CN110638870A - 一种从荷叶中联产多种活性物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从荷叶中联产多种活性物质的方法，该包括以下步骤：提取、萃取得各活性物质部分，再分别对各部分进行分离纯化，最终得到了8种生物碱单体、3种黄酮单体以及4种多酚单体，且本申请制备得到的荷叶总生物碱、荷叶总黄酮以及荷叶总多酚均可直接应用于不同的领域。本发明提供的方法操作简便，生产周期短，分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可实现工业化从荷叶中联产多种活性物质，得到的单体的纯度达95％以上，有效成分回收率大于70%，极大地利用了荷叶资源。
Description
技术领域
本发明属于中药活性成分的分离纯化技术领域，具体涉及一种从荷叶中联产多种活性物质的方法。
背景技术
荷叶为睡莲科莲属植物莲Nelumbo nucifera Gaertn .的干燥叶，世界各国均有分布，在我国大部分地区也均有分布，主产于湖北、湖南、浙江、江苏等地，在湖北种植面积达100万亩左右。本公司地处湖北洪湖，是著名的水产之都，盛产莲藕，其是洪湖的主要特产之一。荷叶苦，平，归肝、脾、胃经，具有解暑清热、生发清阳、散瘀止血等功效。1991 年11月，卫生部的卫监发(1991) 第45 号文件中，荷叶被列入第2 批“既是食品又是药品”的名单之中。荷叶具有减肥降脂作用，《本草纲目》中就有“荷叶服之，令人瘦劣”的记载。荷叶中含有蛋白质、维生素 C、脂肪、碳水化合物、胡萝卜素、硫胺素、尼克酸等物质，同时还含有铁、钙、磷等多种微量元素以及黄酮类化合物和包括荷叶碱、亚美罂粟碱、原荷叶碱、N-去甲基荷叶碱等在内的多种生物碱。荷叶中的黄酮类化合物和生物碱均具有明显的生物活性和生理功能，荷叶提取物具有降脂减肥、抗氧化、抑制高胆固醇血症和动脉硬化和抑菌等功效，因此对于荷叶提取物的研究成为医药、美容、食品界备受关注的焦点。
荷叶中活性物质种类丰富，包括多酚类、黄酮类、生物碱类、皂苷类、甾体类、有机酸、多糖、氨基酸及挥发油等物质，用于化妆品配方中，能够起到显著的抗氧化、抗皱、补水、美白、淡化色斑、亮肤等作用。
由于洪湖莲藕的种植量大，由此衍生的一系列产品也非常多，但其多由藕、莲子等加工制作而成，目前对于荷叶的利用还不充分，造成了资源的极大浪费。目前传统提取荷叶粉有效物质的方法提取得率都不高，而且提取过程中都会使用到大量的有机溶剂，不利于实际生产应用。
本发明为充分利用荷叶资源，拓展荷叶资源的应用领域，减少因为荷叶腐烂而对环境造成的污染问题，对其中的活性成分进行提取、纯化，其工艺简单，成本低廉，同时可联产多种生物活性物质，进而应用于不同的领域。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的缺陷，提供一种从荷叶中联产多种生物活性物质的方法。该方法操作简便，生产周期短，分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可实现工业化联产荷叶中多种生物活性物质，得到的各活性物质纯度高达95％以上，有效成分回收率大于70%。
为了实现上述发明，本发明采用的技术方案如下：从荷叶中联产多种生物活性物质的方法包括以下步骤：
1）将荷叶清洗烘干后，粉碎过80目筛，以体积分数为65-95%的甲醇或乙醇，超声波辅助加热提取2-3次，提取温度为60-85℃，每次提取时间为0.5-2小时，合并提取液，提取液经真空抽滤去除滤渣，减压浓缩得浸膏；
2）将步骤1）得到的浸膏用水分散后，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，所得氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分供进一步分离；
3）将上述步骤2）中得到的氯仿部分经超滤膜设备，所得过滤液再经纳滤膜设备，所得滤液减压浓缩后，经冷冻干燥或喷雾干燥得荷叶总生物碱；
4）将上述荷叶中生物碱用中低压制备型液相色谱进行分离，以0.1-0.2%三乙胺的水溶液和乙腈作为洗脱剂，依次进行梯度洗脱，分瓶收集洗脱液，静置析晶并过滤干燥后，经鉴定，共得到如下具体8种生物碱：荷叶碱、去氢荷叶碱、莲碱、去氢莲碱、亚美罂粟碱、巴婆碱、O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱；
5）将上述步骤2）中得到的乙酸乙酯部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上大孔吸附树脂，用10倍柱体积的去离子水洗脱，再依次用水、50-75%乙醇洗脱，分别洗至无色，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总黄酮；
6）将步骤5）得到的荷叶总黄酮上Sephadex LH-20 柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，经TCL检测合并相同组分，上述各组分再经半制备型HPLC，乙腈-水为洗脱剂，最终分离得到如下3种黄酮化合物：槲皮素、木犀草素、3-甲氧基槲皮素，其中3-甲氧基槲皮素为首次从荷叶中分离得到；
7）将上述步骤2）中得到的正丁醇部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上聚酰胺柱层析，以乙醇-水进行梯度洗脱，每个梯度洗3-5倍柱体积，收集30%-50%乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总多酚；
8）上述步骤7）所得的荷叶总多酚上半制备型HPLC，以甲醇-水作为流动相，流速为1ml/min，收集不同时间的流出物，最终分离得到如下4中多酚物质：儿茶素、表儿茶素、Nympholide A2和Nympholide B3。
上述步骤1）中提取溶剂的用量为药材质量：溶液体积为1Kg: 10-40L；超声波功率为350W；
步骤3）中超滤和纳滤的温度均控制在40-60℃、压力均控制在0.6-2.2MPa；
步骤5）中大孔吸附树脂为AB-8大孔树脂，上样浓度为20mg /mL，上样体积20mL，径高比为1:30，乙醇浓度为70%。
本发明还提供了上述步骤3）所得的荷叶总生物碱在制备降脂减肥药品、食品或化妆品中的应用。
本发明还提供了上述步骤5）所得的荷叶总黄酮在制备化妆品中的应用。
本发明还提供了上述步骤7）所得的荷叶总多酚在制备化妆品中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点是：
本发明提供了一种从荷叶中联产多种活性物质的方法，该包括以下步骤：提取、萃取得各活性物质部分，再分别对各部分进行分离纯化，最终得到了8种生物碱单体、3种黄酮单体以及4种多酚单体，且本申请制备得到的荷叶总生物碱、荷叶总黄酮以及荷叶总多酚均可直接应用于不同的领域。其中对于荷叶总生物碱的分离提取，本发明采用膜分离技术并联合中低压制备型液相色谱进行分离，快速高效地获得了多种生物碱单体；对于荷叶总黄酮的分离纯化，本发明以大孔吸附树脂、Sephadex LH-20 柱色谱以及半制备型HPLC联合使用，高效分离得到了3种黄酮单体，其中3-甲氧基槲皮素为首次从荷叶中分离得到；对于荷叶总多酚的分离纯化，本申请以聚酰胺柱层析联合半制备型HPLC，同样高效地分离得到了4种多酚单体。上述单体化合物的获得，为进一步开发荷叶可利用价值提供了重要保障。
本发明所提供的一种从荷叶中联产多种活性物质的方法，优化提取分离步骤，降低生产成本，依据该方法所得的活性单体含量大于95%，有效成分回收率大于70%。
具体实施方式
实施例1：
从荷叶中联产多种生物活性物质的方法包括以下步骤：
1）将荷叶25kg清洗烘干后，粉碎过80目筛，以体积分数为75%的乙醇，超声波辅助加热提取3次，提取温度为65℃，每次提取时间为1.5小时，提取溶剂的用量为药材质量：溶液体积为1Kg: 20L；超声波功率为350W，合并提取液，提取液经真空抽滤去除滤渣，减压浓缩得浸膏；
2）将步骤1）得到的浸膏用水分散后，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，所得氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分供进一步分离；
3）将上述步骤2）中得到的氯仿部分经超滤膜设备，温度控制在40-60℃、压力控制在0.6-2.2MPa，所得过滤液再经纳滤膜设备，温度控制在40-60℃、压力控制在0.6-2.2MPa，所得滤液减压浓缩后，经冷冻干燥或喷雾干燥得荷叶总生物碱；
4）将上述荷叶中生物碱用中低压制备型液相色谱进行分离，以0.1三乙胺的水溶液和乙腈作为洗脱剂，依次进行梯度洗脱，分瓶收集洗脱液，静置析晶并过滤干燥后，经鉴定，共得到如下具体8种生物碱：荷叶碱、去氢荷叶碱、莲碱、去氢莲碱、亚美罂粟碱、巴婆碱、O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱，上述化合物纯度均大于98%；
5）将上述步骤2）中得到的乙酸乙酯部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上AB-8大孔吸附树脂，上样浓度为20mg /mL，上样体积20mL，径高比为1:30，用10倍柱体积的去离子水洗脱，再依次用水、70%乙醇洗脱，分别洗至无色，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总黄酮；
6）将步骤5）得到的荷叶总黄酮上Sephadex LH-20 柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，经TCL检测合并相同组分，上述各组分再经半制备型HPLC，乙腈-水为洗脱剂，最终分离得到如下3种黄酮化合物：槲皮素、木犀草素、3-甲氧基槲皮素，其中3-甲氧基槲皮素为首次从荷叶中分离得到，上述化合物纯度均大于95%；
7）将上述步骤2）中得到的正丁醇部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上聚酰胺柱层析，以乙醇-水进行梯度洗脱，每个梯度洗3-5倍柱体积，收集30%-50%乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总多酚；
8）上述步骤7）所得的荷叶总多酚上半制备型HPLC，以甲醇-水作为流动相，流速为1ml/min，收集不同时间的流出物，最终分离得到如下4中多酚物质：儿茶素、表儿茶素、Nympholide A2和Nympholide B3，上述化合物纯度均大于95%。
实施例2：
从荷叶中联产多种生物活性物质的方法包括以下步骤：
1）将荷叶50kg清洗烘干后，粉碎过80目筛，以体积分数为65%的甲醇，超声波辅助加热提取2次，提取温度为70℃，每次提取时间为2小时，提取溶剂的用量为药材质量：溶液体积为1Kg: 10L；超声波功率为350W，合并提取液，提取液经真空抽滤去除滤渣，减压浓缩得浸膏；
2）将步骤1）得到的浸膏用水分散后，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，所得氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分供进一步分离；
3）将上述步骤2）中得到的氯仿部分经超滤膜设备，温度控制在60℃、压力控制在1.5MPa，所得过滤液再经纳滤膜设备，温度控制在60℃、压力控制在2.0MPa，所得滤液减压浓缩后，经冷冻干燥或喷雾干燥得荷叶总生物碱；
4）将上述荷叶中生物碱用中低压制备型液相色谱进行分离，以0.2三乙胺的水溶液和乙腈作为洗脱剂，依次进行梯度洗脱，分瓶收集洗脱液，静置析晶并过滤干燥后，经鉴定，共得到如下具体8种生物碱：荷叶碱、去氢荷叶碱、莲碱、去氢莲碱、亚美罂粟碱、巴婆碱、O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱，上述化合物纯度均大于98%；
5）将上述步骤2）中得到的乙酸乙酯部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上AB-8大孔吸附树脂，上样浓度为20mg /mL，上样体积20mL，径高比为1:30，用10倍柱体积的去离子水洗脱，再依次用水、70%乙醇洗脱，分别洗至无色，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总黄酮；
6）将步骤5）得到的荷叶总黄酮上Sephadex LH-20 柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，经TCL检测合并相同组分，上述各组分再经半制备型HPLC，乙腈-水为洗脱剂，最终分离得到如下3种黄酮化合物：槲皮素、木犀草素、3-甲氧基槲皮素，其中3-甲氧基槲皮素为首次从荷叶中分离得到，上述化合物纯度均大于95%；
7）将上述步骤2）中得到的正丁醇部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上聚酰胺柱层析，以乙醇-水进行梯度洗脱，每个梯度洗3-5倍柱体积，收集30%-50%乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总多酚；
8）上述步骤7）所得的荷叶总多酚上半制备型HPLC，以甲醇-水作为流动相，流速为1ml/min，收集不同时间的流出物，最终分离得到如下4中多酚物质：儿茶素、表儿茶素、Nympholide A2和Nympholide B3，上述化合物纯度均大于95%。
实施例3：
从荷叶中联产多种生物活性物质的方法包括以下步骤：
1）将荷叶100kg清洗烘干后，粉碎过80目筛，以体积分数为90%的乙醇，超声波辅助加热提取3次，提取温度为85℃，每次提取时间为1小时，提取溶剂的用量为药材质量：溶液体积为1Kg: 40L；超声波功率为350W，合并提取液，提取液经真空抽滤去除滤渣，减压浓缩得浸膏；
2）将步骤1）得到的浸膏用水分散后，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，所得氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分供进一步分离；
3）将上述步骤2）中得到的氯仿部分经超滤膜设备，温度控制在40-60℃、压力控制在0.6-2.2MPa，所得过滤液再经纳滤膜设备，温度控制在40-60℃、压力控制在0.6-2.2MPa，所得滤液减压浓缩后，经冷冻干燥或喷雾干燥得荷叶总生物碱；
4）将上述荷叶中生物碱用中低压制备型液相色谱进行分离，以0.1三乙胺的水溶液和乙腈作为洗脱剂，依次进行梯度洗脱，分瓶收集洗脱液，静置析晶并过滤干燥后，经鉴定，共得到如下具体8种生物碱：荷叶碱、去氢荷叶碱、莲碱、去氢莲碱、亚美罂粟碱、巴婆碱、O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱，上述化合物纯度均大于98%；
5）将上述步骤2）中得到的乙酸乙酯部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上AB-8大孔吸附树脂，上样浓度为20mg /mL，上样体积20mL，径高比为1:30，用10倍柱体积的去离子水洗脱，再依次用水、70%乙醇洗脱，分别洗至无色，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总黄酮；
6）将步骤5）得到的荷叶总黄酮上Sephadex LH-20 柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，经TCL检测合并相同组分，上述各组分再经半制备型HPLC，乙腈-水为洗脱剂，最终分离得到如下3种黄酮化合物：槲皮素、木犀草素、3-甲氧基槲皮素，其中3-甲氧基槲皮素为首次从荷叶中分离得到，上述化合物纯度均大于95%；
7）将上述步骤2）中得到的正丁醇部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上聚酰胺柱层析，以乙醇-水进行梯度洗脱，每个梯度洗3-5倍柱体积，收集30%-50%乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总多酚；
8）上述步骤7）所得的荷叶总多酚上半制备型HPLC，以甲醇-水作为流动相，流速为1ml/min，收集不同时间的流出物，最终分离得到如下4中多酚物质：儿茶素、表儿茶素、Nympholide A2和Nympholide B3，上述化合物纯度均大于95%。
Claims (7)
1.一种从荷叶中联产多种生物活性物质的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将荷叶清洗烘干后，粉碎过80目筛，以体积分数为65-95%的甲醇或乙醇，超声波辅助加热提取2-3次，提取温度为60-85℃，每次提取时间为0.5-2小时，合并提取液，提取液经真空抽滤去除滤渣，减压浓缩得浸膏；
2）将步骤1）得到的浸膏用水分散后，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，所得氯仿部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分供进一步分离；
3）将上述步骤2）中得到的氯仿部分经超滤膜设备，所得过滤液再经纳滤膜设备，所得滤液减压浓缩后，经冷冻干燥或喷雾干燥得荷叶总生物碱；
4）将上述荷叶中生物碱用中低压制备型液相色谱进行分离，以0.1-0.2%三乙胺的水溶液和乙腈作为洗脱剂，依次进行梯度洗脱，分瓶收集洗脱液，静置析晶并过滤干燥后，经鉴定，共得到如下具体8种生物碱：荷叶碱、去氢荷叶碱、莲碱、去氢莲碱、亚美罂粟碱、巴婆碱、O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱；
5）将上述步骤2）中得到的乙酸乙酯部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上大孔吸附树脂，用10倍柱体积的去离子水洗脱，再依次用水、50-75%乙醇洗脱，分别洗至无色，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总黄酮；
6）将步骤5）得到的荷叶总黄酮上Sephadex LH-20 柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，经TCL检测合并相同组分，上述各组分再经半制备型HPLC，乙腈-水为洗脱剂，最终分离得到如下3种黄酮化合物：槲皮素、木犀草素、3-甲氧基槲皮素，其中3-甲氧基槲皮素为首次从荷叶中分离得到；
7）将上述步骤2）中得到的正丁醇部分减压浓缩至干，用蒸馏水溶解，将所得水溶液上聚酰胺柱层析，以乙醇-水进行梯度洗脱，每个梯度洗3-5倍柱体积，收集30%-50%乙醇洗脱液，浓缩干燥即荷叶总多酚；
8）上述步骤7）所得的荷叶总多酚上半制备型HPLC，以甲醇-水作为流动相，流速为1ml/min，收集不同时间的流出物，最终分离得到如下4中多酚物质：儿茶素、表儿茶素、Nympholide A2和Nympholide B3。
2.根据权利要求1所述的一种从荷叶中联产多种生物活性物质的方法，其特征在于：所述步骤1）中提取溶剂的用量为药材质量：溶液体积为1Kg: 10-40L；超声波功率为350W。
3.根据权利要求1所述的一种从荷叶中联产多种生物活性物质的方法，其特征在于：所述步骤3）中超滤和纳滤的温度均控制在40-60℃、压力均控制在0.6-2.2MPa。
4.根据权利要求1所述的一种从荷叶中联产多种生物活性物质的方法，其特征在于：所述步骤5）中大孔吸附树脂为AB-8大孔树脂，上样浓度为20mg /mL，上样体积20mL，径高比为1:30，乙醇浓度为70%。
5.权利要求1步骤3）所得的荷叶总生物碱在制备降脂减肥药品、食品或化妆品中的应用。
6.权利要求1步骤5）所得的荷叶总黄酮在制备化妆品中的应用。
7.权利要求1步骤7）所得的荷叶总多酚在制备化妆品中的应用。
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