碎获得胞内酶液，并将甜菊糖直接加入经稀释的胞内酶液中，通过加入、利福平、青霉素或其他抗生素抑制杂菌及黄杆菌JH的生长，在适当的温度和pH下转化，即可获得甜茶甙转化液。

将黄杆菌JH经离心破壁后所得胞内酶液作为初始胞内酶液，加入pH4-10的缓冲液，其中酶液量为40%(V/V)。加入甜菊糖使其在转化液中浓度为1%（W/W），然后加入0.05% (W/W)的利福平或其他抗生素后转化。甜菊糖原液组成见图1，经胞内酶液转化4 h后的组成见图2，转化12 h后的组成见图3，SS转化率的时间曲线见图4。分别制备同样的活化菌液，分别加入0.6%(W/W)胆酸钠，0.2%(W/W)SDS，1%(W/W)CTAB，1%(W/W) Triton-100进行破壁得酶液，对SS转化的效率见图5所示。将胞内酶进行分离纯化，酶的凝胶电泳图见图6。

本发明的优点体现在：将甜菊糖经黄杆菌JH CCTCC NO:M209202所产的β-葡萄糖苷酶转化后得到甜茶甙，解决了甜茶甙制备中原料来源有限的问题，使甜茶甙生产可以不受地域限制，同时为甜菊糖的利用提供了新的途径，也为SS转变为RA提供了重要中间步骤与解决方法。由于本发明操作简便，转化效率极高，提取的胞内酶液在15 h转化率可达100%，如果酶经初步分离纯化后，4 h转化率即可达到96%，转化迅速，具有极强的应用价值。

附图说明

图1：1%（W/W）甜菊糖转化原液HPLC图

图2：1%（W/W）甜菊糖胞内酶转化4 h的HPLC图

图3：1%（W/W）甜菊糖胞内酶转化12 h的HPLC图

图4：高压破碎细胞制备的胞内酶转化时间曲线图

图5：不同表面活性剂制备的胞内酶液转化率时间曲线图

图6：胞内酶提取后的凝胶电泳图谱。

具体实施方式

黄杆菌JH的培养：

 中国公开号为CN101701238A的专利公开了一株黄杆菌JH（Chryseobacteriumsp.JH），菌种保藏编号为CCTCC NO:M209202。将该菌接入活化培养基，37℃、180 r/min培养36 h，即得到活化好的菌液。

胞内酶液的制备：

活化培养的菌液4℃、12000r/min冷冻离心所得菌体用pH4-10缓冲液洗涤两次，并用少量缓冲液重新悬浮。将重悬菌液冰浴。采用高压细胞破碎仪对菌体进行破碎，重复破碎3次，将破碎后的菌液于4℃、8000r/min离心10 min，去除沉淀，得初始胞内酶液。

或将收集的菌体用pH4-10的缓冲液定容后加入0.01%~10%( W/W)的SDS或CTAB或Triton-100或胆酸钠。完全破碎后经离心去除沉淀，得到上清酶液。

或者将收集的菌体用pH4-10的缓冲液定容后于-60℃条件下冷冻过夜，并于室温下解冻，反复冻融3次，离心去除沉淀，得上清酶液。

或者将收集的菌体用pH4-10的缓冲液直接定容后经100 hz频率超声波处理20 h后离心收集上清。

胞内酶液对SS的转化：

取高压破碎所得初始胞内酶液用pH 4-10的缓冲液稀释后加甜菊糖使其浓度为10 mg/mL。在该转化体系中添加1 mL 0.5 mg/mL利福平水溶液，于30℃对SS进行转化。或者直接在经其他方式破碎所得胞内液中添加甜菊糖，使其浓度为10 mg/mL，在相同条件下对SS进行转化。

实施例1：

100 mL活化培养的菌液4℃、12000r/min冷冻离心所得菌体用pH 4.0-10的缓冲液洗涤两次，采用高压细胞破碎仪于压力4000KPa下对菌体进行破碎，重复3次，将破碎后的菌液于4℃、8000r/min离心10 min，去除沉淀，上清液即为初始胞内酶液。将所得初始胞内酶液加甜菊糖使其浓度为1%（W/W）。在该转化体系中添加1 mL 0.05%（W/W）的利福平水溶液，在pH4-10条件下对SS转化，12 h转化率92%，15 h转化率达100%.

实施例2：

相同条件下制备的重悬菌液冰浴0.05 h。采用高压细胞破碎仪于压力3000 KPa下对菌体进行破碎，重复破碎2次，将破碎后的菌液于4℃、8000r/min离心10 min，去除沉淀即为初始胞内酶液。加pH 4.0-10的缓冲液使酶液量为40%（V/V），加甜菊糖使其浓度为1%（W/W）。在该转化体系中添加1 mL 0.05%（W/W）的青霉素水溶液，与实施例1相同条件下对SS进行转化。经4 h转化率完全转化。

实施例3：

相同条件下制备的重悬菌液冰浴2 h。采用高压细胞破碎仪于压力5000 KPa下对菌体进行破碎，重复破碎6次，破碎后相同条件下制备初始胞内酶液13 mL。取一定体积初始胞内酶液用pH 10缓冲液稀释至酶液添加量为1%（V/V），加甜菊糖使其浓度为0.1%（W/W）。在该转化体系中添加2 mL 0.01%（W/W）的利福平水溶液，与实施例1相同条件下对SS进行转化。经10 h完全转化。

实施例4：

相同条件下制备的重悬菌液冰浴5 h。采用高压细胞破碎仪于压力10000 KPa下对菌体进行破碎，重复破碎2次，破碎后相同条件下制备初始胞内酶液用pH 9.0缓冲液稀释至酶液添加量为10%（V/V），加甜菊糖使其浓度为0.5%（W/W）。在该转化体系中添加0.01 mL 0.1%（W/W）的利福平水溶液，与实施例1相同条件下对SS进行转化。经10 h完全转化。

实施例5：

相同条件下制备的重悬菌液冰浴0.5 h。采用高压细胞破碎仪于压力15000 KPa下对菌体进行破碎，重复破碎2次，破碎后相同条件下制备初始胞内酶用pH 5.0缓冲液稀释至酶液添加量为70%（V/V），加甜菊糖使其浓度为6%（W/W）。在该转化体系中添加0.01 mL 0.1 %（W/W）的青霉素水溶液，与实施例1相同条件下对SS进行转化。经15 h完全转化。

实施例6：

相同条件下制备的重悬菌液冰浴1 h。采用高压细胞破碎仪于压力3000 KPa下对菌体进行破碎，重复破碎10次，破碎后相同条件下制备初始胞内酶液，用制备的初始胞内酶直接加甜菊糖使其浓度为10%（W/W），使酶液添加量为100%（V/V）。在该转化体系中添加2 mL 0.01%（W/W）的青霉素水溶液，与实施例1相同条件下对SS进行转化。经24 h可完全转化。

实施例7：

相同条件下制备的重悬菌液冰浴0.5 h。采用高压细胞破碎仪于压力8000 KPa下对菌体进行破碎，重复破碎3次，破碎后相同条件下制备初始胞内酶液用pH 8.0缓冲液稀释至酶液添加量为40%（V/V），加甜菊糖使其浓度为1%（W/W）。在该转化体系中添加1 mL 0.05%（W/W）的利福平水溶液，于pH4.0、30℃（±1℃）、100 r/min条件下对SS转化，经12 h完全转化。

实施例8：

胞内酶液制备方法及转化液制备方法与实施例7相同，转化条件为pH4.0，37℃（±1℃），150 r/min，经8h完全转化。

实施例9：

胞内酶液制备方法及转化液制备方法与实施例7相同，转化条件为pH10.0、50℃（±1℃）、200 r/min。经18 h完全转化。

实施例10：

胞内酶液制备方法及转化液制备方法与实施例7相同，转化条件为pH12.0、60℃（±1℃）、180 r/min。经7 h完全转化。

实施例11：

胞内酶液制备方法及转化液制备方法与实施例7相同，转化条件为pH7.0、45℃（±1℃）、200 r/min。经9h完全转化。

实施例12：

胞内酶液制备方法及转化条件与实施例7相同，所不同的是转化液制备过程中添加0.01 mL 0.1 %（W/W）的氯霉素。

实施例13：

胞内酶液制备方法及转化条件与实施例7相同，所不同的是转化液制备过程中添加1 mL 0.05 %（W/W）的氯霉素。

实施例14：

胞内酶液制备采用表面活性剂方法，将收集的菌体用缓冲液定容后加入胆酸钠7%(W/W)，完全破碎后经离心去除沉淀，得到上清酶液，将其体积用相同缓冲液再次定容至30 mL。加入1%（W/W）甜菊糖及1 mL 0.05%（W/W）的利福平水溶液，转化条件与实施例12相同。14 h完全转化。

实施例15：

100 mL活化培养的菌液4℃、12000r/min冷冻离心所得菌体用pH 9.0缓冲液重新悬浮，于-60℃条件下冷冻过夜，并于室温下解冻，反复冻融3次，离心去除沉淀，得上清酶液，加入1%( W/W)甜菊糖，转化方法同实施例12。经12h完全转化。

实施例16：

同样方法收集的菌体经100 hz频率超声波处理20 h后离心收集上清，加入1%( W/W)甜菊糖，转化方法同实施例12。经6 h完全转化。

实施例17：

同样方法收集的菌体用缓冲液定容，用50%的甲醇或乙醇处理后离心，弃有机溶剂相，保留水相并定容至30 mL。加入1%( W/W)甜菊糖，转化方法同实施例12。经20 h可全转化。

实施例18：

与实施例14相同，所不同的是加入0.1% (W/W) 胆酸钠。经10 h完全转化。

实施例19：

与实施例14相同，所不同的是加入0.6% (W/W) 胆酸钠。经8h完全转化。

实施例20：

与实施例14相同，所不同的是加入0.01%( W/W) SDS。经12 h转化率达80%以上，18 h完全转化。

实施例21：

与实施例14相同，所不同的是加入0.2%( W/W) SDS 或1%( W/W) SDS。经9 h完全转化。

实施例22：

与实施例14相同，所不同的是加入0.2%( W/W) CTAB。经12 h转化率达70%，18 h可完全转化。

实施例23：

与实施例14相同，所不同的是加入1%( W/W)或8%( W/W) CTAB。经24 h可完全转化。其中1%( W/W) CTAB转化12 h的时间曲线图如图5所示。

实施例24：

与实施例14相同，所不同的是加入0.5%( W/W) Triton-100。经12 h可完全转化。

实施例25：

与实施例14相同，所不同的是加入1%( W/W)或4%( W/W) Triton-100。经17h完全转化。

实施例26：

与实施例17相同，所不同的是用1%的甲醇处理。经12 h完全转化。

实施例27：

与实施例1的制备初始胞内酶的方法及转化条件相同，所不同的是初始胞内液经50%硫酸铵沉淀后，pH 5.0缓冲液溶解后加1%SS进行转化，4 h转化率为100%。分离的胞内酶凝胶电泳图如图6所示。

实施例28：

与实施例7相同，所不同的是不加抗生素。经14 h完全转化。

Claims (9)

1.一种甜菊糖苷快速转化为甜茶甙的方法，其特征在于，包括下述步骤：

（1）胞内酶提取：将黄杆菌活化，得到的活化菌液经4℃、12000 r/min离心12 min，弃去上清，收集菌体，将菌液采用高压细胞破碎仪或表面活性剂对菌体进行破碎，将破碎后的菌液于4℃、8000 r/min离心10 min，去除沉淀，上清用pH 4-10的缓冲液定容至10 mL ~100 mL，即为初始胞内液；

（2）转化：取初始胞内液加甜菊糖使其溶解制成甜菊糖转化液；对甜菊糖进行转化，获得甜茶甙。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所说的菌体重悬液冰浴时间为0.05 h~5 h；所说的高压破碎采用的压力为3000 KPa ~15000 KPa，重复破碎2~10次。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所说的菌体重悬液冰浴时间为0.05 h~5 h；用表面活性剂对细胞进行破碎，表面活性剂是胆酸钠、SDS、CTAB或Triton-100，表面活性剂的添加量为0.01%~10%(W/W)。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所说的甜菊糖是甜菊苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙或它们的混合物。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所说的甜菊糖转化液是由甜菊糖直接加入经稀释的初始胞内酶液制成，转化液中甜菊糖的浓度为0.1~10%（W/W）。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所说的甜菊糖转化液体系中加入抗生素。

7.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所说的抗生素是利福平或青霉素或氯霉素，添加的抗生素溶液的浓度为0.01%~0.1%(W/W)，需加入该浓度下抗生素的体积为0.01 mL~10 mL。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中初始胞内酶液的添加量为1%~100%(V/V)。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中转化时间为1 h~48 h；转化温度为30℃~60℃；转化体系的pH值为4.0~12.0。

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