BR112018000298B1

BR112018000298B1 - Método para reduzir o teor de ácido caurenóico de uma composição de glicosídeo de esteviol

Info

Publication number: BR112018000298B1
Application number: BR112018000298-4A
Authority: BR
Inventors: Robert Geertman; Igor Galaev
Original assignee: Dsm Ip Assets B.V.
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2016-07-11
Publication date: 2022-06-07
Also published as: CN107849081A; US20180371003A1; WO2017009293A1; EP3319974A1; US20210371445A1; BR112018000298A2; CA2991662A1; CN107849081B; US11124535B2; MY192148A

Abstract

COMPOSIÇÃO DE GLICOSÍDEO DE ESTEVIOL. A presente invenção se refere a uma composição que compreende um ou mais glicosídeos de esteviol cuja composição compreende ácido caurenóico em uma quantidade de não mais que 150 ppm. A invenção também se refere a um método para preparar uma composição de glicosídeo de esteviol, em que o método compreende: fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol; combinar a composição de glicosídeo de esteviol com um solvente para formar uma solução de glicosídeo de esteviol; e cristalizar uma composição de glicosídeo de esteviol a partir da solução de glicosídeo de esteviol, em que a cristalização é executada no pH 7,0 ou abaixo. A invenção também se refere a um método para reduzir o teor de ácido caurenóico de uma composição de glicosídeo de esteviol, cujo método compreende: fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol que compreende ácido caurenóico; combinar a composição de glicosídeo de esteviol com um solvente para formar uma solução de glicosídeo de esteviol; e cristalizar uma composição de glicosídeo de esteviol a partir da solução de glicosídeo de esteviol, em que a cristalização é executada no pH 7,0, para reduzir, através disso, a quantidade de ácido caurenóico na composição de glicosídeo de esteviol.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere a uma composição que compreende um ou mais glicosídeos de esteviol. A invenção também se refere a um método para preparar uma composição de glicosídeo de esteviol.

Antecedentes da Invenção

[0002] As folhas da erva perene, Stevia rebaudiana Bert., acumulam quantidades de compostos intensamente adocicados conhecidos como glicosídeos de esteviol. Enquanto que a função biológica desses compostos não está clara, esses possuem significância comercial como adoçantes de alta potência alternativos.

[0003] Esses glicosídeos de esteviol adocicados possuem propriedades sensoriais e funcionais que aparentam ser superiores àquelas de muitos adoçantes de alta potência. Além disso, estudos sugerem que o esteviosídeo pode reduzir níveis de glicose sanguínea em diabéticos do Tipo II e pode reduzir a pressão sanguínea em pacientes com hipertensão moderada.

[0004] Os glicosídeos de esteviol que se acumulam em folhas de estévia onde podem compreender de 10 a 20 % do peso seco da folha. O esteviosídeo e o rebaudiosídeo A são tanto termoestáveis quanto estáveis em pH e adequados para uso em bebidas gasosas e muitos outros alimentos. O esteviosídeo é entre 110 e 270 vezes mais doce que a sacarose, o rebaudiosídeo A entre 150 e 320 vezes mais doce que a sacarose. Além disso, o rebaudiosídeo D é também um adoçante de glicosídeo de diterpeno de alta potência que se acumula em folhas de estévia. Esse pode ser cerca de 200 vezes mais doce que a sacarose. O rebaudiosídeo M é um adoçante de glicosídeo de diterpeno de alta potência adicional. Esse está presente em quantidades-traço em certas variedades da folha de estévia, mas acredita-se que tenha um perfil de sabor superior.

[0005] Os glicosídeos de esteviol têm sido tradicionalmente extraídos da plantaStevia. Na Stevia, o (- )-ácido caurenóico, um intermediário em biossíntese de ácido giberélico (GA), é convertido no dipterepeno esteviol tetracíclico, que, então, prossegue através de uma via de glicosilação de múltiplas etapas para formar os vários glicosídeos de esteviol. Entretanto, as produtividades podem ser variáveis e afetadas por agricultura e condições ambientais. Ademais, a cultivação de estévia requer área útil substancial, um longo tempo antes da colheita, mão-de- obra intensa e custos adicionais para a extração e a purificação dos glicosídeos.

[0006] Portanto, mais recentemente, tem-se desenvolvido o interesse na produção de glicosídeos de esteviol com o uso de processos fermentativos. Os documentos WO2013/110673 e WO2015/007748 descrevem microrganismos que podem ser usados para produzir pelo menos os glicosídeos de esteviol rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D e rebaudiosídeo M.

[0007] Exigem-se métodos para isolar glicosídeos de esteviol de tais processos fermentativos, por exemplo para considerar o acúmulo de compostos em caldos de fermentação que podem não estar presentes em composições derivadas de plantas de glicosídeos de esteviol.

Sumário da invenção

[0008] A presente invenção tem como base a identificação de um processo para a recuperação de glicosídeos de esteviol, por exemplo, a partir de caldos de fermentação, em que a composição de glicosídeo de esteviol resultante compreende baixo ou nenhum teor de ácido caurenóico.

[0009] Desse modo, a invenção refere-se a uma composição que compreende um ou mais glicosídeos de esteviol cuja composição compreende ácido caurenóico. No entanto, o ácido caurenóico está presente em uma quantidade de não mais que cerca de 150 ppm, por exemplo, não mais que cerca de 100 ppm, de preferência, em uma quantidade de não mais que cerca de 10 ppm. Ou seja, a invenção refere-se a uma composição que compreende um ou mais glicosídeos de esteviol e ácido caurenóico, em que a quantidade de ácido caurenóico é não mais que cerca de 150 ppm, por exemplo, não mais que cerca de 100 ppm, de preferência, em uma quantidade de não mais que cerca de 10 ppm

[0010] Tipi camente, a composição compreenderá uma alta quantidade, como pelo menos cerca de 95 % em peso seco, de um glicosídeo de esteviol, como rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo M.

[0011] A invenção também se refere a: - um método para preparar, por exemplo purificar, uma composição de glicosídeo de esteviol, cujo método compreende cristalizar glicosídeos de esteviol a partir de uma solução que compreende glicosídeos de esteviol, em que a cristalização é executada com pH em torno de 7,0 ou abaixo; - um método para reduzir o teor de ácido caurenóico de uma composição de glicosídeo de esteviol, cujo método compreende cristalizar os glicosídeos de esteviol a partir de uma solução que compreende glicosídeos de esteviol e ácido caurenóico, em que a cristalização é executada no pH 7,0 ou abaixo; - um método para preparar, por exemplo, purificar, uma composição de glicosídeo de esteviol, cujo método compreende: fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol; combinar a composição de glicosídeo de esteviol com um solvente para formar uma solução de glicosídeo de esteviol; e cristalizar uma composição de glicosídeo de esteviol a partir da solução de glicosídeo de esteviol, em que a cristalização é executada no pH 7,0 ou abaixo. e - um método para reduzir o teor de ácido caurenóico de uma composição de glicosídeo de esteviol, cujo método compreende: fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol que compreende ácido caurenóico; combinar a composição de glicosídeo de esteviol com um solvente para formar uma solução de glicosídeo de esteviol; e cristalizar uma composição de glicosídeo de esteviol a partir da solução de glicosídeo de esteviol, em que a cristalização é executada no pH 7,0, para reduzir, através disso, a quantidade de ácido caurenóico na composição de glicosídeo de esteviol.

[0012] Além disso, a invenção refere-se a uma composição de glicosídeo de esteviol obtenível por um método da invenção.

Descrição detalhada da invenção

[0013] Ao longo do presente relatório descritivo e das reivindicações anexas, as palavras "compreender”, "incluir" e "ter" e variações como "compreende", "compreendendo", "inclui" e "incluindo" devem ser interpretadas inclusivamente. Ou seja, essas palavras são destinadas a expressar a possível inclusão de outros elementos ou números inteiros não especificamente citados, onde for permitido pelo contexto.

[0014] Os artigos "um" e "uma" são usados no presente documento para se referirem a um ou a mais que um (isto é, a um ou pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" pode significar um elemento ou mais de um elemento.

[0015] No presente documento, uma composição de glicosídeo de esteviol significa uma composição que compreende um ou mais glicosídeos de esteviol e uma solução de glicosídeo de esteviol é uma solução que compreende um ou mais glicosídeos de esteviol.

[0016] A invenção refere-se a um método para purificar glicosídeos de esteviol, por exemplo a partir de um caldo de fermentação que compreende um ou mais glicosídeos de esteviol produzidos por um microrganismo. Tal microrganismo pode tipicamente ser um microrganismo recombinante que foi modificado de modo que tenha capacidade para produzir um ou mais glicosídeos de esteviol. A invenção também refere-se a composições produzidas por tal processo.

[0017] Uma composição da invenção compreende um ou mais glicosídeos de esteviol. Além disso, uma composição da invenção compreende ácido caurenóico. No entanto, a composição compreende ácido caurenóico em uma quantidade de não mais que cerca de 150 ppm, como não mais que cerca de 100 ppm. Ou seja, uma composição da invenção compreende uma quantidade diferente de zero de ácido caurenóico até uma quantidade máxima de cerca de 150 ppm, como não mais que cerca de 100 ppm.

[0018] Uma composição da invenção pode compreender até cerca de 90 ppm, até cerca de 80 ppm, até cerca de 70 ppm, até cerca de 60 ppm, até cerca de 50 ppm, até cerca de 40 ppm, até cerca de 30 ppm, até cerca de 20 ppm, até cerca de 10 ppm, até cerca de 5 ppm ou menos de ácido caurenóico.

[0019] Uma quantidade mínima de ácido caurenóico em uma composição da invenção pode ser pelo menos 0,1 ppm, pelo menos 0,5 ppm ou pelo menos 1 ppm.

[0020] Dessa forma, uma composição da invenção pode compreender de 0,1 ppm a 150 ppm de ácido caurenóico, 0,1 ppm a 100 ppm de ácido caurenóico, de 0,1 ppm a 50 ppm de ácido caurenóico, de 0,1 ppm a 10 ppm de ácido caurenóico, de 0,5 ppm a 150 ppm de ácido caurenóico, de 0,5 ppm a 100 ppm de ácido caurenóico, de 0,5 ppm a 50 ppm de ácido caurenóico, de 0,5 ppm a 10 ppm de ácido caurenóico, de 1 ppm a 150 ppm de ácido caurenóico, de 1 ppm a 100 ppm de ácido caurenóico, de 1 ppm a 50 ppm de ácido caurenóico ou de 1 ppm a 10 ppm de ácido caurenóico.

[0021] O ácido caurenóico pode estar presente em uma composição da invenção na forma de compostos de ácido caurenóico glicosilados. A quantidade de ácido caurenóico pode ser expressada em termos da quantidade total de ácido caurenóico como é e que está presente em quaisquer compostos de ácido caurenóico glicosilados.

[0022] As quantidades expressadas em ppm podem ser alternativamente expressadas como mg/kg, em que 1 ppm é equivalente a 1 mg/kg.

[0023] Uma composição da invenção pode compreender um ou mais dentre rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo M, esteviosídeo, dulcosíde A, rubusosídeo ou esteviolbiosídeo.

[0024] Uma composição da invenção pode compreender pelo menos 80 % em uma base de peso seco de um glicosídeo de esteviol, por exemplo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo M. Uma composição da invenção pode compreender pelo menos 85 % em uma base de peso seco de um glicosídeo de esteviol, por exemplo rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo M. Uma composição da invenção pode compreender pelo menos 90 % em uma base de peso seco de um glicosídeo de esteviol, por exemplo rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo M. Uma composição da invenção pode compreender pelo menos 95 % em uma base de peso seco de um glicosídeo de esteviol, por exemplo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo M. Uma composição da invenção pode compreender pelo menos 97 % em uma base de peso seco de um glicosídeo de esteviol, por exemplo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo M. Uma composição da invenção pode compreender pelo menos 98 % em uma base de peso seco de um glicosídeo de esteviol, por exemplo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo M. Uma composição da invenção pode compreender pelo menos 99 % em uma base de peso seco de um glicosídeo de esteviol, por exemplo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo M.

[0025] Um glicosídeo de esteviol presente em uma composição da invenção em uma quantidade de pelo menos 80 % em uma base de peso seco pode ser qualquer um dentre rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo M, esteviosídeo, dulcosíde A, rubusosídeo ou esteviolbiosídeo. De preferência, o glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo M.

[0026] Dessa forma, uma composição da invenção pode compreender rebaudiosídeo A em uma quantidade de pelo menos 80 % em uma base de peso seco, pelo menos 85 % em uma base de peso seco, pelo menos 90 % em uma base de peso seco, pelo menos 95 % em uma base de peso seco, pelo menos 97 % em uma base de peso seco, pelo menos 98 % em uma base de peso seco ou pelo menos 99 % em uma base de peso seco de pelo menos de um glicosídeo de esteviol e, além de uma quantidade diferente de zero de ácido caurenóico até uma quantidade máxima de cerca de 150 ppm, como até cerca de 100 ppm, por exemplo, até cerca de 10 ppm.

[0027] Dessa forma, uma composição da invenção pode compreender rebaudiosídeo D em uma quantidade de pelo menos 80 % em uma base de peso seco, pelo menos 85 % em uma base de peso seco, pelo menos 90 % em uma base de peso seco, pelo menos 95 % em uma base de peso seco, pelo menos 97 % em uma base de peso seco, pelo menos 98 % em uma base de peso seco ou pelo menos 99 % em uma base de peso seco de pelo menos de um glicosídeo de esteviol e, além de uma quantidade diferente de zero de ácido caurenóico até uma quantidade máxima de cerca de 150 ppm, como até cerca de 100 ppm, por exemplo até cerca de 10 ppm.

[0028] Dessa forma, uma composição da invenção pode compreender rebaudiosídeo M em uma quantidade de pelo menos 80 % em uma base de peso seco, pelo menos 85 % em uma base de peso seco, pelo menos 90 % em uma base de peso seco, pelo menos 95 % em uma base de peso seco, pelo menos 97 % em uma base de peso seco, pelo menos 98 % em uma base de peso seco ou pelo menos 99 % em uma base de peso seco de pelo menos de um glicosídeo de esteviol e, além de uma quantidade diferente de zero de ácido caurenóico até uma quantidade máxima de cerca de 150 ppm, como até cerca de 100 ppm, por exemplo até cerca de 10 ppm.

[0029] O método para preparar, por exemplo purificar, uma composição de glicosídeo de esteviol como fornecido pela invenção compreende cristalizar glicosídeos de esteviol a partir de uma solução que compreende glicosídeos de esteviol. O método é tipicamente um previsto na purificação de uma composição de glicosídeo de esteviol existente, em particular, para reduzir pelo menos o teor de ácido caurenóico.

[0030] O método é um que compreende uma etapa de cristalização executada em um pH 7,0 ou menor. Essa etapa permite uma redução significativa da quantidade de ácido caurenóico. A cristalização no maior pH não permite tal redução na quantidade de ácido caurenóico.

[0031] Des sa forma, um método da invenção pode compreender: fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol (uma primeira composição de glicosídeo de esteviol); combinar a composição de glicosídeo de esteviol com um solvente para formar uma solução de glicosídeo de esteviol; e cristalizar uma composição de glicosídeo de esteviol (uma segunda composição de glicosídeo de esteviol) a partir da solução de glicosídeo de esteviol, em que a cristalização é executada no pH 7,0 ou menor.

[0032] A composição de glicosídeo de esteviol produzida nesse método (a segunda composição de glicosídeo de esteviol) compreende uma menor quantidade de ácido caurenóico que a (primeira) composição de glicosídeo de esteviol de partida.

[0033] Consequentemente, a invenção fornece um método para reduzir a quantidade de ácido caurenóico em uma composição de glicosídeo de esteviol pela cristalização de glicosídeos de esteviol a partir de uma solução que compreende glicosídeos de esteviol em um pH 7,0 ou menor.

[0034] Tal método pode compreender: fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol (uma primeira composição de glicosídeo de esteviol) que compreende ácido caurenóico; combinar a composição de glicosídeo de esteviol com um solvente para formar uma solução de glicosídeo de esteviol; e cristalizar uma composição de glicosídeo de esteviol (uma segunda composição de glicosídeo de esteviol) a partir da solução de glicosídeo de esteviol, em que a cristalização é executada no pH 7,0, para reduzir, através disso, a quantidade de ácido caurenóico na composição de glicosídeo de esteviol (a primeira composição de glicosídeo de esteviol).

[0035] A composição de glicosídeo de esteviol produzida nesse método (a segunda composição de glicosídeo de esteviol) compreende uma menor quantidade de ácido caurenóico que a (primeira) composição de glicosídeo de esteviol de partida.

[0036] A etapa de cristalização em tais métodos pode ser executada em um pH de 6,0 ou abaixo, em um pH de 5,0 ou abaixo, em um pH de 4,0 ou abaixo ou em um pH de cerca de 3,8.

[0037] Um método da invenção pode compreender a cristalização de composição de glicosídeo de esteviol de baixa pureza. Uma composição de glicosídeo de esteviol de baixa pureza pode compreender até cerca de 60 %, até cerca de 70 %, ou até cerca de 80 % de um determinado glicosídeo de esteviol, por exemplo rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo M, em peso em uma base seca. O restante de tal composição de glicosídeo de esteviol compreende, em geral, outros glicosídeos de esteviol e impurezas que incluem ácido caurenóico. Em geral, uma composição de glicosídeo de esteviol de baixa pureza pode conter de cerca de 80 % ou de cerca de 90 % de glicosídeos de esteviol em peso.

[0038] Tipi camente, em um método da invenção, uma composição de glicosídeo de esteviol, como uma composição de glicosídeo de esteviol de baixa pureza é combinada com um solvente orgânico para formar uma solução de glicosídeo de esteviol de baixa pureza. O solvente orgânico opcionalmente pode compreendem adicionalmente água em uma quantidade até cerca de 25 % em peso. Por exemplo, em modalidades particulares, o solvente orgânico pode compreender adicionalmente água em uma quantidade de cerca de 3 % a cerca de 20 % em peso. Os exemplos não limitativos de solventes orgânicos incluem álcool, acetona, acetonitrilo e acetato de etila. Álcool, como usado no presente documento, se refere a qualquer grupo de cadeia linear, ramificada ou cíclica; alquila substituída ou não substituída, alquenila, ou alquinila ligado a pelo menos uma porção química de hidroxila. Os exemplos não limitativos de álcoois incluem etanol, metanol, isopropanol, 1-propanol, 1-butanol, 2-butanol, terc-butanol e isobutanol.

[0039] Em particular, o solvente orgânico pode compreender uma mistura de água e pelo menos um solvente orgânico. Em uma outra modalidade exemplificativa, o pelo menos um solvente orgânico compreende um álcool, sendo que o álcool compreende etanol, metanol ou misturas dos mesmos.

[0040] A solução de glicosídeo de esteviol pode compreender o solvente e composição de glicosídeo de esteviol em uma razão de peso que varia de cerca de 15 a cerca de 4 partes de solvente a cerca de 1 parte de glicosídeo de esteviol.

[0041] A cristalização de acordo com a invenção pode ser executada a qualquer temperatura adequada. A cristalização pode compreender adicionalmente resfriar a solução de glicosídeo de esteviol. Em geral, a solução de glicosídeo de esteviol pode ser resfriada a uma temperatura adequada para a precipitação dos glicosídeos de esteviol a partir da solução de glicosídeo de esteviol.

[0042] Pode-se permitir que a cristalização da solução de glicosídeo de esteviol ocorra em um período de tempo suficiente para obter um rendimento desejável da composição de glicosídeo de esteviol a partir da solução de glicosídeo de esteviol. Por exemplo, a cristalização da solução de glicosídeo de esteviol pode proceder de cerca de 0,5 horas a cerca de 120 horas (5 dias), cerca de 12 horas a cerca de 96 horas (4 dias), cerca de 24 horas (1 dia) a cerca de 72 horas (3 dias) ou por qualquer período de tempo entre os mesmos.

[0043] Após a cristalização da solução de glicosídeo de esteviol de baixa pureza, uma composição de glicosídeo de esteviol de maior pureza, por exemplo, uma composição de glicosídeo de esteviol substancialmente pura, pode ser obtida compreendendo, por exemplo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo M. A "composição de glicosídeo de esteviol substancialmente pura" é usada no presente documento para se referir a composições que compreendem cerca de 95 % ou mais em peso (em uma base seca) de glicosídeos de esteviol.

[0044] O rendimento total da composição de glicosídeo de esteviol pode ser, por exemplo, cerca de 25 % ou mais. O rendimento é usado no presente documento para se referir, em geral, à massa obtida em relação à massa de partida.

[0045] O método da invenção pode compreender adicionalmente a semeadura da solução de glicosídeo de esteviol de baixa pureza mediante o começo da cristalização da solução de glicosídeo de esteviol. A semeadura pode ser, em geral, realizada à mesma temperatura na qual permite-se que a cristalização proceda.

[0046] A semeadura para a solução de glicosídeo de esteviol de baixa pureza pode ser, em geral, realizada, por exemplo, pela adição de cristais substancialmente puros de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo M à solução de glicosídeo de esteviol em uma quantidade suficiente para promover a precipitação do rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo M e outros glicosídeos de esteviol. Uma quantidade suficiente para promover a precipitação pode, em geral, compreender uma composição de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo M substancialmente pura em uma quantidade de cerca de 0,0001 % a cerca de 1 % em peso da solução de glicosídeo de esteviol de baixa pureza, de cerca de 0,01 % a cerca de 1 % em peso, ou qualquer quantidade entre as mesmas.

[0047] O método da invenção pode compreender adicionalmente separar e lavar a composição de glicosídeo de esteviol após sua cristalização. A composição de glicosídeo de esteviol pode ser separada de seu sobrenadante por uma variedade de técnicas de separação de sólido-líquido que utiliza força centrífuga, que inclui, sem limitação, centrífuga de cesto perfurado vertical e horizontal, centrífuga de cuba sólida, centrífuga de decantador, centrífuga do tipo peeler, centrífuga do tipo pusher, centrífuga do tipo Heinkel, centrífuga de cilindro de discos e separação em ciclone. Adicionalmente, a separação pode ser aperfeiçoada por quaisquer métodos de filtração por gravidade, vácuo ou pressão, que incluem, sem limitação, o uso de correia, tambor, tipo Nutsche, folha, placa, tipo Rosenmund, tipo ignificador e filtros de bolsa e filtro-prensa. A operação do dispositivo de separação de sólido e líquido pode ser contínua, semicontínua ou em modo em lote. A composição de glicosídeo de esteviol também pode ser lavada no dispositivo de separação com uso de vários solventes orgânicos e misturas dos mesmos e pode ser parcial ou totalmente seca no dispositivo de separação com uso de qualquer número de gases, incluindo, sem limitação, nitrogênio ou argônio, para evaporar solvente líquido residual. A composição de glicosídeo de esteviol pode ser automática ou manualmente removida do dispositivo de separação com uso de líquidos, gases ou meios mecânicos pela dissolução de sólido ou manutenção da forma sólida.

[0048] O método da invenção pode compreender adicionalmente secar a composição de glicosídeo de esteviol. Os métodos adequados para secar tais composições são conhecidos àquele versado na técnica e incluem, porém sem limitação, o uso de um secador giratório a vácuo, secador de leito de fluido, secador de túnel giratório, secador de placa, secador de bandeja, secador do tipo Nauta, secador por aspersão, secador rápido, secador de mícron, secador em recipiente, secador de pás de alta e baixa velocidade e secador de micro-onda. Em uma modalidade exemplificativa, a composição de glicosídeo de esteviol é seca com uso de uma purga de nitrogênio ou argônio para remover o solvente residual a uma temperatura em uma faixa de cerca de 40 °C a cerca de 60 °C por um período de tempo de cerca de 5 horas a cerca de 5 dias, de cerca de 1 dia a cerca de 4 dias, de cerca de 2 dias a cerca de 3 dias, ou por qualquer período de tempo entre os mesmos.

[0049] Um método da invenção permite que uma composição de glicosídeo de esteviol seja alcançada (a segunda composição de glicosídeo de esteviol identificada acima) que compreende ácido caurenóico em uma quantidade de não mais que cerca de 150 ppm, não mais que cerca de 100 ppm, não mais que 90 ppm, não mais que cerca de 80 ppm, não mais que cerca de 70 ppm, não mais que cerca de 60 ppm, não mais que cerca de 50 ppm, não mais que cerca de 40 ppm, não mais que cerca de 30 ppm, não mais que cerca de 20 ppm, não mais que cerca de 10 ppm ou menos.

[0050] A composição pode compreender uma quantidade diferente de zero de ácido caurenóico, como pelo menos 0,1 ppm, pelo menos 0,5 ppm ou pelo menos 1 ppm de ácido caurenóico.

[0051] No método da invenção, um ou mais dos glicosídeos de esteviol (em uma primeira composição de glicosídeo de esteviol ou uma composição de glicosídeo de esteviol de partida) podem ser produzidos de modo fermentativo. Ou seja, a composição de glicosídeo de esteviol a ser purificada pode ser uma derivada de um caldo de fermentação. Um caldo de fermentação pode ser submetido a um ou mais dentre uma separação de sólido/líquido, uma etapa de rompimento celular, uma etapa de cromatografia, uma etapa de concentração e uma etapa de secagem antes da cristalização de acordo com o método da presente invenção.

[0052] A composição de glicosídeo de esteviol que resulta de um método da invenção pode compreender um ou mais de qualquer um dentre rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo M, esteviosídeo, dulcosíde A, rubusosídeo ou esteviolbiosídeo.

[0053] A composição de glicosídeo de esteviol que resulta de um método da invenção pode compreender pelo menos 80 % em uma base de peso seco de pelo menos de um glicosídeo de esteviol, por exemplo, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % em uma base de peso seco de pelo menos de um glicosídeo de esteviol, como rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D ou rebaudiosídeo M.

[0054] Os glicosídeos de esteviol usados na invenção podem ser produzidos de modo fermentativo, por exemplo derivados de um hospedeiro recombinante com capacidade para produzir um glicosídeo de esteviol. Por exemplo, um hospedeiro recombinante adequado pode ser capaz de produzir um ou mais dentre, por exemplo, esteviol-13-monosídeo, esteviol-19-monosídeo, éster de 2-O-β-D-glicopiranosil-β-D- glicopiranosil de ácido 13-[(β-D-Glicopiranosil)oxi)caur- 16-en-18-óico, rubusosídeo, esteviosídeo, dulcosídeo A, esteviol-19-disídeo, esteviolbiosídeo, rebA, rebB, rebC, rebE, rebD, rebF ou rebM.

[0055] Um hospedeiro recombinante adequado pode compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos recombinantes que codificam um ou mais polipeptídeos tendo atividade de UDP-glicosiltransferase (UGT).

[0056] Para os propósitos desta invenção, um polipeptídeo que tem atividade de UGT é um que tem atividade de glicosiltransferase (EC 2.4), isto é, que pode atuar como um catalisador para a transferência de uma unidade de monossacarídeo a partir de um açúcar de nucleotídeo ativado (também conhecido como "doador de glicosila") para uma molécula aceitante de glicosila, usualmente um álcool. dado de glicosila para um UGT é tipicamente o açúcar de nucleotídeo difosfato glicose de uridina (uracil-difosfato glicose, UDP-glicose).

[0057] Tais UGTs adicionais podem ser selecionadas de modo a produzir um glicosídeo de esteviol desejado. Os diagramas esquemáticos de formação de glicosídeo de esteviol não são apresentados em Humphrey et al., Plant Molecular Biology (2006) 61: 47-62 e Mohamed et al., J. Plant Physiology 168 (2011) 1136-1141. Além disso, a Figura 1 apresenta um diagrama esquemático de formação de glicosídeo de esteviol.

[0058] Um hospedeiro recombinante pode, dessa forma, compreender uma ou mais sequências de ácido nucleico recombinantes que codificam um ou mais dentre: (i) um polipeptídeo tendo atividade de UGT74G1; (ii) um polipeptídeo tendo atividade de UGT2; (iii) um polipeptídeo tendo atividade de UGT85C2; e (iv) ) um polipeptídeo tendo atividade de UGT76G1;

[0059] Um hospedeiro recombinante pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a adição de uma C-13-glicose em esteviol. Isso significa que uma levedura recombinante adequada para uso em um método de invenção pode compreender uma UGT que é capaz de catalisar uma reação na qual o esteviol é convertido em esteviolmonosídeo.

[0060] Tal hospedeiro recombinante pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade mostrada por UDP-glicosiltransferase (UGT) UGT85C2, através do que a sequência de nucleotídeo mediante transformação da levedura confere àquela levedura a capacidade de converter esteviol em esteviolmonosídeo.

[0061] A atividade de UGT85C2 é a transferência de uma unidade de glicose em 13-OH de esteviol.

[0062] Dessa forma, um UGT85C2 adequado pode funcionar como uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol 13-OH transferase e uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol-19- 0-glicosídeo 13-OH transferase. Um polipeptídeo UGT85C2 funcional também pode catalisar as reações de transferase que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol além de esteviol e esteviol-19-O-glicosídeo. Tais sequências podem ser chamadas de sequências de UGT1 no presente documento.

[0063] Um hospedeiro recombinante pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem atividade de UGT2.

[0064] Um polipeptídeo que tem atividade de UGT2 é o que funciona como uma uridina 5'-difosfo glicosil: A esteviol13-O-glicosídeo transferase (também chamada de esteviol-13-monoglicosídeo 1,2-glicosilase) transfere uma porção química de glicose para C-2' da 13-O-glicose da molécula aceitante, esteviol13-O-glicosídeo. Tipicamente, um polipeptídeo de UGT2 adequado também funciona como uma uridina 5'-difosfo glicosil: A rubusosídeo transferase transfere uma porção química de glicose para C-2' da 13-O- glicose da molécula aceitante, rubusosídeo.

[0065] Um polipeptídeo que tem atividade de UGT2 também pode catalisar as reações que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol além de esteviol13-0-glicosídeo e rubusosídeo, por exemplo, polipeptídeos de UGT2 funcionais podem utilizar esteviosídeo como um substrato, transferindo uma porção química de glicose para C-2' do resíduo de 19-O- glicose para produzir rebaudiosídeo E. Polipeptídeos de UGT2 funcionais também podem utilizar rebaudiosídeo A como um substrato, transferindo uma porção química de glicose para C-2' do resíduo de 19-O-glicose para produzir rebaudiosídeo D. No entanto, um polipeptídeo UGT2 funcional não transfere tipicamente uma porção química de glicose para compostos de esteviol que têm uma glicose ligada a 1,3 na posição C-13, isto é, a transferência de uma porção química de glicose para esteviol 1,3-biosídeo e 1,3- steviosídeo tipicamente não ocorre.

[0066] Um polipeptídeo que tem atividade de UGT2 também pode transferir porções químicas de açúcar de doadores além de uridina difosfato glicose. Por exemplo, um polipeptídeo que tem atividade de UGT2 pode atuar como uma uridina 5'- difosfo D-xilosil: A esteviol13-O-glicosídeo transferase transfere uma porção química de xilose para C-2' da 13-O- glicose da molécula aceitante, esteviol13-O-glicosídeo. Como um outro exemplo, um polipeptídeo que tem atividade de UGT2 pode atuar como uma uridina 5'-difosfo L-ramnosil: A esteviol13-0-glicosídeo transferase transfere uma porção química de ramnose para C-2' da 13-O-glicose da molécula aceitante, esteviol.

[0067] Um hospedeiro recombinante pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade de UGT pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a adição de uma C-19-glicose em esteviolbiosídeo. Ou seja, um hospedeiro recombinante pode compreender um UGT que é capaz de catalisar uma reação na qual esteviolbiosídeo é convertido em esteviosídeo. Por conseguinte, tal hospedeiro recombinante pode ser capaz de converter esteviolbiosídeo a esteviosídeo. A expressão de tal sequência de nucleotídeos pode conferir à levedura recombinante a capacidade de produzir, pelo menos, esteviosídeo.

[0068] Um hospedeiro recombinante pode, dessa forma, também compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade mostrada por UDP-glicosiltransferase (UGT) UGT74G1, através do que a sequência de nucleotídeo mediante a transformação da levedura confere à célula a capacidade de converter esteviolbiosídeo em esteviosídeo.

[0069] Os polipeptídeos UGT74G1 adequados podem ser capazes de transferir uma unidade de glicose em 13-OH ou 19-COOH, respectivamente, de esteviol. Um polipeptídeo UGT74G1 adequado pode funcionar como uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol 19-COOH transferase e uma uridina 5'- difosfo glicosil: esteviol-13-O-glicosídeo 19-COOH transferase. Os polipeptídeos UGT74G1 funcionais também podem catalisar as reações de glicosil transferase que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol além de esteviol e esteviol-13-O-glicosídeo, ou que transferem porções químicas de açúcar de doadores além de uridina difosfato glicose. Tais sequências podem ser chamadas no presente documento de sequências de UGT3.

[0070] Um hospedeiro recombinante pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar glicosilação do C-3’ da glicose na posição C13 de esteviosídeo. Ou seja, uma levedura recombinante adequada para uso em um método da invenção pode compreender um UGT que é capaz de catalisar uma reação em que o esteviosídeo é convertido em rebaudiosídeo A. Consequentemente, tal levedura recombinante pode ser capaz de converter esteviosídeo em rebaudiosídeo A. A expressão de tal sequência de nucleotídeo pode conferir ao hospedeiro a capacidade de produzir pelo menos rebaudiosídeo A.

[0071] Um hospedeiro recombinante pode, dessa forma, também compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade mostrada por UDP-glicosiltransferase (UGT) UGT76G1, através do que a sequência de nucleotídeo mediante a transformação de uma levedura confere àquela levedura a capacidade de converter esteviosídeo em rebaudiosídeo A.

[0072] Um UGT76G1 adequado adiciona uma porção química de glicose ao C-3' da C-13-O-glicose da molécula aceitante, um esteviol 1,2 glicosídeo. Dessa forma, UGT76G1 funciona, por exemplo, como uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol 13-0-1,2 glicosídeo C-3' glicosil transferase e uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol-19-0-glicose, 13-0-1,2 biosídeo C-3' glicosil transferase. Os polipeptídeos UGT76G1 funcionais também podem catalisar as reações de glicosil transferase que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol que contêm açúcares além da glicose, por exemplo, esteviol ramnosídeos e esteviol xilosídeos. Tais sequências podem ser chamadas no presente documento de sequências de UGT4. Um UGT4 pode alternativa ou adicionalmente ser capaz de converter RebD em RebM.

[0073] Um hospedeiro recombinante compreende tipicamente sequências de nucleotídeos que codificam pelo menos um polipeptídeo tendo atividade de UGT1, pelo menos um polipeptídeo tendo atividade de UGT2, pelo menos um polipeptídeo tendo atividade de UGT3 e pelo menos um polipeptídeo tendo atividade de UGT4. Uma ou mais destas sequências de ácidos nucleicos podem ser recombinantes. Um determinado ácido nucleico pode codificar um polipeptídeo que tem uma ou mais das atividades acima. Por exemplo, um ácido nucleico codifica um polipeptídeo que tem duas, três ou quatro das atividades apresentadas acima. De preferência, uma levedura recombinante para uso no método da invenção compreende atividade de UGT1, UGT2 e UGT3 e UGT4. Sequências UGT1, UGT2, UGT3 e UGT4 adequadas estão descritas na Tabela 1 do documento WO2015/007748.

[0074] Um hospedeiro recombinante pode compreender duas ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo tendo qualquer uma atividade de UGT, por exemplo, atividade de UGT1, 2, 3 ou 4. Quando um hospedeiro recombinante compreende duas ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo tendo qualquer uma atividade de UGT, estas sequências de ácidos nucleicos podem ser iguais ou diferentes e/ou podem codificar polipeptídeos iguais ou diferentes. Em particular, um hospedeiro recombinante pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos que codifica dois polipeptídeos UGT2 diferentes.

[0075] Um hospedeiro recombinante pode compreender uma ou mais sequências de nucleotídeo recombinantes que codificam um ou mais dentre: um polipeptídeo que tem atividade de ent-copalil pirofosfato sintase; um polipeptídeo que tem atividade de ent-Caureno sintase; um polipeptídeo que tem atividade de ent-Caureno oxidase; e um polipeptídeo que tem atividade de ácido caurenóico 13- hidroxilase.

[0076] Para os propósitos da presente invenção, um polipeptídeo tendo atividade de ent -pirofosfato copalil sintase (EC 5.5.1.13) é capaz de catalisar a reação química:

[0077] Es sa enzima tem um substrato, geranilgeranil pirofosfato, e um produto, ent-copalil pirofosfato. Essa enzima participa em biossíntese de giberelina. Essa enzima pertence à família de isomerase, especificamente a classe de liases intramoleculares. O nome sistemático dessa classe de enzima é ent-copalil-difosfato liase (desciclização). Outros nomes em uso comum incluem que tem ent-copalil pirofosfato sintase, ent-caureno sintase A e ent-caureno sintetase A.

[0078] As sequências de ácido nucleico adequadas que codificam uma ent-copalil pirofosfato sintase podem, por exemplo, compreender uma sequência como apresentado em SEQ ID. NO: 1, 3, 5, 7, 17, 19, 59, 61, 141, 142, 151, 152, 153, 154, 159, 160, 182 ou 184 do documento WO2015/007748.

[0079] Para os propósitos desta invenção, um polipeptídeo que tem atividade de ent-caureno sintase (EC 4.2.3.19) é um polipeptídeo que é capaz de catalisar a reação química: ent-copalil difosfato =ent-caureno + difosfato

[0080] Por conseguinte, essa enzima tem um substrato, ent-copalil difosfato, e dois produtos, ent-Caureno e difosfato.

[0081] Essa enzima pertence à família deliases, especificamente as liases de carbono-oxigênio que atuam em fosfatos. O nome sistemático dessa classe de enzima é ent- copalil-difosfato difosfato-liase (ciclização, formação de ent-caureno). Outros nomes em uso comum incluem ent-caureno sintase B, ent-caureno sintetase B, ent-copalil-difosfato difosfato-liase e (ciclização). Essa enzima participa em biossíntese de diterpenoide.

[0082] As sequências de ácido nucleico adequadas que codificam uma ent-Caureno sintase podem, por exemplo, compreender uma sequência como apresentado em SEQ ID. NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 63, 65, 143, 144, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 183 ou 184 do documento WO2015/007748.

[0083] As ent-copalil difosfato sintases podem também ter uma atividade deent-caureno sintase distinta associada à mesma molécula de proteína. A reação catalisada por ent- caureno sintase é a próxima etapa na via biossintética para giberelinas. Os dois tipos de atividade enzimática são distintos, e a mutagênese sítio-dirigida para suprimir a atividade de ent-caureno sintase da proteína leva ao acúmulo de ent-copalil pirofosfato.

[0084] Consequentemente, uma única sequência de nucleotídeo usada em um hospedeiro recombinante da invenção pode codificar um polipeptídeo que tem atividade de ent- copalil pirofosfato sintase e atividade ent-caureno sintase. Alternativamente, as duas atividades podem ser codificadas por duas sequências de nucleotídeo separadas distintas.

[0085] Para os propósitos desta invenção, um polipeptídeo que tem atividade de ent-caureno oxidase (EC 1.14.13.78) é um polipeptídeo que é capaz de catalisar três oxidações sucessivas do grupo 4-metila de ent-caureno para gerar ácido caurenóico. Tal atividade requer tipicamente a presença de um citocromo P450.

[0086] As sequências de ácido nucleico adequadas que codificam uma ent-Caureno oxidase podem, por exemplo, compreender uma sequência como apresentado em SEQ ID. NO: 21, 23, 25, 67, 85, 145, 161, 162, 163, 180 ou 186 do documento WO2015/007748.

[0087] Para os propósitos da invenção, um polipeptídeo que tem atividade de ácido caurenóico 13-hidroxilase (EC 1.14.13) é um que é capaz de catalisar a formação de esteviol (ácido ent-caur-16-en-13-ol-19-óico) que usa NADPH e O2. Tal atividade também pode ser chamada de atividade de ent-ca 13-hidroxilase.

[0088] As sequências de ácido nucleico adequadas que codificam uma ácido caurenóico 13-hidroxilase podem, por exemplo, compreender uma sequência como apresentado em SEQ ID. NO: 27, 29, 31, 33, 69, 89, 91, 93, 95, 97, 146, 164, 165, 166, 167 ou 185 do documento WO2015/007748.

[0089] Um hospedeiro recombinante pode compreender uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo que tem atividade de NADPH-citocromo p450 redutase. Ou seja, um hospedeiro recombinante da invenção pode ser capaz de expressar uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem atividade de NADPH- citocromo p450 redutase. Para os propósitos da invenção, um polipeptídeo que tem atividade de NADPH-Citocromo P450 redutase (EC 1.6.2.4; também conhecida como NADPH:ferriemoproteína oxidorredutase, NADPH:hemoproteína oxidorredutase, NADPH:P450 oxidorredutase, P450 redutase, POR, CPR, CYPOR) é tipicamente uma que é uma enzima ligada à membrana que permite a transferência de elétron para citocromo P450 no microssomo da célula eucariota de uma enzima que contém FAD e FMN NADPH:citocromo P450 redutase (POR; EC 1.6.2.4).

[0090] Em um hospedeiro recombinante, a capacidade do hospedeiro de produzir geranilgeranil difosfato (GGPP) pode ser regulada de modo ascendente. "Regulada de modo ascendente" no contexto desta invenção implica que o hospedeiro recombinante produz mais GGPP que um hospedeiro não recombinante equivalente.

[0091] Consequentemente, um hospedeiro recombinante pode compreender uma ou mais sequências de nucleotídeo que codificam hidroximetilglutaril-CoA redutase, farnesil- pirofosfato sintetase e geranilgeranil difosfato sintase, através do que a(s) sequência(s) de nucleotídeo mediante transformação de um hospedeiro confere(s) àquele hospedeiro a capacidade de produzir níveis elevados de GGPP. Dessa forma, um hospedeiro recombinante de acordo com a invenção pode compreender uma ou mais sequências de ácido nucleico recombinante que codificam um ou mais dentre hidroximetilglutaril-CoA redutase, farnesil-pirofosfato sintetase e geranilgeranil difosfato sintase.

[0092] Consequentemente, um hospedeiro recombinante pode compreender sequências de ácido nucleico que codificam um ou mais dentre: um polipeptídeo que tem atividade de hidroximetilglutaril-CoA redutase; um polipeptídeo que tem atividade de farnesil-pirofosfato sintetase; e

[0093] Um hospedeiro recombinante pode ser, por exemplo, um organismo multicelular ou uma célula do mesmo ou um organismo unicelular. Um hospedeiro pode ser uma célula hospedeira procariota, arqueobacteriana ou eucariota.

[0094] Uma célula hospedeira procariota pode, mas não é limitada a, uma célula hospedeira bacteriana. Uma célula hospedeira eucariota pode ser, mas não é limitada a, uma célula hospedeira de levedura, fungo, ameba, alga ou animal.

[0095] Uma célula hospedeira eucariota pode ser uma célula hospedeira fúngica. "Fungos" incluem todas as espécies da subdivisão Eumycotina (Alexopoulos, C. J., 1962, In: Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc., New York, EUA). O termo fungo inclui assim dentre outros, fungos filamentosos e levedura.

[0096] "Fungos filamentosos" são definidos no presente documento como microrganismos eucariotas que incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina e Oomycota ((como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são caracterizados por uma parede micelial composta de quitina, celulose, glucano, quitosano, manano e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo se dá por alongamento da hifa e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. As cepas fúngicas filamentosas incluem, mas não são limitados a, cepas de Acremonium, Aspergillus, Agaricus, Aureobasidium, Cryptococcus, Corynascus, Chrysosporium, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Monascus, Mucor, Myceliophthora, Mortierella, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Phanerochaete Podospora, Pycnoporus, Rhizopus, Schizophyllum, Sordaria, Talaromyces, Rasmsonia, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes e Trichoderma. As cepas fúngicas filamentosas preferenciais que podem servir como células hospedeiras pertencem à espécie Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus fumigatus, Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinum, Acremonium chrysogenum, Trichoderma reesei, Rasamsonia emersonii (anteriormente conhecida como Talaromyces emersonii), Aspergillus sojae, Chrysosporium lucknowense, Myceliophtora thermophyla. As células hospedeiras de referência para a comparação de características de fermentação de células transformadas e não transformadas, incluem, por exemplo, Aspergillus niger CBS120.49, CBS 513.88, Aspergillus oryzae ATCC16868, ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892, Aspergillus fumigatus AF293 (CBS101355), P. chrysogenum CBS 455.95, Penicillium citrinum ATCC 38065, Penicillium chrysogenum P2, Acremonium chrysogenum ATCC 36225, ATCC 48272, Trichoderma reesei ATCC 26921, ATCC 56765, ATCC 26921, Aspergillus sojae ATCC11906, Chrysosporium lucknowense ATCC44006 e derivados de todas essas cepas. As particularmente preferenciais como célula hospedeira fúngica filamentosa são Aspergillus niger CBS 513.88 e derivados da mesma.

[0097] Uma célula hospedeira eucariota pode ser uma célula de levedura. As células hospedeiras de levedura preferenciais podem ser selecionadas dos gêneros: Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae, S. bayanus, S. pastorianus, S. carlsbergensis), Brettanomyces, Kluyveromyces, Candida (por exemplo, C. krusei, C. revkaufi, C. pulcherrima, C. tropicalis, C. utilis), Issatchenkia (por exemplo, I. orientalis) Pichia (por exemplo, P. pastoris), Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Pachysolen, Schwanniomyces, Trichosporon, Yarrowia (por exemplo, Y. lipolytica (anteriormente classificado como Candida lipolytica)), Yamadazyma .

[0098] As células hospedeiras procariotas podem ser células hospedeiras bacterianas. A célula hospedeira bacteriana pode ser bactérias Gram-negativas ou Gram- positivas. Os exemplos de bactérias incluem, mas não são limitados a, bactérias que pertencem ao gênero Bacillus (por exemplo, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. puntis, B. megaterium, B. halodurans, B. pumilus,), Acinetobacter, Nocardia, Xanthobacter, Escherichia (por exemplo, E. coli (por exemplo, cepas DH 1 OB, Stbl2, DH5-alpha, DB3, DB3.1 ), DB4, DB5, JDP682 e ccdA-over (por exemplo, Pedido n° US 09/518,188))), Streptomyces, Erwinia, Klebsiella, Serratia (por exemplo, S. marcessans), Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa), Salmonella (por exemplo, S. typhimurium, S. typhi). As também bactérias também incluem, mas não são limitadas a, bactérias fotossintéticas (por exemplo, bactérias verdes sem enxofre (por exemplo, bactérias Choroflexus bacteria (por exemplo, C. aurantiacus), Chloronema (por exemplo, C. gigateum)), bactérias verdes com enxofre (por exemplo, Chlorobium bacteria (por exemplo, C. limicola), Pelodictyon (por exemplo, P. luteolum), bactérias púrpuras com enxofre (por exemplo, Chromatium (por exemplo, C. okenii)), e bactérias púrpuras sem enxofre (por exemplo, Rhodospirillum (por exemplo, R. rubrum), Rhodobacter (por exemplo R. sphaeroides, R. capsulatus), e Rhodomicrobium bacteria (por exemplo, R. vanellii)).

[0099] As células hospedeiras podem ser células hospedeiras de organismos não microbianos. Os exemplos de tais células, incluem, mas não são limitados a, células de inseto (por exemplo, Drosophila (por exemplo, D. melanogaster), Spodoptera (por exemplo, células Sf9 ou Sf21 de S. frugiperda) e Trichoplusa (por exemplo, células High- Five); células de nemátodos (por exemplo, células de C. elegans); células aviárias; células de anfíbios (por exemplo, células de Xenopus laevis); células de répteis; e células de mamíferos (por exemplo, NIH3T3, 293, CHO, COS, VERO, C127, BHK, Per-C6, melanoma Bowes e células HeLa).

[0100] Um hospedeiro recombinante pode ser capaz de se desenvolver em qualquer fonte de carbono adequada conhecida na técnica e converter a mesma em um glicosídeo de esteviol. O hospedeiro recombinante pode ser capaz de converter diretamente biomassa vegetal, celuloses, hemiceluloses, pectinas, ramnose, galactose, fucose, maltose, maltodextrinas, ribose, ribulose, ou amido, derivado de amido, sacarose, lactose e glicerol. Por conseguinte, um hospedeiro preferencial expressa enzimas como celulases (endocelulases e exocelulases) e hemicelulases (por exemplo, endo e exoxilanases, arabinases) necessárias para a conversão de celulose em monômeros de glicose e hemicelulose em monômeros de xilose e arabinose, pectinases capazes de converter pectinas em ácido glucurônico e ácido galacturônico ou amilases para converter amido em monômeros de glicose. De preferência, o hospedeiro é capaz de converter uma fonte de carbono selecionada do grupo que consiste em glicose, xilose, arabinose, sacarose, lactose e glicerol. A célula hospedeira pode, por exemplo, ser uma célula hospedeira eucariota como descrito no documento WO03/062430, WO06/009434, EP1499708B1, WO2006096130 ou WO04/099381.

[0101] As té cnicas de genética padrão, para a construção de tais hospedeiros recombinantes, como superexpressão de enzimas nas células hospedeiras, modificação genética de células hospedeiras, ou técnicas de hibridisação, são métodos conhecidos na técnica, como descrito em Sambrook e Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ou F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing e Wiley Interscience, New York, EUA (1987). Métodos para transformação, modificação genética, etc. de células hospedeiras fúngicas são conhecidos, por exemplo, dos documentos EP-A-0 635 574, WO 98/46772, WO 99/60102 e WO 00/37671, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635 574 e US 6.265.186.

[0102] Um processo para a preparação de um glicosídeo de esteviol pode compreender a fermentação de um hospedeiro recombinante como descrito no presente documento que é capaz de produzir pelo menos um glicosídeo de esteviol em um meio de fermentação adequado, e, opcionalmente, recuperar o glicosídeo de esteviol. a. O meio de fermentação usado no processo de produção de um glicosídeo de esteviol pode ser qualquer meio de fermentação adequado, que permita o crescimento de uma determinada célula hospedeira eucariótica. Os elementos essenciais do meio de fermentação são conhecidos pelos elementos versados na técnica e podem ser adaptados à célula hospedeira selecionada.

[0103] De preferência, o meio de fermentação compreende uma fonte de carbono selecionada do grupo que consiste em biomassa vegetal, celuloses, hemiceluloses, pectinas, ramnose, galactose, fucose, frutose, maltose, maltodextrinas, ribose, ribulose, ou amido, derivados de amido, sacarose, lactose, ácidos graxos, triglicerídeos e glicerol. De preferência, o meio de fermentação também compreende uma fonte de nitrogênio como ureia, ou um sal de amônio como sulfato de amônio, cloreto de amônio, nitrato de amônio ou fosfato de amônio.

[0104] O processo de fermentação de acordo com a presente invenção pode ser executado em modo de batelada, batelada alimentada ou contínuo. Um processo de hidrólise e fermentação separadas (SHF) ou um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) também podem ser aplicados. Uma combinação desses modos de processo de fermentação também pode ser possível para produtividade ideal. Um processo de SSF pode ser particularmente atraente se amido, celulose, hemicelulose ou pectina for usado como uma fonte de carbono no processo de fermentação, em que pode ser necessário adicionar enzimas hidrolíticas, como celulases, hemicelulases ou pectinases para hidrolisar o substrato.

[0105] O hospedeiro recombinante usado no processo para a preparação de um glicosídeo de esteviol pode ser qualquer hospedeiro recombinante adequado como definido no presente documento acima. Pode ser vantajoso usar um hospedeiro recombinante eucariota de acordo com a invenção no processo, uma vez que a maioria das células eucariotas não requer condições estéreis para propagação e são insensíveis a infeções por bacteriófagos. Além disso, as células hospedeiras eucariotas podem ser desenvolvidas em pH baixo para impedir contaminação bacteriana.

[0106] O hospedeiro recombinante pode ser um microrganismo anaeróbico facultativo. Um hospedeiro recombinante anaeróbico facultativo pode ser propagado aerobicamente para uma concentração celular alta. Essa fase anaeróbica pode, então, ser executada em densidade celular alta que reduz o volume de fermentação requerido substancialmente, e pode minimizar o risco de contaminação com microrganismos aeróbicos.

[0107] O processo de fermentação para a produção de um glicosídeo de esteviol de acordo com a presente invenção pode ser um processo de fermentação aeróbica ou anaeróbica.

[0108] Um processo de fermentação anaeróbica pode ser definido no presente documento como um processo de fermentação executado na ausência de oxigênio ou em que substancialmente nenhum oxigênio é consumido, de preferência, menos que 5, 2,5 ou 1 mmol/l/h, e em que as moléculas orgânicas servem tanto como doadoras de elétron quanto como aceitantes de elétron. O processo de fermentação de acordo com a presente invenção também pode ser primeiramente executado sob condições aeróbicas e subsequentemente sob condições anaeróbicas.

[0109] O processo de fermentação também pode ser executado sob condições de oxigênio limitado ou microaeróbicas. Alternativamente, o processo de fermentação pode primeiramente ser executado sob condições aeróbicas e subsequentemente sob condições de oxigênio limitado. Um processo de fermentação de oxigênio limitado é um processo em que o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e pela composição do fluxo de gás entrante, bem como as propriedades reais de transferência de massa/mistura do equipamento de fermentação usado.

[0110] A produção de um glicosídeo de esteviol no processo pode ocorrer durante a fase de crescimento da célula hospedeira, durante a fase estacionária (estado de equilíbrio) ou durante ambas as fases. Pode ser possível executar o processo de fermentação em diferentes temperaturas.

[0111] O processo para a produção de um glicosídeo de esteviol pode ser executado a uma temperatura que é ideal para o hospedeiro recombinante. A temperatura de crescimento ideal pode diferir para cada hospedeiro recombinante transformado e é conhecida pelo elemento versado na técnica. A temperatura ideal pode ser maior que a ideal para organismos do tipo selvagem desenvolverem o organismo eficientemente sob condições não estéreis sob sensibilidade de infecção mínima e custo de resfriamento mais baixo. Alternativamente, o processo pode ser executado a uma temperatura que não é ideal para desenvolvimento do hospedeiro recombinante.

[0112] O processo para a produção de um glicosídeo de esteviol de acordo com a presente invenção pode ser um processo realizado em qualquer valor de pH adequado. Se o hospedeiro recombinante for uma levedura, o pH no meio de fermentação de preferência tem um valor abaixo de 6, de preferência abaixo de 5,5, de preferência abaixo de 5, de preferência abaixo de 4,5, de preferência abaixo de 4, de preferência abaixo de pH 3,5 ou abaixo de pH 3,0, ou abaixo de pH 2,5, de preferência acima de pH 2. Uma vantagem da execução da fermentação nesses valores de pH baixos é que o desenvolvimento de bactérias contaminantes no meio de fermentação pode ser impedido.

[0113] Tal processo pode ser executado em uma escala industrial. O produto de tal processo é um caldo de fermentação que compreende um ou mais glicosídeos de esteviol. Tal caldo de fermentação pode ser submetido a um ou mais dentre uma separação de sólido/líquido, uma etapa de rompimento celular, uma etapa de cromatografia, uma etapa de concentração e uma etapa de secagem antes da cristalização de acordo com o método da presente invenção.

[0114] Uma composição de acordo com a invenção ou uma composição produzida pelo processo de acordo com a presente invenção pode ser usada em qualquer aplicação conhecida para tais compostos. Em particular, tal composição pode, por exemplo, ser usada como um adoçante, por exemplo, em um alimento ou uma bebida. Portanto, de acordo com a invenção, é proporcionado um gênero alimentício, alimento para animais ou bebida que compreende uma composição da invenção ou uma composição produzida pelo processo de acordo com a presente invenção.

[0115] Por exemplo, uma composição da invenção ou uma composição produzida pelo processo de acordo com a presente invenção pode ser formulada em refrigerantes, como um adoçante de mesa, goma de mascar, laticínio como iogurte (por exemplo, iogurte natural), torta, cereal ou alimento à base de cereal, nutracêutico, farmacêutico, gel comestível, produto de confeitaria, cosmético, pastas de dente ou outra composição de cavidade oral, etc. Além disso, um glicosídeo de esteviol ou uma composição da invenção pode ser usado como um adoçante não apenas para bebidas, produtos alimentícios, e outros produtos dedicados ao consumo humano, mas também em suprimento animal e forragem com características aprimoradas.

[0116] Consequentemente, a invenção fornece, inter alia, um produto alimentício, alimento ou bebida que compreende uma composição da invenção ou uma composição produzida pelo processo de acordo com a presente invenção.

[0117] Durante a fabricação de produtos alimentícios, bebidas, farmacêuticos, cosméticos, produtos de mesa, goma de mascar, os métodos convencionais como mistura, amassamento, dissolução, decapagem, permeação, percolação, borrifo, atomização, infusão e outros métodos podem ser usados.

[0118] Uma composição da invenção ou uma composição produzida pelo processo de acordo com a presente invenção pode ser usada em formas secas ou líquidas. O mesmo pode ser adicionado antes ou depois do termotratamento de produtos alimentícios. A quantidade do adoçante depende do propósito de uso. O mesmo pode ser adicionado sozinho ou na combinação com outros compostos.

[0119] Uma composição da invenção ou uma composição produzida pelo processo de acordo com a presente invenção pode ser mesclada com um ou mais adoçantes caloríficos ou não caloríficos adicionais. Tal mesclagem pode ser usada para aprimorar o perfil de sabor ou temporal ou a estabilidade. Uma ampla faixa tanto de adoçantes não calóricos quanto calóricos pode ser adequada para mesclagem com um glicosídeo de esteviol ou uma composição da invenção. Por exemplo, os adoçantes não calóricos como mogrosídeo, monatina, aspartame, sais de acessulfame, ciclamato, sucralose, sais de sacarina ou eritritol. Os adoçantes caloríficos adequados para mesclagem com um glicosídeo de esteviol ou uma composição da invenção incluem álcoois de açúcar e carboidratos como sacarose, glicose, frutose e HFCS. Aminoácidos com sabor doce como glicina, alanina ou serina também podem ser usados.

[0120] Uma composição da invenção ou uma composição produzida pelo processo de acordo com a presente invenção pode ser usada na combinação com um supressor de adoçante, como um supressor de adoçante natural. O mesmo pode ser combinado com um melhorador de sabor umami, como um aminoácido ou um sal do mesmo.

[0121] Uma composição da invenção ou uma composição produzida pelo processo de acordo com a presente invenção pode ser combinada com um poliol ou álcool de açúcar, um carboidrato, uma substância fisiologicamente ativa ou ingrediente funcional (por exemplo, um carotenoide, fibra dietética, ácido graxo, saponina, antioxidante, nutracêutico, flavonoide, isotiocianato, fenol, esterol ou estanol vegetal (fitoesteróis e fitoestanóis), um poliol, um prebiótico, um probiótico, um fitoestrogênio, proteína de soja, sulfetos/tióis, aminoácidos, uma proteína, uma vitamina, um mineral e/ou uma substância classificada com base em benefícios de saúde, como cardiovascular, redutor de colesterol ou anti-inflamatória.

[0122] Uma composição da invenção ou uma composição produzida pelo processo de acordo com a presente invenção pode incluir um agente de saborização, um componente de aroma, um nucleotídeo, um ácido orgânico, um sal de ácido orgânico, um ácido inorgânico, um composto amargo, uma proteína ou hidrolisato de proteína, um tensoativo, um flavonoide, um composto adstringente, uma vitamina, uma fibra dietética, um antioxidante, um ácido graxo e/ou um sal.

[0123] Uma composição da invenção ou uma composição produzida pelo processo de acordo com a presente invenção pode ser aplicada como um adoçante de alta intensidade para produzir bebidas com zero caloria, calorias reduzidas ou diabéticas e produtos alimentícios com características de sabor aprimoradas. Também pode ser usado em drinks, produtos alimentícios, farmacêuticos e outros produtos nos quais o açúcar não pode ser usado.

[0124] Além disso, uma composição da invenção ou uma composição produzida pelo processo de acordo com a presente invenção pode ser usada como um adoçante não apenas para drinks, produtos alimentícios e outros produtos dedicados ao consumo humano, mas também em ração animal e forragem com características aprimoradas.

[0125] Os exemplos de produtos em que uma composição da invenção ou uma composição produzida pelo processo de acordo com a presente invenção pode ser usada como um composto de adoçamento podem ser bebidas alcoólicas como vodca, vinho, cerveja, licor, saquê, etc.; sucos naturais, drinks refrescantes, refrigerantes gasosos, drinks dietéticos, drinks de zero caloria, drinks e alimentos de caloria reduzida, drinks de iogurte, sucos instantâneos, café instantâneo, tipos em pó de bebidas instantâneos, produtos enlatados, xaropes, pasta de soja fermentada, molho de soja, vinagre, temperos, maionese, ketchups, curry, sopa, caldo instantâneo, molho de soja em pó, vinagre em pó, tipos de biscoitos, biscoito de arroz, cream crackers, pão, chocolates, caramelo, doces, goma de mascar, geleia, pudim, frutas e vegetais em conserva, nata, compota, marmelada, massa de flor, leite em pó, sorvete, gelado, vegetais e frutas embalados em garrafas, feijões cozidos e enlatados, carne e alimentos cozidos em molho adocicado, produtos alimentícios vegetais agrícolas, frutos do mar, presunto, salsicha, embutido de peixe, salsicha de peixe, massa de peixe, produtos de peixe fritos em imersão, produtos de fruto do mar seco, produtos alimentícios congelados, alga marinha em conserva, carne em conserva, tabaco, produtos medicinais e muitos outros. A princípio, pode-se ter aplicações ilimitadas.

[0126] A composição adoçada compreende uma bebida, cujos exemplos não limitantes incluem bebidas gasosas e não gasosas como colas, refrigerantes de gengibre, cervejas-de- raiz, sidras, refrigerantes com sabor de fruta (por exemplo, refrigerantes com sabor cítrico como lima-limão ou laranja), refrigerantes em pó e similares; sucos de fruta originados de frutas ou vegetais, sucos de fruta incluindo sucos espremidos ou similares, sucos de fruta que contêm pedaços de fruta, bebidas de fruta, bebidas de suco de fruta, bebidas que contêm sucos de fruta, bebidas com saborizantes de fruta, sucos vegetais, sucos que contêm vegetais e sucos misturados que contêm frutas e vegetais; bebidas esportivas, drinks energéticos, água saborizada e drinks similares (por exemplo, água com saborizantes natural ou sintético); bebidas do tipo chá ou de uso diário como café, cacau, chá preto, chá verde, chá oolong e similares; bebidas que contêm componentes de leite como bebidas leitosas, café que contém componentes de leite, café com leite, chá de leite, bebidas de leite de frutas, iogurte bebível, bebidas com bactérias formadoras de ácido láctico ou similares; e laticínios.

[0127] Em geral, a quantidade de adoçante presente em uma composição adoçada varia amplamente dependendo do tipo particular de composição adoçada e de sua doçura desejada. Os elementos de conhecimento comum na técnica podem discernir prontamente a quantidade apropriada de adoçante para colocar na composição adoçada.

[0128] Durante a fabricação de produtos alimentícios, bebidas, farmacêuticos, cosméticos, produtos de mesa, goma de mascar, os métodos convencionais como mistura, amassamento, dissolução, decapagem, permeação, percolação, borrifo, atomização, infusão e outros métodos podem ser usados.

[0129] Dessa forma, as composições que incorporam uma composição da invenção ou uma composição produzida pelo processo de acordo com a presente invenção podem ser feitas por qualquer método conhecido pelos versados na técnica que fornecem misturas uniformes homogêneas ou misturas homogêneas dos ingredientes. Esses métodos incluem mescla seca, secagem por aspersão, aglomeração, granulação a úmido, compactação, cocristalização e similares.

[0130] Em forma sólida, uma composição da invenção ou uma composição produzida pelo processo de acordo com a presente invenção pode ser fornecida para consumidores em qualquer forma adequada para entrega no artigo comestível a ser adoçado, incluindo sachês, pacotes, bolsas ou caixas, cubos, tabletes, vapores ou tiras dissolvíveis. A composição pode ser entregue como uma dose unitária ou em forma a granel.

[0131] Para faixas convenientes de sistemas e composições de adoçante líquido de formas fluidas, semifluidas, massa e creme, a embalagem apropriada que usa material de embalagem apropriado em qualquer formato ou forma deve ser inventada para ser conveniente para carregar ou descartar ou armazenar ou transportar qualquer combinação que contém qualquer um dos produtos de adoçante acima ou combinação de produtos produzidos acima.

[0132] Uma composição da invenção ou uma composição produzida pelo processo de acordo com a presente invenção pode incluir vários agentes avolumadores, ingredientes funcionais, corantes, saborizantes. Modalidades da invenção: 1. Uma composição que compreende um ou mais glicosídeos de esteviol cuja composição compreende ácido caurenóico em uma quantidade de não mais que cerca de 150 ppm. 2. Uma composição que compreende um ou mais glicosídeos de esteviol cuja composição compreende ácido caurenóico em uma quantidade de não mais que cerca de 100 ppm, por exemplo, não mais que cerca de 10 ppm. 3. Uma composição de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que os glicosídeos de esteviol são produzidos de modo fermentativo. 4. Uma composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores que compreende um ou mais de qualquer um dentre rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo M, esteviosídeo, dulcosíde A, rubusosídeo ou esteviolbiosídeo. 5. Uma composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores que compreende pelo menos 80 % em uma base de peso seco de pelo menos um glicosídeo de esteviol. 6. Uma composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores que compreende pelo menos 95% em uma base de peso seco de pelo menos um glicosídeo de esteviol. 7. Um método para preparar uma composição de glicosídeo de esteviol, cujo método compreende: fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol; combinar a composição de glicosídeo de esteviol com um solvente para formar uma solução de glicosídeo de esteviol; e cristalizar uma composição de glicosídeo de esteviol a partir da solução de glicosídeo de esteviol, em que a cristalização é executada no pH 7,0 ou abaixo. 8. Um método para reduzir o teor de ácido caurenóico de uma composição de glicosídeo de esteviol, cujo método compreende: fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol que compreende ácido caurenóico; combinar a composição de glicosídeo de esteviol com um solvente para formar uma solução de glicosídeo de esteviol; e cristalizar uma composição de glicosídeo de esteviol a partir da solução de glicosídeo de esteviol, em que a cristalização é executada no pH 7,0, para reduzir, através disso, a quantidade de ácido caurenóico na composição de glicosídeo de esteviol. 9. Um método, de acordo com a modalidade 7 ou 8, em que a cristalização é executada no pH 6,0 ou abaixo. 10. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades 7 a 9, em que a cristalização é executada no pH 5,0 ou abaixo. 11. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades 7 a 10, em que a cristalização é executada no pH 4,0 ou abaixo. 12. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades 7 a 11, em que a composição de glicosídeo de esteviol resultante compreende ácido caurenóico em uma quantidade de não mais que cerca de 150 ppm, como não mais que cerca de 100 ppm. 13. Um método, de acordo com a modalidade 12, em que a composição de glicosídeo de esteviol resultante compreende ácido caurenóico em uma quantidade de não mais que cerca de 10 ppm. 14. Um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, em que os glicosídeos de esteviol são produzidos de modo fermentativo. 15. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades 7 a 14, em que a composição de glicosídeo de esteviol resultante compreende um ou mais de qualquer um dentre rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo M, esteviosídeo, dulcosíde A, rubusosídeo ou esteviolbiosídeo. 16. Um método, de acordo com qualquer uma das modalidades 7 a 15, em que a composição de glicosídeo de esteviol resultante compreende pelo menos 80 % em uma base de peso seco de pelo menos um glicosídeo de esteviol. 17. Um método, de acordo com a modalidade 16, em que a composição de glicosídeo de esteviol resultante compreende pelo menos 95 % em uma base de peso seco de pelo menos um glicosídeo de esteviol. 18. Uma composição de glicosídeo de esteviol obtenível por um método, de acordo com qualquer uma das modalidades 7 a 17.

[0133] Uma referência no presente documento a um documento de patente ou outra matéria que é dada como técnica anterior não deve ser adotada como uma admissão de que aquele documento ou matéria era conhecida ou que as informações contidas pelo menos eram parte do conhecimento comum geral na data de prioridade de qualquer uma das reivindicações.

[0134] A revelação de cada referência apresentada no presente documento é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0135] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes Exemplos:

EXEMPLOS Exemplo 1: Redução de ácido caurenóico em uma composição de glicosídeo de esteviol por cristalização

[0136] Uma composição de glicosídeo de esteviol que contém rebaudiosídeo A produzido de modo fermentativo foi produzida por fermentação de uma cepa Yarrowia lipolitica com base em ML14869 como descrito no pedido de patente copendente n° PCT/EP2016/055734. Uma variante UGT2, UGT2_5b, foi adicionada a ML14869, como é descrito no Exemplo 15 do documento PCT/EP2016/055734 (UGT2_5b tem o quadro de leitura aberto que tem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 11 de documento PCT/EP2016/055734) para chegar na cepa final que foi usada.

[0137] A cepa foi fermentada com uso do procedimento apresentado nos documentos WO2013/110673 e WO2015/007748.

[0138] Desse modo, o caldo de fermentação foi submetido às etapas a seguir: centrifugação, choque de calor, filtração de polimento, cromatografia sobre uma coluna HP20, concentração/evaporação, troca catiônica, troca aniônica e, então, o material final foi seco por aspersão.

[0139] O material que contém glicosídeo de esteviol derivado de modo fermentativo seco resultante que compreende rebaudiosídeo A foi dissolvido em 70 g de Reb A por litro de solvente (etanol:água 92:8) por 15 minutos a 70-75 °C. A solução resultante foi filtrada com uso de um filtro Pall HS 200 com uma alimentação de corpo de 6 gramas Dicalite (em 0,012 m2) a uma temperatura de 75 °C com uma pressão de no máximo 0,1 MPa (1 bar).

[0140] A solução resultante foi, dessa forma, cristalizada no pH 10,5 ou pH 3,8 (ajuste para pH executado com HCl a 4 M). Isso foi seguido de um perfil de resfriamento de uma temperatura inicial de 75 °C resfriada por 5 horas a 5 °C. Dessa forma, a temperatura foi mantida a 5 °C.

[0141] Dessa forma, a filtração e a lavagem foram executadas com uso de um filtro de correia configurado com um pano de filtro de 20 μm (tipo Larox PB 1180 B) . O líquido de lavagem foi a mistura de solvente, isto é, etanol:água 92:8 e resfriado a 5 °C. As porções de pasta aquosa de 1,5 - 2 litros foram usadas para lavar por 3 vezes com o líquido de lavagem de 150 - 200 ml (igual ao volume de pélete).

[0142] Dessa forma, a secagem foi executada em um forno a vácuo de 100 mbar a 55 - 60 °C até que o etanol esteja abaixo de 0,5 %.

[0143] O ácido caurenóico foi determinado por LC-MS.

[0144] Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo e demonstram que o pH tem uma influência pronunciada na remoção de KA e que o uso de uma cristalização de pH inferior permite que a quantidade de KA de uma composição de glicosídeo de esteviol seja muito reduzida. Tabela 1: Valores de KA por cristalizações de etanol em diferentes pHs

Claims

1. Método para reduzir o teor de ácido caurenóico de uma composição de glicosídeo de esteviol, caracterizado por compreender: fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol que compreende ácido caurenóico, em que os glicosídeos de esteviol são produzidos de modo fermentativo; combinar a composição de glicosídeo de esteviol com um solvente para formar uma solução de glicosídeo de esteviol, em que o solvente é um álcool compreendendo água em uma quantidade de 3 a 20 % em peso; e cristalizar uma composição de glicosídeo de esteviol a partir da solução de glicosídeo de esteviol, em que a cristalização é executada no pH 5,0 ou abaixo até o pH 3,8, em que a composição de glicosídeo de esteviol resultante compreende ácido caurenóico em uma quantidade de não mais que 100 ppm, em que a composição de glicosídeo de esteviol resultante compreende pelo menos 80 % em uma base de peso seco de pelo menos um glicosídeo de esteviol selecionado de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D e rebaudiosídeo M.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cristalização é realizada em pH 4,0 ou abaixo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a composição de glicosídeo de esteviol resultante compreende ácido caurenóico em uma quantidade de não mais que 10 ppm.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a composição de glicosídeo de esteviol resultante compreende ainda um ou mais de qualquer um dentre rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, esteviosídeo, dulcosíde A, rubusosídeo ou esteviolbiosídeo.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a composição de glicosídeo de esteviol resultante compreende pelo menos 95 % em uma base de peso seco de pelo menos um glicosídeo de esteviol.