CN101967137A - 酶法提取植物黄酮化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酶法提取植物黄酮化合物的方法，步骤如下：(1)浸提，其中酶解水提一遍，醇提二遍；(2)上柱纯化；(3)处理解析液，得到植物黄酮化合物产品。本发明以生物技术理论、天然产物化学理论和技术、国际药物检验标准为指导，制定生产实验方案，确定适宜的酶法提取工艺和黄酮糖苷生物转化工艺，获得高生物效价的产物。确定复合多种酶制剂，优化最佳转化条件，提高黄酮的生物转化效率。制定大孔吸附树脂的吸附技术方案，用于工业化生产，提高产品中苷元型黄酮的含量。

Description

酶法提取植物黄酮化合物的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是一种酶法提取植物黄酮化合物的方法。

背景技术

植物是人类可以利用的最丰富自然资源，植物中所含有的黄酮类生物活性物质是食品、化工和医药工业原料的主要来源。但是，在植物体内这些黄酮类物质以不同的糖苷形式，分布于植物体内不同的部位，如银杏、柿子、核桃、山楂、香椿等的果实、叶片、根茎等。这些功效物质一般在植物果实中苷元型黄酮类含量更多一些，但是在植物茎叶中以低活性的黄酮糖苷类物质所占的比例更高，但是含量却比果实高。因此，富集植物茎叶中的黄酮类生物活性物质，利用化学或生物技术加以修饰改性，提高其生物活性和生物可利用率，具有重要的理论与实际意义。

黄酮类化合物广泛存在于植物的各个部位，尤其是花、叶部位，主要存在于芸香科、唇形科、豆科、伞形科、银杏科与菊科中，如苦荞、山楂、桑叶、银杏叶、竹叶、可可、葛根等。有文献估计约有20％的中草药中含有黄酮类化合物，可见其资源之丰富。自1814年发现的第一个黄酮类化合物——白杨素以来，到1980年以分离出黄酮类化合物约2700种。

黄酮类物质是色原酮或色原烷的衍生物，以C6-C3-C6结构为基本母核的天然产物，即两个苯环通过3个碳原子结合而成。其中C3部分可以是脂链，或与C6部分形成六元或五元氧杂环。黄酮类物质主要由花色素、黄酮醇、黄酮、儿茶酚和黄烷酮组成，其中以黄酮醇类最为常见，其次是黄酮类，其余则较少见，多具有颜色。这些黄酮糖甙类物质的结构又包括甙和甙元两类，植物界中的黄酮类化合物大部分以糖甙的形式存在，一部分以游离甙元形式存在。这些物质对减少器质性病变，诸如癌症、动脉硬化的发病率起到了重要作用。

作为药理因子，黄酮类化合物具有降血压、降血脂、防止血栓形成、防治心脑血管疾病、增强免疫、降低血管脆性、改善心脑血管血液循环等作用。黄酮类化合物在体内代谢快，与维生素C相似，过多时通过尿液排出体外。黄酮类化合物由于代谢快，在体内不蓄积，需要经常补充。人体自身不能合成类黄酮，必须从食物中得到，食物来源是谷物、蔬菜、水果、果汁、茶叶等。

在国外，苷元型黄酮是黄酮类产品生产和研究的热点。目前在日本已经有多种苷元型黄酮的生产，其最有代表性的苷元型黄酮产品即为大豆异黄酮苷元的生产。技术上采用化学法或生物转化方法。化学法产品质量差，副产物多。在国内，糖苷型黄酮的生物转化和苷元型黄酮的研究和生产的报道很少。为了充分提取不同极性的黄酮化合物，在实际生产中通常采用极性低的有机溶剂或水提等方法。由于对医药产品和保健品的安全要求，醇水多成为常用提取溶剂，提取效率往往偏低。为了解决这些问题，需要确立高效清洁的植物提取技术。近年，酶法提取药用植物已成为中药提取研究的重要方法。由于植物茎叶中的总黄酮几乎都被以纤维素为主体的细胞壁所包围，这些细胞间尚有原果胶粘结，因此，应用以纤维素酶和果胶酶为主的复合酶液对植物叶进行酶解，然后提取，可以大大提高总黄酮得率。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种酶法提取植物黄酮化合物的方法，本方法成本低廉，总黄酮得率高，适于工业化生产。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种酶法提取植物黄酮化合物的方法，步骤如下：

(1)浸提：将植物叶片粉碎成叶粉，将该叶粉装入萃取罐，加入溶剂进行提取。其中酶解水提一遍，醇提二遍，具体为：

第一遍：酶解水提：加入为原料六倍量体积的水，以及为原料重量0.1-0.5％的复合酶，保持温度50℃，提取2h，过滤；

第二遍：加入为原料五倍量体积的70％-80％的乙醇溶剂，提取温度70℃-80℃，提取2h，过滤；

第三遍：加入为原料五倍量体积的70％-80％的乙醇溶剂，提取温度70℃-80℃，提取1h，过滤；

合并第一遍和第二遍提取液，用脱味锅进行浓缩脱除乙醇溶剂，浓缩成为水溶液，放置沉淀3小时后进行离心分离，得到上清液；第三遍提取液直接沉淀即可，合并上清液；

(2)上柱纯化

取分离后的上清液以1BV/h流速上柱，然后用水冲洗，冲洗流速为2BV/h，弃去流出液，用70％乙醇溶剂0.8-1倍流速解析，换上80％乙醇溶剂后当流出液流出后开始接收解析液；

(3)处理解析液

将得到的解析液减压浓缩以除去乙醇，然后将浓缩液再加去离子水调整固形物含量，进行喷雾干燥，得到植物黄酮化合物产品。

而且，所述复合酶中果胶酶∶纤维素酶＝6-7∶3-4，为质量比。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明利用微生物复合酶对黄酮配糖体分子结构中的活性点、基本活性结构及可能的作用基团进行生物转化，再通过大孔吸附树脂进行吸附生产出疗效好、附加值高的银杏黄酮甙元生物转化产物。

2、本发明应用以纤维素酶和果胶酶为主的复合酶液对植物叶进行酶解，然后用水提取，可以大大提高总黄酮得率。另外，由于植物黄酮化合物在植物细胞中以甙元和糖甙两种形式存在，在醇水体系中甙元由于其极性低不易被提取，黄酮甙元以90-95％高浓度乙醇提取，黄酮糖甙以60％左右乙醇才能进行提取。因此利用转苷酶和糖等糖基供体将极性低的黄酮甙元、黄酮苷转为更高极性的黄酮苷，从而提高总黄酮在醇水中的提取率。同时，由于被提取的物质极性的增加，可望在低浓度的纯水体系中进行提取，从而可以减少乙醇用量，降低成本。

3、本发明以生物技术理论、天然产物化学理论和技术、国际药物检验标准为指导，制定生产实验方案，确定适宜的酶法提取工艺和黄酮糖苷生物转化工艺，获得高生物效价的产物。确定复合多种酶制剂，优化最佳转化条件，提高黄酮的生物转化效率。制定大孔吸附树脂的吸附技术方案，用于工业化生产，提高产品中苷元型黄酮的含量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1，以银杏叶为例。

一种酶法提取植物黄酮化合物的方法，步骤如下：

(1)浸提

将银杏叶粉碎成20目银杏叶粉，称取450kg银杏叶粉装入萃取罐，加入溶剂进行提取。酶解水提一遍，醇提二遍。其中银杏叶采自天津蓟县的干银杏叶。

第一遍：酶解水提：加入2700L的水，0.1％的复合酶，该复合酶中果胶酶∶纤维素酶＝7∶3(质量比)，其中保持温度50℃，提取2h，过滤；本实施例所用的果胶酶及纤维素酶为天津市诺奥科技有限公司的市售产品。

第二遍：加入2250L 80％的乙醇溶剂，提取温度70℃，提取2h，过滤；

第三遍：加入2250L 80％的乙醇溶剂，提取温度70℃，提取1h，过滤；

合并第一遍和第二遍提取液，用脱味锅进行浓缩脱除乙醇溶剂。浓缩到溶液2000L左右，成为水溶液，放置沉淀3小时后进行离心分离，得到上清液。第三遍提取液，不用浓缩，直接用于第二轮的提取。

(2)上柱纯化

取分离后的上清液以1BV/h流速上柱，然后用1200L水冲洗，冲洗流速为2BV/h，弃去流出液。用70％乙醇溶剂0.8倍流速解析，换上80％乙醇溶剂后当流出液流出10L后开始接收，最后解析溶剂用量为900L。本工步中，所用大孔吸附树脂包括HPD600(沧州宝恩化工有限公司)；YWD01G3、YWD01F、07C(沧州远威化工有限公司)；ABS-17、AB-8(天津南开大学化工厂)，均为市售产品。

(3)处理解析液

将得到的解析液减压浓缩到大约还剩80L，除去乙醇，然后将浓缩液再加去离子水调整固形物含量，进行喷雾干燥，得到银杏叶黄酮化合物产品。

(4)产品检测

检测产品黄酮含量、得率、银杏酸含量、银杏内酯含量等。

(5)结论

乙醇为溶剂提取银杏叶总黄酮类物质的提取率明显高于水提取法。添加复合酶水解后，再用80％乙醇溶液提取黄酮类物质的效果明显，得率提高16％，而且粗提物的量减少，黄酮物质的纯度提高了18.9％，这不但提高了黄酮物质的收得率，也为后续的上柱分离纯化减轻了负担，提高了产品中黄酮的含量。

通过初步计算，1吨银杏叶原料使用复合酶增加成本为120元，按照总黄酮提取率提高了7％计算，可增加提取物的产量大约1千克，增加收入1020元。

实施例2，以沙棘杏叶为例。

(1)浸提

将试验需要的沙棘杏叶粉碎成20目沙棘叶粉，称取450kg该沙棘叶粉装入萃取罐，加入溶剂进行提取。提取三遍：

第一遍：酶解水提：加入2700L的水，0.2％的复合酶，该复合酶中果胶酶∶纤维素酶＝6∶4(质量比)，提取温度50℃，提取2h，过滤；

第二遍：加入2700L 70％的乙醇溶剂，提取温度75℃，提取2h，过滤；

第三遍：加入2700L 70％的乙醇溶剂，提取温度75℃，提取1h，过滤；

合并第一遍和第二遍提取液，浓缩到溶液2000L左右，放置沉淀，3小时后进行离心分离，得到上清液。第三遍提取液，不用浓缩，直接用于第二轮的提取。

(2)上柱纯化

取分离后的溶液以1BV/h流速上柱，然后用1200L水冲洗，冲洗流速为2BV/h，弃去流出液。用70％乙醇溶剂1BV/h流速解析，换上80％乙醇溶剂，出液流出10L后开始接收，最后解析溶剂用量为900L。

(3)处理解析液

将得到的解析液减压浓缩到大约还剩100L，除去乙醇，然后将浓缩液再加去离子水调整固形物含量，大约为30％左右，进行喷雾干燥，得到产品，进行称量及检测。

(4)检测产品黄酮含量、得率等。

(5)结论

酶解条件：复合酶酶解法提取沙棘叶黄酮的效果更好，加入复合酶时提取率明显升高，尤其是在果胶酶与纤维素酶之比为6∶4时，得率最高，为4.82％，比未采用酶解工艺单纯乙醇溶液提取的方法提高17％左右。

Claims (2)

1.一种酶法提取植物黄酮化合物的方法，其特征在于：步骤如下：

(1)浸提：将植物叶片粉碎成叶粉原料，将该叶粉原料装入萃取罐，加入溶剂进行提取。其中酶解水提一遍，醇提二遍，具体为：

第一遍：酶解水提：加入为原料六倍量体积的水，以及为原料重量0.1-0.5％的复合酶，保持温度50℃，提取2h，过滤；

第二遍：加入为原料五倍量体积的70％-80％的乙醇溶剂，提取温度70℃-80℃，提取2h，过滤；

第三遍：加入为原料五倍量体积的70％-80％的乙醇溶剂，提取温度70℃-80℃，提取1h，过滤；

合并第一遍和第二遍提取液，用脱味锅进行浓缩脱除乙醇溶剂，浓缩成为水溶液，放置沉淀3小时后进行离心分离，得到上清液；第三遍提取液直接沉淀即可，合并上清液；

(2)上柱纯化

取分离后的上清液以1BV/h流速上柱，然后用水冲洗，冲洗流速为2BV/h，弃去流出液，用70％乙醇溶剂0.8-1倍流速解析，换上80％乙醇溶剂后当流出液流出后开始接收解析液；

(3)处理解析液

将得到的解析液减压浓缩以除去乙醇，然后将浓缩液再加去离子水调整固形物含量，进行喷雾干燥，得到植物黄酮化合物产品。

2.根据权利要求1所述的酶法提取植物黄酮化合物的方法，其特征在于：所述复合酶中果胶酶∶纤维素酶＝6-7∶3-4，为质量比。