CN109563118A - 甜菊醇糖苷的结晶 - Google Patents
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Abstract
一种纯化莱鲍迪甙M的方法,所述方法包括:(a)提供包含莱鲍迪甙M的溶液,其中莱鲍迪甙M的浓度为至少约10g/L,莱鲍迪甙M的纯度为以干基计至少约10重量%;和(b)从所述溶液中结晶出包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物,从而纯化莱鲍迪甙M。
Description
技术领域
本发明涉及纯化莱鲍迪甙M(rebaudioside M)的方法以及包含通过所述方法能够获得的莱鲍迪甙M的组合物。
背景技术
多年生草本植物甜叶菊(Stevia rebaudiana Bert.)的叶子积聚大量被称为甜菊醇糖苷(steviol glycosides)的具有强烈甜味的化合物。虽然这些化合物的生物功能尚不清楚,但它们作为替代性高效甜味剂具有商业意义。
这些甜的甜菊醇糖苷的功能和感官特性表现为优于许多高效甜味剂的功能和感官特性。此外,研究表明甜菊苷(stevioside)能够降低II型糖尿病患者的血糖水平,并且能够降低轻度高血压患者的血压。
甜菊醇糖苷积聚在甜叶菊叶中,其中它们可占叶干重的10%至20%。甜菊苷和莱鲍迪甙A均是热稳定和pH稳定的,并且适用于碳酸饮料和许多其他食物。甜菊苷比蔗糖甜110与270倍之间,莱鲍迪甙A比蔗糖甜150与320倍之间。此外,莱鲍迪甙D也是在甜叶菊叶中积聚的高效二萜糖苷甜味剂。它可比蔗糖甜约200倍。莱鲍迪甙M是另一种高效二萜糖苷甜味剂。它在某些甜叶菊品种叶中以痕量存在,但已表明其具有优异的味道特征。
目前的联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)下的食品添加剂联合专家委员会(JECFA)标准要求将甜菊醇糖苷的总量纯化至95%或更高。
用于纯化莱鲍迪甙A的现有方法依赖于重复的纯化步骤,包括色谱,其是昂贵且耗时的操作,以及有机溶剂的使用。有机溶剂的使用需要复杂且昂贵的设备,例如,必须使用所谓的无爆炸设备。需要再生有机溶剂并且需要采取措施以减少由于溶剂排放而对环境的影响,这进一步增加了成本。
先前报道的从莱鲍迪甙A和甜菊苷的混合物中纯化莱鲍迪甙A的工作需要许多重复的纯化步骤。美国专利No.5,962,678公开了使用无水甲醇溶液对莱鲍迪甙A进行重结晶以获得纯度为80%的莱鲍迪甙A。通过多次重复用无水甲醇重结晶,莱鲍迪甙A的纯度可以提高至超过95%。美国专利公开No.2006/0083838公开了通过用包含乙醇和4%-15%水的溶剂重结晶来纯化莱鲍迪甙A。日本专利申请No.55-23756公开了一种通过从乙醇水溶液(>70%)中结晶来纯化莱鲍迪甙A和甜菊苷的方法,以获得纯度为80%的莱鲍迪甙A。美国专利公开No.2007/0082103公开了一种通过从乙醇水溶液中重结晶来纯化莱鲍迪甙A的方法,从粗制莱鲍迪甙(60%)进行两步重结晶导致以97%的产率形成纯度>98%的莱鲍迪甙。WO2007/149672和WO2011/082288公开了使用有机溶剂的单步结晶方法。
然而,这些现有技术方法不能仅使用单一重结晶步骤来提供能够满足当前JECFA标准的基本上纯的甜菊醇糖苷组合物或具有足够纯度的莱鲍迪甙A组合物,并且通常需要使用色谱和有机溶剂。此外,尚未报道这种回收方法与莱鲍迪甙M的纯化有关。
因此,需要简单、有效且经济的制备基本上纯的甜菊醇糖苷组合物的方法,理想的是所述方法减少对色谱的需要和/或有机溶剂的使用。
发明概述
本发明基于以下发现:莱鲍迪甙M(rebM)可以从包含该甜菊醇糖苷的水溶液中直接结晶。这种直接结晶允许在单一单元操作中潜在地获得高纯度rebM组合物,例如基本上纯的rebM组合物,通常不需要吸附色谱(也称为“结合洗脱色谱”)且/或不需要使用有机溶剂。
因此,本发明满足了以下需要:提供纯化包含rebM的甜菊醇糖苷组合物的方法,以获得具有更高纯度rebM的组合物,优选以高产率获得具有更高纯度rebM的组合物。
因此,本发明提供了一种纯化莱鲍迪甙M的方法,所述方法包括:
(a)提供包含莱鲍迪甙M的溶液,其中莱鲍迪甙M的浓度为至少约10g/L,莱鲍迪甙M的纯度为以干基计至少约10重量%;和
(b)从所述溶液中结晶出包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物,
从而纯化莱鲍迪甙M。
本发明还提供了:
-一种纯化莱鲍迪甙M的方法,所述方法包括基本上在不存在有机溶剂的情况下纯化莱鲍迪甙M,
-一种纯化莱鲍迪甙M的方法,所述方法包括在不存在吸附色谱步骤的情况下纯化莱鲍迪甙M,和
-一种组合物,所述组合物包含通过前述权利要求中任一项所述的方法能够获得的莱鲍迪甙M。
附图简介
图1示出了甜菊醇糖苷的直接结晶回收方法。
图2和图3示出了导致甜菊醇糖苷生物合成的潜在通路的示意图。
发明详述
在本说明书和所附权利要求书中,词语“包含”、“包括”和“具有”以及变化形式应被解释为包含性的。也就是说,这些词语意图表达在上下文允许的情况下可包含未具体叙述的其他要素或整数。
不使用数量词修饰时在本文中用于指代一个或一个以上(即一个或至少一个)的语法对象。举例来说,“要素”可意指一个要素或多于一个要素。
甜菊醇糖苷组合物可被用作天然高效甜味剂。rebM是可以以不同的量存在于甜菊醇糖苷组合物中的甜菊醇糖苷之一。通常,在植物来源的提取物中仅发现痕量的rebM,但它可以在发酵来源的甜菊醇糖苷组合物中以较高的量存在。
随着甜菊醇糖苷组合物中总rebM的量增加,组合物的成本也进一步提高。
因此,需要提供以经济的方式制备包含高纯度rebM的组合物的方法。
特别地,需要提供以经济的方式制备具有高纯度rebM的基本上纯的甜菊醇糖苷组合物的方法。
本发明通过提供下述方法满足了这种需要,所述方法用于将包含较低纯度rebM的组合物纯化为包含较高纯度rebM的组合物,例如包含基本上纯的rebM的组合物。
本文中关于给定的莱鲍迪甙例如rebM所使用的纯度表示:以干基计,给定组合物中该莱鲍迪甙的重量百分比。
在本发明的方法中,提供了较低纯度的rebM溶液,其可以直接结晶以获得更高纯度的甜菊醇糖苷组合物。该方法通常不需要使用吸附色谱,也不需要使用有机溶剂。
也就是说,本发明的方法通常是这样的方法,其中通过从水中直接结晶rebM而从包含低纯度rebM的组合物获得包含高纯度rebM的组合物。
因此,本发明涉及:
-一种纯化rebM的方法,所述方法包括基本上在不存在有机溶剂的情况下纯化rebM,
-一种纯化rebM的方法,所述方法包括在不存在吸附色谱步骤的情况下纯化rebM。
因此,本发明涉及一种纯化莱鲍迪甙M的方法,所述方法包括:
(a)提供包含莱鲍迪甙M的溶液,其中莱鲍迪甙M的浓度为至少约10g/L,莱鲍迪甙M的纯度为以干基计至少约10重量%;和
(b)从所述溶液中结晶出包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物,
从而纯化莱鲍迪甙M。
也就是说,本发明的方法允许纯化包含低纯度rebM(例如以干基计纯度为至少约10重量%的rebM)的甜菊醇糖苷组合物(本文中的“低纯度组合物”或“低纯度溶液”),使得所产生的甜菊醇糖苷组合物包含高纯度的rebM(本文中的“高纯度组合物”),例如以干基计至少约60%重量的rebM。
图1说明了可以实施本发明方法的一种方式。
所述方法可包括浓缩步骤。因此,本发明涉及一种纯化莱鲍迪甙M的方法,所述方法包括:
(a)提供包含莱鲍迪甙M的溶液,其中莱鲍迪甙M的浓度为至少约10g/L,莱鲍迪甙M的纯度为以干基计至少10重量%;
(b)浓缩所述溶液以获得包含浓度为至少约80g/L的莱鲍迪甙M的溶液;和
(c)从所述溶液中结晶出包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物,
从而纯化莱鲍迪甙M。
低纯度溶液中rebM的浓度可以为至少约10g/L,例如至少约15g/L,例如至少约30g/L,例如至少约40g/L。
可将步骤(a)中的溶液浓缩,使得溶液中的rebM浓度至少提高至约50g/L、至少约100g/L、至少约150g/L、至少约200g/L、至少约250g/L或至少约300g/L或更高。
步骤(a)中的溶液的rebM纯度可以为以干基计至少约10重量%,例如以干基计至少约15重量%,例如以干基计至少约20重量%,例如以干基计至少约30重量%,例如以干基计至少约40重量%,例如以干基计至少约50重量%或更高。
可以使用上述浓度和纯度的任何组合来限定用于该方法的合适的低纯度溶液。
例如,步骤(a)中的溶液可以具有10g/L的rebM浓度和以干基计15重量%或20重量%的纯度。
步骤(a)中的溶液可以是从甜叶菊植物中提取的原始形式的粗制甜菊醇糖苷组合物。或者,所述溶液可包含通过甜菊醇或甜菊醇糖苷的酶促转变而形成的甜菊醇糖苷。但优选地,这种溶液是发酵产生的甜菊醇糖苷组合物。也就是说,溶液可以是包含通过发酵产生的甜菊醇糖苷的组合物。
因此,包含rebM的步骤(a)中的溶液可以是从Stevia rebaudiana植物获得的溶液或者通过甜菊醇和/或甜菊醇糖苷的酶促转变而获得的溶液。然而,优选地,这种溶液可以是源自甜菊醇糖苷的发酵产生的溶液(参见,例如,WO2015/007748)。
因此,包含rebM的步骤(a)中的溶液可以是发酵液或可以是源自发酵液的溶液,即由能够将碳源转变为rebM的生物体产生。
如果使用包含rebM的发酵产生的甜菊醇糖苷组合物,则可以进行一个或多个回收步骤以在步骤(a)中提供包含rebM的溶液。例如,可以使用固液分离步骤,例如通过离心,以从培养液中分离细胞。任选地,固液分离之后可以进行澄清步骤。
可以提供其中rebM的浓度低于约10g/L的包含rebM的溶液,随后浓缩该溶液以提供包含浓度为至少约10g/L的rebM的溶液。本文描述了合适的浓缩技术。
步骤(a)中包含rebM的溶液通常包含其他甜菊醇糖苷和杂质。RebM可占总甜菊醇糖苷的约70%至75%。其他杂质(例如未消化的糖、蛋白质和盐)可占总干物质的约50%至约60%。
本发明的方法可导致制备下述高纯度组合物,所述高纯度组合物包含rebM的纯度为以干基计至少约60重量%,例如以干基计至少约70重量%,例如以干基计至少约80重量%或更高,例如以干基计至少约90重量%或更高,例如以干基计至少约95%重量%或更高,或甚至更高的纯度。
包含rebM的基本上纯的组合物可包含纯度为以干基计至少约95重量%,例如以干基计至少约98重量%,例如至少约95重量%或更高,或甚至更高纯度的rebM。
在本发明的方法中,包含rebM的高纯度组合物可包含一种或多种其他甜菊醇糖苷。因此,包含rebM的高纯度组合物可包含的rebM的量为总甜菊醇糖苷的以干基计至少约70重量%,例如以干基计至少约80重量%或更多,例如以干基计至少约90重量%或更多,例如以干基计至少约95重量%或至少约98%重量。
根据本发明的方法产生的包含rebM的高纯度组合物通常可包含以干基计不超过约150ppm的贝壳杉烯酸(kaurenoic acid)和/或贝壳杉烯酸等价物,例如以干基计不超过约100ppm的贝壳杉烯酸和/或贝壳杉烯酸等价物,例如以干基计不超过约50ppm的贝壳杉烯酸和/或贝壳杉烯酸等价物。
根据本发明的方法产生的包含rebM的高纯度组合物通常可包含以干基计不超过约2%的甜菊苷。
浓缩(如果使用的话)可以通过任何方便的方法进行。通常,任何浓缩步骤都不包括色谱以浓缩期望甜菊醇糖苷的量。也就是说,本发明的方法通常是不使用吸附色谱的方法,即不存在吸附色谱步骤的方法。吸附色谱有时称为结合洗脱色谱。
浓缩步骤(如果使用的话)可包括:
超滤和纳滤(nanofiltration)的组合;
蒸发;
和/或在步骤(a)中喷雾干燥溶液,然后再溶解喷雾干燥的材料。
浓缩步骤可包括(i)超滤和纳滤;和/或(ii)蒸发,例如超滤和纳滤的组合,随后是蒸发。
超滤可以利用膜进行,其中膜的截留值为约3kDa至约15kDa,例如约10kDa。
纳滤可以利用膜进行,其中膜的硫酸钠标称保留(nominal retention)高于90%。
在本发明的方法中,包含rebM的高纯度组合物可优选从水溶液中结晶。也就是说,包含rebM的高纯度组合物可从包含较低纯度rebM的水溶液中结晶。出于本发明的目的,水溶液是基本上不含有机溶剂的水溶液。因此,水溶液可以是基本上唯一的溶剂是水的水溶液(即,可以存在少量或痕量的其他溶剂,例如约2%或更少的一种或多种有机溶剂,例如约1%或更少的一种或多种有机溶剂)。
结晶可以是单步结晶。
因此,本发明的方法可以基本上在不存在有机溶剂的情况下进行。
在本发明的方法中,可以用足以促进rebM结晶的量的rebM在步骤(a)中的溶液或浓缩溶液(如果使用浓缩步骤的话)中播种(seeded)。
本发明的方法可包括分离和洗涤包含rebM的高纯度组合物。这些步骤可以基本上在不存在任何有机溶剂的情况下进行。
本发明的方法可包括干燥包含rebM的高纯度组合物。
本发明的方法可包括一个或多个进一步的纯化结晶步骤(例如精(polish)结晶)以除去另外的杂质。所述另外的步骤可以使用水或在一种或多种有机溶剂的存在下进行。
因此,本发明的方法可以是基本上在不存在任何有机溶剂的情况下进行所有结晶步骤的方法。
本发明的优选方法是这样的方法,其中不使用吸附色谱步骤,并且其中一个或多个结晶步骤基本上在不存在任何有机溶剂的情况下进行,例如在水中进行。在这样的方法中,可完全不使用有机溶剂,例如在任何分离或洗涤步骤中可完全不使用有机溶剂,其中可以使用水。
所得到的包含rebM的高纯度组合物的组成和产率可以通过适当选择参数来控制,所述参数例如进行浓缩的方式(如果使用该步骤的话)、溶液温度、沉淀温度、混合时间、沉淀时间、pH和溶液的播种。
使低纯度溶液或该溶液的浓缩形式结晶的方法可以在任何合适的温度下进行。这样的温度通常可以为约20℃至约85℃,例如约75℃。
特别地,低纯度溶液或该溶液的浓缩形式的结晶可进一步包括冷却所述低纯度溶液或浓缩物。通常,可以将低纯度溶液或浓缩物冷却至适合于rebM沉淀的温度(“沉淀温度”)。
所述沉淀温度的实例可以是约4℃至约65℃、约15℃至约45℃或其间的任何温度。
低纯度甜菊醇糖苷溶液的结晶可进行足够长的时间(“沉淀时间”或“冷却时间”),以从低纯度甜菊醇糖苷溶液获得期望产率的基本上纯的甜菊醇糖苷组合物。例如,在特定实施方式中,低纯度甜菊醇糖苷溶液的结晶可进行约0.5小时至约120小时(5天)、约12小时至约96小时(4天)、约24小时(1天)至约72小时(3天)、约48小时(2天)或其间的任何时间长度。
结晶后,可以获得包含较高纯度rebM的组合物,例如包含基本上纯的rebM的组合物。
较高纯度的甜菊醇糖苷组合物的总产率可以为至少约20%,例如至少约25%,例如至少约30%。本文中使用的产率通常是指相对于起始质量获得的质量。
本发明的方法可进一步包括在低纯度甜菊醇糖苷溶液的结晶开始后播种低纯度甜菊醇糖苷溶液。播种通常可以在与允许进行结晶的温度相同的温度下进行。例如,在约20℃至约85℃的温度、例如约75℃的温度下进行播种。
低纯度甜菊醇糖苷溶液的播种通常可以通过以足以促进rebM沉淀的量向所述低纯度溶液或浓缩物中加入基本上纯的rebM晶体来进行。
本发明的方法可进一步包括在结晶后分离并洗涤较高纯度的甜菊醇糖苷组合物。可通过利用离心力的各种固液分离技术将较高纯度的甜菊醇糖苷组合物与其上清液(有机溶剂和杂质)分离,所述固液分离技术包括但不限于垂直和水平的多孔篮式离心机、无孔转鼓离心机、沉降式离心机、刮刀式离心机、推料式离心机、海因克尔型离心机、碟片式离心机和漩涡分离。另外,可通过任何压力、真空或重力过滤方法来增强分离,所述方法包括但不限于使用带、鼓、Nutsche式、叶片、板、罗森蒙德式、Sparkler式和袋式过滤器以及压滤机。固液分离装置的操作可以是连续模式、半连续模式或分批模式。也可使用水、多种有机溶剂及其混合物在分离装置上洗涤较高纯度的甜菊醇糖苷组合物,并可使用任何数量的气体(包括但不限于氮气或氩气)在分离装置上部分或完全干燥以蒸发残余的液体。可以使用液体、气体或机械方法,通过溶解固体或保持固体形式,从分离装置中自动或手动移除较高纯度的甜菊醇糖苷组合物。
本发明的方法可进一步包括干燥较高纯度的甜菊醇糖苷组合物。用于干燥这种组合物的合适方法是本领域技术人员已知的,包括但不限于使用旋转式真空干燥器、流化床干燥器、旋转式隧道式干燥器、板式干燥器、盘架干燥器、Nauta式干燥器、喷雾干燥器、闪蒸干燥机、微米干燥机、盘式干燥机、高低速桨式干燥机和微波干燥机。在一个示例性实施方式中,在约40℃至约60℃的温度范围内,使用氮气或氩气吹扫干燥较高纯度的甜菊醇糖苷组合物持续约5小时至约5天、约1天至约4天、约2天至约3天或其间的任何时间长度,以除去残余溶剂。
如果期望进一步纯化,则可以重复纯化低纯度溶液的方法,或者可以进一步纯化较高纯度的组合物,例如,通过离子交换色谱来进行。
总甜菊醇糖苷通常包含一种或多种选自以下的甜菊醇糖苷:莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙F、甜菊苷、杜克苷A、甜茶苷和甜菊双糖苷。
可以使用本领域普通技术人员已知的方法测量组合物的纯度。一种这样的方法包括高效液相色谱(HPLC)。本领域普通技术人员还应该理解,样品中的水分可能影响纯度测量的准确度。因此,测量纯度时,组合物应是基本上干燥的。在本文中使用时,“基本上干燥的组合物”和“以干基计”可互换使用,并且可包含至多约10%重量的水分。
本发明中使用的rebM溶液可以是发酵产生的,例如可以是发酵液或源自发酵液的溶液。这种rebM溶液可源自能够生产甜菊醇糖苷的重组宿主。
因此,合适的重组宿主可能够生产rebM。
合适的重组宿主可包含编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)活性的一种或多种多肽的一种或多种重组核酸序列。
出于本发明的目的,具有UGT活性的多肽是具有糖基转移酶活性(EC 2.4)的多肽,即可以充当催化剂以将单糖单元从活化的核苷酸糖(又称“糖基供体”)转移到糖基受体分子(通常是醇)的多肽。UGT的糖基供体典型地是核苷酸糖尿苷二磷酸葡萄糖(尿嘧啶-二磷酸葡萄糖,UDP-葡萄糖)。
可以选择这种另外的UGT以产生期望的甜菊醇糖苷。Humphrey等人,PlantMolecular Biology(2006)61:47-62和Mohamed等人,J.Plant Physiology 168(2011)1136-1141中示出了甜菊醇糖苷形成的示意图。另外,图2和图3示出了甜菊醇糖苷形成的示意图。
因此,重组宿主可包含一个或多个编码以下一项或多项的重组核酸序列:
(i)具有UGT74G1活性的多肽;
(ii)具有UGT2活性的多肽;
(ii)具有UGT85C2活性的多肽;和
(iii)具有UGT76G1活性的多肽。
重组宿主可包含编码能够催化向甜菊醇添加C-13-葡萄糖的多肽的核苷酸序列。也就是说,适用于本发明方法的重组酵母可包含能够催化将甜菊醇转化为甜菊醇单糖苷的反应的UGT。
这种重组宿主可包含编码具有由UDP-糖基转移酶(UGT)UGT85C2所示活性的多肽的核苷酸序列,其中酵母转化后所述核苷酸序列赋予所述酵母将甜菊醇转化为甜菊醇单糖苷的能力。
UGT85C2活性是将葡萄糖单元转移至甜菊醇的13-OH。因此,合适的UGT85C2可充当尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇13-OH转移酶和尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇-19-O-葡糖苷13-OH转移酶。功能性UGT85C2多肽还可催化葡糖基转移酶反应,所述反应利用除甜菊醇和甜菊醇-19-O-葡糖苷以外的甜菊醇糖苷底物。此类序列在本文中可被称为UGT1序列。
重组宿主可以包含编码具有UGT2活性的多肽的核苷酸序列.
具有UGT2活性的多肽是充当尿苷5'-二磷酸葡萄糖基:甜菊醇-13-O-葡糖苷转移酶(又称甜菊醇-13-单葡萄糖苷1,2-转葡萄糖基酶)的多肽,其将葡萄糖部分转移到受体分子甜菊醇-13-O-葡糖苷的13-O-葡萄糖的C-2'。通常,合适的UGT2多肽还充当将葡萄糖部分转移到受体分子甜茶苷的13-O-葡萄糖的C-2'的尿苷5'-二磷酸葡萄糖基:甜茶苷转移酶。
具有UGT2活性的多肽也可以催化利用除甜菊醇-13-O-葡糖苷和甜茶苷以外的甜菊醇糖苷底物的反应,例如,功能性UGT2多肽可利用甜菊苷作为底物,从而将葡萄糖部分转移至19-O-葡萄糖残基的C-2'以产生莱鲍迪甙E。功能性UGT2多肽也可以利用莱鲍迪甙A作为底物,从而将葡萄糖部分转移至19-O-葡萄糖残基的C-2'以产生莱鲍迪甙D。然而,功能性UGT2多肽通常不将葡萄糖部分转移至在C-13位具有1,3-结合的葡萄糖的甜菊醇化合物,即将葡萄糖部分转移至甜菊醇1,3-双糖苷和1,3-甜菊苷通常不会发生。
具有UGT2活性的多肽也可以从除尿苷二磷酸葡萄糖以外的供体转移糖部分。例如,具有UGT2活性的多肽充当尿苷5'-二磷酸D-木糖基:甜菊醇-13-O-葡糖苷转移酶,其将木糖部分转移至受体分子甜菊醇-13-O-葡糖苷的13-O-葡萄糖的C-2'。作为另一个实例,具有UGT2活性的多肽可充当尿苷5'-二磷酸L-鼠李糖基:甜菊醇-13-O-葡糖苷转移酶,其将鼠李糖部分转移至受体分子甜菊醇的13-O-葡萄糖的C-2'。
重组宿主可以包含编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列,可以包含编码能够催化将C-19-葡萄糖添加到甜菊双糖苷的多肽的核苷酸序列。也就是说,重组宿主可以包含能够催化将甜菊双糖苷转化为甜菊苷的反应的UGT。因此,这种重组宿主可能够将甜菊双糖苷转化为甜菊苷。这种核苷酸序列的表达可以赋予重组酵母产生至少甜菊苷的能力。
因此,重组宿主可以还包含编码具有由UDP-糖基转移酶(UGT)UGT74G1所示活性的多肽的核苷酸序列,其中转化酵母后所述核苷酸序列赋予细胞将甜菊双糖苷转化为甜菊苷的能力。
合适的UGT74G1多肽可以能够将葡萄糖单元分别转移至甜菊醇的13-OH或19-COOH。合适的UGT74G1多肽可充当尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇19-COOH转移酶和尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇-13-O-葡糖苷19-COOH转移酶。功能性UGT74G1多肽还可催化使用除甜菊醇和甜菊醇-13-O-葡糖苷以外的甜菊醇糖苷底物,或者从除尿苷二磷酸葡萄糖以外的供体转移糖部分的糖基转移酶反应。此类序列在本文中可被称为UGT3序列。
重组宿主可包含编码能够催化甜菊苷的C-13位置处的葡萄糖的C-3'的葡糖基化的多肽的核苷酸序列。也就是说,适用于本发明方法的重组酵母可包含UGT,所述UGT能够催化甜菊苷转化为莱鲍迪甙A的反应。因此,这种重组酵母可以能够将甜菊苷转化为莱鲍迪甙A。这种核苷酸序列的表达可赋予酵母产生至少莱鲍迪甙A的能力。
因此,重组宿主可以还包含编码具有由UDP-糖基转移酶(UGT)UGT76G1所示活性的多肽的核苷酸序列,其中转化后所述核苷酸序列赋予酵母将甜菊苷转化为莱鲍迪甙A的能力。
合适的UGT76G1向受体分子甜菊醇1,2糖苷的C-13-O-葡萄糖的C-3'添加葡萄糖部分。因此,UGT76G1例如充当尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇13-O-1,2葡糖苷C-3'葡糖基转移酶和尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇-19-O-葡萄糖、13-O-1,2双糖苷C-3'葡糖基转移酶。功能性UGT76G1多肽还可催化葡糖基转移酶反应,所述反应使用含有除葡萄糖以外的糖的甜菊醇糖苷底物,例如甜菊醇鼠李糖苷和甜菊醇木糖苷。此类序列在本文中可被称为UGT4序列。UGT4可以替代地或者另外地能够将RebD转化为RebM。
重组宿主通常包含编码至少一种具有UGT1活性的多肽、至少一种具有UGT2活性的多肽、至少一种具有UGT3活性的多肽和至少一种具有UGT4活性的多肽的核苷酸序列。这些核酸序列中的一种或多种可以是重组的。给定的核酸可以编码具有一种或多种上述活性的多肽。例如,核酸编码具有两种、三种或四种上述活性的多肽。优选地,用于本发明方法的重组酵母包含UGT1、UGT2和UGT3以及UGT4活性。合适的UGT1、UGT2、UGT3和UGT4序列在WO2015/007748的表1中进行了描述。
重组宿主可包含两种或更多种编码具有任何一种UGT活性(例如UGT1、UGT2、UGT3或UGT4活性)的多肽的核酸序列。当重组宿主包含两种或更多种编码具有任何一种UGT活性的多肽的核酸序列时,这些核酸序列可以相同或不同,和/或可以编码相同或不同的多肽。特别地,重组宿主可包含编码两种不同UGT2多肽的核酸序列。
重组宿主可以包含一个或多个编码以下一项或多项的重组核苷酸序列:
具有对映-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽;
具有对映-贝壳杉烯合酶活性的多肽;
具有对映-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽;以及
具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽。
出于本发明的目的,具有对映-柯巴基焦磷酸合酶(EC 5.5.1.13)的多肽能够催化化学反应:
所述酶具有一种底物,香叶基香叶基焦磷酸;以及一种产物,对映-柯巴基焦磷酸。所述酶参与赤霉素的生物合成。所述酶属于异构酶家族,特别是分子内裂解酶的类别。所述酶类别的系统名称是对映-柯巴基-二磷酸裂解酶(脱环)。通常使用的其他名称包括具有对映-柯巴基焦磷酸合酶、对映-贝壳杉烯合酶A和对映-贝壳杉烯合成酶A。
编码对映-柯巴基焦磷酸合酶的合适核酸序列可例如包含WO2015/007748的SEQID.NO:1、3、5、7、17、19、59、61、141、142、151、152、153、154、159、160、182或184中列出的序列。
出于本发明的目的,具有对映-贝壳杉烯合酶活性(EC 4.2.3.19)的多肽是能够催化以下化学反应的多肽:
对映-柯巴基二磷酸对映-贝壳杉烯+二磷酸
因此,所述酶具有一种底物,对映-柯巴基二磷酸;以及两种产物,对映-贝壳杉烯和二磷酸。
所述酶属于裂解酶家族,特别是作用于磷酸盐/酯的碳-氧裂解酶。所述酶类别的系统名称是对映-柯巴基二磷酸二磷酸-裂解酶(环化,对映-贝壳杉烯形成)。常用的其它名称包括对映-贝壳杉烯合酶B、对映-贝壳杉烯合成酶B、对映-柯巴基-二磷酸二磷酸-裂解酶和(环化)。所述酶参与双萜类生物合成。
编码对映-贝壳杉烯合酶的合适核酸序列可例如包含WO2015/007748的SEQID.NO:9、11、13、15、17、19、63、65、143、144、155、156、157、158、159、160、183或184中列出的序列。
对映-柯巴基二磷酸合酶还可具有与相同蛋白质分子相关联的不同对映-贝壳杉烯合酶活性。由对映-贝壳杉烯合酶催化的反应是赤霉素的生物合成途径中的下一步骤。两种类型的酶活性是不同的,并且定点诱变以抑制蛋白质的对映-贝壳杉烯合酶活性导致对映-柯巴基焦磷酸的积累。
因此,本发明的重组宿主中使用的单个核苷酸序列可编码具有对映-柯巴基焦磷酸合酶活性和对映-贝壳杉烯合酶活性的多肽。或者,两种活性可由两个不同的分离的核苷酸序列编码。
出于本发明的目的,具有对映-贝壳杉烯氧化酶活性(EC 1.14.13.78)的多肽是能够催化对映-贝壳杉烯的4-甲基的三次连续氧化以产生贝壳杉烯酸的多肽。这种活性通常需要细胞色素P450的存在。
编码对映-贝壳杉烯氧化酶的合适核酸序列可例如包括WO2015/007748的SEQID.NO:21、23、25、67、85、145、161、162、163、180或186中列出的序列。
出于本发明的目的,具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性(EC 1.14.13)的多肽是能够催化使用NADPH和O2形成甜菊醇(对映-贝壳杉-16-烯-13-醇-19-酸)的多肽。这种活性也可称为对映-贝壳杉烯酸13-羟化酶活性。
编码贝壳杉烯酸13-羟化酶的合适核酸序列可例如包括WO2015/007748的SEQID.NO:27、29、31、33、69、89、91、93、95、97、146、164、165、166、167或185中列出的序列。
重组宿主可包含编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的重组核酸序列。也就是说,本发明的重组宿主可能够表达编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的核苷酸序列。出于本发明的目的,具有NADPH-细胞色素P450还原酶活性(EC1.6.2.4;也称为NADPH:高铁血红蛋白氧化还原酶、NADPH:血红素蛋白氧化还原酶、NADPH:P450氧化还原酶、P450还原酶、POR、CPR、CYPOR)的多肽通常是一种这样的多肽,其为膜结合酶,允许电子从含有FAD和FMN的酶NADPH:细胞色素P450还原酶(POR;EC 1.6.2.4)转移至真核细胞的微粒体中的细胞色素P450。
在重组宿主中,可上调宿主产生香叶基香叶基二磷酸(GGPP)的能力。在本发明的上下文中,上调意味着重组宿主比等同的非重组宿主产生更多的GGPP。
因此,重组宿主可包含编码羟甲基戊二酰基-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合成酶和香叶基香叶基二磷酸合酶的一个或多个核苷酸序列,由此宿主转化后所述核苷酸序列赋予宿主产生提高水平的GGPP的能力。因此,根据本发明的重组宿主可包含编码羟甲基戊二酰基-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合成酶和香叶基香叶基二磷酸合酶中的一种或多种的一个或多个重组核酸序列。
因此,重组宿主可包含编码以下中的一种或多种的核酸序列:
具有羟甲基戊二酰基-辅酶A还原酶活性的多肽;
具有法尼基-焦磷酸合成酶活性的多肽;和
重组宿主可以是例如多细胞生物或其细胞或单细胞生物。宿主可以是原核、古细菌或真核宿主细胞。
原核宿主细胞可以是但不限于细菌宿主细胞。真核宿主细胞可以是但不限于酵母、真菌、变形虫、藻类、动物、昆虫宿主细胞。
真核宿主细胞可以是真菌宿主细胞。“真菌”包括真菌(Eumycotina)亚门的所有物种(Alexopoulos,C.J.,1962,在Introductory Mycology,JohnWiley&Sons,Inc.(约翰威立出版有限公司),纽约)。因此,术语真菌包括丝状真菌和酵母等等。
“丝状真菌”在本文中定义为真核微生物,其包括真菌和卵菌亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995,同上所定义)。丝状真菌是以由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖以及其它复合多糖构成的菌丝壁为特征。营养体生长是通过菌丝延长,并且碳代谢是专性需氧的。丝状真菌菌株包括但不限于以下各项的菌株:枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、伞菌属(Agaricus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、棒囊壳属(Corynascus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、网孢菌属(Filibasidium)、镰孢菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻瘟病菌属(Magnaporthe)、红曲霉属(Monascus)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、被孢霉属(Mortierella)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、平革菌属(Phanerochaete)、柄孢壳菌属(Podospora)、密孔菌属(Pycnoporus)、根霉菌属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、粪壳菌属(Sordaria)、踝节菌属(Talaromyces)、篮状菌属(Rasmsonia)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)以及木霉属(Trichoderma)。可充当宿主细胞的优选丝状真菌菌株属于以下物种:黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、桔青霉(Penicillium citrinum)、枝顶孢霉(Acremonium chrysogenum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、埃默森篮状菌(Rasamsonia emersonii)(先前称为埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii))、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、鲁克文金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉(Myceliophtora thermophyla)。用于比较转化和未转化细胞的发酵特征的参考宿主细胞包括例如黑曲霉CBS120.49、CBS 513.88;米曲霉ATCC16868、ATCC 20423、IF0 4177、ATCC 1011、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC11601、ATCC12892;烟曲霉AF293(CBS101355);产黄青霉CBS 455.95;桔青霉ATCC 38065;产黄青霉P2;枝顶孢霉ATCC 36225、ATCC 48272;里氏木霉ATCC 26921、ATCC 56765、ATCC26921;酱油曲霉ATCC11906;鲁克文金孢子菌ATCC44006以及所有这些菌株的衍生株。作为丝状真菌宿主细胞特别优选的是黑曲霉CBS 513.88及其衍生株。
真核宿主细胞可以是酵母细胞。优选的酵母宿主细胞可选自以下属:酵母属(例如,酿酒酵母(S.cerevisiae)、贝酵母(S.bayanus)、巴斯德酵母(S.pastorianus)、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis))、酒香酵母属(Brettanomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)(例如,克鲁斯假丝酵母(C.krusei)、拉考夫假丝酵母(C.revkaufi)、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis))、伊萨酵母属(Issatchenkia)(例如,东方伊萨酵母(I.orientalis))、毕赤酵母属(Pichia)(例如,巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、管囊酵母属(Pachysolen)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、毛孢子菌属(Trichosporon)、耶氏酵母属(例如,解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)(先前分类为解脂假丝酵母(Candidalipolytica)))、Yamadazyma。
原核宿主细胞可以是细菌宿主细胞。细菌宿主细胞可以是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。细菌的实例包括但不限于,属于以下属的细菌:芽孢杆菌属(Bacillus)(例如,枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、潘蒂芽孢杆菌(B.puntis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus))、不动杆菌(Acinetobacter)、诺卡氏菌属(Nocardia)、黄杆菌属(Xanthobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如,大肠杆菌(例如,菌株DH 1OB、Stbl2、DH5-α、DB3、DB3.1)、DB4、DB5、JDP682和ccdA-over(例如,美国申请号09/518,188)))、链霉菌属(Streptomyces)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)(粘质沙雷氏菌(S.marcessans))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如,铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如,鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、伤寒沙门氏菌(S.typhi))。细菌还包括但不限于光合细菌(例如,绿色非硫细菌(例如,绿弯菌属(Choroflexus)细菌(例如橙黄绿弯菌(C.aurantiacus))、绿丝菌属(Chloronema)(例如,巨大绿丝菌(C.gigateum)))、绿色硫细菌(例如,绿菌属(Chlorobium)细菌(例如,泥生绿菌(C.limicola))、暗网菌属(Pelodictyon)(例如,微黄暗网菌(P.luteolum))、紫色硫细菌(例如,着色菌属(Chromatium)(例如,奥氏着色菌(C.okenii)))以及紫色非硫细菌(例如,红螺菌属(Rhodospirillum)(例如,深红红螺菌(R.rubrum))、红细菌属(Rhodobacter)(例如类球红细菌(R.sphaeroides)、荚膜红细菌(R.capsulatus))和红微菌属(Rhodomicrobium)细菌(例如万尼氏红微菌(R.vanellii)))。
宿主细胞可以是来自非微生物生物体的宿主细胞。此类细胞的实例包括但不限于昆虫细胞(例如,果蝇属(Drosophila)(例如,黑腹果蝇(D.melanogaster))、夜蛾属(Spodoptera)(例如,草地贪夜蛾(S.frugiperda)Sf9或Sf21细胞)和粉纹夜蛾属(Trichoplusa)(例如,High-Five细胞));线虫细胞(例如,秀丽线虫(C.elegans)细胞);禽类细胞;两栖动物细胞(例如,非洲爪蟾(Xenopus laevis)细胞);爬行动物细胞;以及哺乳动物细胞(例如NIH3T3、293、CHO、COS、VERO、C127、BHK、Per-C6、Bowes黑色素瘤和HeLa细胞)。
重组宿主可能够在本领域中已知的任何合适的碳源上生长,并且将其转化为甜菊醇糖苷。重组宿主可能够直接转化植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油。因此,优选的宿主表达酶如用于将纤维素转化成葡萄糖单体和将半纤维素转化成木糖和阿拉伯糖单体所需的纤维素酶(内切纤维素酶和外切纤维素酶)和半纤维素酶(例如内切和外切木聚糖酶、阿拉伯糖酶),能够将果胶转化成葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的果胶酶或将淀粉转化成葡萄糖单体的淀粉酶。优选地,宿主能够转化选自由以下各项组成的组的碳源:葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖和甘油。宿主细胞可例如是WO03/062430、WO06/009434、EP1499708B1、WO2006096130或WO04/099381中所描述的真核宿主细胞。
用于构建这种重组宿主的标准遗传技术(例如在宿主细胞中过表达酶、宿主细胞的遗传修饰或杂交技术)是本领域已知的方法,例如在Sambrook和Russel(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,或F.Ausubel等人编辑,"Current protocols inmolecular biology",Green Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)中所描述的。用于真菌宿主细胞的转化和遗传修饰的方法从例如EP-A-0 635 574、WO 98/46772、WO 99/60102和WO 00/37671、WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US 6,265,186中获知。
制备甜菊醇糖苷的方法可以包括发酵如本文所述的重组宿主,所述重组宿主能够在合适的发酵培养基中产生至少一种甜菊醇糖苷;以及任选地回收所述甜菊醇糖苷。
在用于产生甜菊醇糖苷的方法中使用的发酵培养基可以是允许特定真核宿主细胞生长的任何合适的发酵培养基。发酵培养基的基本要素是本领域的技术人员已知的,并且可适用于所选择的宿主细胞。
优选地,发酵培养基包含选自由以下各项组成的组的碳源:植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、果糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖、脂肪酸、甘油三酯和甘油。优选地,发酵培养基还包含氮源,如尿素;或铵盐,如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或磷酸铵。
根据本发明的发酵方法可以分批、分批补料或连续模式进行。也可应用单独的水解和发酵(SHF)方法或同时糖化和发酵(SSF)方法。这些发酵方法模式的组合对于最佳生产率来说也可以是可行的。如果在发酵方法中使用淀粉、纤维素、半纤维素或果胶作为碳源,则SSF方法可以是特别有吸引力的,其中可需要添加水解酶如纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶以水解底物。
在用于制备甜菊醇糖苷的方法中使用的重组宿主可以是如上文所定义的任何合适的重组宿主。在所述方法中使用根据本发明的重组真核重组宿主可以是有利的,因为大多数真核细胞不需要无菌条件用于繁殖,并且对噬菌体感染不敏感。此外,真核宿主细胞可在低pH下生长以防止细菌污染。
重组宿主可以是兼性厌氧微生物。兼性厌氧重组宿主可以需氧方式繁殖至高细胞浓度。然后可在高细胞密度下进行这种厌氧阶段,这显著地降低了所需的发酵体积并且可使需氧微生物污染的风险最小化。
用于产生根据本发明的甜菊醇糖苷的发酵方法可以是需氧或厌氧发酵方法。
厌氧发酵方法可在本文中定义为在不存在氧的情况下运行或者基本上不消耗氧(优选小于5、2.5或1mmol/L/h),并且其中有机分子充当电子供体和电子受体两者的发酵方法。根据本发明的发酵方法也可首先在需氧条件下运行,且随后在厌氧条件下运行。
发酵方法也可在限氧或微需氧条件下进行。或者,发酵方法可首先在需氧条件下运行,且随后在限氧条件下运行。限氧发酵方法是其中氧消耗受到从气体到液体的氧传递的限制的过程。氧限制的程度由进入气流的量和组成以及所用发酵设备的实际混合/传质特性决定。
在本发明方法中甜菊醇糖苷的产生可在宿主细胞的生长阶段期间、固定(稳定状态)阶段期间或在两个阶段期间发生。在不同的温度下运行发酵方法可以是可行的。
用于产生甜菊醇糖苷的方法可在对于重组宿主来说最佳的温度下进行。对于每种转化的重组宿主而言,最佳生长温度可不同并且是本领域的技术人员已知的。最佳温度可高于野生型生物的最适温度,以在非无菌条件下在最低感染敏感性和最低冷却成本的条件下使生物体有效生长。或者,所述方法可在对于重组宿主的生长来说不是最佳的温度下进行。
用于产生根据本发明的甜菊醇糖苷的方法可在任何合适的pH值下进行。如果重组宿主是酵母,则发酵培养基中的pH优选具有低于6、优选低于5.5、优选低于5、优选低于4.5、优选低于4、优选低于pH 3.5或低于pH 3.0或低于pH 2.5、优选高于pH 2的值。在这些低pH值下进行发酵的优点是可防止发酵培养基中污染性细菌的生长。
这种方法可在工业规模上进行。这种方法的产物是包含一种或多种甜菊醇糖苷(特别是至少rebM)的发酵液。然后可以根据本文所述的方法处理培养液。
本发明还涉及包含通过根据本发明的方法能够获得的莱鲍迪甙M的组合物(“本发明的组合物”)。
本发明的组合物可用于对于此类化合物来说已知的任何应用中。特别地,这种组合物可例如用作甜味剂,例如用于食品或饮料中。因此,根据本发明,提供了包含本发明的组合物的食品、饲料或饮料。
例如,本发明的组合物可被配制成软饮料、配制为桌面甜味剂、口香糖、乳制品如酸奶(例如原味酸奶)、蛋糕、谷物或基于谷类的食物、营养食品、药物、食用凝胶、糖果产品、化妆品、牙膏或其它口腔组合物等。此外,本发明的组合物可用作甜味剂,不仅用于饮料、食品和其它专门用于人消费的产品,而且用于具有改进的特性的动物饲料和草料中。
因此,本发明尤其提供了一种包含本发明的组合物的食品、饲料或饮料。
在食品、饮料、药物、化妆品、桌面产品、口香糖的制造过程中,可使用诸如混合、捏合、溶解、酸浸、渗透、渗滤、喷洒、雾化、灌注和其它方法的常规方法。
本发明的组合物可以干的形式或液体的形式使用。它可在食品热处理之前或之后加入。甜味剂的量取决于使用目的。它可单独添加或与其它化合物组合添加。
本发明的组合物可与一种或多种其它非热量或热量甜味剂掺混。这种掺混可用于改进风味或时间特征或稳定性。广泛范围的非热量和热量甜味剂均可适用于与本发明的组合物掺混。例如,非热量甜味剂如罗汉果苷、莫纳甜、阿斯巴甜、安赛蜜盐、环磺酸盐、三氯蔗糖、糖精盐或赤藓糖醇。适用于与本发明的甜菊醇糖苷或组合物掺混的热量甜味剂包括糖醇和碳水化合物如蔗糖、葡萄糖、果糖和HFCS。还可使用甜味氨基酸,如甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸。
本发明的组合物可与甜味剂抑制剂如天然甜味剂抑制剂组合使用。它可与鲜味增强剂如氨基酸或其盐组合。
本发明的组合物可与多元醇或糖醇、碳水化合物、生理活性物质或功能成分(例如类胡萝卜素、膳食纤维、脂肪酸、皂苷、抗氧化剂、营养食品、类黄酮、异硫氰酸酯、苯酚、植物甾醇或甾烷醇(植物甾醇和植物甾烷醇)、多元醇、益生元、益生菌、植物雌激素、大豆蛋白、硫化物/硫醇、氨基酸、蛋白质、维生素、矿物质和/或基于健康益处如心血管、降胆固醇或抗炎分类的物质组合。
本发明的组合物可包括调味剂、芳香组分、核苷酸、有机酸、有机酸盐、无机酸、苦味化合物、蛋白质或蛋白质水解产物、表面活性剂、类黄酮、收敛剂化合物、维生素、膳食纤维、抗氧化剂、脂肪酸和/或盐。
本发明的组合物可作为高强度甜味剂应用,以产生具有改进的味道特征的零卡路里、低卡路里或糖尿病人用饮料和食品。它也可用于不能使用糖的饮料、食品、药物和其他产品中。
此外,本发明的组合物可用作甜味剂,不仅用于饮料、食品和其它专门用于人消费的产品,而且用于具有改进的特性的动物饲料和草料中。
本发明的组合物可用作甜味化合物的产品的实例可以是酒精饮料,如伏特加酒、葡萄酒、啤酒、烈酒、清酒等;天然果汁、提神饮料、碳酸软饮料、减肥饮料、零卡路里饮料、低卡路里饮料和食物、酸奶饮料、速溶果汁、速溶咖啡、粉末型速溶饮料、罐装产品、糖浆、发酵大豆酱、酱油、醋、调味品、蛋黄酱、番茄酱、咖喱、汤、速食肉汤、酱油粉、醋粉、多种类型的饼干、香米饼、咸饼干、面包、巧克力、焦糖、糖果、口香糖、果冻、布丁、蜜饯和腌菜、鲜奶油、果酱、橘子酱、糖花膏、奶粉、冰淇淋、冰糕、包装在瓶中的蔬菜和水果、罐装和煮熟的豆类、在甜味酱中煮熟的肉和食物、农业蔬菜食品、海鲜、火腿、香肠、鱼火腿、鱼香肠、鱼酱、油炸鱼制品、干制海产品、冷冻食品、腌渍海带、腊肉、烟草、医药产品等。原则上它可具有无限应用。
甜味组合物包括饮料,其非限制性实例包括非碳酸饮料和碳酸饮料,如可乐、姜汁汽水、根汁汽水、苹果汁、水果味软饮料(例如柑橘味软饮料,如柠檬莱姆或橙汁)、软饮料粉等;来自水果或蔬菜的果汁、包括榨汁等的果汁、含有果粒的果汁、水果饮料、果汁饮料、含果汁的饮料、具有水果调味料的饮料、蔬菜汁、含蔬菜的汁以及含水果和蔬菜的混合果汁;运动饮料、能量饮料、接近水的饮料等(例如具有天然或合成调味剂的水);茶类或喜欢型饮料如咖啡、可可、红茶、绿茶、乌龙茶等;含乳成分饮料如乳饮料、含乳成分咖啡、牛奶咖啡、奶茶、果奶饮料、饮用酸奶、乳酸菌饮料等;以及乳制品。
通常,甜味组合物中存在的甜味剂的量取决于甜味组合物的具体类型及其所需的甜度而广泛变化。本领域的普通技术人员可容易确定加入到甜味组合物中的甜味剂的适当量。
在食品、饮料、药物、化妆品、桌面产品、口香糖的制造过程中,可使用诸如混合、捏合、溶解、酸浸、渗透、渗滤、喷洒、雾化、灌注和其它方法的常规方法。
因此,掺入了本发明的组合物的组合物可通过本领域的技术人员已知的提供成分的均匀或均质混合物的任何方法来制备。这些方法包括干混、喷雾干燥、团聚、湿法制粒、压实、共结晶等。
呈固体形式时,本发明的组合物可以适于递送到待甜化的食物中的任何形式提供给消费者,所述形式包括小袋、小包、散装袋或盒、方块、片剂、喷雾或可溶解的条。所述组合物可以单位剂量或散装形式递送。
对于液体甜味剂体系和组合物而言,应开发方便范围的流体、半流体、糊状和膏状形式、使用任何形状或形式的适当包装材料的适当包装,其便于携带或分配或储存或运输含有任何上述甜味剂产品或上述产生的产品的组合的任何组合。
本发明的组合物可包含多种填充剂、功能成分、着色剂、调味剂。
本发明的一些实施方式:
1.一种纯化莱鲍迪甙M的方法,所述方法包括:
(a)提供包含莱鲍迪甙M的溶液,其中莱鲍迪甙M的浓度为至少约10g/L,莱鲍迪甙M的纯度为以干基计至少约10重量%;和
(b)从所述溶液中结晶出包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物,
从而纯化莱鲍迪甙M。
2.根据实施方式1的纯化莱鲍迪甙M的方法,所述方法包括:
(a)提供包含莱鲍迪甙M的溶液,其中莱鲍迪甙M的浓度为至少约10g/L,莱鲍迪甙M的纯度为以干基计至少10重量%;
(b)浓缩所述溶液以获得包含浓度为至少约80g/L的莱鲍迪甙M的溶液;和
(c)从所述溶液中结晶出包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物,
从而纯化莱鲍迪甙M。
3.根据实施方式1或2所述的方法,其中所述包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物包含以干基计纯度高于约60重量%的莱鲍迪甙M。
4.根据实施方式3所述的方法,其中所述包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物包含以干基计纯度高于约90重量%的莱鲍迪甙M。
5.根据前述实施方式之任一所述的方法,其中所述包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物包含以干基计至少约98重量%的总甜菊醇糖苷。
6.根据前述实施方式之任一所述的方法,其中所述包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物包含以干基计不超过约150ppm的贝壳杉烯酸等价物。
7.根据前述实施方式之任一所述的方法,其中所述高纯度组合物包含以干基计不超过约2%的甜菊苷。
8.根据前述实施方式之任一所述的方法,其中所述浓缩步骤(b)不包括色谱以浓缩期望的甜菊醇糖苷的量。
9.根据实施方式2-8中任一项所述的方法,其中所述浓缩步骤(b)包括:
超滤和纳滤的组合;
蒸发;
和/或在步骤(a)中喷雾干燥所述溶液,然后再溶解喷雾干燥的材料。
10.根据前述实施方式之任一所述的方法,所述方法基本上在不存在有机溶剂的情况下进行。
11.根据前述实施方式之任一所述的方法,其中从水溶液中结晶出所述包含rebM的高纯度组合物。
12.根据前述实施方式之任一所述的方法,所述方法还包括用足以促进莱鲍迪甙M结晶的量的莱鲍迪甙M在包含莱鲍迪甙M的溶液中播种。
13.根据前述实施方式之任一所述的方法,所述方法还包括分离和洗涤所述包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物。
14.根据前述实施方式之任一所述的方法,所述方法还包括干燥所述包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物。
15.根据前述实施方式之任一所述的方法,其中进行进一步的纯化结晶。
16.根据前述实施方式之任一所述的方法,其中莱鲍迪甙M溶液包含发酵产生的莱鲍迪甙M。
17.一种纯化莱鲍迪甙M的方法,所述方法包括基本上在不存在有机溶剂的情况下纯化莱鲍迪甙M。
18.一种纯化莱鲍迪甙M的方法,所述方法包括在不存在吸附色谱步骤的情况下纯化莱鲍迪甙M。
19.根据前述实施方式之任一所述的方法,其中(a)中包含莱鲍迪甙M的溶液的莱鲍迪甙M浓度为至少约15g/L、至少约20g/L、至少约25g/L、至少约30g/L或至少约40g/L。
20.根据前述实施方式之任一所述的方法,其中(a)中包含rebM的溶液的莱鲍迪甙M纯度为以干基计至少约15重量%、以干基计至少约20重量%、以干基计至少约25%、以干基计至少约30%、以干基计至少约40%或以干基计至少约50%或更高。
21.一种组合物,其包含通过前述实施方式之任一所述的方法能够获得的莱鲍迪甙M。
在本文对专利文件或作为现有技术给出的其他材料的引用不应被认为承认该文件或材料是已知的或它包含的信息是任何这些权利要求的优先权日时公知常识的一部分。
在本文所述的每个参考文献的披露均通过引用以其全部内容并入本文。
本发明通过以下实施例来进一步说明:
实施例
实施例1:从水性流中直接结晶莱鲍迪甙M
使用WO2013/110673和WO2015/007748中所述的方法构建具有表1中所示基因型的Yarrowia lipolytica菌株STV2216。
表1.菌株STV2216的基因型。括号内指示菌株中存在的基因拷贝数
将Yarrowia lipolytica菌株在含有培养基的摇瓶中在30℃和220rpm下培养1天,所述培养基含有1%酵母提取物和3.6%甘油。
随后,用摇瓶预培养物接种种子发酵罐。种子发酵的矿质培养基基于Verduyn等人(Verduyn C,Postma E,Scheffers WA,Van Dijken JP.Yeast,1992年7月;8(7):501-517)。通过添加氨(10重量%)将pH控制在5.0。将温度控制在30℃。通过调节搅拌器速度将pO2控制在20%。
2天后从种子发酵罐中接种生产发酵罐。生产发酵的矿质培养基基于Verduyn等人(Verduyn C,Postma E,Scheffers WA,Van Dijken JP.Yeast,1992年7月;8(7):501-517)。分批阶段后,开始葡萄糖进料并保持培养液中的葡萄糖浓度有限。通过添加氨(10重量%)将pH控制在5.7。将温度控制在30℃。通过调节搅拌器速度将pO2控制在20%。
将培养液样品在水和33%乙腈中稀释,并用LC/MS分析。所得培养液中甜菊醇糖苷(SG)和贝壳杉烯酸糖苷(KAG)的组成如表2所示。
表2:发酵液的组成
如下处理实验室规模发酵后的发酵液:
-以4000×g离心30分钟;
-将上清液中的pH调节至3.5,并将上清液在70℃下加热30分钟;
-通过离心澄清加热的上清液;
-将澄清的上清液通过具有10kDa截留值的膜超滤;
-使用具有150-300Da截留值的膜对超滤后的渗透物进行纳滤。
纳滤渗余物中莱鲍迪甙M的浓度一超过30g/l,就观察到了莱鲍迪甙M自发开始结晶。使结晶过夜进行,通过真空过滤分离晶体,将晶体饼用2倍饼体积的水洗涤,并在真空烘箱中干燥。最终,从0.871kg NF渗余物中分离出了14.5g干燥的晶体。
晶体的组成如下表3所示。
表3.莱鲍迪甙M晶体的组成
组分 | 单位 | 值 |
灰分 | (%) | 0.09 |
Reb A | (%) | 4.8 |
Reb B | (%) | 0.6 |
Reb C | (%) | <LOD |
Reb D | (%) | 0.5 |
Reb E | (%) | <LOD |
Reb M | (%) | 95 |
甜菊苷 | (%) | 0.037 |
甜菊双糖苷 | (%) | 0.01 |
莱鲍迪甙G | (%) | <LOD |
甜茶苷 | (%) | 0.01 |
甜菊醇19单糖苷 | (%) | 0.0008 |
甜菊醇13单糖苷 | (%) | 0.01 |
甜菊醇 | (ppm) | 4 |
异甜菊醇 | (ppm) | <LOD |
贝壳杉烯酸 | (ppm) | <LOD |
贝壳杉烯酸19单葡萄糖苷 | (ppm) | <LOD |
贝壳杉烯酸19二葡萄糖苷 | (ppm) | <LOD |
贝壳杉烯酸19三葡萄糖苷 | (ppm) | <LOQ |
贝壳杉烯酸19四葡萄糖苷 | (ppm) | <LOD |
为了实现从KAG进一步纯化,如下所述将从发酵液产生的晶体从水溶液中重结晶。
将2.5g晶体在100ml水中的悬浮液加热至75℃,保持10分钟以溶解晶体。将溶液以10℃/h冷却至20℃并在该温度下孵育过夜。将形成的晶体真空过滤并用两倍饼体积的95%乙醇洗涤。
洗涤液的选择是因为莱鲍迪甙M在其中的溶解度低。将晶体在60℃下真空干燥过夜。该程序产生1.7g干燥的Reb-M晶体。通过LC-UV测定,晶体含有>95%Reb-M,所有KAG的水平均低于LC-MS的检测极限。
Claims (21)
1.一种纯化莱鲍迪甙M的方法,所述方法包括:
(a)提供包含莱鲍迪甙M的溶液,其中莱鲍迪甙M的浓度为至少约10g/L,莱鲍迪甙M的纯度为以干基计至少约10重量%;和
(b)从所述溶液中结晶出包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物,
从而纯化莱鲍迪甙M。
2.根据权利要求1的纯化莱鲍迪甙M的方法,所述方法包括:
(a)提供包含莱鲍迪甙M的溶液,其中莱鲍迪甙M的浓度为至少约10g/L,莱鲍迪甙M的纯度为以干基计至少10重量%;
(b)浓缩所述溶液以获得包含浓度为至少约80g/L的莱鲍迪甙M的溶液;和
(c)从所述溶液中结晶出包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物,
从而纯化莱鲍迪甙M。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物包含以干基计纯度高于约60重量%的莱鲍迪甙M。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物包含以干基计纯度高于约90重量%的莱鲍迪甙M。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物包含以干基计至少约98重量%的总甜菊醇糖苷。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物包含以干基计不超过约150ppm的贝壳杉烯酸等价物。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述高纯度组合物包含以干基计不超过约2%的甜菊苷。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述浓缩步骤(b)不包括色谱以浓缩期望的甜菊醇糖苷的量。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的方法,其中所述浓缩步骤(b)包括:
超滤和纳滤的组合;
蒸发;
和/或在步骤(a)中喷雾干燥所述溶液,然后再溶解喷雾干燥的材料。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,所述方法基本上在不存在有机溶剂的情况下进行。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中从水溶液中结晶出所述包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,所述方法还包括用足以促进莱鲍迪甙M结晶的量的莱鲍迪甙M在包含莱鲍迪甙M的溶液中播种。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,所述方法还包括分离和洗涤所述包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法,所述方法还包括干燥所述包含莱鲍迪甙M的高纯度组合物。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中进行进一步的纯化结晶。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中莱鲍迪甙M溶液包含发酵产生的莱鲍迪甙M。
17.一种纯化莱鲍迪甙M的方法,所述方法包括基本上在不存在有机溶剂的情况下纯化莱鲍迪甙M。
18.一种纯化莱鲍迪甙M的方法,所述方法包括在不存在吸附色谱步骤的情况下纯化莱鲍迪甙M。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中(a)中包含莱鲍迪甙M的溶液的莱鲍迪甙M浓度为至少约15g/L、至少约20g/L、至少约25g/L、至少约30g/L或至少约40g/L。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中(a)中包含莱鲍迪甙M的溶液的莱鲍迪甙M纯度为以干基计至少约15重量%、以干基计至少约20重量%、以干基计至少约25%、以干基计至少约30%、以干基计至少约40%或以干基计至少约50%或更高。
21.一种组合物,其包含通过前述权利要求中任一项所述的方法能够获得的莱鲍迪甙M。
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