CN1978452A - 罗布麻甲素制备新工艺 - Google Patents

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堵年生
马成
热娜·卡斯木
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Abstract

本发明以大花罗布麻(Poacynum hendersonii(Hook.F.)Woodson)或罗布麻(Apocynum venetum Linn)的叶为原料，采用水提醇沉除杂的方法，提取液经大孔吸附树脂分离后再用葡聚糖凝胶LH－20纯化得罗布麻甲素，此法与传统硅胶柱层析的方法相比，具有实验周期短，有机溶媒消耗少，制得的产品得率高和纯度好的特点，本法制得的罗布麻甲素可供药物研究或化学对照品使用。以本发明制备的罗布麻甲素经过光谱鉴定确证其结构为槲皮素－3－O－β－D－吡喃葡萄糖苷，其纯度经纯度角测定后，纯度角小于纯度阈值，经计算该化合物纯度为99％以上，符合对照品要求。

Description

罗布麻甲素制备新工艺
技术领域：本发明涉及一种用大孔吸附树脂法从大花罗布麻(Poacynumn hendersonii(Hook.F.)Woodson)或罗布麻(Apocynum venetum Linn)中分离罗布麻甲素的新方法。
背景技术：罗布麻甲素，又称异槲皮苷(isoquercitrin)，化学名称为槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside)，广泛存在于罗布麻、大花罗布麻和草棉花等植物中，它具有降压、降酶和抗血小板聚集作用。以往文献的制备方法是乙醇提取，提取物再用石油醚、乙酸乙酯分别萃取，其中乙酸乙酯部分再经过硅胶柱层析而获得(江纪武，肖庆祥.植物药有效成分手册.北京：轻工业出版社，1989；张超等.中药地菍黄酮类成分的分离与鉴定，中国药学杂志2003；38(4)：256-258；胡碧煌，田珍，楼之岑.大叶白麻叶中黄酮甙的分离和鉴定，植物学报1988；30(5)：565-568)。传统的方法耗时长，所用有机溶媒多。本法使用水、乙醇或稀醇提取，提取液经适当处理直接通过大孔吸附树脂，分别用水和稀乙醇洗脱，稀乙醇部分减压浓缩，然后再用Sephadex LH-20纯化，直接析出罗布麻甲素。经光谱测定结构，数据与罗布麻甲素文献值一致；经纯度角测定，证明本法获得的罗布麻甲素纯度可达99％。
发明内容：本发明是从大花罗布麻叶中分离制备得到的罗布麻甲素。
1.以大花罗布麻叶为原料，加水煎煮提取，提取液经乙醇沉淀杂质，醇沉液回收乙醇后，通过大孔吸附树脂，分别以水和含水乙醇洗脱，TLC检查罗布麻甲素，取含罗布麻甲素的组分再通过葡聚糖凝胶LH-20，以水和含水甲醇洗脱，在含水甲醇洗脱液中得到黄色沉淀，经甲醇重结晶后即得罗布麻甲素。
2.将制得的罗布麻甲素经过UV、IR、1H-NMR和13C-NMR光谱鉴定，确证其结构为槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；将制得的罗布麻甲素经美国Waters公司生产的高效液相色谱系统(二极管阵列检测器)进行纯度角测定，通过检测和计算罗布麻甲素的纯度角小于纯度阈值，色谱峰内无共流出物，纯度达到对照品要求。
附图说明：本发明共涉及4个图示，现作如下说明
图1为包含有杂质的色谱峰
图2为罗布麻甲素对照品和供试品的高效液相色谱图
图3为罗布麻甲素的色谱峰纯度匹配图
图4为罗布麻甲素高效液相三维色谱图，其中x轴：保留时间，y轴：吸收度，z轴：波长
具体实施方式：
1、提取分离
大花罗布麻干燥叶1.5kg加水煎煮提取2次，第1次加10倍量水煎煮1.5h，第2次加8倍量水煎煮1h，合并煎煮液，2层纱布过滤，减压浓缩成稠膏，加95％乙醇至上清液含醇量为20％，过夜。过滤，除去沉淀，滤液回收乙醇后浓缩至800mL备用。
(1)大孔吸附树脂筛选(TLC法)
选择常用的几种大孔吸附树脂---AB-8(天津南开大学化工厂)、HPD-100和HPD-450(河北沧州化工厂)、HP2MGL(日本三菱化工)、SP825(日本)，各取30mL(在95％乙醇中体积)湿法装于2cm×30cm小柱中，乙醇洗净杂质后，再用水洗至无醇味，备用。实验结果见表1。
根据表中结果显示，HPD-100型与HP2MGL二种型号树脂对罗布麻甲素在水中有较好的吸附性能，而在30-50％乙醇中有较好的解吸附行为，考虑价格我们选择国产树脂HPD-100作为实验用树脂。
                              表1罗布麻甲素在不同大孔树脂中解吸附情况
洗脱液乙醇浓度                            大孔吸附树脂型号
    HPD-100     HPD-450     HP2MGL   AB-8   SP825
    水30％50％70％95％     无有有无无     有有无无无     无有有无无   有有有有有   有无无无无
(2)罗布麻甲素分离制备
HPD-100型大孔树脂1kg湿法装柱(10cm×80cm)，先用乙醇洗净杂质后，再用水洗至无醇味，将大花罗布麻提取液上柱，分别以水、30％乙醇洗脱，取30％洗脱物浓缩后再通过Sephadex LH-20柱，分别以水、30％、50％甲醇洗脱，200-250mL接一个流份，在30％和50％甲醇洗脱液中得到黄色沉淀，经甲醇重结晶后，得黄色结晶960mg。
2、结构确认及纯度角测定
(1)结构鉴定
主要利用光谱，包括紫外、红外、质谱、核磁共振谱(1H-NMR、13C-NMR)分析，鉴定其结构。
分子式为C21H20O12，黄色颗粒结晶，与ZrO-Cl2试剂作用呈黄色，加入柠檬酸甲醇溶液则颜色褪去，再加入2％盐酸加热后颜色复出，表明该化合物为3-羟基苷化的黄酮醇，UV(CH3OH)：λmax358nm，IR(KBr)vmaxcm-1：3396(OH)，2826(CH)，1655(α，β-不饱和酮C＝O)，1604，1505，1458(Ar)，1432，1356，1292，1205，1062(vC-O)，807(δCH(C＝C))。EI-MSm/z：465(M++H)，303(M++H-162)；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)、13C-NMR(400MHz，DMSO-d6)见表2。
罗布麻甲素结构式(槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)
表2  罗布麻甲素的化学位移值(δ，溶剂为DMSO-d6)
 序号   1H-NMR   序号     13C-NMR     序号     13C-NMR
 682′5′6′5-OH7-OH3′-OH4′-OHGlc-1(β)   6.20(d，J＝2.0Hz)6.41(d，J＝2.0Hz)7.59(d，J＝2.0Hz)6.85(d，J＝9.2)7.57(dd，J＝1.7，6.8Hz)12.5610.879.749.235.46(d，J＝7.8Hz)   23456789101′2′     156.3133.3177.4161.298.6164.193.5156.2104.0121.6115.2     3′4′5′6′Glc-1″2″3″4″5″6″     144.8148.4116.2121.2100.874.176.569.977.660.9
(2)纯度角测定
关于对照品的纯度检测，常规多采用简单的归一化法计算，但当色谱峰中包含共析物的杂质峰时，虽然主峰没有出现肩峰、驼峰或严重拖尾现象，其纯度也不一定能得到保证(图1)。纯度角检测是目前国际公认的化合物纯度鉴定的一种先进方法，相关文献报道很少[1-2]。对于糖苷类化合物申报对照品的要求当中，应当需要检定化合物的纯度角。因此，本文为确定罗布麻甲素的纯度，增加了纯度角的测定，结果显示其纯度符合要求，纯度达99％以上，本发明为罗布麻甲素申报对照品提供技术参数。
[1]孙可达.高效液相色谱鉴定卡松防腐剂[J].化学世界，1998，(2)：101-103
[2]朱玲英等.明智颗粒剂中丹参酮含量测定及纯度评估[J].时珍国医国药，2000，11(5)：395-396
1)色谱条件
色谱柱为Symmetry C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液(40∶60)；流速0.8mL/min；柱温35℃；检测波长358nm。在本色谱条件下，罗布麻甲素峰峰形对称，没有干扰，理论塔板数不低于6000，罗布麻甲素保留时间约为6min，色谱图见图2。
2)纯度角测定
应用Waters公司2996(PDA)检测器，Empower工作站中提供有关峰纯度处理功能，对罗布麻甲素色谱峰进行纯度检测，罗布麻甲素色谱峰开始时间5.750，结束时间6.583，峰顶时间为6.112。计算纯度角为0.118，纯度阈值为0.335，纯度角小于纯度阈值，结果见图3，由图3可以说明在色谱峰内不包含共流出物，表明该峰具有光谱一致性。
罗布麻甲素的纯度也可在HPLC 3D色谱图上得到反映，结果见图4。图4中显示，除溶剂峰外，在罗布麻甲素出峰的时间范围内，流出物的紫外吸收显示出较好的一致性，说明罗布麻甲素的纯度较高，其含量经计算在99％以上。

Claims (3)

1.一种从罗布麻或大花罗布麻叶中获得的化学纯品---罗布麻甲素，该物质经纯度角测定，纯度达99％以上。
2.如权利要求1所述化合物的制备工艺，包含下列步骤：
1)罗布麻或大花罗布麻叶，以水或乙醇，或以醇-水任何比例混合的溶剂，加热或温浸提取；
2)提取液减压或常压浓缩至一定密度的稠膏，加20％-70％乙醇沉淀杂质后，回收乙醇；
3)回收稠液加水稀释，加到装有非极性大孔吸附树脂的柱中，先后以水和一定浓度的乙醇(或甲醇)洗脱，收集含醇洗脱部分，回收醇液；
4)将步骤3)得到的浓缩物加水稀释，加到装有凝胶色谱柱(优化型号为Sephadex LH-20)中，先后分别以水和一定浓度的乙醇(或甲醇)洗脱，收集含醇洗脱部分，此时立即析出结晶；
5)由步骤4)得到的结晶再经甲醇重结晶后即得罗布麻甲素；
6)经紫外、红外、质谱和核磁共振分析后，确证其结构为槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，即罗布麻甲素；
7)经纯度角分析后，该化合物纯度为99％以上，符合对照品要求。
3.按权利要求1和2所制备得到的罗布麻甲素作为任何罗布麻药材的对照品或标识化合物的应用，或作为活性成分在制备抑制血小板聚集药物、降压辅助制剂中的应用。
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