CN105255971A - 双酶法制备甜菊单糖苷 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备甜菊单糖苷的方法。属于天然化合物的合成技术领域。以常见的糖苷酶为催化剂，一步法催化甜菊糖苷水解制备单糖苷。该种方法具有方法简单、选择性和转化率高、成本低廉、分离提纯简单等优点。本发明提供了一种高效、简便、廉价的新方法以制备甜菊单糖苷。

Description

双酶法制备甜菊单糖苷
技术领域
本发明属于天然化合物的生物合成技术领域，具体涉及利用常见的糖苷酶一步法直接催化制备甜菊单糖苷的方法。
背景技术
从甜叶菊叶子中提取的甜菊糖苷不仅是一类高甜度低热值的天然甜味剂，而且甜菊糖苷还具有多种药理活性。新版甜菊糖苷国标(GB8270-2014)指出，甜菊糖苷包括甜菊苷(Stevioside，Stv)、瑞鲍迪苷A(rebaudiosideA，RebA)、瑞鲍迪苷B(rebaudiosideB，RebB)、瑞鲍迪苷C(rebaudiosideC，RebC)、瑞鲍迪苷D(rebaudiosideD，RebD)、瑞鲍迪苷F(rebaudiosideF，RebF)、杜克苷A(dulcosideA)、甜茶苷(rubusoside，Ru)、甜菊双糖苷(steviolbioside，Sbio)等九种糖苷。这些糖苷可以直接应用，也可以进一步衍生化，得到更多自然界中鲜有并且具有特殊功能性的糖苷。如对其中含量最高的甜菊苷Stv进行糖基化可以提高溶解性，降低后苦涩味；又如本发明人已公开一种用来源于Sulfolobussp.的β-葡萄糖苷酶催化制备甜菊醇的方法(专利号：201210352461.6)，可以一步法得到高纯度甜菊醇；再如酸性水解Stv得到异甜菊醇，然后对其进行修饰，可以得到具有特定药理活性的衍生物。
甜菊单糖苷(steviolmonoside，Sm，CAS：60129-60-4)是一种在自然界中鲜有的甜菊糖苷，甜茶叶子(RubussuavissimusS.Lee)醇沉可以得到少量Sm(KohGarYee等，2009)。水解Stv，RebA等过程中产生也会产生Sm，但会进一步水解生成甜菊醇或异甜菊醇(deOliveiraBH等,2007)，因而控制反应停在甜菊单糖苷Sm这一步，需要较高的反应选择性。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便的方式制备高纯度甜菊单糖苷。本发明选用两种比较常见的糖苷酶，一步法催化水解甜菊苷Stv制备甜菊单糖苷，具体反应方程式如下：
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
将甜菊糖苷配制成10mg/mL到250mg/mL的水溶液，然后在37℃-45℃下恒温搅拌0.5h，反应的pH值始终控制在7左右。按照顺序分别加入一定量两种糖苷酶，加入第二种酶时反应升温至55℃-75℃，总反应1h-24h；过滤，洗涤，重结晶即可得甜菊单糖苷。加入两种糖苷酶的顺序为，先为来源于酵母的β-葡萄糖苷酶，然后再加入来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶，时间间隔为6h-12h，加入的比例为1:5。
本发明的有益效果：
利用常见的糖苷酶催化甜菊苷Stv制备甜菊单糖苷，本发明具有廉价，简单，高效，产物纯度高，分离容易等优点。
附图说明
图1甜菊单糖苷的离子流图(a：总离子流图；b：479.3选择性离子流图)
图2甜菊单糖苷的质谱图(479.3，[Msm-H]-；965.6，[2Msm-H]-；)
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明，其目的仅在于更好的说明本发明的内容但并不以任何方式限制本发明。
实施例1
配制甜菊苷溶液50mL，浓度为10mg/mL，然后在37℃下恒温搅拌0.5h，反应的pH值始终控制在7左右。先按照800U/gStv加入来源于酵母的β-葡萄糖苷酶，反应6h；再加入来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶2000U/gStv，加入第二种酶时反应升温至55℃，再反应12h；过滤后用纯水洗涤三次，水/甲醇/异丙醇溶液中重结晶即可得高甜菊单糖苷。HPLC分析Stv的转化率为95.0％，Sm的产率和纯度分别为85.4％和96.0％。
实施例2
配制甜菊苷溶液50mL，浓度为250mg/mL，然后在45℃下恒温搅拌0.5h，反应的pH值始终控制在7左右。先按照1500U/gStv加入来源于酵母的β-葡萄糖苷酶，反应12h；再加入来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶3000U/gStv，加入第二种酶时反应升温至75℃，再反应6h；过滤后用纯水洗涤三次，水/甲醇/异丙醇溶液中重结晶即可得高甜菊单糖苷。HPLC分析Stv的转化率为90.5％，Sm的产率和纯度分别为88.5％和95.0％。
实施例3
用甜叶菊提取物配制甜菊苷溶液100mL，Stv含量为100mg/mL，然后在40℃下恒温搅拌0.5h，反应的pH值始终控制在7左右。先按照500U/gStv加入来源于酵母的β-葡萄糖苷酶，反应18h；再加入来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶1500U/gStv，加入第二种酶时反应升温至75℃，再反应6h；过滤后用纯水洗涤三次，水/甲醇/异丙醇溶液中重结晶即可得高甜菊单糖苷。HPLC分析Stv的转化率为83.5％，Sm的产率和纯度分别为75.0％和90.8％。
实施例4
配制甜菊苷溶液5L，浓度为250mg/mL，然后在45℃下恒温搅拌0.5h，反应的pH值始终控制在7左右。先按照3000U/gStv加入来源于酵母的β-葡萄糖苷酶，反应12h；再加入来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶3000U/gStv，加入第二种酶时反应升温至75℃，再反应12h；过滤后用纯水洗涤三次，水/甲醇/异丙醇溶液中重结晶即可得高甜菊单糖苷。HPLC分析Stv的转化率为98％，Sm的产率和纯度分别为92.5％和96.0％。

Claims (4)

1.一种制备甜菊单糖苷的方法，其特征在于将甜菊糖苷配制成10mg/mL到250mg/mL的水溶液，然后在37℃-75℃下恒温搅拌0.5h，按照顺序分别加入一定量两种糖苷酶，反应1h-24h；过滤，洗涤，重结晶即可得甜菊单糖苷。
2.根据权利要求1所述的一种制备甜菊单糖苷的方法，其特征是所述的甜菊糖苷为甜菊苷或是含有甜菊苷的甜叶菊提取物。
3.根据权利要求1所述的一种制备甜菊单糖苷的方法，其特征是所述的加入两种糖苷酶的顺序为，先为来源于酵母的β-葡萄糖苷酶，然后再加入来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶，时间间隔为6h-12h，加入的比例为1:5。
4.根据权利要求1所述的一种制备甜菊单糖苷的方法，其特征是所述的温度为先保持在37℃-45℃，然后加入第二种糖苷酶后再控制在55℃-75℃，反应的pH值始终控制在7左右。
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