CN110590882B - 一种从金花葵花中同时分离纯化6种黄酮化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从金花葵花中同时分离纯化6种黄酮化合物的方法，具体涉及从金花葵花中同时分离纯化芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素‑8‑O‑葡萄糖醛酸苷、杨梅素和槲皮素的方法，属于天然化合物提取和分离领域。方法如下：微波辅助醇水提取金花葵花，采用溶剂萃取法获得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相萃取物，利用金花葵花6种黄酮在各萃取相的溶解度不同实现初步纯化；利用聚酰胺快速制备色谱和制备型高效液相色谱分离前述混合物，获得芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素‑8‑O‑葡萄糖醛酸苷、杨梅素和槲皮素等6种黄酮化合物，纯度均大于95.0％。该方法操作简单、生产周期较短、制得产物纯度高，可作为分离纯化高纯度金花葵花黄酮的首选方法。

Description

一种从金花葵花中同时分离纯化6种黄酮化合物的方法
技术领域
本发明涉及一种分离纯化黄酮类化合物的方法，具体涉及从金花葵花中同时分离纯化高纯度芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素和槲皮素的方法。属于天然化合物提取和分离领域。
背景技术
金花葵花为锦葵科秋葵属Malvaceae一年生草本植物金花葵Hibiseu manihotL.的干燥花冠，含有多种活性成分，在药品、食品或保健品等行业中具有较好的应用前景。近年，金花葵花作为提取黄酮类物质的重要来源受到各方关注。已有研究表明，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、杨梅素和槲皮素是金花葵花的主要黄酮类化合物，其含量分别为0.0748％、1.0763％、 0.5820％、0.1185％和0.0527％(沈阳药科大学学报，2019，36，118-122)，此外，还有研究报道棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷为金花葵花中含量最高的黄酮类化合物，达到3.411％ (Journal of chromatographic science，2009，47，206-210)。因此，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素和槲皮素是金花葵花中含量较高的6种黄酮类化合物。
芦丁(Rutin)，又名槲皮素-3-O-β-D-芸香糖苷，分子式C27H30O16，分子量610.52，为淡黄色或淡绿色针状结晶或结晶性粉末，苷元为槲皮素，是一种广泛存在于植物中的黄酮醇配糖体，结构式如下式 所示。芦丁及其衍生物具有广泛的药理活性，临床上主要用于防治脑出血、高血压、视网膜出血、紫癜和急性出血性肾炎等。
Figure BDA0002202672940000011
金丝桃苷(Hyperoside)，又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，异槲皮苷(Isoquercitrin)，又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，二者互为同分异构体，分子式C21H20O12，分子量464.38，黄色针状结晶，具有相同的槲皮素苷元和相似的极性，属于黄酮醇苷类化合物，结构式如下式 所示。许多药理学研究表明，金丝桃苷具有改善心血管功能、脑缺血/再灌注损伤保护、抗氧化还原、抗炎、镇痛止咳、降压等作用(中国药房，2016，27，1415-1417)，异槲皮苷具有降血压、抗炎、抗抑郁等药理学活性(药学实践杂志，2011，29，272-274)。
Figure BDA0002202672940000021
棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷(Hibifolin)，分子式C21H18O14，分子量494.36，苷元为棉皮素，作为一种典型的含有6个羟基的黄酮醇类化合物，具有良好的抗炎活性和神经细胞保护作用(Computational biology and chemistry，2016，64，353-358)，结构式如下式 所示。临床可作为一种用于抗老年痴呆、肿瘤疾病及心血管等疾病的潜在药物(Neuroscienceletters，2009，461，172–176)。
Figure BDA0002202672940000022
异槲皮苷(Isoquercitrin)，分子式C21H20O12，分子量464.38，黄色针状结晶，熔点230℃。动物实验表明具有降血压作用。毛细血管渗透性等试验表明具有抗炎作用。也有报道对棉蛉芽虫的幼虫有毒杀作用，具有降酶作用，可作为田基黄治疗肝炎的有效成分之一，结构式如下式 所示。
Figure BDA0002202672940000023
杨梅素(Myricetin)，分子式C15H10O8，分子量318.23，黄色针状晶体，是一种六羟基黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗微生物、抗神经退化、抗高血压、抗过敏、抗酸、降血糖和抗炎、镇痛等多种药理作用(食品与药品，2019，21，75-80)，结构式如下式 所示。
Figure BDA0002202672940000031
槲皮素(Quercetin)，分子式C15H10O7，分子量302.23，是一种五羟基黄酮类化合物，存在于多种植物的花、叶与果实中，具有抗癌，抗氧化，抗炎，抗血栓，抗病毒，心血管保护，免疫调节等多种药理学活性(药学研究，2013，32，400-403)。
Figure BDA0002202672940000032
金花葵花中含量较高的6种黄酮类化合物结构相似，难以采用常规方法同时分离纯化得到高纯度的黄酮单体。目前，黄酮的分离纯化方法主要有溶剂萃取法、膜分离法、柱色谱法、薄层色谱法以及高效液相制备色谱法等。比如，王新财等(中国专利CN201210303085.1) 利用柱层析的方法从荷叶中分离芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素的方法，每种黄酮单体纯度均≤93.0％。魏吉城等(中国专利CN201510618470.9)通过乙醇提取、大孔树脂提取金花葵总黄酮，所制得黄酮提取物总黄酮含量大于70％，其中，金丝桃苷的含量仅大于7％。谢冬养(中国专利CN201711046644.4)通过亚临界流体萃取和大孔树脂层析的方式从红旱莲中提取槲皮素和异槲皮苷。这些方法都存在产物为混合物，单体黄酮化合物纯度较低、生产周期长、操作复杂等问题，限制了金花葵花中黄酮的应用。目前从金花葵花中同时纯化多种高纯度的黄酮类化合物尚未见报道。
本发明从金花葵花提取液出发，通过溶剂萃取、聚酰胺快速纯化制备色谱和高效液相色谱法，开发一种黄酮产物纯度高、生产周期较短、操作简单的方法。该方法可以实现从金花葵花中分离纯化芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素和槲皮素等6种黄酮，每种黄酮化合物的纯度均高于95％(HPLC分析)。
发明内容
本发明的目的是提供一种从金花葵花中同时分离纯化6种黄酮化合物，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素和槲皮素的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种从金花葵花提取液出发，利用溶剂萃取、聚酰胺快速纯化制备色谱和高效液相色谱法，分离纯化获得6种黄酮化合物方法，6种黄酮化合物为芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素和槲皮素，其纯度均高于95％，其步骤如下：
1)金花葵花提取液的制备：精密称取一定量干燥金花葵花粗粉末，用已经优化的提取条件：70％乙醇水溶液为提取溶剂，料液比为1:20g/mL，微波提取温度为80℃，微波提取时间10min，然后重复提取三次，收集上清液，即得金花葵花提取液，在4℃下保存备用。
2)多溶剂萃取：将步骤1)得到的金花葵提取液依次使用等量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，多次重复萃取，合并萃取液，减压浓缩，得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相浸膏；对金花葵花各萃取相浸膏进行分析，结果表明金花葵花黄酮主要富集在乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，根据各萃取相中黄酮单体含量的差异进行下一步分离纯化。
3)聚酰胺快速制备色谱纯化：金花葵花中黄酮化合物结构类似，简单的方法难以区分，采用单一方法同时获得多种黄酮化合物单体不可能。因此采用聚酰胺快速制备色谱纯化步骤 2)得到的乙酸乙酯相浸膏，使成分复杂的浸膏初步得以分离，在快速制备色谱分离纯化过程中，采用UV检测器在360nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质。快速制备色谱的纯化条件如下：
色谱柱：以聚酰胺为填料的自填装色谱柱(Φ22mm╳300mm，75～150μm，30g)；
流动相：A相：水；B相：乙醇；流速：30mL/min；
压力上限：200psi；上样量：乙酸乙酯相浸膏溶液(10mL/次)；
梯度洗脱条件：0-10min：B相0；10-25min：B相10％；25-50min：B相30％；50-75min：B相50％；75-85min：B相70％；85-100min：B相95％。
采用高效液相色谱色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得三组混合物为乙酸乙酯相-Ⅰ、乙酸乙酯相-Ⅱ和乙酸乙酯相-Ⅲ。
4)制备型高效液相色谱纯化：将上述用聚酰胺快速制备色谱分离纯化的三组混合物乙酸乙酯相-Ⅰ、乙酸乙酯相-Ⅱ、乙酸乙酯相-Ⅲ、以及正丁醇相浸膏和水相浸膏用制备型高效液相色谱进行进一步分离纯化。考虑制备色谱体系的承受压力、产品纯度及溶剂消耗，优化得出各组分的最佳制备型高效液相色谱条件，按照最佳制备型高效液相色谱条件多次重复进样，收集各馏分并检测，减压浓缩，真空干燥，获得芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O- 葡萄糖醛酸苷、杨梅素和槲皮素等6种黄酮化合物，经HPLC检测其纯度均高于95％。
用高效液相色谱法分析金花葵花提取液、石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相、水萃取相和制备的6种黄酮化合物，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素和槲皮素，得到的分析色谱图如附图所示。采用的色谱条件为：Waters HPLC高效液相色谱仪，色谱柱为ODS C18(4.6mm×200mm，5μm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸溶液梯度洗脱(0～18min，15:85～16:84v/v；18～26min，16:84～20:80v/v；26～35min， 20:80～40:60v/v；35～40min，40:60～40:60v/v；40～50min，40:60～15:85v/v)，流速为 1.0mL/min，检测波长为360nm，进样量10μL，柱温为30℃。
作为优选，所述步骤2)中分别使用等量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取3-5次至金花葵花黄酮提取液至颜色较浅，利用金花葵花黄酮在各萃取相中的溶解度不同实现初步的分离纯化。最优选的萃取次数为4次。
作为优选，所述步骤3)中的乙酸乙酯相-Ⅰ、乙酸乙酯相-Ⅱ和乙酸乙酯相-Ⅲ分别为聚酰胺快速制备色谱纯化过程中使用30％乙醇洗脱液、50％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液洗脱得到的混合组分。
作为优选，所述步骤4)中的乙酸乙酯相-Ⅰ混合物的最佳制备型高效液相色谱条件为：色谱柱：ODS C18色谱柱(φ20mm×250mm，5μm)；柱温：30℃；检测波长：360 nm；流速15mL/min；上样量：1mL；流动相洗脱条件：乙腈-0.1％甲酸溶液(18:82v/v) 等度洗脱。
作为优选，所述步骤4)中的乙酸乙酯相-Ⅱ混合物的最佳制备型高效液相色谱条件为： ODS C18反相色谱柱(φ20mm×250mm，5μm)；柱温：30℃；检测波长：360nm；流速15mL/min；上样量：1mL；流动相洗脱条件：甲醇-0.1％甲酸溶液(50:50v/v)等度洗脱。
作为优选，所述步骤4)中的乙酸乙酯相-Ⅲ混合物的最佳制备型高效液相色谱条件为：色谱柱：ODS C18反相色谱柱(φ20mm×250mm，5μm)；柱温：30℃；检测波长： 360nm；流速15mL/min；上样量：1mL；流动相洗脱条件：甲醇-0.1％甲酸溶液(60:40v/v) 等度洗脱。
作为优选，所述步骤4)中的正丁醇相的最佳制备型高效液相色谱条件为：色谱柱：ODS C18反相色谱柱(φ20mm×250mm，5μm)；柱温：30℃；检测波长：360nm；流速 15mL/min；上样量：1.5mL；流动相洗脱条件：甲醇-0.1％甲酸溶液(50:50v/v)等度洗脱。
作为优选，所述步骤4)中的水相的最佳制备型高效液相色谱条件为：ODS C18反相色谱柱(φ20mm×250mm，5μm)；柱温：30℃；检测波长：360nm；流速15mL/min；上样量：1mL；流动相洗脱条件：甲醇-0.1％甲酸溶液(60:40v/v)等度洗脱。
本发明取得了如下有益成果：
1.采用溶剂萃取法获得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相四种萃取混合物，金花葵花黄酮类混合物主要富集在乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，利用金花葵花中含量较高的6 种黄酮化合物在各萃取相的溶解度不同实现了初步纯化；
2.利用聚酰胺快速制备色谱和制备型高效液相色谱，优化制备色谱条件，经过多次分离纯化获得6种黄酮化合物，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素和槲皮素，其纯度均大于95.0％；
3.上述分离纯化方法具有操作简单、生产周期较短等特点，并且获得黄酮化合物纯度高、因而可作为分离纯化高纯度金花葵花黄酮的首选方法。
附图说明
图1是金花葵花提取液的高效液相色谱图。
图2是芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素和槲皮素混合对照品的高效液相色谱图。
图3是石油醚相浸膏的高效液相色谱图。
图4是乙酸乙酯相浸膏的高效液相色谱图。
图5是正丁醇相浸膏的高效液相色谱图。
图6是水相浸膏的高效液相色谱图。
图7是三组混合物乙酸乙酯相-Ⅰ、乙酸乙酯相-Ⅱ和乙酸乙酯相-Ⅲ的高效液相色谱图。
图8是经制备型高效液相色谱制得的芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素和槲皮素的高效液相色谱图。
图8 中，1—芦丁；2—金丝桃苷；3—异槲皮苷；4—棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷；5—杨梅素；6—槲皮素。
具体实施方式：
下面结合附图和具体的实施例对本发明的一种从金花葵花中同时分离纯化6种黄酮化合物的方法进一步说明，以便本领域的技术人员更加了解本发明，但是并不以此限制本发明。
实施例1：
1)金花葵花提取液的制备：精密称取107g干燥金花葵花粗粉末，以料液比为1:20g/mL，70％乙醇水溶液，80℃为提取条件，微波提取10min，抽滤，重复提取三次，收集上清液，定容到250mL容量瓶中即得金花葵花提取液，其高效液相色谱图如图1所示；
2)溶剂萃取：将步骤1)得到的金花葵提取液次使用等量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，重复萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，定容到250mL容量瓶，获到金花葵花石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，其石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相的高效液相色谱图分别如附图3、4、5和6所示；
3)聚酰胺快速制备色谱法纯化：对成分较为复杂的乙酸乙酯相经聚酰胺快速制备色谱进行初步分离纯化，采用UV检测器检测，收集在360nm有吸收的物质，每15mL收集一个馏分。快速制备色谱的纯化条件如下：
色谱柱：以聚酰胺为填料的自填装色谱柱(Φ22mm╳300mm，75～150μm，30g)；
流动相：A相：水；B相：乙醇；流速30mL/min；
压力上限：200psi；上样量：乙酸乙酯相(10mL/次)；
洗脱条件：0-10min：B相0；10-25min：B相10％；25-50min：B相30％；50-75min： B相50％；75-85min：B相70％；85-100min：B相95％。
采用高效液相色谱法对收集各馏分进行检测，分别收集30％乙醇洗脱液、50％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥，获得三种混合物组分乙酸乙酯相-Ⅰ、乙酸乙酯相-Ⅱ和乙酸乙酯相-Ⅲ，其高效液相色谱图如图7所示；
4)制备型高效液相色谱法纯化：将上述无法完全用聚酰胺快速制备色谱分离的混合组分乙酸乙酯相-Ⅰ、乙酸乙酯相-Ⅱ、乙酸乙酯相-Ⅲ、正丁醇相和水相用制备型高效液相色谱进行进一步分离纯化。
综合考虑制备色谱体系的承受压力、产品纯度及溶剂消耗，不断优化制备色谱条件，得出以下条件为各组分的最佳制备型高效液相色谱条件，表1是各混合组分最佳制备型高效液相色谱条件。
表1各混合组分最佳制备型高效液相色谱条件
Figure BDA0002202672940000071
Figure BDA0002202672940000081
按照表1的制备色谱条件多次重复进样，对各馏分收集并检测，合并相同组分，减压浓缩，真空干燥，经高效液相色谱定量分析，获得芦丁32.7mg，纯度为95.93％；获得金丝桃苷73.2mg，纯度为96.88％；获得异槲皮苷65.8mg，纯度为99.75％；获得棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷145.5mg，纯度为99.49％；获得杨梅素65.0mg，纯度为95.37％；获得槲皮素28.9mg，纯度为96.48％。分析各黄酮化合物的高效液相色谱图如附图8所示。
实施例2：
基本操作同实施例1，不同之处在于精密称取110g干燥金花葵花粗粉末，经高效液相色谱分析，获得芦丁35.4mg，纯度为96.87％；获得金丝桃苷72.5mg，纯度为95.37％；获得异槲皮苷67.5mg，纯度为98.34％；获得棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷151.8mg，纯度为99.27％；获得杨梅素63.2mg，纯度为96.58％；获得槲皮素25.3mg，纯度为95.78％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种从金花葵花中同时分离纯化6种黄酮化合物的方法，其特征在于：
1)金花葵花提取液的制备：称取干燥金花葵花粗粉末，提取条件为：70％乙醇水溶液为提取溶剂，料液比为1:20g/mL，微波提取温度为80℃，微波提取时间10min，然后重复提取三次，收集上清液，即得金花葵花提取液；
2)溶剂萃取：将步骤1)得到的金花葵提取液依次使用等量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，多次重复萃取，合并萃取液，减压浓缩，得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相浸膏；对金花葵花各萃取相浸膏进行分析，表明金花葵花黄酮主要富集在乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，根据各萃取相中黄酮单体含量的差异进行下一步分离纯化；
3)聚酰胺快速制备色谱法纯化：金花葵花黄酮化合物结构类似，种类多，因此采用聚酰胺快速制备色谱对步骤2)得到的乙酸乙酯相浸膏进行初步分离纯化，经快速制备色谱分离纯化，采用UV检测器在360nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质；快速制备色谱的纯化条件如下：
色谱柱：以聚酰胺为填料的自填装内径为22mm，柱长为300mm，粒度为75～150μm，添料量为30g的色谱柱；流动相：A相：水；B相：乙醇；流速：30mL/min；压力上限：200psi；上样量：乙酸乙酯相为10mL/次；梯度洗脱条件：0-10min：B相0；10-25min：B相10％；25-50min：B相30％；50-75min：B相50％；75-85min：B相70％；85-100min：B相95％；
采用高效液相色谱色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得三组混合物为乙酸乙酯相-Ⅰ、乙酸乙酯相-Ⅱ和乙酸乙酯相-Ⅲ；
4)制备型高效液相色谱纯化：将上述无法完全用聚酰胺快速制备色谱分离纯化的混合组分乙酸乙酯相-Ⅰ、乙酸乙酯相-Ⅱ、乙酸乙酯相-Ⅲ、正丁醇相和水相用制备型高效液相色谱进一步分离纯化；综合考虑制备色谱体系的承受压力、产品纯度及溶剂消耗，制备色谱条件得出各组分的最佳制备型高效液相色谱条件，按照该条件多次重复进样，对各馏分收集并分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素和槲皮素6种黄酮化合物，其纯度均大于95％。
2.根据权利要求1所述的一种从金花葵花中同时分离纯化6种黄酮化合物的方法，其特征在于：加入等量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3-5次至金花葵花黄酮提取液至颜色较浅，利用金花葵花黄酮在各萃取相中的溶解度不同实现初步的分离纯化。
3.根据权利要求1所述的一种从金花葵花中同时分离纯化6种黄酮化合物的方法，其特征在于：乙酸乙酯相-Ⅰ、乙酸乙酯相-Ⅱ和乙酸乙酯相-Ⅲ分别为聚酰胺快速制备色谱使用30％乙醇洗脱液、50％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液洗脱获得组分。
4.根据权利要求1所述的一种从金花葵花中同时分离纯化6种黄酮化合物的方法，其特征在于：乙酸乙酯相-Ⅰ的最佳制备型高效液相色谱条件为：色谱柱：内径为20mm，柱长为250mm，粒度为5μm的ODS C18色谱柱；柱温：30℃；检测波长：360nm；流速15mL/min；上样量：1mL；流动相洗脱条件：乙腈-0.1％甲酸溶液的体积比为18:8等度洗脱。
5.根据权利要求1所述的一种从金花葵花中同时分离纯化6种黄酮化合物的方法，其特征在于：乙酸乙酯相-Ⅱ的制备型高效液相色谱条件为：内径为20mm，柱长为250mm，粒度为5μm的ODS C18色谱柱；柱温：30℃；检测波长：360nm；流速15mL/min；上样量：1mL；流动相洗脱条件：甲醇-0.1％甲酸溶液的体积比为50:50等度洗脱。
6.根据权利要求1所述的一种从金花葵花中同时分离纯化6种黄酮化合物的方法，其特征在于：乙酸乙酯相-Ⅲ的制备型高效液相色谱条件为：色谱柱：内径为20mm，柱长为250mm，粒度为5μm的ODS C18反相色谱柱；柱温：30℃；检测波长：360nm；流速15mL/min；上样量：1mL；流动相洗脱条件：甲醇-0.1％甲酸溶液的体积比为60:40等度洗脱。
7.根据权利要求1所述的一种从金花葵花中同时分离纯化6种黄酮化合物的方法，其特征在于：正丁醇相的制备型高效液相色谱条件为：色谱柱：内径为20mm，柱长为250mm，粒度为5μm的ODS C18反相色谱柱；柱温：30℃；检测波长：360nm；流速15mL/min；上样量：1.5mL；流动相洗脱条件：甲醇-0.1％甲酸溶液的体积比为50:50等度洗脱。
8.根据权利要求1所述的一种从金花葵花中同时分离纯化6种黄酮化合物的方法，其特征在于：水相的制备型高效液相色谱条件为：色谱柱：内径为20mm，柱长为250mm，粒度为5μm的ODS C18反相色谱柱；柱温：30℃；检测波长：360nm；流速15mL/min；上样量：1mL；流动相洗脱条件：甲醇-0.1％甲酸溶液的体积比为60:40等度洗脱。
9.根据权利要求2所述的一种从金花葵花中同时分离纯化6种黄酮化合物的方法，其特征在于：加入等量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取次数为4次。
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