CN105408339A - 高-纯度甜叶菊醇糖苷 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了制备高度纯化的甜叶菊醇糖苷，特别是莱苞迪苷A，D和M的方法。所述方法包括利用将各种起始组合物转变为目标甜叶菊醇糖苷的重组微生物。此外，随制备其的方法公开了新甜叶菊醇糖苷reb？D2及reb？M2。高度纯化的莱苞迪苷作为非-热量甜味剂在可食用和可咀嚼的组合物诸如任何饮料，糖果，面包产品，曲奇饼干和口香糖中有用。

Description

高-纯度甜叶菊醇糖苷
【技术领域】
本发明涉及制备包含甜叶菊醇糖苷的组合物，包括高度纯化的甜叶菊醇糖苷组合物的生物催化过程。本发明也涉及新甜叶菊醇糖苷，分离其的方法和新甜叶菊醇糖苷的用途。
【背景技术】
高强度甜味剂具有蔗糖的甜度水平的许多倍的甜度水平。它们基本上是非-热量的，及通常在膳食和减小的卡路里产品，包括食品和饮料中使用。高强度甜味剂不引发升胰岛素应答，使它们适合于在面向糖尿病患者和其他对于控制他们的碳水化合物摄入感兴趣的个体的产品中使用。
甜叶菊醇糖苷是在甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)，在南美洲的特定地区天然生长的紫莞科(Asteraceae)(菊科(Compositae))的多年生灌木的叶中发现的一类化合物。它们结构上表征为单碱基，甜叶菊醇，由在位置C13和C19碳水化合物残基的存在而不同。它们在甜叶菊属(Stevia)叶中蓄积，组成大致10％～20％的总干重。以干重计，在甜叶菊属(Stevia)的叶中发现的4种主要糖苷一般包括甜叶菊苷(9.1％)，莱苞迪苷A(3.8％)，莱苞迪苷C(0.6～1.0％)和卫矛醇苷A(0.3％)。其他知道的甜叶菊醇糖苷包括莱苞迪苷B，C，D，E，F和M，甜叶菊双糖苷和悬钩子苷。
尽管知道自甜叶菊(Steviarebaudiana)制备甜叶菊醇糖苷的方法，许多这些方法不合适于商业上使用。
因此，对于简单，有效和经济的制备包含甜叶菊醇糖苷的组合物，包括高度纯化的甜叶菊醇糖苷组合物的方法仍有需求。
此外，对于新甜叶菊醇糖苷和制备及分离其的方法仍有需求。
【发明概述】
本发明提供制备包含目标甜叶菊醇糖苷的组合物的生物催化过程，其通过使包含有机底物的起始组合物接触微生物和/或生物催化剂，由此产生包含目标甜叶菊醇糖苷的组合物。
起始组合物可为任何包含至少一个碳原子的有机化合物。在一实施方式中，起始组合物选自：多元醇或糖醇，各种碳水化合物。
目标甜叶菊醇糖苷可为任何甜叶菊醇糖苷。在一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷是甜叶菊醇单苷，甜叶菊双糖苷，悬钩子苷，卫矛醇苷B，卫矛醇苷A，莱苞迪苷B，莱苞迪苷G，甜叶菊苷，莱苞迪苷C，莱苞迪苷F，莱苞迪苷A，莱苞迪苷I，莱苞迪苷E，莱苞迪苷H，莱苞迪苷L，莱苞迪苷K，莱苞迪苷J，莱苞迪苷M，莱苞迪苷M2，莱苞迪苷D，莱苞迪苷D2，莱苞迪苷N，莱苞迪苷O或合成甜叶菊醇糖苷。
在一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷是甜叶菊苷。
在另一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷是莱苞迪苷A。
在再一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷是莱苞迪苷D。
在仍另一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷是莱苞迪苷M(也被称为莱苞迪苷X)。
微生物可为具有对于转变起始组合物为目标甜叶菊醇糖苷必需的酶任何微生物。
生物催化剂会包含用于转变起始组合物为目标甜叶菊醇糖苷的至少一种酶。
生物催化剂可位于微生物的表面上和/或在细胞内或可分泌到微生物外。
生物催化剂可为全细胞悬浮液，粗裂解物或纯化的酶。
生物催化剂可处于游离的形式或固定到由无机或有机材料制造的固体支持物。
对于转变起始组合物为目标甜叶菊醇糖苷必需的酶包括甜叶菊醇生物合成酶，UDP-糖基转移酶(UGT)和/或UDP-再循环酶。
在一实施方式中，甜叶菊醇生物合成酶包括甲羟戊酸(MVA)通路酶。
在另一实施方式中，甜叶菊醇生物合成酶包括非-甲羟戊酸2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸通路(MEP/DOXP)酶。
在一实施方式中，甜叶菊醇生物合成酶选自：牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶，柯巴基二磷酸合酶，贝壳杉烯合酶，贝壳杉烯氧化酶，贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)，甜叶菊醇合成酶，脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)，D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)，4-二磷酸胞苷基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)，4-二磷酸胞苷基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)，4-二磷酸胞苷基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(MCS)，l-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)，l-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶(HDR)，乙酰乙酰-CoA硫解酶，截短的HMG-CoA还原酶，甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶，细胞色素P450还原酶等。
UDP-葡萄糖基转移酶可为能向甜叶菊醇及或甜叶菊醇糖苷底物添加至少一个葡萄糖单元而提供目标甜叶菊醇糖苷的任何UDP-葡萄糖基转移酶。
在一实施方式中，甜叶菊醇生物合成酶和UDP-葡萄糖基转移酶在微生物中产生。微生物可为，例如，大肠埃希氏菌(E.coli)，糖酵母属(Saccharomycessp.)，曲霉属(Aspergillussp.)，毕赤酵母属(Pichiasp,)，芽孢杆菌属(Bacillussp.)，耶氏酵母属(Yarrowiasp.)等。在另一实施方式中，合成UDP-葡萄糖基转移酶。
在一实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶选自：UGT74G1，UGT85C2，UGT76G1，UGT91D2和与这些多肽以及编码这些UGT的分离的核酸分子具有实质性(>85％)同一性的UGT。
在一实施方式中，甜叶菊醇生物合成酶，UGT和UDP-葡萄糖再循环系统存在于一个微生物中。微生物可为例如，大肠埃希氏菌(E.coli)，糖酵母属(Saccharomycessp.)，曲霉属(Aspergillussp.)，毕赤酵母属(Pichiasp.)，芽孢杆菌属(Bacillussp.)，耶氏酵母属(Yarrowiasp.)
在一实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是能向悬钩子苷添加至少一个葡萄糖单元而形成甜叶菊苷的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在特定实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2。
在一实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是能向甜叶菊苷添加至少一个葡萄糖单元而形成莱苞迪苷A的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在特定实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。
在另一实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是能向莱苞迪苷A添加至少一个葡萄糖单元而形成莱苞迪苷D的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在特定实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2。在另一实施方式中，UGT是由定向衍化产生的具有更高活性和/或选择性的UGT91D2的改善的变体。
在仍另一实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是能向莱苞迪苷D添加至少一个葡萄糖单元而形成莱苞迪苷M的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在特定实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。在另一实施方式中，UGT是由定向衍化产生的具有更高活性和/或选择性的UGT76G1的改善的变体。
任选地，本发明的方法还包含再循环UDP而提供UDP-葡萄糖。在一实施方式中，方法包括通过提供再循环催化剂和再循环底物再循环UDP，使得使用催化性量的UDP-葡萄糖基转移酶和UDP-葡萄糖(图3)实施甜叶菊醇糖苷底物生物转化为目标甜叶菊醇糖苷。
在一实施方式中，再循环催化剂是蔗糖合酶。
在一实施方式中，再循环底物是蔗糖。
任选地，本发明的方法还包括自起始组合物分离目标甜叶菊醇糖苷。目标甜叶菊醇糖苷可由至少一种适合的方法，诸如，例如，结晶，由膜分离，离心，提取，层析分离或此类方法的组合分离。
在一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷可在微生物内产生。在另一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷可分泌出来到培养基中。在另一个实施方式中，释放的甜叶菊醇糖苷可自培养基连续移出。在仍另一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷在反应完成之后分离。
在一实施方式中，分离产生组合物包含大于约80无水重量％的目标甜叶菊醇糖苷，即，高度纯化的甜叶菊醇糖苷组合物。在另一实施方式中，分离产生包含大于约90重量％的目标甜叶菊醇糖苷的组合物。在特定实施方式中，其组合物包含大于约95重量％的目标甜叶菊醇糖苷。在其他实施方式中，其组合物包含大于约99重量％的目标甜叶菊醇糖苷。
目标甜叶菊醇糖苷可为任何多态性的或无定形形式，包括水合物，溶剂化物，无水物或其组合。
纯化的目标甜叶菊醇糖苷可作为甜味剂用于消费性产品。适合的消费性产品包括，但不限于，食品，饮料，药物组合物，烟草产品，营养物组合物，口腔卫生学组合物，及化妆品组合物。
本发明也提供新甜叶菊醇糖苷莱苞迪苷D2(rebD2,莱苞迪苷D的异构体)和莱苞迪苷M2(rebM2,莱苞迪苷M的异构体)，其分别是rebD及rebM的异构体。在一实施方式中，提供分离的及纯化的rebD2。在另一实施方式中，提供分离的及纯化的rebM2。本文公开的rebD2及rebM2也可存在于任何消费性产品中。在特定实施方式中，提供包含rebD2和/或rebM2的饮料。
本文也提供制备rebD2及rebM2的方法。二者在rebA向rebD的生物转化期间形成。rebM2被认为自rebD2的原位生物转化形成。
在一实施方式中，本发明是制备包含rebD2的组合物的方法，其包括：(a)使包含rebA的起始组合物接触能将rebA转化为rebD2的酶，UDP-葡萄糖和任选地UDP-葡萄糖再循环酶，而产生包含rebD2的组合物，及(b)分离包含rebD2的组合物。
在另一实施方式中，本发明是制备包含rebM2的组合物的方法，其包括(a)使包含rebD2的起始组合物接触能将rebD2转化为rebM2的酶，UDP-葡萄糖和任选地UDP-葡萄糖再循环酶，而产生包含rebM2的组合物，及(b)及分离包含rebM2的组合物。
还是制备包含rebM2的组合物的方法，包括(a)使包含rebA的起始组合物接触能将rebA转化为rebD2的酶，UDP-葡萄糖和任选地UDP-葡萄糖再循环酶，而产生包含rebD2的组合物，(b)任选地，分离包含rebD2的组合物，(c)使包含rebD2的组合物接触能将rebD2转化为rebM2的酶，UDP-葡萄糖和任选地UDP-葡萄糖再循环酶而产生包含rebM2的组合物，及(d)分离包含rebM2的组合物。
组合物可还被纯化而提供具有大于约95干重％的纯度的rebD2或rebM2。
【附图说明】
包括附图而提供本发明的进一步理解。图例证本发明的实施方式，与说明书一起用于解释本发明的实施方式的原理。
图1显示rebM的结构。
图2显示自甜叶菊苷生物催化产生rebM。
图3显示自甜叶菊苷，使用酶UGT76G1生物催化产生rebA，和相伴的UDP向UDP葡萄糖经蔗糖合酶的再循环。
图4显示rebM的IR谱。
图5.显示自rebD的rebM的生物催化产生的产物的HPLC层析谱，如详细描述于实施例14中。具有24.165分钟的保留时间的峰对应于未反应的rebD。具有31.325分钟的保留时间的峰对应于rebM。
图6.显示纯化的自rebD由生物催化产生的rebM的HPLC层析谱。
图7显示rebM标准物的HPLC层析谱。
图8显示rebM标准物及自rebD自生物转化纯化的rebM的共注射的HPLC层析谱。
图9显示rebM标准物及自rebD生物合成后纯化的rebM的1HNMR谱的叠加。
图10显示自rebD生物催化产生后纯化的rebM的HRMS谱。
图11显示半-合成甜叶菊醇糖苷混合物，批号CB-2977-106的LC-MS分析，显示TIC(A)，在1.8min的峰的MS(B)，在4.1min的rebM2峰的MS(C)，在6.0min的rebD峰的MS(D)，在7.7min的rebD2峰的MS(E)，在9.4min的峰的MS(F)，在15.2min的莱苞迪苷A峰的MS(G)，在16.5min的峰的MS(H)，及在18.3min的峰的MS(I)。
图12显示半-合成甜叶菊醇糖苷混合物，批号CB-2977-106的踪迹。层析谱网格线不是均质的，由于检测器在注射后14min再校准。
图13显示半-合成甜叶菊醇糖苷混合物，批号CB-2977-106(A)，分离的rebM2(B)，分离的rebD(C)及分离的rebD2(D)的HPLC分析。
图14显示rebD2的1HNMR谱(500MHz,吡啶-d5)。
图15显示rebD2的13CNMR谱(125MHz，吡啶-d5)。
图16显示rebD2的13CNMR谱的放大图(125MHz,吡啶-d5)。
图17显示rebD2的1H-1HCOSY谱(500MHz,吡啶-d5)。
图18显示rebD2的HSQC-DEPT谱(500MHz，吡啶-d5)。
图19显示rebD2的HMBC谱。
图20显示rebD2(500MHz,吡啶-d5)的HMBC谱的放大图。
图21显示rebM2的1HNMR谱(500MHz，D2O)。
图22显示rebM2的13CNMR谱(125MHz,D2O/TSP)。
图23显示rebM2的13CNMR谱的放大图(125MHz,D2O/TSP)。
图24显示rebM2的1H-1HCOSY谱(500MHz,D2O)。
图25显示rebM2的HSQC-DEPT谱(500MHz，D2O)。
图26显示rebM2(500MHz,D2O)的HMBC谱。
图27显示rebM2(500MHz,D2O)的HMBC谱的放大图。
图28显示rebM2的另一HMBC谱。
图29显示rebM2的1HNMR谱。
图30显示rebM2的13CNMR谱。
图31显示rebM2的另一13CNMR谱。
图32显示rebM2的1H-1HCOSY谱。
图33显示rebM2的HSQC-DEPT谱。
图34显示rebM2的HMBC谱。
图35显示rebM2的另一HMBC谱。
图36显示rebM2的1D-TOCSY谱。
图37显示rebM2的1D-TOCSY谱。
图38显示rebM2的1D-TOCSY谱。
图39显示rebM2的1D-TOCSY谱。
图40显示HPLC(CAD)分析。
图41显示HPLC(CAD)分析。
图42显示HPLC(CAD)分析。
图43显示HPLC(CAD)分析。
图44显示HPLC(CAD)分析。
图45显示HPLC(CAD)分析。
图46显示HPLC(CAD)分析。
图47显示HPLC(CAD)分析。
图48显示HPLC(CAD)分析。
图49显示HPLC(CAD)分析。
图50显示HPLC(CAD)分析。
图51显示HPLC(CAD)分析。
图52显示HPLC(CAD)分析。
图53显示LCMS层析谱。
图54显示LCMS层析谱。
图55显示LCMS层析谱。
图56显示LCMS层析谱。
图57显示反应特征。
图58显示HPLC(CAD)分析。
图59显示HPLC(CAD)分析。
图60显示HPLC(CAD)分析。
图61显示HPLC(CAD)分析。
图62显示HPLC(CAD)分析。
图63显示LCMS层析谱。
图64显示HPLC(CAD)分析。
图65显示HPLC(CAD)分析。
图66显示HPLC(CAD)分析。
图67显示HPLC(CAD)分析。
图68显示HPLC(CAD)分析。
图69显示HPLC分析的结果。
【发明详述】
本发明提供制备包含目标甜叶菊醇糖苷的组合物的生物催化过程，其通过使起始组合物，包含有机底物，接触微生物和/或生物催化剂，由此产生包含目标甜叶菊醇糖苷的组合物。
本发明的一个目的是提供自各种起始组合物制备甜叶菊醇糖苷，特别是甜叶菊苷，rebE，rebA，rebD，rebD2，rebM及rebM2的有效生物催化方法。
如本文所用，“生物催化”或“生物催化”指称使用天然的或遗传加工的生物催化剂，诸如细胞，蛋白酶，而对有机化合物实施单或多步骤化学转化。生物催化包括发酵，生物合成和生物转化过程。使用游离的以及固定的形式的生物催化剂的分离的酶和全体-细胞生物催化方法二者为本领域所知。生物催化剂蛋白酶可为天然存在的或重组蛋白。
如本文所用，术语“甜叶菊醇糖苷”指称甜叶菊醇的糖苷，包括但不限于天然存在的甜叶菊醇糖苷，例如甜叶菊醇单苷，甜叶菊双糖苷，悬钩子苷，卫矛醇苷B，卫矛醇苷A，莱苞迪苷B，莱苞迪苷G，甜叶菊苷，莱苞迪苷C，莱苞迪苷F，莱苞迪苷A，莱苞迪苷I，莱苞迪苷E，莱苞迪苷H，莱苞迪苷L，莱苞迪苷K，莱苞迪苷J，莱苞迪苷M，莱苞迪苷M2，莱苞迪苷D，莱苞迪苷D2，莱苞迪苷N，莱苞迪苷O，合成甜叶菊醇糖苷，例如酶学地葡萄糖基化的甜叶菊醇糖苷和其组合。
甜叶菊醇和其糖苷的化学结构
(Glc＝葡萄糖)
【起始组合物】
如本文所用，“起始组合物”指称任何含有一种或更多包含至少一个碳原子的有机化合物的组合物(通常水溶液)。
在一实施方式中，起始组合物选自：多元醇和各种碳水化合物。
术语“多元醇”指称含有多于一个羟基的分子。多元醇可为二元醇，三元醇，或四元醇，其分别含有2，3和4个羟基。多元醇也可含有多于4个羟基，诸如五元醇，六元醇，七元醇，等，其分别含有5，6或7个羟基。此外，多元醇也可为糖醇，多羟基醇或是还原型的碳水化合物，其中所述羰基(醛或酮,还原糖)被还原成伯或仲羟基的多元醇。多元醇的例包括，但不限于，赤藓糖醇，麦芽糖醇，甘露糖醇，山梨糖醇，乳糖醇，木糖醇，肌醇，ISOMALT，丙二醇，甘油，苏糖醇，半乳糖醇，氢化的异麦芽酮糖，还原的异麦芽糖-寡糖，还原的木-寡糖，还原的龙胆-寡糖，还原的麦芽糖糖浆，还原的葡萄糖糖浆，氢化的淀粉水解产物，聚多羟糖醇和糖醇或任何其他能被还原的碳水化合物。
术语“碳水化合物”指称通式(CH2O)n的用多羟基取代的醛或酮化合物，其中n是3～30，以及它们的寡聚体和聚合物。本发明的碳水化合物可，此外，在一个或更多位置被取代或脱氧。碳水化合物，如本文所用，包括未修饰的碳水化合物，碳水化合物衍生物，取代的碳水化合物及修饰的碳水化合物。如本文所用，短语“碳水化合物衍生物”，“取代的碳水化合物”和“修饰的碳水化合物”是同义的。修饰的碳水化合物是指其中至少一个原子已被添加，去除或取代的，或其组合的任何碳水化合物。由此，碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物包括取代的及未经取代的单糖，二糖，寡糖和多糖。碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物任选地可在任何对应C-位置脱氧，和/或被下列一个或更多部分取代，诸如氢，卤素，卤代烷基，羧基，酰基，酰氧基，氨基，酰胺基，羧基衍生物，烷氨基，二烷基氨基，芳氨基，烷氧基，芳氧基，硝基，氰基，磺基，巯基，亚氨基，磺酰基，次磺酰基，亚硫酰基，氨磺酰基，碳烷氧基，羧酰胺基，膦酰基，亚膦酰基，磷酰基，膦基，硫酯，硫醚，肟基，肼基，氨基甲酰基，磷酸，膦酸根合或任何其他有活力的官能团，只要碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物发挥改善甜味剂组合物的甜味的功能。
可根据本发明使用的碳水化合物的例包括，但不限于，塔格糖，海藻糖，半乳糖，鼠李糖，各种环糊精，环状寡糖，各种类型的麦芽糊精，葡聚糖，蔗糖，葡萄糖，核酮糖，果糖，苏糖，阿拉伯糖，木糖，来苏糖，阿洛糖，阿卓糖，甘露糖，艾杜糖，乳糖，麦芽糖，转化糖，异海藻糖，新海藻糖，异麦芽酮糖，赤藓糖，脱氧核糖，古洛糖，艾杜糖，塔罗糖，赤藓酮糖，木酮糖，阿洛酮糖，松二糖，纤维二糖，支链淀粉，葡萄糖胺，甘露糖胺，岩藻糖，葡萄糖醛酸，葡萄糖酸，葡萄糖酸-内酯，阿比可糖，半乳糖胺，甜菜寡糖，异麦芽糖-寡糖(异麦芽糖,异麦芽糖丙糖,潘糖等)，木-寡糖(木三糖,木二糖等)，木-终结的寡糖，龙胆-寡糖(龙胆二糖,龙胆三糖,龙胆四糖等)，山梨糖，黑曲霉-寡糖，异麦芽酮糖寡糖，果糖寡糖(蔗果三糖,霉菌赤藓醛糖等)，麦芽四醇，麦芽三醇，麦芽糖-寡糖(麦芽三糖,麦芽四糖,麦芽五糖,麦芽六糖,麦芽七糖等)，淀粉，菊粉，菊粉-寡糖，乳果糖，蜜二糖，棉子糖，核糖，异构化的液体糖诸如高果糖玉米糖浆，偶联糖和大豆寡糖。此外，本文所用的碳水化合物可为D-或L-构型。
起始组合物可为合成或纯化的(部分或完全)，可商购的或制备的。
在一实施方式中，起始组合物是甘油。
在另一实施方式中，起始组合物是葡萄糖。
在再一实施方式中，起始组合物是蔗糖。
在仍另一实施方式中，起始组合物是淀粉。
在另一实施方式中，起始组合物是麦芽糊精。
起始组合物的有机化合物作为用于产生目标甜叶菊醇糖苷的底物，如本文所述。
【目标甜叶菊醇糖苷】
本方法的目标甜叶菊醇糖苷可为可由本文公开的方法制备的任何甜叶菊醇糖苷。在一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷选自：甜叶菊醇单苷，甜叶菊双糖苷，悬钩子苷，卫矛醇苷B，卫矛醇苷A，莱苞迪苷B，莱苞迪苷G，甜叶菊苷，莱苞迪苷C，莱苞迪苷F，莱苞迪苷A，莱苞迪苷I，莱苞迪苷E，莱苞迪苷H，莱苞迪苷L，莱苞迪苷K，莱苞迪苷J，莱苞迪苷M，莱苞迪苷M2，莱苞迪苷D，莱苞迪苷D2，莱苞迪苷N或莱苞迪苷O，或其他甜叶菊醇的糖苷。
在一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷是甜叶菊苷。在另一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷是rebA。在再一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷是rebE。在仍另一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷是rebD。在仍另一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷是rebD2。在进一步实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷是rebM。在仍还另一实施方式，目标甜叶菊醇糖苷是rebM2。
目标甜叶菊醇糖苷可处于任何多态性或无定形形式，包括水合物，溶剂化物，无水或其组合。
在一实施方式中，本发明是用于产生rebD的生物催化过程。
在仍另一实施方式中，本发明是用于产生rebD2的生物催化过程。
在再一实施方式中，本发明是用于产生rebM的生物催化过程。
在进一步实施方式中，本发明是用于产生rebM2的生物催化过程。
任选地，本发明的方法还包括自起始组合物分离目标甜叶菊醇糖苷。目标甜叶菊醇糖苷可由任何适合的方法，诸如，例如，结晶，由膜分离，离心，提取，层析分离或此类方法的组合分离。
在特定实施方式中，本文所述的方法得到高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷组合物。术语“高度纯化的”，如本文所用，指称组合物具有大于约80无水重量％的目标甜叶菊醇糖苷。在一实施方式中，高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷组合物含有大于约90无水重量％的目标甜叶菊醇糖苷，诸如，例如，以干重计大于约91％，大于约92％，大于约93％，大于约94％，大于约95％，大于约96％，大于约97％，大于约98％或大于约99％目标甜叶菊醇糖苷含量。
在一实施方式中，当目标甜叶菊醇糖苷是rebM时，本文所述的方法提供组合物具有以干重计大于约90％rebM含量。在另一特定实施方式中，当目标甜叶菊醇糖苷是rebM时，本文所述的方法提供组合物包含以干重计大于约95％rebM含量。
在另一实施方式中，当目标甜叶菊醇糖苷是rebM2时，本文所述的方法提供组合物具有以干重计大于约90％rebM2含量。在另一特定实施方式中，当目标甜叶菊醇糖苷是rebM2时，本文所述的方法提供组合物包含以干重计大于约95％rebM2含量。
在仍另一实施方式中，当目标甜叶菊醇糖苷是rebD时，本文所述的方法提供组合物以干重计大于约90％rebD含量。在另一特定实施方式中，当目标甜叶菊醇糖苷是rebD时，本文所述的方法提供组合物包含以干重计大于约99％rebD含量。
在再一实施方式中，当目标甜叶菊醇糖苷是rebD2时，本文所述的方法提供组合物以干重计大于约90％rebD2含量。在另一特定实施方式中，当目标甜叶菊醇糖苷是rebD2时，本文所述的方法提供组合物包含以干重计大于约95％rebD2含量。
在进一步实施方式中，当目标甜叶菊醇糖苷是rebA时，本文所述的方法提供组合物包含以干重计大于约90％rebA含量。在另一特定实施方式中，当目标甜叶菊醇糖苷是rebA时，本文所述的方法提供组合物包含以干重计大于约95％rebA含量。
在仍进一步实施方式中，当目标甜叶菊醇糖苷是rebE时，本文所述的方法提供组合物包含以干重计大于约90％rebE含量。在另一特定实施方式中，当目标甜叶菊醇糖苷是rebE时，本文所述的方法提供组合物包含以干重计大于约95％rebE含量。
在仍进一步实施方式中，当目标甜叶菊醇糖苷是rebI时，本文所述的方法提供组合物包含以干重计大于约90％rebI含量。在另一特定实施方式中，当目标甜叶菊醇糖苷是rebI时，本文所述的方法提供组合物包含以干重计大于约95％rebI含量。
在仍进一步实施方式中，当目标甜叶菊醇糖苷是甜叶菊苷时，本文所述的方法提供组合物包含以干重计大于约90％甜叶菊苷含量。在另一特定实施方式中，当目标甜叶菊醇糖苷是甜叶菊苷时，本文所述的方法提供组合物包含以干重计大于约95％甜叶菊苷含量。
【微生物和生物催化剂】
在本发明的一实施方式中，将微生物或生物催化剂与起始组合物接触而产生目标甜叶菊醇糖苷。微生物可为任何具有对于转变起始组合物为目标甜叶菊醇糖苷必需的酶的微生物。这些酶在微生物的基因组内编码。
在一实施方式中微生物可为，例如，大肠埃希氏菌(E.coli)，糖酵母属(Saccharomycessp.)，曲霉属(Aspergillussp.)，毕赤酵母属(Pichiasp.)，芽孢杆菌属(Bacillussp.)，耶氏酵母属(Yarrowiasp.)等。
酶可位于微生物的表面和/或在细胞内和/或可由微生物分泌出到培养基中。
生物催化剂包含至少一种酶和可为全细胞悬浮液，粗裂解物或纯化的酶。
对于转变起始组合物为目标甜叶菊醇糖苷必需的酶包括甜叶菊醇生物合成酶和UDP-糖基转移酶(UGT)。任选地其可包括UDP再循环酶。UDP再循环酶可为蔗糖合酶和再循环底物可为蔗糖。
在一实施方式中，甜叶菊醇生物合成酶包括甲羟戊酸(MVA)通路酶。
在另一实施方式中，甜叶菊醇生物合成酶包括非-甲羟戊酸2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸通路(MEP/DOXP)酶。
在一实施方式中，甜叶菊醇生物合成酶选自：牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶，柯巴基二磷酸合酶，贝壳杉烯合酶，贝壳杉烯氧化酶，贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)，甜叶菊醇合成酶，脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)，D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)，4-二磷酸胞苷基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)，4-二磷酸胞苷基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)，4-二磷酸胞苷基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(MCS)，l-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)，l-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶(HDR)，乙酰乙酰-CoA硫解酶，截短的HMG-CoA还原酶，甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶，细胞色素P450还原酶等。
UDP-葡萄糖基转移酶可为能向甜叶菊醇及或甜叶菊醇糖苷底物添加至少一个葡萄糖单元而提供目标甜叶菊醇糖苷的任何UDP-葡萄糖基转移酶。
在一实施方式中，微生物是游离的。在另一实施方式中，微生物固定。例如，微生物可固定到由无机或有机材料制造的固体支持物。适合于固定微生物的固体支持物的非限制性例包括衍生的纤维素或玻璃，陶瓷，金属氧化物或膜。微生物可，例如，由共价连接，吸附，交联，获集或包裹固定到固体支持物。
在一实施方式中，微生物在包含水和各种选自下列的组分的水性介质中：碳源，能源，氮源，微量元素，维生素，核苷，磷酸核苷，二磷酸核苷，三磷酸核苷，有机和无机盐，有机和无机酸，碱等。碳源包括甘油，葡萄糖，二氧化碳，碳酸盐，碳酸氢盐。氮源可包括硝酸盐，亚硝酸盐，氨基酸，肽，胨或蛋白。
在特定实施方式中，培养基包含缓冲剂。适合的缓冲剂包括，但不限于，PIPES缓冲剂，乙酸缓冲液和磷酸缓冲液。在特定实施方式中，培养基包含磷酸缓冲液。
在一实施方式中，培养基也可包括有机溶剂。
在一实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是能向悬钩子苷添加至少一个葡萄糖单元，由此产生甜叶菊苷的任何UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可为，例如，UGT91D2。
在另一实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是能向悬钩子苷添加至少一个葡萄糖单元，由此产生莱苞迪苷E的任何UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可为，例如，UGTSL2。
在再一实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是能向莱苞迪苷E添加至少一个葡萄糖单元，由此产生莱苞迪苷D的任何UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可为，例如，UGT76G1。
在仍实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是能向甜叶菊苷添加至少一个葡萄糖单元，由此产生莱苞迪苷A的任何UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可为，例如，UGT76G1。
在进一步实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是能向莱苞迪苷A添加至少一个葡萄糖单元，由此产生莱苞迪苷D和/或莱苞迪苷D2和/或莱苞迪苷M2的任何UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可为，例如，UGT91D2或UGTSL2。
在另一实施方式中，能向莱苞迪苷A添加至少一个葡萄糖单元的UDP-葡萄糖基转移酶选自以下GenInfo标识符号的列表，优选自表1显示的组，及更优选自表2显示的组。
表1
表2
GI号 登录 来源 内部参照
460409128 XP.004249992.1 番茄(Solanum lycopersicum) UGTSL
460386018 XP.004238697.1 番茄(Solanum lycopersicum) -
460409134 XP.004249995.1 番茄(Solanum lycopersicum) -
460410132 XP.004250485.1 番茄(Solanum lycopersicum) UGTSL2
460410130 XP.004250484.1 番茄(Solanum lycopersicum) -
460410128 XP.004250483.1 番茄(Solanum lycopersicum) -
460378310 XP.004234916.1 番茄(Solanum lycopersicum) -
209954733 BAG80557.1 宁夏枸杞(Lycium barbarum) UGTLB
209954725 BAG80553.1 宁夏枸杞(Lycium barbarum) -
在仍另一实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是能向莱苞迪苷D添加至少一个葡萄糖单元而形成莱苞迪苷M和/或莱苞迪苷M2的任何UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可为，例如，UGT76G1。
任选地，本发明的方法还包括再循环UDP而提供UDP-葡萄糖。在一实施方式中，方法包括再循环UDP，其通过提供再循环催化剂，即，能UDP-葡萄糖过度产生的生物催化剂，及再循环底物，使得使用催化性量的UDP-葡萄糖基转移酶和UDP-葡萄糖实施底物甜叶菊醇糖苷转变为目标甜叶菊醇糖苷(图3)。
在一实施方式中，UDP-葡萄糖再循环催化剂是蔗糖合酶。
在一实施方式中，再循环底物是蔗糖。
在一实施方式中，生物催化剂包含多于一种UDP-葡萄糖基转移酶。
在实施方式中，生物催化剂包含多于一种UDP-葡萄糖基转移酶和UDP-葡萄糖再循环催化剂。
目标甜叶菊醇糖苷任选地自得到的组合物纯化。目标甜叶菊醇糖苷自反应培养基的纯化可由至少一种适合的方法实现而提供高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷组合物。适合的方法包括结晶，由膜分离，离心，提取(液体或固相)，层析分离，HPLC(制备性或分析)或此类方法的组合。
【化合物和方法】
本发明也提供分离的及高度纯化的rebD2。rebD2是rebD的异构体及，其具有以下结构：
13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯]
在另一实施方式中，本发明提供具有大于约95无水重量％的纯度的rebD2，诸如，例如，大于约96重量％，大于约97重量％，大于约98重量％或大于约99重量％。
在再一实施方式中，本发明提供在甜叶菊醇糖苷混合物中具有大于约95重量％的纯度的rebD2，诸如，例如，大于约96重量％，大于约97重量％，大于约98重量％或大于约99重量％。
本发明也提供包含rebD2的组合物。
在一实施方式中，本发明提供制备rebD2的方法，其包括：
(a)使包含rebA的起始组合物接触能将rebA转化为rebD2的酶，UDP-葡萄糖和任选地UDP-葡萄糖再循环酶，而产生包含rebD2的组合物；以及
(b)分离包含rebD2的组合物。
在一些实施方式中，能将rebA转化为rebD2的酶是UDP-葡萄糖基转移酶，诸如，例如，UGT91D2，UGTSL，UGTSL_Sc，UGTSL2(GINo.460410132版本XP_004250485.1)，GINo.460409128(UGTSL)版本XP_004249992.1，GINo.115454819版本NP_001051010.1，GINo.187373030，版本ACD03249.1。GINo.222619587版本EEE55719.1，GINo.297795735版本XP_002865752.1或EUGT11。
能将rebA转化为rebD2的酶可固定或在重组微生物中。
在一实施方式中，固定酶。在另一实施方式中，酶在重组微生物中。
在一实施方式中，微生物是游离的。在另一实施方式中，固定微生物。例如，微生物可固定到由无机或有机材料制造的固体支持物。适合于固定微生物的固体支持物的非限制性例包括衍生的纤维素或玻璃，陶瓷，金属氧化物或膜。微生物可，例如，由共价连接，吸附，交联，获集或包裹固定到固体支持物。
适合的微生物包括，但不限于，大肠埃希氏菌(E.coli)，糖酵母属(Saccharomycessp.)，曲霉属(Aspergillussp.)，毕赤酵母属(Pichiasp.)，芽孢杆菌属(Bacillussp.)，耶氏酵母属(Yarrowiasp.)。
在一实施方式中，微生物在包含水和选自下列的各种组分的水性介质中：碳源，能源，氮源，微量元素，维生素，核苷，磷酸核苷，二磷酸核苷，三磷酸核苷，有机和无机盐，有机和无机酸，碱等。碳源包括甘油，葡萄糖，二氧化碳，碳酸盐，碳酸氢盐。氮源可包括硝酸盐，亚硝酸盐，氨基酸，肽，胨或蛋白。
在特定实施方式中，培养基包含缓冲剂。适合的缓冲剂包括，但不限于，PIPES缓冲剂，乙酸缓冲液和磷酸缓冲液。在特定实施方式中，培养基包含磷酸缓冲液。
在一实施方式中，培养基也可包括有机溶剂。
在特定实施方式中，酶是能将rebA转化为rebD2的UDP-葡萄糖基转移酶。
在更特定实施方式中，酶选自UGT91D2，UGTSL，UGTSL_Sc，UGTSL2(GINo.460410132版本XP_004250485.1)，GINo.460409128(UGTSL)verisonXP_004249992.1，GINo.115454819版本NP_001051010.1，GINo.187373030，版本ACD03249.1。GINo.222619587版本EEE55719.1，GINo.297795735版本XP_002865752.1或EUGT11和UGT与这些具有实质性(>85％)序列同一性。
在再更特定实施方式中，酶是UGTSL2或由定向衍化产生的及具有更高活性的其改善的变体。
在一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷可在微生物内产生。在另一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷可分泌出到培养基中。在另一个实施方式中，释放的甜叶菊醇糖苷可自培养基连续移出。在仍另一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷在反应完成之后分离。
rebD2自反应培养基的分离可由任何适合的方法实现而提供包含rebD2的组合物。适合的方法包括，但不限于，裂解，结晶，由膜分离，离心，提取(液体或固相)，层析分离，HPLC(制备性或分析)或此类方法的组合。在特定实施方式中，分离可由裂解和离心达到。
在一些实施方式中，分离可导致小于约95无水重量％的rebD2纯度，及组合物可含有，例如，甜叶菊醇糖苷和/或残留的反应产物。包含rebD2的组合物可还被纯化而提供高度纯化的rebD2，即具有大于约95无水重量％的纯度的rebD2。在一些实施方式中，包含rebD2的组合物可还被纯化而提供具有大于约96％，大于约97％，大于约98％或大于约99无水重量％的纯度的rebD2。
纯化可受本领域技术人员知道的任何手段影响，包括但不限于结晶，由膜分离，离心，提取(液体或固相)，层析分离，HPLC(制备性或分析)或此类方法的组合。在特定实施方式中，HPLC用于纯化rebD2。在更特定实施方式中，半-制备性HPLC用于纯化rebD2。
例如，可使用2-步骤半-制备性HPLC纯化。第1步骤利用使用以以下梯度含有A(水中25％MeCN)和B(水中30％MeCN)的移动相的C18柱:
时间(min) ％A ％B
0.0-5.0 100 0
20 20 80
25 20 80
30 100 0
第二步骤利用相同的柱和条件，但仅用等度移动相：水中20％MeCN。
本领域技术人员会认可，特定柱，移动相，注射体积和其他HPLC参数可改变。
在一实施方式中，本发明提供分离的及高度纯化的rebM2。rebM2是rebM的异构体，且其具有以下结构：
(13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯])
在另一实施方式中，本发明提供具有大于约95无水重量％的纯度的rebM2，诸如，例如，大于约96重量％，大于约97重量％，大于约98重量％或大于约99重量％。
在再一实施方式中，本发明提供在甜叶菊醇糖苷混合物中具有大于约95重量％的纯度的rebM2，诸如，例如，大于约96重量％，大于约97重量％，大于约98重量％或大于约99重量％。
在仍另一实施方式中，本发明提供在甜叶菊提取物中具有大于约95重量％的纯度的rebM2，诸如，例如，大于约96重量％，大于约97重量％，大于约98重量％或大于约99重量％。
本发明也提供包含rebM2的组合物。
已发现，rebM2在rebA向rebD的生物转化期间产生。如上所述，rebA向rebD的生物转化也产生rebD2。因此，在一实施方式中，本发明提供制备rebM2的方法，其包括：
(a)使包含rebA和/或rebD2的起始组合物接触能将rebA和/或rebD2转化为rebM2的酶，UDP-葡萄糖和任选地UDP-葡萄糖再循环酶而产生包含rebM2的组合物；以及
(b)分离包含rebM2的组合物。
不被理论束缚，目前相信，通路始于rebA转化为rebD2，之后是rebD2转化为rebM2。因此，在一实施方式中，本发明提供制备rebM2的方法，其包括：
(a)使包含rebD2的起始组合物接触能将rebD2转化为rebM2的酶，UDP-葡萄糖和任选地UDP-葡萄糖再循环酶而产生包含rebM2的组合物；以及
(b)分离包含rebM2的组合物。
在仍另一实施方式中，制备rebM2的方法包括：
(a)使包含rebA的起始组合物接触能将rebA转化为rebD2的酶，UDP-葡萄糖和任选地UDP-葡萄糖再循环酶而产生包含rebD2的组合物；
(b)任选地，分离包含rebD2的组合物；
(c)使包含rebD2的组合物接触能将rebD2转化为rebM2的酶，UDP-葡萄糖和任选地UDP-葡萄糖再循环酶而产生包含rebM2的组合物；以及
(d)分离包含rebM2的组合物。
酶可为UDP-葡萄糖基转移酶，诸如，例如，UGT91D2，UGTSL，UGTSL_Sc，UGTSL2(GINo.460410132版本XP_004250485.1)，GINo.460409128(UGTSL)版本XP_004249992.1，GINo.115454819版本NP_001051010.1，GINo.187373030，版本ACD03249.1。GINo.222619587版本EEE55719.1，GINo.297795735版本XP_002865752.1或EUGT11。
酶可固定或在重组微生物中。
在一实施方式中，将酶固定。在另一实施方式中，酶在重组微生物中。
在一实施方式中，微生物是游离的。在另一实施方式中，将微生物固定。例如，微生物可固定到由无机或有机材料制造的固体支持物。适合于固定微生物的固体支持物的非限制性例包括衍生的纤维素或玻璃，陶瓷，金属氧化物或膜。微生物可，例如，由共价连接，吸附，交联，获集或包裹固定到固体支持物。
适合的微生物包括，但不限于，大肠埃希氏菌(E.coli)，糖酵母属(Saccharomycessp.)，曲霉属(Aspergillussp.)，毕赤酵母属(Pichiasp.)，芽孢杆菌属(Bacillussp.)，耶氏酵母属(Yarrowiasp.)。
在一实施方式中，微生物在包含水和选自下列的各种组分的水性介质中：碳源，能源，氮源，微量元素，维生素，核苷，磷酸核苷，二磷酸核苷，三磷酸核苷，有机和无机盐，有机和无机酸，碱等。碳源包括甘油，葡萄糖，二氧化碳，碳酸盐，碳酸氢盐。氮源可包括硝酸盐，亚硝酸盐，氨基酸，肽，胨或蛋白。
在特定实施方式中，培养基包含缓冲剂。适合的缓冲剂包括，但不限于，PIPES缓冲剂，乙酸缓冲液和磷酸缓冲液。在特定实施方式中，培养基包含磷酸缓冲液。
在一实施方式中，培养基也可包括有机溶剂。
在特定实施方式中，酶是能将rebA和/或rebD2转化为rebM2及含于大肠埃希氏菌(E.coli)中的UDP-葡萄糖基转移酶。
在更特定实施方式中，酶选自UGT91D2，UGTSL，UGTSL_Sc，UGTSL2(GINo.460410132版本XP_004250485.1)，GINo.460409128(UGTSL)verisonXP_004249992.1，GINo.115454819版本NP_001051010.1，GINo.187373030，版本ACD03249.1。GINo.222619587版本EEE55719.1，GINo.297795735版本XP_002865752.1或EUGT11。
在再更特定实施方式中，酶是UGTSL2或由定向衍化产生的及具有更高活性的其改善的变体。
在一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷rebM2可在微生物内产生。在另一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷可分泌出到培养基中。在另一个实施方式中，释放的甜叶菊醇糖苷可自培养基连续移出。在仍另一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷在反应完成之后分离。
自反应培养基的rebM2的分离可由任何适合的方法实现而提供包含rebM2的组合物。适合的方法包括，但不限于，裂解，结晶，由膜分离，离心，提取(液体或固相)，层析分离，HPLC(制备性或分析)或此类方法的组合。在特定实施方式中，分离可由裂解和离心达到。
在一些实施方式中，分离可导致rebM2纯度小于约95无水重量％，及组合物可含有，例如，甜叶菊醇糖苷和/或残留的反应产物。
包含rebM2的组合物可还被纯化而提供高度纯化的rebM2，即具有大于约95无水重量％的纯度的rebM2。在一些实施方式中，包含rebM2的组合物可还被纯化而提供具有大于约96％，大于约97％，大于约98％或大于约99无水重量％的纯度的rebM2。
纯化可受任何本领域技术人员知道的手段影响，包括但不限于结晶，由膜分离，离心，提取(液体或固相)，层析分离，HPLC(制备性或分析)或此类方法的组合。在特定实施方式中，HPLC用于纯化rebM2。在更特定实施方式中，半-制备性HPLC用于纯化rebM2。
例如，可使用2-步骤半-制备性HPLC纯化。第1步骤利用使用以下列梯度:含有A(水中25％MeCN)和B(水中30％MeCN)的移动相的C18柱。
时间(min) ％A ％B
0.0-5.0 100 0
20 20 80
25 20 80
30 100 0
第二步骤利用相同的柱和条件，但仅有等度移动相：水中20％MeCN。
本领域技术人员会认可，可改变特定柱，移动相，注射体积和其他HPLC参数。
根据本发明制备的纯化的甜叶菊醇糖苷可用于各种消费性产品，包括但不限于食品，饮料，药物组合物，烟草产品，营养物组合物，口腔卫生学组合物，及化妆品组合物。
在本发明中获得的高纯度rebM，具有1291.29的分子量，C56H90O33的分子式，CAS登录号1220616-44-3，及结构显示于图1，处于白色和无气味粉的形式。当与10％蔗糖溶液比较时，化合物是糖的甜度的约200倍。红外线吸收谱显示于图4。
纯rebM化合物的其他性质包括249～250℃的熔点，及在50％乙醇中[α]D 25-19.0°的比旋光(C＝1.0)。rebM在水中的溶解度是约0.3％，及随温度增加而增加。
rebM在甲醇，乙醇，n-丙醇和异丙醇的稀释的溶液中是可溶性的。但是，其在丙酮，苯，氯仿和醚中不溶。
根据本发明获得的rebM是热和pH-稳定的。
根据本发明获得的高度纯化的目标糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM和/或rebM2可“如”甜味剂，香料，食品成分一样被使用，或与至少一种甜味剂，香料，食品成分和/或其组合组合使用。
香料的非限制性例包括石灰，柠檬，橙，果实，香蕉，葡萄，梨，菠萝，芒果，浆果，苦杏仁，可乐，肉桂，糖，棉花糖果和香兰香料和/或其组合。
其他食品成分的非限制性例包括选自下列的至少一种：香料，酸化剂，有机和氨基酸，着色剂，填充剂，修饰的淀粉，胶，组织形成剂，防腐剂，抗氧化剂，乳化剂，稳定剂，增稠剂及胶凝剂和/或其组合。
根据本发明获得的高度纯化的目标糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM和/或rebM2可以各种多态形式制备，包括但不限于水合物，溶剂化物，无水，无定形形式和/或其组合。
根据本发明获得的高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM和/或rebM2可作为高强度天然的甜味剂掺入食料，饮料，药物组合物，化妆品，口香糖，表顶部产物，谷物，乳产品，牙膏和其他口腔腔组合物等。
高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM和/或rebM2可作为单独的甜味剂用作甜味化化合物，或其可与至少一种天然存在的高强度甜味剂一起使用，诸如甜叶菊苷，rebA，rebB，rebC，rebD，rebE，rebF，甜叶菊双糖苷，卫矛醇苷A，悬钩子苷，罗汉果苷，Oubli果甜蛋白(brazzein)，新橙皮苷二氢查耳酮，甘草酸和其盐，祝马丁，紫苏糖，PERNANDULCIN，木库罗苷，白元参苷，糙苏苷-I，二甲基-六氢芴-二羧酸，阿布鲁索苷，巴西甘草甜素，肉质雪胆皂苷，甜茶树苷，皮提罗苷，聚婆朵苷A，巴西红木素，甜过江藤甜蛋白，叶甜素，菝葜苷，根皮苷，三叶苷，二氢黄酮醇，二氢槲皮素-3-乙酸，新落新妇苷，反式-桂醛，莫纳汀和其盐，SELLIGUEAINA，苏木素，应乐果甜蛋白，水龙骨甜素，皮提罗苷A，皮提罗苷B，马槟榔甜蛋白，潘塔亭，蜜拉圣果素，仙茅甜蛋白，NEOCULIN，绿原酸，西那林，罗汉果甜味剂，罗汉果苷V，赛门苷和/或其组合。
在特定实施方式中，rebD2和/或rebM2可在甜味剂组合物中一起使用，其包含选自下列的化合物：rebA，rebB，rebD，NSF-02，罗汉果苷V，赤藓糖醇和/或其组合。
高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM和/或rebM2也可与合成高强度甜味剂组合使用，诸如三氯半乳蔗糖，乙酰舒泛钾，阿司帕坦，阿力甜，糖精，新橙皮苷二氢查耳酮，环己氨基磺酸，新特姆，甘素，SUOSANADVANTAME，它们的盐等。
而且，高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM和/或rebM2可与天然的甜味剂抑制物组合使用，诸如匙羹藤酸，勿甜素，枣甜素，LACTISOLE等。rebD，rebD2，rebM和/或rebM2也可与各种鲜味增强物组合。rebD，rebD2，rebM和/或rebM2可与鲜味品尝及甜氨基酸混合，诸如谷氨酸，天冬氨酸，甘氨酸，丙氨酸，苏氨酸，脯氨酸，丝氨酸，谷氨酸，赖氨酸和色氨酸。
高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM可与一种或更多选自下列的添加剂组合使用：碳水化合物，多元醇，氨基酸和它们的对应盐，聚-氨基酸和它们的对应盐，糖酸和它们的对应盐，核苷酸，有机酸，无机酸，包括有机酸盐和有机碱盐的有机盐，无机盐，苦化合物，风味剂及调味成分，收敛化合物，蛋白或蛋白水解产物，表面活性剂，乳化剂，类黄酮，醇，聚合物和其组合。
高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM和/或rebM2可与多元醇或糖醇组合。术语“多元醇”指称含有多于一个羟基的分子。多元醇可为二元醇，三元醇，或四元醇，其分别含有2，3和4个羟基。多元醇也可含有多于4个羟基，诸如五元醇，六元醇，七元醇，等，其分别含有5，6或7个羟基。此外，多元醇也可为糖醇，多羟基醇或是还原型的碳水化合物，其中所述羰基(醛或酮,还原糖)被还原为伯或仲羟基的多元醇。多元醇的例包括，但不限于，赤藓糖醇，麦芽糖醇，甘露糖醇，山梨糖醇，乳糖醇，木糖醇，肌醇，ISOMALT，丙二醇，甘油，苏糖醇，半乳糖醇，氢化的异麦芽酮糖，还原的异麦芽糖-寡糖，还原的木-寡糖，还原的龙胆-寡糖，还原的麦芽糖糖浆，还原的葡萄糖糖浆，氢化的淀粉水解产物，聚多羟糖醇和糖醇或任何其他不不利地影响甜味剂组合物的味道的能被还原的碳水化合物。
高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM和/或rebM2可与卡路里减少的甜味剂组合，诸如D-塔格糖，阿洛酮糖，阿洛糖，L-糖，L-山梨糖，L-阿拉伯糖等。
高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM和/或rebM2也可与各种碳水化合物组合。术语“碳水化合物”通常指称通式(CH2O)n的经多羟基取代的醛或酮化合物，其中n是3～30，以及它们的寡聚体和聚合物。本发明的碳水化合物可，此外，在一个或更多位置被取代或脱氧。碳水化合物，如本文所用，包括未修饰的碳水化合物，碳水化合物衍生物，取代的碳水化合物及修饰的碳水化合物。如本文所用，短语“碳水化合物衍生物”，“取代的碳水化合物”和“修饰的碳水化合物”是同义的。修饰的碳水化合物是指其中至少一个原子已被添加，去除的或取代的，或其组合的任何碳水化合物。由此，碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物包括取代的及未经取代的单糖，二糖，寡糖和多糖。碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物任选地可在任何对应C-位置脱氧，和/或被一个或更多下列部分取代，诸如氢，卤素，卤代烷基，羧基，酰基，酰氧基，氨基，酰胺基，羧基衍生物，烷氨基，二烷基氨基，芳氨基，烷氧基，芳氧基，硝基，氰基，磺基，巯基，亚氨基，磺酰基，次磺酰基，亚硫酰基，氨磺酰基，碳烷氧基，羧酰胺基，膦酰基，亚膦酰基，磷酰基，膦基，硫酯，硫醚，肟基，肼基，氨基甲酰基，磷酸，膦酸根合或任何其他有活力的官能团，只要碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物发挥改善甜味剂组合物的甜味的功能。
可根据本发明使用的碳水化合物的例包括，但不限于，阿洛酮糖，松二糖，阿洛酮糖，阿洛糖，D-塔格糖，海藻糖，半乳糖，鼠李糖，各种环糊精，环状寡糖，各种类型的麦芽糊精，葡聚糖，蔗糖，葡萄糖，核酮糖，果糖，苏糖，阿拉伯糖，木糖，来苏糖，阿洛糖，阿卓糖，甘露糖，艾杜糖，乳糖，麦芽糖，转化糖，异海藻糖，新海藻糖，异麦芽酮糖，赤藓糖，脱氧核糖，古洛糖，艾杜糖，塔罗糖，赤藓酮糖，木酮糖，阿洛酮糖，松二糖，纤维二糖，支链淀粉，葡萄糖胺，甘露糖胺，岩藻糖，葡萄糖醛酸，葡萄糖酸，葡萄糖酸-内酯，阿比可糖，半乳糖胺，甜菜寡糖，异麦芽糖-寡糖(异麦芽糖,异麦芽糖丙糖,潘糖等)，木-寡糖(木三糖,木二糖等)，木-终结的寡糖，龙胆-寡糖(龙胆二糖,龙胆三糖,龙胆四糖等)，山梨糖，黑曲霉-寡糖，异麦芽酮糖寡糖，果糖寡糖(蔗果三糖,霉菌赤藓醛糖等)，麦芽四醇，麦芽三醇，麦芽糖-寡糖(麦芽三糖,麦芽四糖,麦芽五糖,麦芽六糖,麦芽七糖等)，淀粉，菊粉，菊粉-寡糖，乳果糖，蜜二糖，棉子糖，核糖，异构化的液体糖诸如高果糖玉米糖浆，偶联糖和大豆寡糖。此外，本文所用的碳水化合物可为D-或L-构型。
根据本发明获得的高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM和/或rebM2可与各种生理学活性物质或功能成分组合使用。功能成分通常分类为以下类别，诸如类胡萝卜素，膳食纤维，脂肪酸，皂苷，抗氧化剂，营养物，类黄酮，异硫氰酸盐，苯酚，种植甾醇和甾烷醇(植物甾醇和植物甾烷醇)；多元醇；益生元，益生菌；植物雌激素；大豆蛋白；硫化物/氢硫基；氨基酸；蛋白；维生素；及矿物质。功能成分也可基于它们的健康益处分类，诸如心血管，胆甾醇-降低和抗-炎性。例示功能成分提供于WO2013/096420，其内容在此通过引用合并。
根据本发明获得的高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM和/或rebM2可作为高强度甜味剂应用而产生具有改善的品尝特征的0卡路里，卡路里减少的或糖尿病性饮料和食品。其也可用于饮料，食料，药物和无法使用糖的其他产品。此外，可将高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM和/或rebM2不仅用作人消费专用的饮料，食料和其他产品的甜味剂，而且用于具有改善的特征的动物饲料和饲料。
高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM和/或rebM2可用作甜味化化合物的消费性产品的例包括，但不限于，酒精饮料诸如伏特加酒，葡萄酒，啤酒，液和SAKE等；天然的汁；清爽饮料；碳酸化的软饮料；节食饮料；0卡路里饮料；卡路里减少的饮料和食品；酸乳饮料；速食汁；速溶咖啡；粉末化的类型的速食饮料；罐装产品；糖浆；发酵的豆瓣酱；大豆酱油；醋；调味品；蛋黄酱；蕃茄酱；咖喱；汤；速溶汤；粉末化的大豆酱油；粉末化的醋；饼干类；大米饼干；薄脆饼干；面包；巧克力；焦糖；糖果；口香糖；果冻；布丁；保存的水果和蔬菜；鲜奶油；果酱；桔子酱；花酱；粉末化的乳；冰淇淋；果汁冰糕；瓶中填充的蔬菜和水果；罐装及热沸的豆；在甜味化的沙司中热沸的肉和食品；农业植物食品；海鲜；火腿；香肠；鱼火腿；鱼香肠；鱼酱；深油炸的鱼产品；干燥的海鲜产品；冷冻的食品；保存的海藻；保存的肉；烟草；药品；及许多其他。原则上其可具有无限的应用。
在产品诸如食料，饮料，药物，化妆品，表顶部产物，及口香糖生产期间，可使用常规方法诸如混合，揉捏，溶解，酸浸，渗透，渗滤，洒，雾化，输注及其他方法。
而且，在本发明中获得的高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM和/或rebM2可以干或液体形式使用。在一实施方式中，提供包含rebD2的桌面甜味剂。在另一实施方式中，提供包含rebM2的桌面甜味剂。
高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷可在食品热处理之前或之后添加。高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM和/或rebM2的量依赖于利用目的。如上所述，其可单独或与其他化合物组合添加。
本发明也针对在饮料中使用rebD2进行甜度增强。本发明也针对在饮料中使用rebM2进行甜度增强。因此，本发明提供包含甜味剂及rebD2和/或rebM2作为甜度增强物的饮料，其中rebD2和/或rebM2以它们的相应甜度识别阈值或以它们的相应甜度识别阈值以下的浓度存在。
如本文所用，术语"甜度增强物"指称能增强或加强在组合物，诸如饮料中甜味的感觉的化合物。术语"甜度增强物"与术语"甜味增强剂"、"甜度增强剂"、"甜度放大剂"和"甜度加强剂"同义。
如本文所用的术语“甜度识别阈值浓度”通常是可由人味觉感觉到的甜化合物的最低知道的浓度，一般约1.0％蔗糖当量(1.0％SE)。一般而言，甜度增强物当以给定甜度增强物的甜度识别阈值浓度或以给定甜度增强物的甜度识别阈值浓度以下存在时，可增强或增强甜味剂的甜味而不本身提供任何可检测的甜味；但是，甜度增强物可以它们的甜度识别阈值浓度以上的浓度本身提供甜味。甜度识别阈值浓度特异于特定增强物和可基于饮料基质改变。甜度识别阈值浓度可容易由给定增强物的味道测试增加浓度测定，直到在给定饮料基质中检测到大于1.0％蔗糖当量。提供约1.0％蔗糖当量的浓度被认为是甜度识别阈值。
在一些实施方式中，甜味剂以约0.5％～约12重量％，诸如，例如，约1.0重量％，约1.5重量％，约2.0重量％，约2.5重量％，约3.0重量％，约3.5重量％，约4.0重量％，约4.5重量％，约5.0重量％，约5.5重量％，约6.0重量％，约6.5重量％，约7.0重量％，约7.5重量％，约8.0重量％，约8.5重量％，约9.0重量％，约9.5重量％，约10.0重量％，约10.5重量％，约11.0重量％，约11.5重量％或约12.0重量％的量存在于饮料中。
在特定实施方式中，甜味剂以约0.5％至约10％，诸如例如，自约2％～约8％，自约3％～约7％或自约4％～约6重量％的量存在于饮料中。在特定实施方式中，甜味剂以约0.5％～约8重量％的量存在于饮料中。在另一特定实施方式中，甜味剂以约2％～约8重量％的量存在于饮料中。
在一实施方式中，甜味剂是传统热量甜味剂。适合的甜味剂包括，但不限于，蔗糖，果糖，葡萄糖，高果糖玉米糖浆和高果糖淀粉糖浆。
在另一实施方式中，甜味剂是赤藓糖醇。
在再一实施方式中，甜味剂是罕见糖。适合的罕见糖包括，但不限于，D-阿洛糖，D-阿洛酮糖，L-核糖，D-塔格糖，L-葡萄糖，L-岩藻糖，L-阿拉伯糖，D-松二糖，D-明串珠菌二糖和其组合。
涵盖的是，甜味剂可单独或与其他甜味剂组合使用。
在一实施方式中，罕见糖是D-阿洛糖。在更特定实施方式中，D-阿洛糖以约0.5％～约10重量％，诸如，例如，约2％～约8％的量存在于饮料中。
在另一实施方式中，罕见糖是D-阿洛酮糖。在更特定实施方式中，D-阿洛酮糖以约0.5％～约10重量％，诸如，例如，约2％～约8％的量存在于饮料中。
在再一实施方式中，罕见糖是D-核糖。在更特定实施方式中，D-核糖以约0.5％～约10重量％，诸如，例如，约2％～约8％的量存在于饮料中。
在仍另一实施方式中，罕见糖是D-塔格糖。在更特定实施方式中，D-塔格糖以约0.5％～约10重量％，诸如，例如，约2％～约8％的量存在于饮料中。
在进一步实施方式中，罕见糖是L-葡萄糖。在更特定实施方式中，L-葡萄糖以约0.5％～约10重量％，诸如，例如，约2％～约8％的量存在于饮料中。
在一实施方式中，罕见糖是L-岩藻糖。在更特定实施方式中，L-岩藻糖以约0.5％～约10重量％，诸如，例如，约2％～约8％的量存在于饮料中。
在另一实施方式中，罕见糖是L-阿拉伯糖。在更特定实施方式中，L-阿拉伯糖以约0.5％～约10重量％，诸如，例如，约2％～约8％的量存在于饮料中。
在仍另一实施方式中，罕见糖是D-松二糖。在更特定实施方式中，D-松二糖以约0.5％～约10重量％，诸如，例如，约2％～约8％的量存在于饮料中。
在仍另一实施方式中，罕见糖是D-明串珠菌二糖。在更特定实施方式中，D-明串珠菌二糖以约0.5％～约10重量％，诸如，例如，约2％～约8％的量存在于饮料中。
相比缺失甜度增强物的对应饮料，其甜度识别阈值或其甜度识别阈值以下的浓度的甜度增强物的添加增加包含甜味剂和甜度增强物的饮料的检测到的蔗糖当量。而且，在缺失任何甜味剂的情况下，甜度可由多于含有相同的浓度的至少一种甜度增强物的溶液的可检测的甜度的量增加。
因此，本发明也提供增强包含甜味剂的饮料的甜度的方法，包括提供包含甜味剂的饮料及添加选自下列的甜度增强物：rebD2，rebM2或其组合，其中rebD2及rebM2以它们的甜度识别阈值或它们的甜度识别阈值以下的浓度存在。
以甜度识别阈值或甜度识别阈值以下的浓度向含有甜味剂的饮料添加rebD2和/或rebM2可增加约1.0％～约5.0％，诸如，例如，约1.0％，约1.5％，约2.0％，约2.5％，约3.0％，约3.5％，约4.0％，约4.5％或约5.0％的检测的蔗糖当量。
下列实施例例证制备高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷，特别是，rebD，rebD2，rebM和/或rebM2的本发明的优选的实施方式。需知本发明不限于实施例中设置的材料，比例，条件和过程，其仅是例证性的。
【实施例】
【实施例1：UGT76G1的体内产生】
将NcoI和NdeI限制侧加入原核酸序列，如描述于Genbank登录no.AAR06912.1。在密码子优化之后，获得以下核酸序列(SEQIDNO:1)：
CCATGGCCCATATGGAAAACAAAACCGAAACCACCGTTCGTCGTCGTCGCCGTATTATTCTGTTTCCGGTTCCGTTTCAGGGTCATATTAATCCGATTCTGCAGCTGGCAAATGTGCTGTATAGCAAAGGTTTTAGCATTACCATTTTTCATACCAATTTTAACAAACCGAAAACCAGCAATTATCCGCATTTTACCTTTCGCTTTATTCTGGATAATGATCCGCAGGATGAACGCATTAGCAATCTGCCGACACATGGTCCGCTGGCAGGTATGCGTATTCCGATTATTAACGAACATGGTGCAGATGAACTGCGTCGTGAACTGGAACTGCTGATGCTGGCAAGCGAAGAAGATGAAGAAGTTAGCTGTCTGATTACCGATGCACTGTGGTATTTTGCACAGAGCGTTGCAGATAGCCTGAATCTGCGTCGTCTGGTTCTGATGACCAGCAGCCTGTTTAACTTTCATGCACATGTTAGCCTGCCGCAGTTTGATGAACTGGGTTATCTGGATCCGGATGATAAAACCCGTCTGGAAGAACAGGCAAGCGGTTTTCCGATGCTGAAAGTGAAAGATATCAAAAGCGCCTATAGCAATTGGCAGATTCTGAAAGAAATTCTGGGCAAAATGATTAAACAGACCAAAGCAAGCAGCGGTGTTATTTGGAATAGCTTTAAAGAACTGGAAGAAAGCGAACTGGAAACCGTGATTCGTGAAATTCCGGCACCGAGCTTTCTGATTCCGCTGCCGAAACATCTGACCGCAAGCAGCAGCAGCCTGCTGGATCATGATCGTACCGTTTTTCAGTGGCTGGATCAGCAGCCTCCGAGCAGCGTTCTGTATGTTAGCTTTGGTAGCACCAGCGAAGTTGATGAAAAAGATTTTCTGGAAATTGCCCGTGGTCTGGTTGATAGCAAACAGAGCTTTCTGTGGGTTGTTCGTCCGGGTTTTGTTAAAGGTAGCACCTGGGTTGAACCGCTGCCGGATGGTTTTCTGGGTGAACGTGGTCGTATTGTTAAATGGGTTCCGCAGCAAGAAGTTCTGGCACACGGCGCAATTGGTGCATTTTGGACCCATAGCGGTTGGAATAGCACCCTGGAAAGCGTTTGTGAAGGTGTTCCGATGATTTTTAGCGATTTTGGTCTGGATCAGCCGCTGAATGCACGTTATATGAGTGATGTTCTGAAAGTGGGTGTGTATCTGGAAAATGGTTGGGAACGTGGTGAAATTGCAAATGCAATTCGTCGTGTTATGGTGGATGAAGAAGGTGAATATATTCGTCAGAATGCCCGTGTTCTGAAACAGAAAGCAGATGTTAGCCTGATGAAAGGTGGTAGCAGCTATGAAAGCCTGGAAAGTCTGGTTAGCTATATTAGCAGCCTGTAATAACTCGAG
在基因合成及使用NdeI和XhoI克隆位点亚克隆进pET30A+载体之后，通过电穿孔在大肠埃希氏菌(E.coli)Bl21(DE3)和大肠埃希氏菌(E.coli)EC100中导入UGT76G1_pET30a+质粒。获得的细胞在陪替-皿中，在卡那霉素的存在生长，选择适合的集落，及允许在液体LB培养基中生长(锥形瓶)。将甘油加入悬浮液作为冷冻保护剂，将400μL等份存储于-20℃和于-80℃。
将含有pET30A+_UGT76G1质粒的大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)的存储等份解冻，及添加到30mL的LBGKP培养基(20g/LLuria肉汤Lennox；50mMPIPES缓冲剂pH7.00；50mM磷酸缓冲液pH7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L的卡那霉素)。使此培养物以135rpm于30℃振摇8h。
生产培养基含有60g/L的过夜表达即时TB培养基(Novagen)，10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素。培养基允许取样品的同时于20℃搅拌，以测量OD和pH。培养物显著生长，获得良好OD。在40h之后，通过离心收获细胞，及冷冻而产生12.7g的细胞湿重。
通过添加BugbusterMaster混合物(Novagen)实施裂解，通过离心回收裂解物，及保持冷冻。用解冻的裂解物实施活性测试。
【实施例2：UGT76G1的体外产生】
使用来自Promega的S30T7高产率蛋白表达系统试剂盒。将4μg的来自大肠埃希氏菌(E.coli)EC100的UGT76G1_pET30a+质粒与80μL的S30预混物加混合，添加72μL的S30T7提取物。添加无核酸酶的水，以便获得200μL的总体积，将得到的溶液于30℃温育2h。将180μL用于催化性测试反应。
【实施例3：UGT91D2的体外产生】
将NcoI和NdeI限制侧加入原核酸序列，如描述于Genbank登录NO.ACE87855.1。在密码子优化之后，获得以下核酸序列(SEQIDNO:2)：
CCATGGCACATATGGCAACCAGCGATAGCATTGTTGATGATCGTAAACAGCTGCATGTTGCAACCTTTCCGTGGCTGGCATTTGGTCATATTCTGCCGTATCTGCAGCTGAGCAAACTGATTGCAGAAAAAGGTCATAAAGTGAGCTTTCTGAGCACCACCCGTAATATTCAGCGTCTGAGCAGCCATATTAGTCCGCTGATTAATGTTGTTCAGCTGACCCTGCCTCGTGTTCAAGAACTGCCGGAAGATGCCGAAGCAACCACCGATGTTCATCCGGAAGATATTCCGTATCTGAAAAAAGCAAGTGATGGTCTGCAGCCGGAAGTTACCCGTTTTCTGGAACAGCATAGTCCGGATTGGATCATCTATGATTATACCCATTATTGGCTGCCGAGCATTGCAGCAAGCCTGGGTATTAGCCGTGCACATTTTAGCGTTACCACCCCGTGGGCAATTGCATATATGGGTCCGAGCGCAGATGCAATGATTAATGGTAGTGATGGTCGTACCACCGTTGAAGATCTGACCACCCCTCCGAAATGGTTTCCGTTTCCGACCAAAGTTTGTTGGCGTAAACATGATCTGGCACGTCTGGTTCCGTATAAAGCACCGGGTATTAGTGATGGTTATCGTATGGGTCTGGTTCTGAAAGGTAGCGATTGTCTGCTGAGCAAATGCTATCATGAATTTGGCACCCAGTGGCTGCCGCTGCTGGAAACCCTGCATCAGGTTCCGGTTGTTCCGGTGGGTCTGCTGCCTCCGGAAGTTCCGGGTGATGAAAAAGATGAAACCTGGGTTAGCATCAAAAAATGGCTGGATGGTAAACAGAAAGGTAGCGTGGTTTATGTTGCACTGGGTAGCGAAGTTCTGGTTAGCCAGACCGAAGTTGTTGAACTGGCACTGGGTCTGGAACTGAGCGGTCTGCCGTTTGTTTGGGCATATCGTAAACCGAAAGGTCCGGCAAAAAGCGATAGCGTTGAACTGCCGGATGGTTTTGTTGAACGTACCCGTGATCGTGGTCTGGTTTGGACCAGCTGGGCACCTCAGCTGCGTATTCTGAGCCATGAAAGCGTTTGTGGTTTTCTGACCCATTGTGGTAGCGGTAGCATTGTGGAAGGTCTGATGTTTGGTCATCCGCTGATTATGCTGCCGATTTTTGGTGATCAGCCGCTGAATGCACGTCTGCTGGAAGATAAACAGGTTGGTATTGAAATTCCGCGTAATGAAGAAGATGGTTGCCTGACCAAAGAAAGCGTTGCACGTAGCCTGCGTAGCGTTGTTGTTGAAAAAGAAGGCGAAATCTATAAAGCCAATGCACGTGAACTGAGCAAAATCTATAATGATACCAAAGTGGAAAAAGAATATGTGAGCCAGTTCGTGGATTATCTGGAAAAAAACACCCGTGCAGTTGCCATTGATCACGAAAGCTAATGACTCGAG
在基因合成及使用NcoI和XhoI克隆位点亚克隆进pET30A+载体之后，将UGT91D2_pET30a+质粒通过电穿孔导入大肠埃希氏菌(E.coli)EC100。获得的细胞在卡那霉素的存在下生长，选择适合的集落，及允许在液体LB培养基(锥形瓶)中生长。将甘油加入悬浮液作为冷冻保护剂，400μL等份存储于-20℃和于-80℃。
将来自Promega的S30T7高产率蛋白表达系统试剂盒用于体外蛋白合成。
将4μg的UGT91D2_pET30a+质粒与80μL的S30预混物加混合，添加72μL的S30T7提取物。添加无核酸酶的水，以便获得200μL的总体积，将得到的溶液于30℃温育2h。将5μL用于SDS-page分析，而余下45μL用于催化性测试反应。
【实施例4：用体内产生的UGT76G1的催化性反应】
反应的总体积是5.0mL，有以下组成：50mM磷酸钠缓冲液pH7.2，3mMMgCl2，2.5mMUDP-葡萄糖，0.5mM甜叶菊苷和500μL的UGT76G1解冻的裂解物。反应于30℃，在轨道摇床上，以135rpm运行。对于各样品，用40μL的2NH2SO4和420μL的甲醇/水(6/4)骤冷460μL的反应混合物。样品立即离心，及在由HPLC(CAD)分析之前于10℃保持。HPLC指示甜叶菊苷向莱苞迪苷A的几乎完全转变，如见于图40。
【实施例5：用体外产生的UGT91D2的催化性反应】
反应总体积是0.5mL，含以下组成：50mM磷酸钠缓冲液pH7.2，3mMMgCl2，3.8mMUDP-葡萄糖，0.1mM莱苞迪苷A和180μL的体外产生的UGT91D2。反应于30℃，在轨道摇床上，以135rpm运行。对于各样品，450μL的反应混合物骤冷用45μL的2NH2SO4和405μL的60％MeOH。在离心之后，上清液由HPLC(CAD)分析。HPLC指示在120h之后莱苞迪苷A向莱苞迪苷D的4.7％转变。
【实施例6：用体外产生的UGT76G1的催化性反应】
反应总体积是2mL，含以下组成：50mM磷酸钠缓冲液pH7.2，3mMMgCl2，3.8mMUDP-葡萄糖，0.5mM莱苞迪苷D和180μL的体外产生的UGT76G1。反应于30℃，在轨道摇床上，以135rpm运行。对于各样品，400μL的反应混合物骤冷用40μL的2NH2SO4和360μL的60％MeOH。在离心之后，上清液由HPLC(CAD)分析。HPLC指示在120h之后莱苞迪苷D向莱苞迪苷M的80％转变，如见于图41。
对于实施例7至12，使用以下缩写：
LBGKP培养基：20g/LLuria肉汤Lennox；50mMPIPES缓冲剂pH7.00；50mM磷酸缓冲液pH7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L的卡那霉素或氨苄西林
LB培养基：(20g/LLuria肉汤Lennox)
【实施例7：由pET30a+质粒和BL21(DE3)表达株制备的UGT76G1的制备和活性】
将pET30a+_UGT76G1质粒转化进BL21(DE3)表达株(LucigenE.EXPRESS电感受态细胞)。获得的细胞在陪替-皿中的LBAgar培养基上，在卡那霉素的存在下生长。选择适合的集落，及允许在含有卡那霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，及将400μL等份存储于-20℃和于-80℃。
将存储等份解冻，及添加到30mL的LBGKP培养基。使此培养物于30℃振摇8h，随后用于接种400mL的含有60g/L的“过夜表达即时TB培养基”(Novagen,参照71491-5)，10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素的生产培养基。于20℃取样品的同时搅拌培养基，以测量OD(600nm)和pH。在40h之后，将细胞通过离心收获，及冷冻。获得的细胞湿重是10.58g。
将3.24g的获得的沉淀通过添加8.1mL的“BugbusterMaster混合物”(Novagen,参照71456)和3.5mL的水裂解。将裂解物通过离心回收，及保持冷冻。
【实施例8：由pET30a+质粒和Tuner(DE3)表达株制备的UGT76G1的制备和活性】
将pET30a+_UGT76G1质粒由热休克处理转化进Tuner(DE3)表达株(NovagenTunertm(DE3)感受态细胞)。使获得的细胞在陪替-皿中，在卡那霉素存在下生长在LBAgar培养基上。选择适合的集落，及使在含有卡那霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，及将400μL等份于-20℃和于-80℃存储。
将存储等份解冻，及添加到100mL的含有50mg/L的卡那霉素的LB培养基。使此培养物于30℃振摇15h。将4.4mL的此培养用于接种200mL的含有LB的生产培养基。此培养基于37℃搅拌，直到获得0.9的OD(600nm)，之后添加400μL的100mMIPTG溶液，及培养基于30℃搅拌4h。将细胞通过离心收获，及冷冻。获得的细胞湿重是1.38g。
将获得的沉淀通过添加4.9mL的“BugbusterMaster混合物”(Novagen,参照71456)和2.1mL的水裂解。将裂解物通过离心回收，及保持冷冻。
【实施例9：由pMAL质粒和BL21表达株制备的UGT76G1的制备和活性】
在将合成的UGT76G1基因使用Nde1和Sal1克隆位点亚克隆进pMAL质粒之后，将pMAL_UGT76G1质粒由热休克处理转化进BL21表达株(NewEnglandBiolabsBL21感受态大肠埃希氏菌(E.coli))。获得的细胞在陪替-皿中在LBAgar培养基上在氨苄西林的存在下生长。选择适合的集落，使在含有氨苄西林的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，400μL等份存储于-20℃和于-80℃。
将存储等份解冻，及添加到30mL的LBGKP培养基。此培养于30℃振摇8h，随后用来接种400mL的含有60g/L的“过夜表达立即TB培养基”(Novagen,参照71491-5)，10g/L的甘油和50mg/L的氨苄西林的生产培养基。培养基取样品的同时于20℃搅拌，以测量OD和pH。在40h之后，将细胞通过离心收获，及冷冻。获得的细胞湿重是5.86g。
2.74g的获得的沉淀通过添加9.6mL的“BugbusterMasterMix”(Novagen,参照71456)和4.1mL的水裂解。将裂解物通过离心回收，及保持冷冻。
【实施例10：由pMAL质粒和ArcticExpress表达株制备的UGT76G1的制备和活性】
将pMAL_UGT76G1质粒由热休克处理转化进ArticExpress表达株(AgilentArcticExpress感受态细胞)。获得的细胞在陪替-皿中在LBAgar培养基上在氨苄西林和遗传霉素的存在下生长。选择适合的集落，在含有氨苄西林和遗传霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，将400μL等份存储于-20℃和于-80℃。
将存储等份解冻，及添加到30mL的LBGKP培养基(含氨苄西林和遗传霉素)。此培养物于30℃振摇8h，随后用来接种400mL的含有60g/L的“过夜表达立即TB培养基”(Novagen,参照71491-5)，10g/L的甘油和50mg/L的氨苄西林的生产培养基。培养基取样品的同时于12℃搅拌，以测量OD(600nm)和pH。在68h之后，将细胞通过离心收获，及冷冻。获得的细胞湿重是8.96g。
2.47g的获得的沉淀通过添加8.73mL的“BugbusterMasterMix”(Novagen,参照71456)和3.79mL的水裂解。将裂解物通过离心回收，及保持冷冻。
【实施例11：由pCOLDIII质粒和ArcticExpress表达株制备的UGT76G1的制备和活性】
在将合成的UGT76G1基因使用Nde1和Xho1克隆位点亚克隆进pCOLDIII质粒之后，将pCOLDIII_UGT76G1质粒由热休克处理转化进ArcticExpress表达株(AgilentArcticExpress感受态细胞)。获得的细胞在陪替-皿中在LBAgar培养基上在氨苄西林和遗传霉素的存在下生长。选择适合的集落，使在含有氨苄西林和遗传霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，将400μL等份存储于-20℃和于-80℃。
将存储等份解冻，及添加到30mL的LBGKP培养基(含氨苄西林和遗传霉素)。此培养于30℃振摇8h，随后用来接种400mL的含有60g/L的“过夜表达立即TB培养基”(Novagen,参照71491-5)，10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素的生产培养基。培养基取样品的同时于12℃搅拌，以测量OD(600nm)和pH。在63h之后，将细胞通过离心收获，及冷冻。获得的细胞湿重是6.54g。
2.81g的获得的沉淀通过添加9.8mL的“BugbusterMasterMix”(Novagen,参照71456)和4.2mL的水裂解。将裂解物通过离心回收，及保持冷冻。
【实施例12：由pCOLDIII质粒和Origami2(DE3)表达株制备的UGT76G1的制备和活性】
将pCOLDIII_UGT76G1质粒由热休克处理转化进Origami2(DE3)表达株(NovagenOrigamiTM2(DE3)感受态细胞)。获得的细胞在陪替-皿中在LBAgar培养基上在氨苄西林的存在下生长。选择适合的集落，使在含有氨苄西林的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，将400μL等份存储于-20℃和于-80℃。
将存储等份解冻，及添加到30mL的LBGKP培养基(含氨苄西林)。此培养于30℃振摇8h，随后用来接种400mL的含有60g/L的“过夜表达立即TB培养基”(Novagen,参照71491-5)，10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素的生产培养基。培养基取样品的同时于12℃搅拌，以测量OD(600nm)和pH。在68h之后，将细胞通过离心收获，及冷冻。获得的细胞湿重是2.53g。
1.71g的获得的沉淀通过添加6.0mL的“BugbusterMaster混合物”(Novagen,参照71456)和1.9mL的水裂解。将裂解物通过离心回收，及保持冷冻。
【实施例13：活性的测定】
在5mL规模，使用用于甜叶菊苷向莱苞迪苷A和莱苞迪苷D向莱苞迪苷M转化的500μL的解冻的裂解物，使用0.5mM的底物，2.5mM的UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，在pH7.2的50mM磷酸钠缓冲液中实施活性测试。取样品及由HPLC分析。UGT76G1的不同制备物的结果总结于以下表。
*注
提及每mL的裂解物的甜叶菊苷和莱苞迪苷M的转化活性。1U会在1小时于30℃和pH7.2转化1μmol的底物。
【实施例14：用于莱苞迪苷D向莱苞迪苷M的转化的50mL规模反应】
在50mL规模，使用5mL的实施例12的裂解物将莱苞迪苷D转化为莱苞迪苷M。反应培养基由50mM磷酸钠缓冲液pH7.2，3mM的MgCl2，2.5mM的UDP-葡萄糖和0.5mM的莱苞迪苷D组成。使反应于30℃振摇90h后，添加50mL的乙醇，及将得到的混合物于-20℃搅拌1h。在以5000g离心10min之后，将上清液经超滤(VivaflowMWCO30000)纯化。获得78mL的渗透物，及将9mL的渗余物用9mL的乙醇稀释，及使再经历超滤(VivaflowMWCO30000)。获得另一14mL的滤出液，将其与第1渗透物组合。组合的渗透物在减压于30℃浓缩，直到获得32mL的清澈的溶液。
产物混合物的HPLC踪迹显示于图5。HPLC在装备双泵，自动采样器和恒温器柱隔室的Agilent1200系列上实施。方法是等度的，有70％水(0.1％甲酸)：30％乙腈组成的移动相。流速是0.1μL/min。使用的柱是PhenomenexProdigy5μODS(3)100A；250x2mm。柱温度维持于40℃。注射体积是20～40μl。
【实施例15：使用pMAL质粒和BL21表达株的UGT91D2的制备】
在将合成UGT91D2基因使用Nde1和Sal1克隆位点亚克隆进pMAL质粒之后，将pMAL_UGT91D2质粒由热休克处理转化进BL21表达株(NewEnglandBiolabsBL21感受态大肠埃希氏菌(E.coli))。获得的细胞在陪替-皿中在LBAgar培养基上在氨苄西林的存在下生长。选择适合的集落，使在含有氨苄西林的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，将400μL等份存储于-20℃和于-80℃。
将存储等份解冻，及添加到30mL的LBGKP培养基。此培养物于30℃振摇8h，随后用来接种400mL的含有60g/L的“过夜表达立即TB培养基”(Novagen,参照71491-5)，10g/L的甘油和50mg/L的氨苄西林的生产培养基。培养基取样品的同时于20℃搅拌，以测量OD和pH。在40h之后，将细胞通过离心收获，及冷冻。获得的细胞湿重是12.32g。
2.18g的获得的沉淀通过添加7.7mL的“BugbusterMasterMix”(Novagen,参照71456)和3.2mL的水裂解。将裂解物通过离心回收，及直接用于活性测试。
【实施例16：使用pMAL质粒和ArcticExpress表达株的UGT91D2的制备】
将pMAL_UGT91D2质粒由热休克处理转化进ArcticExpress表达株(AgilentArcticExpress感受态细胞)。获得的细胞在陪替-皿中在LBAgar培养基上在氨苄西林和遗传霉素的存在下生长。选择适合的集落，使在含有氨苄西林和遗传霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，将400μL等份存储于-20℃和于-80℃。
将存储等份解冻，及添加到30mL的LBGKP培养基(含氨苄西林和遗传霉素)。此培养于30℃振摇8h，随后用来接种400mL的含有60g/L的“过夜表达立即TB培养基”(Novagen,参照71491-5)，10g/L的甘油和50mg/L的氨苄西林的生产培养基。培养基允许于20℃搅拌16h，之后是取样品的同时于12℃搅拌另一50h，以测量OD(600nm)和pH。将细胞通过离心收获，及冷冻。获得的细胞湿重是15.77g。
2.57g的获得的沉淀通过添加9.0mL的“BugbusterMasterMix”(Novagen,参照71456)和3.8mL的水裂解。将裂解物通过离心回收，及直接用于活性测试。
【实施例17：使用pET30a+质粒和Tuner(DE3)表达株的UGT91D2的制备】
将pET30a+_UGT91D2质粒由热休克处理转化进Tuner(DE3)表达株(NovagenTunertm(DE3)感受态细胞)。使获得的细胞在陪替-皿中，在卡那霉素存在下生长在LBAgar培养基上。选择适合的集落，及使在液体LBGKP培养基(含卡那霉素)中生长。添加甘油，及将400μL等份于-20℃和于-80℃存储。
将存储等份解冻，及添加到100mL的含有50mg/L的卡那霉素的LB培养基。此培养物于30℃振摇15h。将6.2mL的此培养物用于接种500mL的含有LB的生产培养基。将此培养基于37℃搅拌，直到获得0.9的OD(600nm)，之后添加500μL的100mMIPTG溶液(培养基中的IPTG浓度是100μM)，培养基于30℃搅拌4h，将细胞通过离心收获，及冷冻。获得的细胞湿重是4.02g。
1.92g的获得的沉淀通过添加6.8mL的“BugbusterMaster混合物”(Novagen,参照71456)和2.8mL的水裂解。将裂解物通过离心回收，及直接测试活性。
【实施例18：使用pET30a+质粒和ArcticExpress表达株的UGT91D2的制备】
将pET30a+_UGT91D2质粒由热休克处理转化进ArcticExpress(DE3)表达株(AgilentArcticExpress感受态细胞)。获得的细胞在陪替-皿中在LBAgar培养基上在卡那霉素和遗传霉素存在下生长。选择适合的集落，在含有卡那霉素和遗传霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，将400μL等份存储于-20℃和于-80℃。
将存储等份解冻，及添加到30mL的LBGKP培养基(含卡那霉素和遗传霉素)。此培养于30℃振摇8h，随后用来接种400mL的含有60g/L的“过夜表达立即TB培养基”(Novagen,参照71491-5)，10g/L的甘油和50mg/L的氨苄西林的生产培养基。培养基于20℃搅拌16h，之后是取样品的同时于12℃搅拌另一50h，以测量OD(600nm)和pH。在60h之后，将细胞通过离心收获，及冷冻。获得的细胞湿重是16.07g。
3.24g的获得的沉淀通过添加11.4mL的“BugbusterMasterMix”(Novagen,参照71456)和4.8mL的水裂解。将裂解物通过离心回收，及直接用于活性测试。
【实施例19：UGT91D2的体内制备的活性的测定】
以5mL规模，用1000μL的用于将悬钩子苷转化为甜叶菊苷的裂解物，使用0.5mM的底物，2.5mM的UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，在pH7.2的50mM磷酸钠缓冲液中实施活性测试。取样品，及由HPLC分析。UGT91D2的不同制备物的结果总结于以下表。
*注：活性以每mL裂解物提及。1U会在1小时于30℃和pH7.2转化1μmol的底物。
【实施例20：用于莱苞迪苷A向莱苞迪苷D转变的其他酶】
由公共数据库鉴定以下UDP-葡萄糖基转移酶的基因，由DNA2.0合成，和随后在pET30a+载体中亚克隆。
微平板 位置 基因名称 内部参照 RebA向的RebD转变
C908201 A1 gi115454819_NP_001051010.1 S115N01A1 有活性的
C908201 G2 gi187373030_ACD03249.1 S115N01G2 有活性的
C908201 A7 gi460409128_XP_004249992.1 S115N05A7 有活性的
C912666 E1 gi222619587_EEE55719.1 S115N06E1 有活性的
C912666 C2 gi297795735_XP_002865752.1 S115N06C2 有活性的
氨基酸序列如下：
SEQIDNO:3
>gi|115454819|ref|NP_001051010.1|Os03g0702500[粳稻(OryzasativaJaponica)组]
MDDAHSSQSPLHVVIFPWLAFGHLLPCLDLAERLAARGHRVSFVSTPRNLARLPPVRPELAELVDLVALPLPRVDGLPDGAEATSDVPFDKFELHRKAFDGLAAPFSAFLDTACAGGKRPDWVLADLMHHWVALASQERGVPCAMILPCSAAVVASSAPPTESSADQREAIVRSMGTAAPSFEAKRATEEFATEGASGVSIMTRYSLTLQRSKLVAMRSCPELEPGAFTILTRFYGKPVVPFGLLPPRPDGARGVSKNGKHDAIMQWLDAQPAKSVVYVALGSEAPMSADLLRELAHGLDLAGTRFLWAMRKPAGVDADSVLPAGFLGRTGERGLVTTRWAPQVSILAHAAVCAFLTHCGWGSVVEGLQFGHPLIMLPILGDQGPNARILEGRKLGVAVPRNDEDGSFDRGGVAGAVRAVVVEEEGKTFFANARKLQEIVADREREERCIDEFVQHLTSWNELKNNSDGQYP
SEQIDNO:4
>gi|187373030|gb|ACD03249.1|UDP-糖基转移酶[糙伏毛燕麦(Avenastrigosa)]
MAVKDEQQSPLHILLFPFLAPGHLIPIADMAALFASRGVRCTILTTPVNAAIIRSAVDRANDAFRGSDCPAIDISVVPFPDVGLPPGVENGNALTSPADRLKFFQAVAELREPFDRFLADNHPDAVVSDSFFHWSTDAAAEHGVPRLGFLGSSMFAGSCNESTLHNNPLETAADDPDALVSLPGLPHRVELRRSQMMDPKKRPDHWALLESVNAADQKSFGEVFNSFHELEPDYVEHYQTTLGRRTWLVGPVALASKDMAGRGSTSARSPDADSCLRWLDTKQPGSVVYVSFGTLIRFSPAELHELARGLDLSGKNFVWVLGRAGPDSSEWMPQGFADLITPRGDRGFIIRGWAPQMLILNHRALGGFVTHCGWNSTLESVSAGVPMVTWPRFADQFQNEKLIVEVLKVGVSIGAKDYGSGIENHDVIRGEVIAESIGKLMGSSEESDAIQRKAKDLGAEARSAVENGGSSYNDVGRLMDELMARRSSVKVGEDIIPTNDGL
SEQIDNO:5
>gi|460409128|ref|XP_004249992.1|预测的：花青素-3-O-葡萄糖苷2-O-葡萄糖醛酸基转移酶-样[番茄(Solanumlycopersicum)]
MSPKLHKELFFHSLYKKTRSNHTMATLKVLMFPFLAYGHISPYLNVAKKLADRGFLIYFCSTPINLKSTIEKIPEKYADSIHLIELHLPELPQLPPHYHTTNGLPPNLNQVLQKALKMSKPNFSKILQNLKPDLVIYDILQRWAKHVANEQNIPAVKLLTSGAAVFSYFFNVLKKPGVEFPFPGIYLRKIEQVRLSEMMSKSDKEKELEDDDDDDDLLVDGNMQIMLMSTSRTIEAKYIDFCTALTNWKVVPVGPPVQDLITNDVDDMELIDWLGTKDENSTVFVSFGSEYFLSKEDMEEVAFALELSNVNFIWVARFPKGEERNLEDALPKGFLERIGERGRVLDKFAPQPRILNHPSTGGFISHCGWNSAMESIDFGVPIIAMPMHLDQPMNARLIVELGVAVEIVRDDDGKIHRGEIAETLKGVITGKTGEKLRAKVRDISKNLKTIRDEEMDAAAEELIQLCRNGN
SEQIDNO:6
>gi|222619587|gb|EEE55719.1|假想蛋白OsJ_04191[粳稻(OryzasativaJaponica)组]
MHVVMLPWLAFGHILPFAEFAKRVARQGHRVTLFSTPRNTRRLIDVPPSLAGRIRVVDIPLPRVEHLPEHAEATIDLPSNDLRPYLRRAYDEAFSRELSRLLQETGPSRPDWVLADYAAYWAPAAASRHGVPCAFLSLFGAAALCFFGPAETLQGRGPYAKTEPAHLTAVPEYVPFPTTVAFRGNEARELFKPSLIPDESGVSESYRFSQSIEGCQLVAVRSNQEFEPEWLELLGELYQKPVIPIGMFPPPPPQDVAGHEETLRWLDRQEPNSVVYAAFGSEVKLTAEQLQRIALGLEASELPFIWAFRAPPDAGDGDGLPGGFKERVNGRGVVCRGWVPQVKFLAHASVGGFLTHAGWNSIAEGLANGVRLVLLPLMFEQGLNARQLAEKKVAVEVARDEDDGSFAANDIVDALRRVMVGEEGDEFGVKVKELAKVFGDDEVNDRYVRDFLKCLSEYKMQRQG
SEQIDNO:7
>gi|297795735|ref|XP_002865752.1|UDP-葡萄糖醛酸基/UDP-葡萄糖基转移酶家族蛋白[琴叶拟南芥琴叶亚种(Arabidopsislyratasubsp.lyrata)]
MDDKKEEVMHIAMFPWLAMGHLLPFLRLSKLLAQKGHKISFISTPRNILRLPKLPSNLSSSITFVSFPLPSISGLPPSSESSMDVPYNKQQSLKAAFDLLQPPLTEFLRLSSPDWIIYDYASHWLPSIAKELGISKAFFSLFNAATLCFMGPSSSLIEESRSTPEDFTVVPPWVPFKSTIVFRYHEVSRYVEKTDEDVTGVSDSVRFGYTIDGSDAVFVRSCPEFEPEWFSLLQDLYRKPVFPIGFLPPVIEDDDDDTTWVRIKEWLDKQRVNSVVYVSLGTEASLRREELTELALGLEKSETPFFWVLRNEPQIPDGFEERVKGRGMVHVGWVPQVKILSHESVGGFLTHCGWNSVVEGIGFGKVPIFLPVLNEQGLNTRLLQGKGLGVEVLRDERDGSFGSDSVADSVRLVMIDDAGEEIREKVKLMKGLFGNMDENIRYVDELVGFMRNDESSQLKEEEEEDDCSDDQSSEVSSETDEKELNLDLKEEKRRISVYKSLSSEFDDYVANEKMG
在微孔板中接收测试的质粒，在各分离的孔中含有质粒作为冷冻干燥的固体。
质粒的悬浮液。向各孔添加24μL的超纯无菌水，和微孔板于室温振摇30分钟。随后，将板于4℃温育1小时。还通过抽吸移液混合各孔的内容物。由Qubit2.0分析，使用1μL的悬浮液实施质粒定量。质粒的测定的量是:
微孔板 位置 内部参照 [质粒]ng/μL
C908201 A1 S115N01A1 32.8
C908201 G2 S115N01G2 41.0
C908201 A7 S115N05A7 56.6
C912666 E1 S115N06E1 64.0
C912666 C2 S115N06C2 31.4
用质粒转化感受态细胞。从-80℃冷冻器获取化学感受态EC100细胞的等份，及存储在冰上。使细胞在冰上解冻10分钟。将10μL的以上描述的质粒溶液的稀释物加入1.5mL的无菌微型管(为了用50pg的DNA转化各细胞)，及存储在冰上。将100μL的化学感受态细胞加入各微型管。在化学感受态细胞质粒混合物在冰上温育20min之后，于42℃实施30s热休克。
还在冰上实施温育2分钟。向各微型管添加300μL的SOC培养基，及将得到的混合物转移到无菌15mL管。在以135rpm振摇着于37℃温育1小时之后，将混合物铺到含有卡那霉素50μg/mL的固体Luria肉汤培养基上。将陪替-皿于37℃温育16小时。
甘油中浓储物溶液的制备和质粒的纯化。向50mL无菌Falcon管添加10mL的含有50μg/mL的卡那霉素的Luria肉汤培养基。将培养基用自以上描述的平皿分离的集落接种，将培养物以135rpm振摇着于37℃温育16小时。
向1.5mL的含有300μL的60％无菌甘油溶液的无菌微型管中添加600μL的培养。浓储物溶液存储于-80℃。
余部的培养物以5,525g于10℃离心10分钟，及在移出上清液之后，沉淀存储在冰上。产生的质粒根据QiagenQiaprepSpinMiniprep试剂盒(ref：27106)纯化，和在260nm处测量质粒产率。质粒溶液存储于4℃。如下测定质粒量:
微孔板 位置 测试的内部参照 [质粒]ng/μL
C908201 A1 S115N01A1 115.7
C908201 G2 S115N01G2 120.4
C908201 A7 S115N05A7 293.8
C912666 E1 S115N06E1 126.1
C912666 C2 S115N06C2 98.8
酶的体外表达。将18μL的质粒溶液(含有大致1.5μg的质粒)用于根据PromegaS30T7高-产率蛋白表达系统(ref:L1110)试剂盒体外表达。表达培养基如下产生:
S30预混物加 T7S30提取物 总
试验 30μL 27μL 57μL
参照 20μL 18μL 38μL
将制备的表达培养基混合物加入质粒溶液，和每45分钟混合混合物着使溶液于30℃温育3小时。冷冻5μL的混合物，然而余部用于莱苞迪苷A向莱苞迪苷D的转变的催化性测试。
对于莱苞迪苷A向莱苞迪苷D的转化的催化性测试。将含有0.5mM莱苞迪苷A，3mMMgCl2，50mM磷酸缓冲液(pH7.2)和2.5mMUDP-葡萄糖的430μL的反应混合物添加到1.5mL无菌微型管。添加52μL的酶表达培养基，及使得到的混合物于30℃反应24小时。在2小时，16小时和24小时之后取125μL样品，及添加到115μL的60％甲醇和10μL的2NH2SO4。将骤冷的样品于室温以18,000g离心2分钟。将200μL转移到HPLC管形瓶及分析。
HPLC分析。HPLC测定如下实施：
设备
设备 提供商 参照 Lot#
Elite 日立 L-2130 NA
光电二极管阵列 日立 L-2455 NA
电晕CAD检测器 ESA 70-6186A CO-2044
注射器100μL 日立 NA
Column Synergy 4u氢-RP 80A(250×4.60mm) Phenomenex 00G-4375-E0 588582-12
仪器条件
柱温度 55℃
检测 UV 205nm；bw 400nm CAD检测
分析持续时间 15min
注射的体积 10μL
流速 1mL/min
移动相梯度程序
时间(min) ％含有0.04％乙酸的水 ％甲醇
0 40 60
8 25 75
10 25 75
11 40 60
15 40 60
以下提供HPLC测定结果：
酶S115N05A7对于RebA向RebD转变具有最高活性(约22.4％)。
随rebD而至少3种酶产生显著量的未知的糖苷(标记为RebUNK；随后鉴定为rebD2)，如见于图42～46。
【实施例21：体外产生的EUGT11的活性】
如描述于专利申请WO/2013/022989A2的EUGT11基因由DNA2.0合成，和随后亚克隆进pET30a+载体。
微平板 位置 GI号 版本 内部参照 RebA向RebD的转变
C912666 G4 41469452 AAS07253.1 S115N08G4 有活性的
氨基-酸序列如下：
SEQIDNO:8
>gi|41469452|gb|AAS07253.1|推定的UDP-葡萄糖醛酸基和UDP-葡萄糖基转移酶[粳稻(OryzasativaJaponica)组]EUGT11酶，来自专利申请WO/2013/022989A2
MHVVICPLLAFGHLLPCLDLAQRLACGHRVSFVSTPRNISRLPPVRPSLAPLVSFVALPLPRVEGLPNGAESTHNVPHDRPDMVELHLRAFDGLAAPFSEFLGTACADWVMPTSSAPRQTLSSNIHRNSSRPGTPAPSGRLLCPITPHSNTLERAAEKLVRSSRQNARARSLLAFTSPPLPYRDVFRSLLGLQMGRKQLNIAHETNGRRTGTLPLNLCRWMWKQRRCGKLRPSDVEFNTSRSNEAISPIGASLVNLQSIQSPNPRAVLPIASSGVRAVFIGRARTSTPTPPHAKPARSAAPRAHRPPSSVMDSGYSSSYAAAAGMHVVICPWLAFGHLLPCLDLAQRLASRGHRVSFVSTPRNISRLPPVRPALAPLVAFVALPLPRVEGLPDGAESTNDVPHDRPDMVELHRRAFDGLAAPFSEFLGTACADWVIVDVFHHWAAAAALEHKVPCAMMLLGSAHMIASIADRRLERAETESPAAAGQGRPAAAPTFEVARMKLIRTKGSSGMSLAERFSLTLSRSSLVVGRSCVEFEPETVPLLSTLRGKPITFLGLMPPLHEGRREDGEDATVRWLDAQPAKSVVYVALGSEVPLGVEKVHELALGLELAGTRFLWALRKPTGVSDADLLPAGFEERTRGRGVVATRWVPQMSILAHAAVGAFLTHCGWNSTIEGLMFGHPLIMLPIFGDQGPNARLIEAKNAGLQVARNDGDGSFDREGVAAAIRAVAVEEESSKVFQAKAKKLQEIVADMACHERYIDGFIQQLRSYKD
在微孔板中接收测试的质粒，在分离的孔中含有质粒作为冷冻干燥的固体。
质粒的悬浮液。向孔添加24μL的超纯无菌水，和微孔板于室温振摇30分钟。随后，将板于4℃温育1小时。孔的内容物还通过抽吸移液混合。质粒定量由Qubit2.0分析，使用1μL的悬浮液实施。如下测定质粒量:
微孔板 位置 测试的内部参照 [质粒]ng/μL
C912666 G4 S115N08G4 19.2
用质粒转化感受态细胞。从-80℃冷冻器获取化学感受态EC100细胞的等份，及存储在冰上。使细胞在冰上解冻10分钟。将10μL的以上描述的质粒溶液的稀释物加入1.5mL的无菌微型管(为了用50pg的DNA转化各细胞)，及存储在冰上。将100μL的化学感受态细胞加入微型管。在将化学感受态细胞/质粒混合物在冰上温育20min之后，于42℃实施30s热休克。
还在冰上实施2分钟温育。向微型管添加300μL的SOC培养基，及将得到的混合物转移到无菌15mL管。在以135rpm振摇着于37℃温育1小时之后，将混合物铺到含有卡那霉素50μg/mL的固体Luria肉汤培养基上。将平皿于37℃温育16小时。
甘油中浓储物溶液的制备和质粒的纯化。向50mL无菌Falcon管添加10mL的含有50μg/mL的卡那霉素的Luria肉汤培养基。培养基用自以上描述的平皿分离的集落接种，和使培养物以135rpm振摇着于37℃温育16小时。
向1.5mL的含有300μL的60％无菌甘油溶液的无菌微型管添加600μL的培养物。浓储物溶液存储于-80℃。
余部的培养物以5,525g于10℃离心10分钟，及在移出上清液之后，沉淀存储在冰上。产生的质粒根据QiagenQiaprepSpinMiniprep试剂盒(ref：27106)纯化，和在260nm处测量质粒产率。质粒溶液存储于4℃。如下测定质粒量:
微孔板 位置 测试的内部参照 [质粒]ng/μL
C912666 G4 S115N08G4 38.4
EUGT11的体外表达。将18μL的稀释的质粒溶液(含有大致1.5μg的质粒)用于根据PromegaS30T7高-产率蛋白表达系统(ref:L1110)试剂盒体外表达。表达培养基如下产生:
S30预混物加 T7S30提取物 DNA模板 总
试验 30μL 27μL 18μL(～1.5μg) 75μL
参照 20μL 18μL 12μL(～1.0μg) 50μL
将制备的表达培养基混合物加入质粒溶液，和每45分钟混合混合物着使溶液于30℃温育3小时。冷冻5μL的混合物，然而余部用于莱苞迪苷A向莱苞迪苷D的转变的催化性测试。
对于莱苞迪苷A向莱苞迪苷D的转化的催化性测试。将430μL的含有0.5mM莱苞迪苷A，3mMMgCl2，50mM磷酸缓冲液(pH7.2)和2.5mMUDP-葡萄糖的反应混合物添加到1.5mL无菌微型管。添加52μL的酶表达培养基，及使得到的混合物于30℃反应24小时。在2小时，16小时和24小时之后取125μL样品，及添加到115μL的60％甲醇和10μL的2NH2SO4。将骤冷的样品于室温以18,000g离心2分钟。将200μL转移到HPLC管形瓶，及分析，如见于图47。
HPLC分析.HPLC测定如在实施例20中描述实施。
以下提供HPLC测定结果：
【实施例22：酶的体内产生】
体内产生实施例20中描述的酶。
在大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)中由热休克导入含有对应于酶的基因的pET30A+载体。获得的细胞在平皿中，在卡那霉素的存在下生长，选择适合的集落，使生长在液体LB培养基(锥形瓶)中。将甘油加入悬浮液作为冷冻保护剂，及400μL等份存储于-20℃和于-80℃。
将含有pET30A+_UGT质粒的大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)的存储等份解冻，及添加到30mL的LBGKP培养基(20g/LLuria肉汤Lennox；50mMPIPES缓冲剂pH7.00；50mM磷酸缓冲液pH7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L的卡那霉素)。使此培养物于30℃以135rpm振摇8hrs。
生产培养基含有60g/L的过夜表达立即TB培养基(Novagen)，10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素。将预培养物添加到400mL的此培养基，和溶液取样品的同时于20℃搅拌，以测量OD和pH。培养物显著生长和获得良好OD。在40hrs之后，将细胞通过离心收获，及冷冻。以下提及细胞湿重(CWW)的以下产率。
GI号 版本 CWW
115454819 NP_001051010.1 9.2g
187373030 ACD03249.1 7.4g
460409128 XP_004249992.1 6.8g
222619587 EEE55719.1 7.5g
297795735 XP_002865752.1 8.8g
通过添加BugbusterMaster混合物(Novagen)实施裂解，和将裂解物通过离心回收，及新鲜使用。
活性的确定。以5mL规模，用1,000μL的用于转化莱苞迪苷A的解冻的裂解物，使用0.5mM的底物，2.5mM的UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，在pH7.2的50mM磷酸钠缓冲液中实施活性测试。取样品，及由HPLC分析，如见于图48～52。
HPLC分析.HPLC测定如在实施例20中描述实施。
以下提供不同酶的结果。
GI号 版本 45hrs后的转变 Reb D选择性
115454819 NP_001051010.1 1.1％ 100％
187373030 ACD03249.1 0.8％ 100％
460409128 XP_004249992.1 62.1％ 43.6％
222619587 EEE55719.1 2.9％ Reb D检测不到
297795735 XP_002865752.1 0.0％ Reb D检测不到
【实施例23：糖苷的鉴定】
将表示GINo.460409128的反应混合物，特别是实施例20的样品“12400S115N05A7T24h130627ABA”(下文S115N05A7)，及实施例22的样品“12400S129N04T45h130712ABA”(下文S129N04)由LC-MS另外地检定，以鉴定未知的糖苷。使用Agilent1200系列HPLC系统，其装备双泵(G1312B)，自动采样器(G1367D)，恒温柱隔室(G1316B)，DAD检测器(G1315C)，与Agilent6110AMSD连接，及与“LC/MSDChemstation”软件接入。
仪器条件
移动相梯度程序
时间(min) A(％)：甲酸0.1％ B(％)：乙腈
0 75 25
8.5 75 25
10.0 71 29
16.5 70 30
在LCMS系统上在3.5min观察到的化合物对应于样品“S115N05A7”中的化合物“未知的4.508”(实施例20)，及样品“S129N04”中的化合物“未知的RT4.526”(实施例22)。LCMS数据提示，此化合物在其结构中具有6个糖苷残基(C56H90O33)，及被发现是rebM的异构体形式，即rebM2(见实施例40讨论)。
然而在LCMS系统上，在7.6min观察到的化合物，对应于样品“S115N05A7”中的化合物“rebUNK”(实施例20)，及样品“S129N04”中的化合物“rebUNK”(实施例22)，LCMS数据提示，“rebUNK”在其结构中具有5个糖苷残基(C50H80O28)，及发现是rebD的异构体形式，即rebD2(见实施例39讨论)。以下提供这些化合物的比和LCMS层析谱，及显示于图53～54。
【实施例24：糖苷的鉴定】
将表示GINo.460409128的反应混合物，特别是实施例22的样品“12400S129N04T45h130712ABA”(下文S129N04)由LC-MS另外地检定，如见于图55～56，随由PureCircleSdnBhd(马来西亚)产生的甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)叶提取物“MLD1”，以确定S129N04糖苷的天然发生。
测定显示，在实施例23中在LCMS系统上在3.5min观察到的化合物(C56H90O33；随后确认为rebM2)，及在实施例23中在LCMS系统上在7.6min观察到的化合物，(C50H80O28；rebUNK；随后确认为rebD2)存在于甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)植物的提取物中。
【实施例25：莱苞迪苷E向莱苞迪苷D的转变】
反应总体积是5.0mL，含以下组成：100mM磷酸钾缓冲液pH7.5，3mMMgCl2，2.5mMUDP-葡萄糖，0.5mM莱苞迪苷E和500μL的UGT76G1解冻的裂解物(在pET30a+载体中克隆UGT76G1基因，及在大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)中表达)。反应于30℃，在轨道摇床上，以135rpm运行。为采样，300μL的反应混合物用30μL的2NH2SO4和270μL的甲醇/水(6/4)骤冷。样品立即离心，及在由HPLC(CAD检测)分析之前于10℃保持。获得对应于莱苞迪苷E向莱苞迪苷D的完全转变的以下反应特征，如见于图57。
【实施例26：为莱苞迪苷D向莱苞迪苷M的转变的UGT76G1的定向衍化】
起始于如描述于Genbank(AAR06912.1)的UGT76G1的氨基酸序列，鉴定可改变用于莱苞迪苷D(RebD)向莱苞迪苷M(RebM)转化的酶的活性的在各种氨基酸位置的不同突变。随后使用由DNA2.0ProteinGPSTM策略设计的此突变的列表合成含有为在大肠埃希氏菌(E.coli)中表达密码子-优化的这些突变中的3，4或5个的96个变体基因。基因在pET30a+质粒中亚克隆，及用于转化大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)化学感受态细胞。获得的细胞在陪替-皿中在固体LB培养基上在卡那霉素的存在下生长。选择适合的集落，使在管中的液体LB培养基中生长。将甘油加入悬浮液作为冷冻保护剂，和400μL等份存储于-20℃和于-80℃。
将含有pET30a+_UGT76G1var质粒的大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)的这些存储等份解冻，及添加到LBGKP培养基(20g/LLuria肉汤Lennox；50mMPIPES缓冲剂pH7.00；50mM磷酸缓冲液pH7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L的卡那霉素)。将此培养物在96微孔板中以135rpm于30℃振摇8h。
3.95mL的含有60g/L的过夜ExpressTM立即TB培养基10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素的生产培养基用50μL的以上描述的培养物接种。在48深孔板中，将得到的培养于20℃搅拌。培养物显著生长，和获得良好OD(600nm；1cm)。在44h之后，将细胞通过离心收获，及冷冻。
通过向解冻的细胞添加Master混合物来实施裂解，和通过离心回收裂解物。用100μL的加入在50mM磷酸缓冲液pH7.2中莱苞迪苷D(终浓度0.5mM)，MgCl2(终浓度3mM)和UDP-葡萄糖(终浓度2.5mM)的溶液的新鲜裂解物实施活性测试。
使反应于30℃运行，和在2，4，7和24h之后取样品，以由HPLC(CAD检测)，使用以上为莱苞迪苷D向莱苞迪苷M的转化描述的分析方法测定转变和初速度。结果示于以下表。
*突变被标识如下：原氨基酸-位置-新氨基酸：例如在第33位的丙氨酸向甘氨酸的突变被标识为A33G。
【实施例27：UGTSL2的体内产生】
SEQIDNO:9
UGTSL2(GI_460410132/XP_004250485.1)氨基酸序列：
MATNLRVLMFPWLAYGHISPFLNIAKQLADRGFLIYLCSTRINLESIIKKIPEKYADSIHLIELQLPELPELPPHYHTTNGLPPHLNPTLHKALKMSKPNFSRILQNLKPDLLIYDVLQPWAEHVANEQNIPAGKLLTSCAAVFSYFFSFRKNPGVEFPFPAIHLPEVEKVKIREILAKEPEEGGRLDEGNKQMMLMCTSRTIEAKYIDYCTELCNWKVVPVGPPFQDLITNDADNKELIDWLGTKHENSTVFVSFGSEYFLSKEDMEEVAFALELSNVNFIWVARFPKGEERNLEDALPKGFLERIGERGRVLDKFAPQPRILNHPSTGGFISHCGWNSAMESIDFGVPIIAMPIHNDQPINAKLMVELGVAVEIVRDDDGKIHRGEIAETLKSVVTGETGEILRAKVREISKNLKSIRDEEMDAVAEELIQLCRNSNKSK
在大肠埃希氏菌(E.coli)Bl21(DE3)中由热休克导入含有UGTSL2基因的pET30A+载体。获得的细胞在陪替-皿中在卡那霉素的存在下生长，选择适合的集落，使生长在液体LB培养基(锥形瓶)中。将甘油加入悬浮液作为冷冻保护剂，及400μL等份存储于-20℃和于-80℃。
将含有pET30A+_UGTSL2质粒的大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)的存储等份解冻，及添加到30mL的LBGKP培养基(20g/LLuria肉汤Lennox；50mMPIPES缓冲剂pH7.00；50mM磷酸缓冲液pH7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L的卡那霉素)。使此培养物以135rpm于30℃振摇8h。
生产培养基含有60g/L的过夜表达立即TB培养基(Novagen)，10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素。将预培养物添加到200mL的此培养基，和溶液取样品的同时于20℃搅拌，以测量OD和pH。培养物显著生长和获得良好OD。在40h之后，将细胞通过离心收获，及冷冻而获得6.22g的细胞湿重。
对1.4g的细胞通过添加BugbusterMaster混合物(Novagen)实施裂解，将裂解物通过离心回收，及新鲜使用。
【实施例28：用UGTSL和UGTSL2的甜叶菊苷向莱苞迪苷E转变的活性的确定】
UGTSL根据实施例22制备，及UGTSL2根据实施例27制备。
以3mL规模，用600μL的用于转化甜叶菊苷的裂解物，使用0.5mM的底物，2.5mM的UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，在pH7.2的50mM磷酸钠缓冲液中实施活性测试。取样品，及由HPLC分析。HPLC分析如显示于图58～59。如在实施例20中描述实施HPLC测定。
以下提供不同酶和对应层析谱的结果
注：1基于甜叶菊苷的初始浓度
【实施例29：用UGTSL和UGTSL2的悬钩子苷向莱苞迪苷E转变的活性的确定】
UGTSL根据实施例22制备，及UGTSL2根据实施例27制备。
以3mL规模，用600μL用于转化悬钩子苷的裂解物，使用0.5mM的底物，2.5mM的UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，在pH7.2的50mM磷酸钠缓冲液中实施活性测试。取样品，及由HPLC分析，如显示于图60～61。HPLC测定如在实施例20中描述实施。
以下提供不同酶和对应层析谱的结果
注：1基于悬钩子苷的初始浓度
【实施例30：用UGTSL2的莱苞迪苷A向莱苞迪苷D转变的活性的确定】
UGTSL2根据实施例27制备。
以3mL规模，用60μL用于转化莱苞迪苷A的裂解物，使用0.5mM的底物，2.5mM的UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，在pH7.2的50mM磷酸钠缓冲液中实施活性测试。取样品，及由HPLC分析，如显示于图62。HPLC测定如在实施例20中描述实施。
以下提供23h.的反应和对应层析谱的结果。
注：1基于莱苞迪苷A的初始浓度
【实施例31：糖苷的鉴定】
随由PureCircleSdnBhd(马来西亚)产生的甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)叶提取物“MLD1”，由LC-MS分析根据实施例30制备的及温育45hrs的反应混合物，以确定天然形成的糖苷的发生。
使用Agilent1200系列HPLC系统，其装备双泵(G1312B)，自动采样器(G1367D)，恒温柱隔室(G1316B)，DAD检测器(G1315C)，连接Agilent6110AMSD，及接入“LC/MSDChemstation”软件，及层析谱显示于图63。
仪器条件
移动相梯度程序
时间(min) A(％)：甲酸0.1％ B(％)：乙腈
0 75 25
30 75 25
33 68 32
75 68 32
测定显示，在实施例23中，在LC-MS系统上在11.77min观察到的化合物与在3.5min观察到的化合物相同(C56H90O33；随后确认为rebM2)，及在实施例23中，在26.64min观察到的化合物与在7.6min观察到的化合物相同(C50H80O28；rebUNK；随后确认为rebD2)。在13.96min观察到rebM的其他异构体，和也在25.06min观察到rebD的另一异构体形式。全部观察到的化合物存在于甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)植物的提取物中。
【实施例32：UGTLB的体内制备和活性确定】
SEQIDNO:10
UGTLB(GI_209954733/BAG80557.1)氨基酸序列
MGTEVTVHKNTLRVLMFPWLAYGHISPFLNVAKKLVDRGFLIYLCSTAINLKSTIKKIPEKYSDSIQLIELHLPELPELPPHYHTTNGLPPHLNHTLQKALKMSKPNFSKILQNLKPDLVIYDLLQQWAEGVANEQNIPAVKLLTSGAAVLSYFFNLVKKPGVEFPFPAIYLRKNELEKMSELLAQSAKDKEPDGVDPFADGNMQVMLMSTSRIIEAKYIDYFSGLSNWKVVPVGPPVQDPIADDADEMELIDWLGKKDENSTVFVSFGSEYFLSKEDREEIAFGLELSNVNFIWVARFPKGEEQNLEDALPKGFLERIGDRGRVLDKFAPQPRILNHPSTGGFISHCGWNSVMESVDFGVPIIAMPIHLDQPMNARLIVELGVAVEIVRDDYGKIHREEIAEILKDVIAGKSGENLKAKMRDISKNLKSIRDEEMDTAAEELIQLCKNSPKLK
在大肠埃希氏菌(E.coli)Bl21(DE3)中由热休克导入含有UGTLB基因的pET30A+载体。使获得的细胞在陪替-皿中在卡那霉素的存在下生长，和选择适合的集落，使生长在液体LB培养基(锥形瓶)中。将甘油加入悬浮液作为冷冻保护剂，及400μL等份存储于-20℃和于-80℃。
将含有pET30A+_UGTLB质粒的大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)的存储等份解冻，及添加到30mL的LBGKP培养基(20g/LLuria肉汤Lennox；50mMPIPES缓冲剂pH7.00；50mM磷酸缓冲液pH7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L的卡那霉素)。使此培养物以135rpm于30℃振摇8h。
生产培养基含有60g/L的过夜表达立即TB培养基(Novagen)，10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素。将预培养物添加到200mL的此培养基，和溶液取样品的同时于20℃搅拌，以测量OD和pH。培养物显著生长和获得良好OD。在40h之后，将细胞通过离心收获，及冷冻而获得5.7g的细胞湿重。
对1.2g的细胞通过添加6mLBugbusterMaster混合物(Novagen)实施裂解，和将裂解物通过离心回收，及新鲜使用。
【用UGTLB的甜叶菊苷向莱苞迪苷E转变的活性确定】
以3mL规模，用600μL用于转化甜叶菊苷的裂解物，使用0.5mM的底物，2.5mM的UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，在pH7.2的50mM磷酸钠缓冲液中实施活性测试。取样品，及由HPLC分析，如显示于图64～66。以下描绘对应层析谱。
酶内部参照 GI号 版本 甜叶菊苷conv.1(反应时间) 莱苞迪苷E形成1
UGTLB 209954733 BAG80557.1 89％(22h.) 3％
注：1基于甜叶菊苷的初始浓度
【用UGTLB的悬钩子苷向莱苞迪苷E转变的活性确定】
以3mL规模，用600μL用于转化悬钩子苷的裂解物，使用0.5mM的底物，2.5mM的UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，在pH7.2的50mM磷酸钠缓冲液中实施活性测试。取样品，及由HPLC分析。以下描绘对应层析谱。
酶内部参照 GI号 版本 悬钩子苷conv.1(反应时间) 莱苞迪苷E形成1
UGTLB 209954733 BAG80557.1 65％(5h.) 4％
注：1基于悬钩子苷的初始浓度
【用UGTLB的莱苞迪苷A向莱苞迪苷D转变的活性确定】
以3mL规模，用600μL用于转化莱苞迪苷A的裂解物，使用0.5mM的底物，2.5mM的UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，在pH7.2的50mM磷酸钠缓冲液中实施活性测试。取样品，及由HPLC分析。以下描绘23h的反应之后的对应层析谱。
酶内部参照 GI号 版本 莱苞迪苷A conv.1(反应时间) 莱苞迪苷D形成1
UGTLB 209954733 BAG80557.1 72％(22h.) 10％
注：1基于莱苞迪苷A的初始浓度
【实施例33：用UGTSL，UGTSL2和UGTLB的悬钩子苷和甜叶菊苷转变的反应产物的确定】
以与实施例28类似方式进行用UGTSL和UGTSL2的甜叶菊苷的转变，及与实施例29类似地进行用UGTSL和UGTSL2的悬钩子苷的转变。与实施例32类似地进行用UGTLB的悬钩子苷和甜叶菊苷的转变。
由LCMS分析反应混合物，以测定全部反应产物。
【悬钩子苷转变产物】
【甜叶菊苷转变产物】
可见，在悬钩子苷转变产物之中，除了甜叶菊苷，RebE和RebD之外，有具有804的分子量的至少3种另外的化合物。这些化合物的保留时间不与RebB匹配，其已知与甜叶菊苷具有相同的分子量。由于这些化合物与甜叶菊苷具有相同的分子量，可推定，这些新甜叶菊醇糖苷是甜叶菊苷的异构体。
另一方面，在甜叶菊苷转变产物之中，除了RebE和RebD，有具有966的分子量的至少3种另外的化合物。这些化合物的保留时间不与RebA匹配，已知其与RebE具有相同的分子量。由于这些化合物与RebA和RebE具有相同的分子量，可推定，这些新甜叶菊醇糖苷是RebA(RebE)的异构体。
【实施例34：啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中UGT76G1的体内产生】
SEQIDNO:11
UGT76G1[甜叶菊(Steviarebaudiana)](gi_37993653/gb_AAR06912.1)
MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL
将上述的氨基酸序列为在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中表达密码子优化。此外酵母共有序列AACACA添加在ATG起始密码子之前。将合成基因在pYES2载体中使用HindIII和XbaI限制性位点进行亚克隆。将pYES2_UGT76G1_Sc载体用于转化化学感受态啤酒糖酵母(S.cerevisiae)INVSc1细胞(Invitrogen)。
使细胞在含有2％葡萄糖缺少尿嘧啶的固体合成最小培养基上生长，和挑选单集落，及使在缺少尿嘧啶的液体合成最小培养基(含有2％葡萄糖的SC-U)中生长。在离心之后，将细胞用SC-U(含有2％葡萄糖)和60％甘油/水悬浮。等份存储于-80℃，及一个等份用于在SC-U(含有2％葡萄糖)中于30℃起始培养43h。将部分此培养物离心，及在诱导培养基(含有2％半乳糖的SC-U)中于30℃悬浮19h30。
通过离心获得细胞，和用5体积的CelLyticTMY细胞裂解试剂(Sigma)裂解。裂解物直接用于活性测试(UGT76G1_Sc)。
【实施例35：用于莱苞迪苷D向莱苞迪苷M的转变的UGT76G1_Sc的活性确定】
UGT76G1_Sc根据实施例34制备。以2mL规模，用200μL用于转化莱苞迪苷D的裂解物，使用0.5mM的底物，2.5mM的UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，在pH7.2的50mM磷酸钠缓冲液中实施活性测试。取样品，及由HPLC分析，如显示于图67。以下描绘对应层析谱。
酶内部参照 莱苞迪苷D conv.1(反应时间) 莱苞迪苷M选择性1
UGT76G1_Sc 85％(21h.) 100％
注：1基于莱苞迪苷D的初始浓度
【实施例36：啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中UGTSL的体内产生】
SEQIDNO:12
UGTSL[番茄(Solanumlycopersicum)](gi_460409128/XP_004249992.1
MSPKLHKELFFHSLYKKTRSNHTMATLKVLMFPFLAYGHISPYLNVAKKLADRGFLIYFCSTPINLKSTIEKIPEKYADSIHLIELHLPELPQLPPHYHTTNGLPPNLNQVLQKALKMSKPNFSKILQNLKPDLVIYDILQRWAKHVANEQNIPAVKLLTSGAAVFSYFFNVLKKPGVEFPFPGIYLRKIEQVRLSEMMSKSDKEKELEDDDDDDDLLVDGNMQIMLMSTSRTIEAKYIDFCTALTNWKVVPVGPPVQDLITNDVDDMELIDWLGTKDENSTVFVSFGSEYFLSKEDMEEVAFALELSNVNFIWVARFPKGEERNLEDALPKGFLERIGERGRVLDKFAPQPRILNHPSTGGFISHCGWNSAMESIDFGVPIIAMPMHLDQPMNARLIVELGVAVEIVRDDDGKIHRGEIAETLKGVITGKTGEKLRAKVRDISKNLKTIRDEEMDAAAEELIQLCRNGN
将上述的氨基酸序列为在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中表达密码子优化。此外酵母共有序列AACACA添加在ATG起始密码子之前。将合成基因使用HindIII和XbaI限制性位点在pYES2载体中进行亚克隆。将pYES2_UGTSL_Sc载体用于转化化学感受态啤酒糖酵母(S.cerevisiae)INVSc1细胞(Invitrogen)。
使细胞在含有2％葡萄糖，缺少尿嘧啶的固体合成最小培养基上生长，和单集落挑选，及使在缺少尿嘧啶的液体合成最小培养基(含有2％葡萄糖的SC-U)中生长。在离心之后，将细胞用SC-U(含有2％葡萄糖)和60％甘油/水悬浮。等份存储于-80℃，及一个等份用于在SC-U(含有2％葡萄糖)中于30℃起始培养43h。将部分此培养物离心，及于30℃在诱导培养基(含有2％半乳糖的SC-U)中悬浮19h30。
通过离心获得细胞，和用5体积的CelLyticTMY细胞裂解试剂(Sigma)裂解。裂解物直接用于活性测试(UGTSL_Sc)。
【实施例37：用于莱苞迪苷A向莱苞迪苷D的转变的UGTSL_Sc的活性确定】
UGTSL_Sc制备根据实施例36。以2mL规模，用200μL用于转化莱苞迪苷A的裂解物，使用0.5mM的底物，2.5mM的UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，在pH7.2的50mM磷酸钠缓冲液中实施活性测试。取样品，及由HPLC分析，如显示于图68。以下描绘对应层析谱。
酶内部参照 莱苞迪苷A conv.1(反应时间) 莱苞迪苷D选择性1
UGTSL_Sc 46％(4h) 42％
注：1基于莱苞迪苷A的初始浓度
【实施例38：莱苞迪苷M的分离】
实施例14的产物混合物的量对于经制备性HPLC方法分离不足够大。因此，将用一系列注射的分析HPLC用于分离混合物的组分。根据以上在实施例14中所述的方法进行分离，以提供对应于图5的HPLC踪迹中的2个主要峰的2个级分：级分A(保留时间24.165分钟)和级分B(保留时间31.325分钟)。
级分A的保留时间与rebD一致，指示来自生物转化反应的未反应的原材料。
纯化的级分B的保留时间(图6)与rebM一致，指示成功的自rebD的生物转化。通过纯化的级分B与rebM标准物(可自PureCircle得到,图7中显示的rebM标准物的HPLC踪迹)的共注射确认级分B中收集的物质鉴定为rebM。级分B及rebM标准物发现以相同的保留时间洗脱(图8)，指示级分B是rebM。
也独立地由NMR和HRMS确认级分B鉴定为rebM。为采样，将级分B在旋转蒸发器下浓缩，冷冻干燥及于40℃干燥40h。
将NMR样品溶于氘化的吡啶(C5D5N)，在VarianUnity加600MHz仪器上使用标准脉冲序列获取谱。将级分B的NMR谱与rebM的NMR谱比较。2个谱的叠加(图9)显示级分B与rebM的峰的一致性。以下示rebM的NMR指定的表：
C5D5N中莱苞迪苷M的1H和13CNMR光谱数据a-c.
a基于COSY，HMQC和HMBC关联制造的指定；b化学位移值以δ(ppm)表示；c偶联常数以Hz表示。
用装备以阳离子模式操作的电喷射电离源的WatersPremierQuadropole飞行时间(Q-TOF)质谱仪产生HRMS(图10)。将样品溶于甲醇，及以2:2:1甲醇:乙腈:水洗脱，及使用机载注射器泵经输注导入。rebM的存在由m/z1313.5265的[M+Na]+加合物确认，其对应于C56H90O33的分子式
【实施例39：RebD2的分离和表征】
粗反应样品。根据实施例22用UGTSL(GI#460409128)制备用于分离的样品，LotCB-2977-106。
HPLC分析.通过使用Waters2695Alliance系统，用以下方法实施样品的初步HPLC分析：phenomenexSynergi氢-RP，4.6×250mm，4μm(p/n00G-4375-E0)；柱Temp：55℃；移动A相：水中的0.0284％乙酸铵(NH4OAc)和0.0116％乙酸(HOAc)；移动B相：乙腈(MeCN)；流速：1.0mL/min；注射体积：10μL。检测由UV(210nm)和CAD实施。
梯度:
时间(min) ％A ％B
0.0-8.5 75 25
10.0 71 29
16.5 70 30
18.5-24.5 66 34
26.5-29.0 48 52
31-37 30 70
38 75 25
用以下方法实施半-制备性纯化级分的分析：水AtlantisdC18，4.6×100mm，5μm(p/n186001340)；移动A相：在水中25％MeCN；移动B相：水中30％MeCN；流速：1.0mL/min；注射体积：10μL。检测由CAD实施。
梯度:
时间(min) ％A ％B
0.0-5.0 100 0
20 20 80
25 20 80
30 100 0
LC-MS.在具有以阴离子模式操作的Waters3100质量检测器的WatersAutoPurificationHPLC/MS系统上实施半-合成甜叶菊醇糖苷混合物的初步分析。通过使用以下方法实施样品分析：phenomenexSynergi氢-RP，4.6×250mm，4μm(p/n00G-4375-E0)；柱Temp：55℃；移动A相：水中的0.0284％NH4OAc和0.0116％HOAc；移动B相：乙腈；流速：1.0mL/min；注射体积：10μL。检测由UV(210nm)，及MSD(-ESIm/z500-2000)实施。梯度条件如以上所列。
分离由HPLC实施。纯化在2步骤中实施。以下总结为半-制备性纯化使用的第1方法。柱：水AtlantisdC18，30×100mm，5μm(p/n186001375)；移动A相：水中25％MeCN；移动B相：水中30％MeCN；流速：45mL/min；注射负荷：20mL的水中溶解的160mg。检测由UV(205nm)实施。
梯度:
时间(min) ％A ％B
0.0-5.0 100 0
20 20 80
25 20 80
30 100 0
第二纯化使用相同的柱和条件，但等度移动相：水中20％MeCN。
自天然的提取物纯化。纯化在3步骤中实施。以下总结为制备性纯化使用的第1方法。第一过程：WatersSymmetryC18，50×250mm，7μm(p/nWAT248000)；等度移动相：含0.05％HOAc的水中50％甲醇(MeOH)；流速：85mL/min；注射负荷：在50mL的移动相中溶解的6g粗提物。检测由UV(210nm)实施。洗脱目标分析物之后，将柱用水中85％MeOH冲洗。
第二过程：WatersSymmetryShieldRP18，50×250mm，7μm(p/nWAT248000)；等度移动相：水中20％MeCN；流速：100mL/min；注射负荷：30mL的水中溶解的0.5g第一级分。检测由UV(210nm)实施。
第三过程：WatersSymmetryShieldRP18，50×250mm，7μm(p/nWAT248000)；等度移动相：水中20％MeCN；流速：100mL/min；注射负荷：30mL的水中溶解的0.5g第二级分。检测由UV(210nm)实施。
MS和MS/MS。MS和MS/MS数据用装备电喷射电离源的Premier质谱仪的WatersQT产生。样品分析由负ESI实施。样品用H2O:乙腈(1:1)稀释50倍，及经输注使用机载注射器泵导入。稀释样品而产生以0.01mg/mL的近似的浓度存在的良好s/n。
NMR.通过在150μL的吡啶-d5中溶解1～2mg来制备样品，在具有2.5mm倒转检测探针的BrukerAvance500MHz仪器上获取NMR数据。1HNMR谱参比残留的溶剂信号(对于吡啶-d5，δH8.74和δC150.35)。
【结果和讨论】
分离和纯化。对根据实施例22用UGTSL(GI#460409128)制备的甜叶菊醇糖苷混合物(批号CB-2977-106)实施分离。物质由LC-MS使用上述方法分析，结果提供于图11。目标靶向的峰是在TIC层析谱中7.7min的那个。此峰的质谱提供m/z1127.6的[M-H]-离子。提供的样品使用以上提供的第1方法条件以单注射(160mg)预先处理。此方法将物质分级分离为糖苷的‘极性’和‘非-极性’混合物。然后将‘极性’混合物通过使用以上第2-步骤条件再处理。半-制备性HPLC踪迹提供于图12。由此半-制备性收集，以纯度>99％分离化合物(CAD,AUC)。级分分析提供于图13。纯化后，将组合的级分由旋转蒸发于35℃浓缩，及冷冻干燥。获得大致1～2mg用于表征。
质量光谱法.通过输注样品获取的ESI-TOF质谱显示m/z1127.4709的[M-H]-离子。[M-H]-离子的质量与分子式C50H80O28良好一致(计算是C50H79O28：1127.4758,误差：-4.3ppm)。MS数据确认1128Da的标称质量，分子式是C50H80O28。
MS/MS谱(选择m/z1127.5的[M-H]-离子用于片段化)指示2葡萄糖单元的损失，和m/z641.3187，479.2655和317.2065的3个葡萄糖部分的连续损失。
NMR光谱学.实施包括1HNMR(图14)，13CNMR(图15和16)，1H-1HCOSY(图17)，HSQC-DEPT(图18)，HMBC(图19和20)，NOESY(图21)和1D-TOCSY(图22～26)的一系列NMR实验，以允许化合物的指定。在～46小时的样品制备后获取的1HNMR中(图27～28)，解析了δH5.04的异头共振，其在原谱中被溶剂(HOD)遮蔽(图14)。
1H，1H-1HCOSY，1H-13CHSQC-DEPT和1H-13CHMBCNMR数据指示，糖苷的中心核心是二萜。1H和1H-13CHSQC-DEPT谱中观察到的5个异头质子的存在确认在结构中5个糖单元。1H-13CHSQC-DEPT谱中δC69.9的亚甲基13C共振指示结构中1→6糖连接的存在。通过使用1H-13CHMBC和1D-TOCSY关联指定糖单元的连接。
自δH1.29的甲基质子至δC177.7的羰基的HMBC关联允许叔甲基(C-18)之一以及C-19的指定，及提供其余苷元的指定的起点。自甲基质子(H-18)至δC38.9，45.0和57.8的碳的另外的HMBC关联允许C-3，C-4和C-5的指定。1H-13CHSQC-DEPT数据的分析指示δC38.9的碳是亚甲基，和δC57.8的碳是甲炔基，它们分别指定为C-3和C-5。这使未在HSQC-DEPT谱中显示关联的δC45.0的碳被指定为四价碳，C-4。C-3(δH0.98和2j.36)和C-5(δH1.04)的1H化学位移通过使用HSQC-DEPT数据指定。H-3质子之一(δH0.98)和δH1.43的质子之间的COSY关联允许H-2质子之一的指定，其进而显示与指定为C-1的δH0.75的质子的关联。C-1和C-2的余下1H和13C化学位移然后基于另外的COSY和HSQC-DEPT关联指定，及总结于下表。
1H和13CNMR(500和125MHz,吡啶-d5)，RebD2的指定。
在δH1.30观察的其他叔甲基单态显示与C-1和C-5的HMBC关联，及指定为C-20。甲基质子显示与四价碳(δC40.3)和甲炔基碳(δC54.5)的另外的HMBC关联，分别指定为C-10和C-9。H-5(δH1.04)和δH1.92和2.43的质子之间的COSY关联然后允许H-6质子的指定，其进而显示与δH1.22和1.30的质子的关联，其指定到C-7。然后自HSQC-DEPT数据测定C-6(δC22.7)和C-7(δC42.2)的13C化学位移。H-9(δH0.88)和δH1.65和1.69的质子之间的COSY关联允许H-11质子的指定，其进而显示与δH1.99和2.25的质子的COSY关联，其指定为H-12质子。然后使用HSQC-DEPT数据指定C-11(δC21.1)和C-12(δC37.5)。自H-12质子(δH2.25)至δC87.1和154.7的碳的HMBC关联分别允许C-13和C-16的指定。在δH5.01和5.64观察的烯质子显示与C-13的HMBC关联，及指定到C-17(经HSQC-DEPT的δC105.2)。烯质子H-17和甲炔基质子H-9显示与δC48.3的碳的HMBC关联，其指定为C-15的。自H-9至δC44.5的亚甲基碳的另外的HMBC关联然后允许C-14的指定。在C-14(δH1.80和2.65)和C-15(δH1.31和2.04)的1H化学位移通过使用HSQC-DEPT数据指定。
NOESY谱中观察到的关联用于指定中心二萜核心的相对立体化学。在NOESY谱中，H-14和H-20之间观察到NOE关联，指示H-14和H-20处于环的相同的面。类似地，在H-9和H-5，H-9和H-18以及H-5和H-18之间观察到NOE关联，但在H-9和H-14之间未观察到NOE关联，指示H-5，H-9和H-18相比H-14和H-20而处在环的对面，如显示于图21。这些数据由此指示，中心核心中的相对立体化学在糖基化步骤期间保留。
以下提供用来指定苷元区的关键HMBC和COSY关联：
1H-13CHSQC-DEPT数据的分析确认5异头质子的存在。异头质子中的3个在1HNMR谱中以δH6.02(δC96.1)，5.57(δC105.3)，及5.34(δC105.3)良好解析。在1H谱中被溶剂(HOD)共振遮蔽的在δH5.04(δC105.6)和5.07(δC98.7)观察到的余下2异头质子由1H-13CHSQC-DEPT数据鉴定。在δH6.02观察到的异头质子显示与C-19的HMBC关联，其指示其对应于GlcI的异头质子。类似地，在δH5.07观察到的异头质子显示与C-13的HMBC关联，使其被指定为GlcII的异头质子。
GlcI异头质子(δH6.02)显示与δH4.07的质子的COSY关联被指定为GlcIH-2，其进而显示与δH4.22的质子(GlcIH-3)的COSY关联，其显示与δH4.12的质子(GlcIH-4)的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱不允许H-5或H-6质子的指定。因此，通过使用GlcI异头质子的选择性辐射，用几个不同混合时间实施一系列1D-TOCSY实验。除了确认GlcIH-2至H-4的指定之外，1D-TOCSY数据显示被指定为GlcIH-5的δH4.04的质子和被指定为GlcIH-6质子的δH4.68的质子之一。其后的质子也用于1D-TOCSY实验。用几个不同混合时间的H-6的选择性辐射也确认GlcIH-1至H-5以及余下H-6(δH4.30)的亚甲基质子的指定。通过使用1H-13CHSQC-DEPT数据测定GlcIC-2(δC74.2)，C-3(δC79.1)，C-4(δC72.1)，C-5(δC78.5)，及C-6(δC69.9)的13C化学位移的指定，以完成GlcI的指定。此外，1H-13CHSQC-DEPT谱中在δC69.9的亚甲基13C共振的存在指示结构中GlcI的1→6糖连接。
在4个余下未指定的葡萄糖部分中，一个基于1H-13CHSQC-DEPT，HMBC和1D-TOCSY关联指定为在GlcI的C-6的取代基。HSQC-DEPT谱中在δC69.9的GlcI的亚甲基13C共振的相对低磁场位移指示GlcI的1→6糖连接。在δH5.04观察到的异头质子显示与GlcIC-6的HMBC关联，及指定为GlcV的异头质子。类似地，显示与GlcV的异头碳的HMBC关联的GlcI的亚甲基质子确认GlcI和GlcV之间1→6糖连接的存在。GlcV异头质子显示与δH4.00的质子的COSY关联，其指定为GlcVH-2，其进而显示与δH4.22的质子(GlcVH-3)的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱未允许基于GlcVH-3的COSY关联而GlcVH-4的指定。但是，在HMBC谱中，GlcVH-3显示与GlcVC-5(δC78.9)的关联。在HSQC-DEPT谱中，GlcVC-5显示与δH3.89(GlcVH-5)的关联。GlcVH-5显示与δH4.21，4.37和4.48的COSY关联。在HSQC-DEPT谱中，δH4.21显示与δC71.4(GlcVH-4)的关联，而δH4.37和4.48显示与δC63.1的关联，及分别指定为GlcVH-6a和H-6b。通过使用1H-13CHSQC-DEPT数据测定GlcVC-2(δC75.7)和C-3(δC79.1)的13C化学位移的指定，以完成GlcV的指定。
在C-19的糖苷的1H和13C化学位移的总结显示于以下表：
1H和13CNMR(500和125MHz,吡啶-d5)，rebD2C-19糖苷的指定。
#1H和13C值可为在位置Glc1-3，GlcV-3和GlcIV-3之间可交换的。
以下提供用来指定C-19糖苷区的关键HMBC，COSY和1D-TOCSY关联的总结。
以类似方式实施GlcII的指定。GlcII异头质子(δH5.07)显示与δH4.37的质子的COSY关联，被指定为GlcIIH-2，其进而显示与δH4.18的质子(GlcIIH-3)的COSY关联。此后的质子显示与δH3.88的质子(GlcIIH-4)的另外的关联，其也显示与δH3.79的质子(GlcIIH-5)的COSY关联。GlcIIH-5也显示与GlcIIH-6质子(δH4.08和4.46)的COSY关联。通过使用HSQC-DEPT数据测定GlcIIC-2(δC81.3)，C-3(δC88.4)，C-4(δC71.1)，C-5(δC77.9)，及C-6(δC63.2)的13C化学位移的指定。自GlcIIH-3至C-2和C-4和也自GlcIIH-4至C-2和C-5的HMBC关联确认以上进行的指定。还支持GlcIIH-4与GlcIIC-6的另外的HMBC关联，以完成GlcII的指定。
余下未指定的葡萄糖部分中的2个基于HMBC关联指定为在GlcII的C-2和C-3的取代基。在δH5.57观察到的异头质子显示与GlcIIC-2的HMBC关联，及指定为GlcIII的异头质子。在δH5.34观察到的异头质子显示与GlcIIC-3的HMBC关联，及指定为GlcIV的异头质子。也观察到自GlcIIH-2至GlcIII的异头碳及自GlcIIH-3至GlcIV的异头碳的交互HMBC关联。
GlcIII(δH5.57)的异头质子显示与δH4.19的质子的COSY关联，其指定为GlcIIIH-2。由于数据重叠，COSY谱未允许H-3至H-6质子的指定。因此，通过使用GlcIII异头质子的选择性辐射，用几个不同混合时间实施一系列1D-TOCSY实验。除了确认GlcIIIH-2的指定之外，1D-TOCSY数据显示δH4.24(GlcIIIH-3)，δH4.27(GlcIIIH-4)，及δH3.94(GlcIIIH-5)的质子。一旦H-4通过使用1D-TOCSY数据指定，自H-4至H-5和进而至H-6的COSY关联被用于指定H-6。在COSY谱中，GlcIIIH-4显示与GlcIIIH-5的关联，其进而显示分别与GlcIIIH-6a和H-6b的δH4.41和4.50的COSY关联。然后通过使用1H-13CHSQC-DEPT关联测定GlcIIIC-2(δC76.8)，C-3(δC78.9)，C-4(δC72.4)，C-5(δC78.8)，及C-6(δC63.5)的13C化学位移，以完成GlcIII的指定。
GlcIV(δH5.34)的异头质子显示与δH4.06的质子的COSY关联，其被指定为GlcIVH-2。由于数据重叠，COSY谱未允许H-3至H-6质子的指定。因此，通过使用GlcIV异头质子的选择性辐射，用几个不同混合时间实施一系列1D-TOCSY实验。除了确认GlcIVH-2的指定之外，1D-TOCSY数据显示δH4.22(GlcIVH-3)，δH4.18(GlcIVH-4)，及δH4.10(GlcIVH-5)的质子。一旦H-4通过使用1D-TOCSY数据指定，自H-4至H-5和进而至H-6的COSY关联用于指定H-6。在COSY谱中，GlcIVH-4显示与GlcIVH-5的关联，其进而显示分别与δH4.32和4.58，GlcIVH-6a和H-6b的COSY关联。然后通过使用1H-13CHSQC-DEPT关联测定GlcIVC-2(δC75.8)，C-3(δC78.9)，C-4(δC72.0)，C-5(δC79.3)，及C-6(δC62.9)的13C化学位移，以完成GlcIV的指定。
就在δH6.02(d,J＝8.1Hz)，5.57(d,J＝7.6Hz)，5.34(d,J＝7.9Hz)和δH5.04(d,J＝8.1Hz)的葡萄糖部分的异头质子观察到的大偶联常数推荐它们的β-取向(图14,27和28)。而余下δH5.07的异头质子被溶剂共振(HDO)遮蔽，自1DTOCSY数据(图24)得知的其偶联常数(J＝～8Hz)也指示β-取向。
在C-13的糖苷的1H和13C化学位移的总结显示于下表：
1H和13CNMR(500和125MHz,吡啶-d5)，RebD2C-13糖苷的指定。
*异头质子被溶剂(HDO)共振遮蔽，自1D-TOCSY数据获得的偶联恒定值。
#1H和13C值可为在Glc1-3，GlcV-3和GlcIV-3之间可交换的。
以下提供用来指定C-13糖苷区的关键HMBC，COSY和1D-TOCSY关联的总结：
NMR和MS分析允许以下显示的结构的全指定。化合物的化学名称是13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯](莱苞迪苷D2或rebD2)。化合物是莱苞迪苷D的异构体。
【实施例40：RebM2的分离和表征】
粗反应样品。根据实施例22用UGTSL(GI#460409128)制备用于分离的样品，LotCB-2977-106。
HPLC分析.通过使用Waters2695Alliance系统用以下方法实施初步HPLC分析：phenomenexSynergi氢-RP，4.6×250mm，4μm(p/n00G-4375-E0)；柱Temp：55℃；移动A相：水中的0.0284％NH4OAc和0.0116％HOAc；移动B相：乙腈(MeCN)；流速：1.0mL/min；注射体积：10μL。检测由UV(210nm)和CAD实施。
梯度:
时间(min) ％A ％B
0.0-5.0 100 0
20 20 80
25 20 80
30 100 0
用以下方法实施半-制备性纯化级分的分析：水AtlantisdC18，4.6×100mm，5μm(p/n186001340)；移动A相：水中25％MeCN；移动B相：水中30％MeCN；流速：1.0mL/min；注射体积：10μL。检测由CAD实施。
梯度:
时间(min) ％A ％B
0.0-8.5 75 25
10.0 71 29
16.5 70 30
18.5-24.5 66 34
26.5-29.0 48 52
31-37 30 70
38 75 25
LC-MS.在具有以阴离子模式操作的Waters3100质量检测器的WatersAutoPurificationHPLC/MS系统上实施半-合成甜叶菊醇糖苷混合物的初步分析。通过使用以下方法实施样品分析：phenomenexSynergi氢-RP，4.6×250mm，4μm(p/n00G-4375-E0)；柱Temp：55℃；移动A相：水中的0.0284％NH4OAc和0.0116％HOAc；移动B相：MeCN；流速：1.0mL/min；注射体积：10μL。检测由UV(210nm)，及MSD(-ESIm/z500-2000)实施。梯度条件如以上所列。
分离由HPLC。纯化实施在2步骤中。以下总结用于半-制备性纯化的第1方法。柱：水AtlantisdC18，30×100mm，5μm(p/n186001375)；移动A相：水中25％MeCN；移动B相：水中30％MeCN；流速：45mL/min；注射负荷：20mL的水中溶解的160mg。检测由UV(205nm)实施。
梯度:
时间(min) ％A ％B
0.0-5.0 100 0
20 20 80
25 20 80
30 100 0
第二纯化使用相同的柱和条件，但等度移动相：水中20％MeCN。
MS和MS/MS。用装备电喷射电离源的Premier质谱仪的WatersQT产生MS和MS/MS数据。样品由负ESI分析。样品用H2O:MeCN(1:1)稀释50倍，及经输注使用机载注射器泵导入。稀释样品而产生以0.01mg/mL的近似的浓度存在的良好s/n。
NMR.通过在150μL的D2O中溶解～1.0mg来制备样品，在具有2.5mm倒转检测探针的BrukerAvance500MHz仪器上获取NMR数据。1HNMR和13CNMR谱分别参比残留的溶剂信号HDO(δH4.79ppm)和TSP(δC0.00ppm)。
【结果和讨论】
分离和纯化。通过使用根据实施例22用UGTSL(GI#460409128)制备的甜叶菊醇糖苷混合物(批号CB-2977-106)实施分离。由LC-MS使用上述方法分析物质(图11)。目标靶向的峰在TIC层析谱中在4.1min处。此峰的质谱提供在m/z1289.7的[M-H]-离子。将提供的样品在单注射(160mg)中，使用以上提供的第1方法条件预先处理。此方法将物质分级分离为糖苷的‘极性’和‘非-极性’混合物。‘极性’混合物然后通过使用以上提供的第2-步骤条件再处理。半-制备性HPLC踪迹显示于图12。自此半-制备性收集，分离纯度>99％的峰(CAD,AUC)。级分分析提供于图13。纯化后，级分由旋转蒸发于35℃浓缩，及冷冻干燥。获得大致1mg。
质量光谱法.通过输注CC-00300的样品获取的ESI-TOF质谱显示在m/z1289.5266的[M-H]-离子。[M-H]-离子的质量与对rebM2预期的分子式C56H90O33良好一致(经计算是C56H89O33：1289.5286,误差：-1.6ppm)。MS数据确认，CC-00300具有1290Da的标称质量，分子式是C56H90O33。
MS/MS谱(选择在m/z1289.5的[M-H]-离子用于片段化)指示在m/z803.3688的3个葡萄糖单元的损失，和在m/z641.3165，479.2633和317.2082的3个葡萄糖部分的连续损失。
NMR光谱学.实施包括1HNMR(图29)，13CNMR(图30和31)，1H-1HCOSY(图32)，HSQC-DEPT(图33)，HMBC(图34和35)，及1D-TOCSY(图36～39)的一系列NMR实验，以允许rebM2的指定。
1H，1H-1HCOSY，1H-13CHSQC-DEPT和1H-13CHMBCNMR数据指示，糖苷的中心核心是二萜。在1H和1H-13CHSQC-DEPT谱中观察到的6个异头质子的存在确认结构中6个糖单元。在1H-13CHSQC-DEPT谱中δC70.9的亚甲基13C共振指示结构中1→6糖连接的存在。通过使用1H-13CHMBC和1D-TOCSY关联指定糖单元的连接。
自δH1.29的甲基质子与δC181.5的羰基的HMBC关联允许叔甲基(C-18)以及C-19之一的指定，及提供指定其余苷元的起点。自甲基质子(H-18)至δC39.8，43.7和59.2的碳的另外的HMBC关联允许C3，C4和C5的指定。1H-13CHSQC-DEPT数据的分析指示，δC39.8的碳是亚甲基，和δC59.2的碳是甲炔基，分别指定为C-3和C-5。这使未在HSQC-DEPT谱中显示关联的δC43.7的碳被指定为四价碳，C-4。通过使用HSQC-DEPT数据指定C-3(δH1.16和2.28)和C-5(δH1.24)的1H化学位移。H-3质子之一(δH1.16)和δH1.49的质子之间的COSY关联允许H-2质子之一的指定，其进而显示与δH0.92的质子的关联，其被指定为C-1。C-1和C-2的余下1H和13C化学位移然后基于另外的COSY和HSQC-DEPT关联指定，及总结于下表。
1HNMR(500MHz,D2O)和13CNMR(125MHz,D2O/TSP)。RebM2苷元的指定。
在δH0.92观察到的其他叔甲基单态显示与C-1和C-5的HMBC关联，及指定为C-20。甲基质子显示与四价碳(δC42.4)和甲炔基(δC55.5)的另外的HMBC关联，分别指定为C-10和C-9。H-5(δH1.24)和δH1.73和1.94的质子之间的COSY关联然后允许H-6质子的指定，其进而显示与δH1.49和1.56的质子的关联，其被指定到C-7。然后自HSQC-DEPT数据测定C-6(δC24.4)和C-7(δC44.2)的13C化学位移。H-9(δH1.09)和δH1.66和1.70的质子之间的COSY关联允许H-11质子的指定，其进而显示与δH1.60和2.00的质子的COSY关联，其被指定为H-12质子。然后使用HSQC-DEPT数据指定C-11(δC22.6)和C-12(δC39.9)。在δH4.98和5.16观察到的烯质子显示与C-13(δC90.9)的HMBC关联，及指定到C-17(δC107.0经HSQC-DEPT)。烯质子H-17显示与δC49.4的碳的HMBC关联，其被指定为C-15。自H-9至δC46.9的亚甲基碳的另外的HMBC关联然后允许C-14的指定。在C-14(δH1.53和2.21)和C-15(δH2.15和2.18)的1H化学位移通过使用HSQC-DEPT数据指定。
以下提供用来指定苷元区的关键HMBC和COSY关联的总结：
1H-13CHSQC-DEPT数据的分析确认6个异头质子的存在。异头质子中的3个在1HNMR谱中以δH5.65(δC95.5)，4.92(δC104.9)，及4.50(δC105.7)良好解析。在δH4.85(δC98.4)，4.84(δC105.0)，及4.83(δC105.3)观察到的余下3个异头质子在1H谱中被残留的溶剂共振重叠。在δH5.65观察到的异头质子显示与C-19的HMBC关联，其指示其对应于GlcI的异头质子。类似地，在δH4.85观察到的异头质子显示与C-13的HMBC关联，允许其被指定为GlcII的异头质子。
GlcI异头质子(δH5.65)显示与δH3.96的质子的COSY关联，其被指定为GlcIH-2，其进而显示与δH3.89的质子(GlcIH-3)的COSY关联，其显示与δH3.71的质子(GlcIH-4)的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱未允许H-5或H-6质子的指定。因此，通过使用GlcI异头质子的选择性辐射，用几个不同混合时间实施一系列1D-TOCSY实验。除了确认GlcIH-2至H-4的指定之外，1D-TOCSY数据显示被指定为GlcIH-5的δH3.73的质子和被指定为GlcIH-6质子的δH4.15的质子之一。后来的质子也用于1D-TOCSY实验。用几个不同混合时间的H-6的选择性辐射也确认GlcIH-1至H-5以及H-6(δH4.00)的余下亚甲基质子的指定。通过使用1H-13CHSQC-DEPT数据测定GlcIC-2(δC80.5)，C-3(δC79.0)，C-4(δC71.5)，C-5(δC79.0)，及C-6(δC70.9)的13C化学位移的指定，以完成GlcI的指定。此外，在1H-13CHSQC-DEPT谱中在δC70.9的亚甲基13C共振的存在指示结构中GlcI的1→6糖连接。
未指定的葡萄糖部分中的2个基于HMBC关联被指定为在GlcI的C-2和C-6的取代基。在δH4.83观察到的异头质子显示与GlcIC-2的HMBC关联，及指定为GlcV的异头质子。在δH4.50观察到的异头质子显示与GlcIC-6的HMBC关联，及指定为GlcVI的异头质子。也观察到自GlcIH-2至GlcV的异头碳及自GlcIH-6至GlcVI的异头碳的交互HMBC关联。
GlcV(δH4.83)的异头质子显示与δH3.32的质子的COSY关联，其被指定为GlcVH-2。GlcVH-2进而显示与δH3.51的质子(GlcVH-3)的COSY关联。此后的质子显示与δH3.38的质子(GlcVH-4)的另外的关联。H-4也显示与δH3.55(GlcVH-5)和GlcVH-5的质子的COSY关联，进而显示与GlcVH-6质子(δH3.76和3.97)的COSY关联。通过使用HSQC-DEPT数据测定GlcVC-2(δC78.5)，C-3(δC78.7)，C-4(δC72.9)，C-5(δC78.8)，及C-6(δC63.6)的13C化学位移的指定。自GlcVH-3至C-2和C-4和也自GlcVH-4至C-3和C-6的HMBC关联确认以上进行的指定，以完成GlcV的指定。
另一葡萄糖部分于1H-13CHSQC-DEPT和HMBC关联指定为GlcI基的C-6的取代基。HSQC-DEPT谱中在δC70.9的GlcI的亚甲基13C共振的相对低磁场位移指示GlcI的1→6糖连接。在δH4.50观察到的异头质子显示与GlcIC-6的HMBC关联，及指定为GlcVI的异头质子。类似地，GlcI的亚甲基质子显示与GlcVI的异头碳的HMBC关联，和此确认GlcI和GlcVI之间的1→6糖连接的存在。GlcVI异头质子显示与δH3.33的质子的COSY关联，其被指定为GlcVIH-2，其进而显示与δH3.49的质子(GlcVIH-3)的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱未允许基于的COSY关联指定GlcVH-4至H-6。因此，通过使用GlcVI异头质子的选择性辐射，用不同混合时间实施一系列1D-TOCSY实验。除了确认GlcVIH-2至H-3的指定之外，1D-TOCSY数据显示为GlcVIH-6质子指定的δH3.45(GlcVIH-4)和δH3.48(GlcVIH-5)的质子和δH3.92和3.94的质子。通过使用1H-13CHSQC-DEPT数据测定GlcVIC-2(δC78.1)，C-3(δC78.6)，C-4(δC72.3)，C-5(δC78.8)，及C-6(δC64.1)的13C化学位移的指定，以完成GlcVI的指定。
在C-19糖苷的1H和13C化学位移的总结见于下表：
HNMR(500MHz,D2O)和13CNMR(125MHz,D2O/TSP)。RebM2糖苷的指定。
*1H和13C值可为与以下表的GlcIV-1可交换的。
以下提供用来指定C-19糖苷区的关键HMBC，COSY和1D-TOCSY关联的总结：
1HNMR(500MHz,D2O)和13CNMR(125MHz,D2O/TSP)。RebM2糖苷的指定。
GlcII的指定以类似方式实施。GlcII异头质子(δH4.85)显示与δH3.75的质子的COSY关联，其被指定为GlcIIH-2，其进而显示与δH3.98的质子(GlcIIH-3)的COSY关联。此后的质子显示与δH3.54的质子(GlcIIH-4)的另外的关联。H-4也显示与δH3.96的质子(GlcIIH-5)的COSY关联。GlcIIH-5也显示与GlcIIH-6质子(δH3.77和3.45)的COSY关联。通过使用HSQC-DEPT数据测定GlcIIC-2(δC81.7)，C-3(δC88.0)，C-4(δC71.3)，C-5(δC80.5)，及C-6(δC63.6)的13C化学位移的指定。自GlcIIH-3至C-2和C-4和也自GlcIIH-4至C-3和C-6的HMBC关联确认以上进行的指定，以完成GlcII的指定。
余下未指定的葡萄糖部分中的2个基于HMBC关联被指定为在GlcII的C-2和C-3的取代基。在δH4.92观察到的异头质子显示与GlcIIC-2的HMBC关联，及指定为GlcIII的异头质子。在δH4.84观察到的异头质子显示与GlcIIC-3的HMBC关联，及指定为GlcIV的异头质子。也观察到GlcIIH-2和GlcIII的异头碳之间及GlcIIH-3和GlcIV的异头碳之间的交互HMBC关联。
GlcIII(δH4.92)的异头质子显示与δH3.32的质子的COSY关联，其被指定为GlcIIIH-2。由于数据重叠，COSY谱未允许H-3至H-6质子的指定。因此，通过使用GlcIII异头质子的选择性辐射，用不同混合时间实施一系列1D-TOCSY实验。除了确认GlcIIIH-2的指定之外，1D-TOCSY数据显示δH3.51(GlcIIIH-3)，δH3.26(GlcIIIH-4)，及δH3.44(GlcIIIH-5)的质子。一旦H-4通过使用1D-TOCSY数据指定，自H-4至H-5和进而至H-6的COSY关联用于指定H-6。在COSY谱中，GlcIIIH-4显示与GlcIIIH-5的关联，其进而显示分别与GlcIIIH-6a和H-6b的δH3.94和3.75的COSY关联。然后通过使用1H-13CHSQC-DEPT关联测定GlcIIIC-2(δC76.3)，C-3(δC78.8)，C-4(δC73.3)，C-5(δC78.8)，及C-6(δC64.4)的13C化学位移，以完成GlcIII的指定。
显示与δH3.41的质子的COSY关联的GlcIV(δH4.84)的异头质子被指定为GlcIVH-2，其进而显示与δH3.46的质子(GlcIVH-3)的COSY关联。此后的质子显示与δH3.45的质子(GlcIVH-4)的另外的关联，其也显示与δH3.75的质子(GlcIVH-5)的COSY关联。GlcIVH-5也显示与GlcIVH-6质子(δH3.55和3.78)的COSY关联。通过使用HSQC-DEPT数据测定GlcIVC-2(δC76.1)，C-3(δC78.8)，C-4(δC72.5)，C-5(δC81.7)，及C-6(δC65.8)的13C化学位移的指定。自GlcIVH-3至C-4和C-5和也自GlcIVH-4至C-3和C-6的HMBC关联确认以上进行的指定，以完成GlcIV的指定。
C-13的糖苷的1H和13C化学位移的总结见于以下表：
1HNMR(500MHz,D2O)和13CNMR(125MHz,D2O/TSP)。RebM2糖苷的指定。
以下提供用来指定C-13糖苷区的关键HMBC，COSY和1D-TOCSY关联的总结：
NMR和MS分析允许以下显示的其结构的全指定。化合物的化学名称是13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯](莱苞迪苷M2或rebM2)。化合物是莱苞迪苷M的异构体。
【实施例41：用于莱苞迪苷D向莱苞迪苷M的转变的UGT76G1的定向衍化(第2轮)】
将来自第1轮UGT76G1的定向衍化(见实施例26UGT76G1var94，其含有突变：Q266E_P272A_R334K_G348P_L379G)的最有活性的克隆选择为用于第2轮的基线克隆。建立53个突变列表，其含有来自第1轮的不同鉴定的阳性突变和由DNA2.0ProteinGPStm策略获得的新突变。此突变列表随后用来设计含有各3个不同突变的92个变体基因。在为在大肠埃希氏菌(E.coli)中表达密码子-优化之后，合成基因，在pET30a+质粒中亚克隆，及用于转化大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)化学感受态细胞。获得的细胞在陪替-皿中在固体LB培养基上在卡那霉素的存在下生长。选择适合的集落，使生长在管中的液体LB培养基中。将甘油加入悬浮液作为冷冻保护剂，和400μL等份存储于-20℃和于-80℃。
将含有pET30a+_UGT76G1var质粒的大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)的这些存储等份解冻，及添加到LBGKP培养基(20g/LLuria肉汤Lennox；50mMPIPES缓冲剂pH7.00；50mM磷酸缓冲液pH7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L的卡那霉素)。使此培养物在96微孔板中于30℃振摇8h。
将3.95mL的含有60g/L的过夜ExpressTM立即TB培养基10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素的生产培养基用50μL的以上描述的培养物接种。在48深孔板中，将得到的培养物于20℃搅拌。培养显著生长和获得良好OD(600nm)。在44h之后，将细胞通过离心收获，及冷冻。
通过向解冻的细胞添加Master混合物实施裂解，和通过离心回收裂解物。用100μL的被加入在50mM磷酸缓冲液pH7.2中莱苞迪苷D(终浓度0.5mM)，MgCl2(终浓度3mM)和UDP-葡萄糖(终浓度2.5mM)的溶液的新鲜裂解物实施活性测试。
使反应于30℃运行，和在2，4，7和24h之后取样品，以由HPLC(CAD检测)，使用以上为莱苞迪苷D向莱苞迪苷M的转化描述的分析方法测定转变和初速度。用基线克隆，Round1-Var94实施并行实验。在22h之后的转变和此基线克隆的初速度定义为100％，和第2轮克隆的标准化的转变和初速度示于以下表:
*突变标识如下：参照基因-原氨基酸-位置-新氨基酸：例如对于来自第1轮UGT76G1的定向衍化的变体94的在第33位的丙氨酸向甘氨酸的突变标识为Round1-Var94(A33G)
这些结果的建模允许获得各突变的效应的排序。以下突变被测定为有益于活性：S42A，F46I，I190L，S274G，I295M，K303G，F314S，K316R，K393R，V394I，I407V，N409K，N409R，Q425E，Q432E，S447A，S456L。
【实施例42：AtSUS的体内产生】
SEQIDNO:13
AtSUS
>gi|79328294|ref|NP_001031915.1|蔗糖合酶1[拟南芥(Arabidopsisthaliana)]
MANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHSHQGKNLMLSEKIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLDMIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIEELLYSDVENKEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRELANLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDRVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVPLAQDD
为在大肠埃希氏菌(E.coli)中表达密码子优化，及使用NdeI和XhoI限制性位点在pET30a+质粒中亚克隆的AtSuS的合成基因。将含有AtSUS基因的pET30A+载体用于转化电感受态大肠埃希氏菌(E.coli)Bl21(DE3)细胞。获得的细胞在陪替-皿中在卡那霉素的存在下生长，和选择适合的集落，使生长在液体LB培养基(锥形瓶)中。将甘油加入悬浮液作为冷冻保护剂，和400μL等份存储于-20℃和于-80℃。
将含有pET30A+_AtSUS质粒的大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)的存储等份解冻，及添加到30mL的LBGKP培养基(20g/LLuria肉汤Lennox；50mMPIPES缓冲剂pH7.00；50mM磷酸缓冲液pH7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L的卡那霉素)。使此培养物以135rpm于30℃振摇8h。
生产培养基含有60g/L的过夜表达立即TB培养基(Novagen)，10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素。将预培养物添加到800mL的此培养基，和溶液取样品的同时于20℃搅拌，以测量OD和pH。培养显著生长和获得良好OD。在40h之后，将细胞通过离心收获，及冷冻而获得30.1g的细胞湿重。
裂解由用1.0mL的50mMTris缓冲剂pH7.5中200mg的细胞的细胞悬浮液的Fastprep(MPBiomedicals,LysingmatrixB,速度6.0,3×40s)实施。将裂解物通过离心回收，及新鲜使用。
【实施例43：用使用UGTSL2，UGT76G1-R1-F12和AtSUS原位制备的UDP-葡萄糖的莱苞迪苷A向莱苞迪苷M的转变】
以1mL规模，使用100mM的蔗糖，3mM的MgCl2，0.25mM的UDP和0.5mM的莱苞迪苷A，在磷酸钾缓冲液(50mM终浓度,pH7.5)中实施反应。通过添加15μL的UGTSL2(见实施例27)裂解物(2U/mL)，150μL的UGT76G1var94(见实施例26)(2.5U/mL)和15μL的AtSUS(见实施例42)(400U/mL)起始反应。反应之后是在将125μL样品用10μL的2NH2SO4和115μL的60％甲醇猝灭之后HPLC。在21h的反应时间之后获得68％的莱苞迪苷M和26％的莱苞迪苷M2。结果呈现于图69。
尽管在上文中以例证目的公开了本发明的各种实施方式，但需知可在不脱离本发明的精神或范围的情况下实施各种变化，修饰和取代。

Claims (43)

1.产生高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷的方法，包括下列步骤：
(a)提供起始组合物，其包含具有至少一个碳原子的有机化合物；
(b)提供微生物，其含有选自下列的至少一种酶：甜叶菊醇生物合成酶，UDP-糖基转移酶和任选地UDP-葡萄糖再循环酶；
(c)使微生物接触含有起始组合物的培养基而产生包含至少一种目标甜叶菊醇糖苷的培养基。
2.产生高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷的方法，包括下列步骤：
(a)提供起始组合物，其包含具有至少一个碳原子的有机化合物；
(b)提供生物催化剂，其包含选自下列的至少一种酶：甜叶菊醇生物合成酶，UDP-糖基转移酶和任选地UDP-葡萄糖再循环酶；
(c)使生物催化剂接触含有起始组合物的培养基而产生包含至少一种目标甜叶菊醇糖苷的培养基。
3.权利要求1或2的方法，其还包括下列步骤：
(d)自培养基分离目标甜叶菊醇糖苷而提供高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷组合物。
4.权利要求1或2的方法，其中所述起始组合物选自：多元醇，碳水化合物，甜叶菊醇，甜叶菊醇糖苷和其组合。
5.权利要求1的方法，其中所述微生物选自：大肠埃希氏菌(E.coli)，糖酵母属(Saccharomycessp.)，曲霉属(Aspergillussp.)，毕赤酵母属(Pichiasp.)，芽孢杆菌属(Bacillussp.)和耶氏酵母属(Yarrowiasp.)。
6.权利要求2的方法，其中所述生物催化剂选自：全细胞悬浮液，粗裂解物或游离的或固定的形式的纯化的酶。
7.权利要求1或2的方法，其中所述目标甜叶菊醇糖苷选自：甜叶菊苷，rebA，rebD，rebD2，rebE，rebM，rebM2和其混合物。
8.权利要求1或2的方法，其中所述目标甜叶菊醇糖苷在细胞内或在培养基外产生，及通过使用结晶，由膜分离，离心，提取，层析分离或此类方法的组合分离。
9.权利要求1或2的方法，其中所述目标甜叶菊醇糖苷含量是大于约95干重％。
10.权利要求9的方法，其中所述目标甜叶菊醇糖苷选自：甜叶菊苷，rebA，rebE，rebD，rebD2，rebM及rebM2。
11.权利要求9的方法，其中所述目标甜叶菊醇糖苷是rebM。
12.根据权利要求1或2的方法制备的高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷组合物，其中所述目标甜叶菊醇糖苷含量是大于约95干重％。
13.权利要求12的高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷组合物，其中所述目标甜叶菊醇糖苷选自rebD及rebM。
14.根据权利要求1或2的方法制备的高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷组合物，其中所述目标甜叶菊醇糖苷是多态性的。
15.权利要求14的高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷组合物，其中所述目标甜叶菊醇糖苷是rebD或rebM。
16.消费性产品，其包含权利要求1或2的高度纯化的目标糖苷组合物，其中所述产品选自：食品，饮料，药物组合物，烟草产品，营养物组合物，口腔卫生学组合物，及化妆品组合物。
17.消费性产品，其包含权利要求1或2的高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷组合物，其中所述产品选自：食品，饮料，药物组合物，烟草产品，营养物组合物，口腔卫生学组合物，及化妆品组合物，且其中所述目标甜叶菊醇糖苷是rebD。
18.消费性产品，其包含权利要求1或2的高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷组合物，其中所述产品选自：食品，饮料，药物组合物，烟草产品，营养物组合物，口腔卫生学组合物，及化妆品组合物，且其中所述目标甜叶菊醇糖苷是rebM。
19.分离的及纯化的rebD2，其具有以下结构：
20.rebD2，其具有以下结构：
21.消费性产品，其包含rebD2。
22.权利要求21的消费性产品，其中所述组合物选自：饮料；天然的汁；清爽饮料；碳酸化的软饮料；节食饮料；0卡路里饮料；卡路里减少的饮料和食品；酸乳饮料；速食汁；速溶咖啡；粉末化的类型的速食饮料；罐装产品；糖浆；发酵的豆瓣酱；大豆酱油；醋；调味品；蛋黄酱；蕃茄酱；咖喱；汤；速溶汤；粉末化的大豆酱油；粉末化的醋；饼干类；大米饼干；薄脆饼干；面包；巧克力；焦糖；糖果；口香糖；果冻；布丁；保存的水果和蔬菜；鲜奶油；果酱；桔子酱；花酱；粉末化的乳；冰淇淋；果汁冰糕；瓶中填充的蔬菜和水果；罐装及热沸的豆；在甜味化的沙司中热沸的肉和食品；农业植物食品；海鲜；火腿；香肠；鱼火腿；鱼香肠；鱼酱；深油炸的鱼产品；干燥的海鲜产品；冷冻的食品；保存的海藻；保存的肉；烟草和药品。
23.饮料，其包含rebD2。
24.制备rebD2的方法，其包括：
(a)使包含rebA的起始组合物接触能将rebA转化为rebD2的酶，UDP-葡萄糖和任选地UDP-葡萄糖再循环酶而产生包含rebD2的组合物；以及
(b)分离包含rebD2的组合物。
25.权利要求24的方法，还包括纯化包含rebD2的组合物而提供具有大于约95无水重量％的纯度的rebD2。
26.分离的及纯化的rebM2，其具有以下结构：
27.rebM2，其具有以下结构：
28.消费性产品，其包含rebM2。
29.权利要求28的消费性产品，其中所述组合物选自：饮料；天然的汁；清爽饮料；碳酸化的软饮料；节食饮料；0卡路里饮料；卡路里减少的饮料和食品；酸乳饮料；速食汁；速溶咖啡；粉末化的类型的速食饮料；罐装产品；糖浆；发酵的豆瓣酱；大豆酱油；醋；调味品；蛋黄酱；蕃茄酱；咖喱；汤；速溶汤；粉末化的大豆酱油；粉末化的醋；饼干类；大米饼干；薄脆饼干；面包；巧克力；焦糖；糖果；口香糖；果冻；布丁；保存的水果和蔬菜；鲜奶油；果酱；桔子酱；花酱；粉末化的乳；冰淇淋；果汁冰糕；瓶中填充的蔬菜和水果；罐装及热沸的豆；在甜味化的沙司中热沸的肉和食品；农业植物食品；海鲜；火腿；香肠；鱼火腿；鱼香肠；鱼酱；深油炸的鱼产品；干燥的海鲜产品；冷冻的食品；保存的海藻；保存的肉；烟草和药品。
30.饮料，其包含rebM2。
31.制备rebM2的方法，其包括：
(a)使包含rebD2的起始组合物接触能将rebD2转化为rebM2的酶，UDP-葡萄糖和任选地UDP-葡萄糖再循环酶而产生包含rebM2的组合物；以及
(b)分离包含rebM2的组合物。
32.权利要求31的方法，还包括纯化包含rebM2的组合物而提供具有大于约95无水重量％的纯度的rebM2。
33.权利要求21的消费性产品，还包含选自下列的至少一种添加剂：碳水化合物，多元醇，氨基酸和它们的对应盐，聚-氨基酸和它们的对应盐，糖酸和它们的对应盐，核苷酸，有机酸，无机酸，包括有机酸盐和有机碱盐的有机盐，无机盐，苦化合物，风味剂及调味成分，收敛化合物，蛋白或蛋白水解产物，表面活性剂，乳化剂，类黄酮，醇，聚合物和其组合。
34.权利要求21的消费性产品，还包含选自下列的至少一种功能成分：皂苷，抗氧化剂，膳食纤维源，脂肪酸，维生素，葡萄糖胺，矿物质，防腐剂，水合剂，益生菌，益生元，体重管理剂，骨质疏松症管理剂，植物雌激素，长链伯脂肪族饱和的醇，植物甾醇和其组合。
35.权利要求21的消费性产品，还包含选自下列的化合物：rebA，rebB，rebD，NSF-02，罗汉果苷V，罗汉果，阿洛酮糖，阿洛糖，D-塔格糖，赤藓糖醇和其组合。
36.桌面甜味剂组合物，其包含rebD2。
37.权利要求28的消费性产品，还包含选自下列的至少一种添加剂：碳水化合物，多元醇，氨基酸和它们的对应盐，聚-氨基酸和它们的对应盐，糖酸和它们的对应盐，核苷酸，有机酸，无机酸，包括有机酸盐和有机碱盐的有机盐，无机盐，苦化合物，风味剂及调味成分，收敛化合物，蛋白或蛋白水解产物，表面活性剂，乳化剂，类黄酮，醇，聚合物和其组合。
38.权利要求28的消费性产品，还包含选自下列的至少一种功能成分：皂苷，抗氧化剂，膳食纤维源，脂肪酸，维生素，葡萄糖胺，矿物质，防腐剂，水合剂，益生菌，益生元，体重管理剂，骨质疏松症管理剂，植物雌激素，长链伯脂肪族饱和的醇，植物甾醇和其组合。
39.权利要求28的消费性产品，还包含选自下列的化合物：RebA，RebB，RebD，NSF-02，罗汉果苷V，罗汉果，阿洛酮糖，阿洛糖，D-塔格糖，赤藓糖醇和其组合。
40.桌面甜味剂组合物，其包含rebM2。
41.增强包含甜味剂的饮料的甜度的方法，其包括：
(a)提供包含甜味剂的饮料；以及
(b)添加选自下列的甜度增强物：rebD2，rebM2或其组合，
其中rebD2和/或rebM2以甜度识别阈值或以甜度识别阈值以下的浓度存在。
42.权利要求1或2的目标甜叶菊醇糖苷，其组合选自下列的至少一种天然存在的高强度甜味剂：甜叶菊，甜叶菊提取物，甜叶菊醇单苷，甜叶菊双糖苷，悬钩子苷，卫矛醇苷A，卫矛醇苷B，莱苞迪苷B，莱苞迪苷G，甜叶菊苷，莱苞迪苷C，莱苞迪苷F，莱苞迪苷A，莱苞迪苷I，莱苞迪苷E，莱苞迪苷H，莱苞迪苷L，莱苞迪苷K，莱苞迪苷J，莱苞迪苷M，莱苞迪苷M2，莱苞迪苷D，莱苞迪苷D2，莱苞迪苷N或莱苞迪苷O，或甜叶菊(Steviarebaudiana)中发现的甜叶菊醇的其他糖苷，罗汉果苷，Oubli果甜蛋白(brazzein)，新橙皮苷二氢查耳酮，甘草酸和其盐，祝马丁，紫苏糖，PERNANDULCIN，木库罗苷，白元参苷，糙苏苷-I，二甲基-六氢芴-二羧酸，阿布鲁索苷，巴西甘草甜素，肉质雪胆皂苷，甜茶树苷，皮提罗苷，聚婆朵苷A，巴西红木素，甜过江藤甜蛋白，叶甜素，菝葜苷，根皮苷，三叶苷，二氢黄酮醇，二氢槲皮素-3-乙酸，新落新妇苷，反式-桂醛，莫纳汀和其盐，SELLIGUEAINA，苏木素，应乐果甜蛋白，水龙骨甜素，皮提罗苷A，皮提罗苷B，马槟榔甜蛋白，潘塔亭，蜜拉圣果素，仙茅甜蛋白，NEOCULIN，绿原酸，西那林，罗汉果甜味剂，罗汉果苷V，罗汉果苷VI，光果木鳖皂苷，赛门苷或罗汉果(Siraitiagrosvenorii)中发现的罗汉果醇的其他糖苷和/或其组合。
43.权利要求1或2的方法，其中所述目标甜叶菊醇糖苷含量是大于约99干重％。
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