CN105492453B - 高纯度的甜菊醇糖苷 - Google Patents

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Abstract

描述了制备高度纯化的甜菊醇糖苷、特别是莱鲍迪苷A、D和M的方法。这些方法包括利用将不同的起始组合物转化为靶甜菊醇糖苷的重组微生物。另外，披露了新颖的甜菊醇糖苷reb D2和reb M2，也披露了制备它们的方法。高度纯化的莱鲍迪苷在可食用和可咀嚼组合物例如任何饮料、糕饼、焙烤产品、饼干和口香糖中可用作无热量甜味剂。

Description

高纯度的甜菊醇糖苷
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年5月28日提交的美国临时专利申请号61/827,922；2013年7月8日提交的美国临时专利申请号61/843,544；2013年8月2日提交的美国临时专利申请号61/861,528；2013年9月23日提交的美国临时专利申请号61/881,166；2013年10月1日提交的美国临时专利申请号61/885,084；2013年11月15日提交的美国临时专利申请号61/904,751；2013年12月9日提交的美国临时专利申请号61/913,482；2013年12月30日提交的美国临时专利申请号61/921,635；2014年1月9日提交的美国临时专利申请号61/925,329、以及2014年2月14日提交的美国临时专利申请号61/939,855的优先权。以上引用的优先权文件以其整体充分地结合在此。
技术领域
本发明涉及用于制备包含甜菊醇糖苷的组合物的生物催化法，所述组合物包括高度纯化的甜菊醇糖苷组合物。本发明还涉及新颖的甜菊醇糖苷、用于分离所述甜菊醇糖苷的方法以及这些新颖的甜菊醇糖苷的用途。
发明背景
高强度甜味剂具有比蔗糖甜味水平高许多倍的甜味水平。它们基本上无热量，并且普遍用于饮食和低热量产品中，包括食品和饮料。高强度甜味剂不引发升糖反应，从而使得它们适合用于针对糖尿病患者和有兴趣控制其碳水化合物摄入的其他人群的产品中。
甜菊醇糖苷是一类在甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)(原产于南美某些地区的菊科(Asteraceae(Compositae))的多年生灌木)叶中发现的化合物。它们的结构特征在于单个碱，甜菊醇，差异在于位置C13和C19上碳水化合物残基的存在。它们在甜叶菊的叶子中积累，构成大约10％-20％的总干重。基于干重，在甜菊属叶中发现的4种主要糖苷通常包括甜菊苷(stevioside)(9.1％)、莱鲍迪苷A(3.8％)、莱鲍迪苷C(0.6％-1.0％)和杜尔可苷A(dulcoside A)(0.3％)。其他已知的甜菊醇糖苷包括莱鲍迪苷B、C、D、E、F和M，甜菊双苷和甜叶悬钩子苷。
虽然已知用于从甜叶菊制备甜菊醇糖苷的方法，但这些方法大多不适合于商业使用。
因此，仍然存在对用于制备包含甜菊醇糖苷的组合物(包括高度纯化的甜菊醇糖苷组合物)的简单、高效且经济的方法的需要。
另外，仍然存在对新颖的甜菊醇糖苷及其制备和分离方法的需要。
发明概述
本发明提供了用于制备包含靶甜菊醇糖苷的组合物的生物催化法，该生物催化法包括使含有起始组合物的介质与生物催化剂接触，该起始组合物包括含有至少一个碳原子的有机化合物，由此产生包含靶甜菊醇糖苷的组合物。
在另一个实施例中，本发明提供了用于产生靶甜菊醇糖苷的方法，该方法包括使一种有机化合物和选自甜菊醇生物合成酶和UDP-糖基转移酶的至少一种酶接触，由此产生包含靶甜菊醇糖苷的组合物。
该包含至少一个碳原子的有机化合物是用于生物转化的底物。在一个实施例中，该有机化合物选自下组，该组由以下各项组成：多元醇或糖醇、或各种碳水化合物。在另一个实施例中，该有机化合物为至少一种甜菊醇糖苷。
靶甜菊醇糖苷可以是与底物甜菊醇糖苷不相同的任何甜菊醇糖苷。在一个实施例中，靶甜菊醇糖苷是甜菊单苷、甜菊双苷、甜叶悬钩子苷、杜尔可苷B、杜尔可苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷M2、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O或合成的甜菊醇糖苷。
在一个实施例中，靶甜菊醇糖苷是甜菊苷。
在另一个实施例中，靶甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷A。
在再另一个实施例中，靶甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷D。
在又另一个实施例中，靶甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷M(也称为莱鲍迪苷X)。
在优选的实施例中，生物催化剂是一种酶、或包含一种或多种酶的细胞，所述酶能够将有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷。生物催化剂可以位于细胞的表面上和/或内部。生物催化剂可以被提供为全细胞悬液、粗裂解物或一种或多种纯化酶的形式。生物催化剂可以处于游离形式或被固定至由无机或有机材料制造的固体支持物。
在一些实施例中，微生物包含用于将有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷的一种或多种必需生物催化剂。因此，本发明还提供了用于通过以下方式制备包含靶甜菊醇糖苷的组合物的生物催化法：使包含有机化合物的起始组合物与包含能够将该有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷的至少一种酶的微生物接触，由此产生包含至少一种靶甜菊醇糖苷的介质。
用于将该有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷必需的酶包括甜菊醇生物合成酶、UDP-糖基转移酶(UGT)和/或UDP-循环酶。
在一个实施例中，甜菊醇生物合成酶选自下组，该组由以下各项组成：香叶基香叶基二磷酸合酶、柯巴基二磷酸合酶、贝壳杉烯合酶、贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)、甜菊醇合成酶、脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)、D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(MCS)、l-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)、l-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶(HDR)、乙酰乙酰-CoA硫解酶、截短的HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和细胞色素P450还原酶。
UDP-葡萄糖基转移酶可以是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜菊醇和/或甜菊醇糖苷底物以提供靶甜菊醇糖苷的任何UDP-葡萄糖基转移酶。
在一个实施例中，甜菊醇生物合成酶和UDP-葡萄糖基转移酶是在微生物中产生的。微生物可以是例如，大肠杆菌、酵母菌属物种、曲霉菌属物种、毕赤酵母属物种、芽孢杆菌属物种、耶氏酵母属物种等。在另一个实施例中，合成了UDP-葡萄糖基转移酶。
在一个实施例中，UDP-葡萄糖基转移酶选自下组，该组由以下各项组成：UGT74G1、UGT85C2、UGT76G1、UGT91D2、UGTSL、UGTSL_Sc、UGTSL2(GI号460410132版本XP_004250485.1)、UGTLB、GI号460409128(UGTSL)版本XP_004249992.1、GI号115454819版本NP_001051010.1、GI号187373030、版本ACD03249.1、GI号222619587版本EEE55719.1、GI号297795735版本XP_002865752.1或EUGT11以及与这些多肽具有实质性(>85％)一致性的UGT、连同具有编码这些UGT的分离的核酸分子的UGT。
在一个实施例中，甜菊醇生物合成酶、UGT和UDP-葡萄糖循环系统存在于一种微生物中。该微生物可以是例如，大肠杆菌、酵母菌属物种、曲霉菌属物种、毕赤酵母属物种、芽孢杆菌属物种、耶氏酵母属物种。
在一个实施例中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜叶悬钩子苷以形成甜菊苷的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在一个具体的实施例中，该UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2。
在一个实施例中，该UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜菊苷以形成莱鲍迪苷A的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在一个具体的实施例中，该UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。
在另一个实施例中，该UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至莱鲍迪苷A以形成莱鲍迪苷D的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在一个具体的实施例中，该UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2。在另一个实施例中，UGT是通过定向演化产生的具有更高活性和/或选择性的UGT91D2的改良变体。
在又另一个实施例中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至莱鲍迪苷D以形成莱鲍迪苷M的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在一个具体的实施例中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。在另一个实施例中，UGT是通过定向演化产生的具有更高活性和/或选择性的UGT76G1的改良变体。
任选地，本发明的方法还包括，再循环UDP以提供UDP-葡萄糖。在一个实施例中，该方法包括，通过提供再循环催化剂和再循环底物来再循环UDP，从而可使用催化量的UDP-葡萄糖基转移酶和UDP-葡萄糖进行甜菊醇糖苷底物至靶甜菊醇糖苷的生物转化。
在一个实施例中，该再循环催化剂是蔗糖合酶。
在一个实施例中，该再循环底物是蔗糖。
任选地，本发明的方法还包括，将靶甜菊醇糖苷从介质分离，以提供高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物。靶甜菊醇糖苷可通过至少一种适当的方法例如像结晶、通过膜的分离、离心、提取、色谱分离或此类方法的组合来分离。
在一个实施例中，可在微生物中产生靶甜菊醇糖苷。在另一个实施例中，靶甜菊醇糖苷可被分泌到介质中。在另一个实施例中，可从介质中连续移除释放的甜菊醇糖苷。在又另一个实施例中，在完成反应之后分离靶甜菊醇糖苷。
在一个实施例中，分离产生包含按干重计超过约80％的靶甜菊醇糖苷的组合物，即高度纯化的甜菊醇糖苷组合物。在另一个实施例中，分离产生包含按重量计超过约90％的靶甜菊醇糖苷的组合物。在具体的实施例中，组合物包含按重量计超过约95％的靶甜菊醇糖苷。在其他的实施例中，组合物包含按重量计超过约99％的靶甜菊醇糖苷。
靶甜菊醇糖苷可以是任何多态形式或无定形形式，包括水合物、溶剂化物、无水形式或其组合。
纯化的靶甜菊醇糖苷可作为甜味剂用于可消费产品。适合的消费产品包括但不限于，食品、饮料、药物组合物、烟草产品、营养制品组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物。
本发明还提供了甜菊醇糖苷莱鲍迪苷D2(reb D2，莱鲍迪苷D的异构体)和莱鲍迪苷M2(reb M2，莱鲍迪苷M的异构体)。在一个实施例中，提供了分离且纯化的reb D2。在另一个实施例中，提供了分离且纯化的reb M2。reb D2和reb M2也可以被呈现为本文披露的任何可消费产品的形式。在一个具体的实施例中，提供了包含reb D2和/或reb M2的饮料。
本文还提供了制备reb D2和reb M2的方法。两者都在从reb A到reb D的生物转化过程中形成。Reb M2被认为是从reb D2在原位生物转化形成的。
在一个实施例中，本发明为用于制备包含reb D2的组合物的方法，该方法包括：(a)使包含reb A的起始组合物与能够将reb A转化为reb D2的酶、UDP-葡萄糖、以及任选的UDP-葡萄糖循环酶接触，以产生包含reb D2的组合物，并且(b)分离包含reb D2的组合物。
在另一个实施例中，本发明为用于制备包含reb M2的组合物的方法，该方法包括(a)使包含reb D2的起始组合物与能够将reb D2转化为reb M2的酶、UDP-葡萄糖、以及任选的UDP-葡萄糖循环酶接触，以产生包含reb M2的组合物，并且(b)分离包含reb M2的组合物。
用于制备包含reb M2的组合物的另一种方法包括(a)使包含reb A的起始组合物与能够将reb A转化为reb D2的酶、UDP-葡萄糖、以及任选的UDP-葡萄糖循环酶接触，以产生包含reb D2的组合物，(b)任选地，分离包含reb D2的组合物，(c)使包含reb D2的组合物与能够将reb D2转化为reb M2的酶、UDP-葡萄糖、以及任选的UDP-葡萄糖循环酶接触，以产生包含reb M2的组合物，并且(d)分离包含reb M2的组合物。
可将该组合物进一步纯化以提供具有基于干重计大于约95％的纯度的reb D2或reb M2。
附图简要说明
附图被包括在内以提供对本发明的进一步理解。这些附图展示了本发明的实施例，并且与说明书一起用来解释本发明的实施例的原理。
图1显示从甜菊苷生物催化产生reb M。
图2显示使用酶UGT76G1从甜菊苷生物催化产生reb A，以及伴随的通过蔗糖合酶进行UDP至UDP-葡萄糖的再循环。
图3显示从reb D生物催化产生reb M的产物的HPLC色谱图，如实施例14中详述。具有24.165分钟的保留时间的峰相对应于未反应的reb D。具有31.325分钟的保留时间的峰相对应于reb M。
图4显示UGT76G1催化的甜菊苷到reb A的转化。
图5显示UGT76G1催化的reb D到reb M的转化。
图6显示半合成甜菊醇糖苷混合物的LC-MS分析，批号CB-2977-106，显示了TIC(A)、在1.8分钟处的峰的MS(B)、在4.1分钟处的reb M2峰的MS(C)、在6.0分钟处的reb D峰的MS(D)、在7.7分钟处的reb D2峰的MS(E)、在9.4分钟处的峰的MS(F)、在15.2分钟处的莱鲍迪苷A峰的MS(G)、在16.5分钟处的峰的MS(H)、和在18.3分钟处的峰的MS(I)。
图7显示半合成甜菊醇糖苷混合物的HPLC分析，批号CB-2977-106(A)，分离的rebM2(B)、分离的reb D(C)和分离的reb D2(D)。
图8显示reb D2的1H NMR谱(500MHz，吡啶-d5)。
图9显示reb D2的13C NMR谱(125MHz，吡啶-d5)。
图10显示reb D2的13C NMR谱的扩展(125MHz，吡啶-d5)。
图11显示reb D2的1H-1H COSY谱(500MHz，吡啶-d5)。
图12显示reb D2的HSQC-DEPT谱(500MHz，吡啶-d5)。
图13显示reb D2的HMBC谱。
图14显示reb D2的HMBC谱的扩展(500MHz，吡啶-d5)。
图15显示reb D2的NOESY谱。
图16显示在约46小时之后获得的reb D2的1H NMR谱(500MHz，吡啶-d5)。
图17显示在约46小时之后获得的reb D2的1H NMR谱的扩展(500MHz，吡啶-d5)。
图18显示reb M2的1H NMR谱(500MHz，D2O)。
图19显示reb M2的13C NMR谱(125MHz，D2O/TSP)。
图20显示reb M2的13C NMR谱的扩展(125MHz，D2O/TSP)。
图21显示reb M2的1H-1H COSY谱(500MHz，D2O)。
图22显示reb M2的HSQC-DEPT谱(500MHz，D2O)。
图23显示reb M2的HMBC谱(500MHz，D2O)。
图24显示reb M2的HMBC谱的扩展(500MHz，D2O)。
详细说明
本发明提供了用于制备包含靶甜菊醇糖苷的组合物的生物催化法，该生物催化法包括通过使含有起始组合物的介质与生物催化剂接触，该起始组合物包括含有至少一个碳原子的有机化合物，由此产生包含靶甜菊醇糖苷的介质。
在另一个实施例中，本发明提供了用于产生靶甜菊醇糖苷的方法，该方法包括使一种有机化合物和选自甜菊醇生物合成酶和UDP-糖基转移酶的至少一种酶接触，由此产生包含靶甜菊醇糖苷的组合物。
本发明的目的是提供一种从起始组合物中的不同有机化合物制备甜菊醇糖苷，尤其是甜菊苷、reb E、reb A、reb D、reb D2、reb M、和reb M2的高效生物催化方法。
如本文使用的，“生物催化”或“生物催化的”是指天然或遗传工程化的生物催化剂，例如酶、或包含能够对有机化合物进行单步或多步化学转化的一种或多种酶的细胞的使用。生物催化过程包括发酵、生物合成和生物转化过程。分离的酶生物催化法和全细胞生物催化法都是本领域已知的。生物催化剂蛋白酶可以是天然存在的或重组的蛋白质。
如本文中使用的，术语“一种或多种甜菊醇糖苷”是指甜菊醇的糖苷，包括但不限于，天然存在的甜菊醇糖苷，例如甜菊单苷、甜菊双苷、甜叶悬钩子苷、杜尔可苷B、杜尔可苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷M2、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O、合成甜菊醇糖苷例如酶促葡萄糖基化的甜菊醇糖苷及其组合。
起始组合物
如本文中使用的，“起始化合物”是指含有包含至少一个碳原子的一种或多种有机化合物的任何组合物(通常为水溶液)。
在一个实施例中，该有机化合物选自下组，该组由以下各项组成：多元醇和各种碳水化合物。在目前方法为发酵法时，这样的有机化合物、以及包含所述有机化合物的起始组合物是特别有用的。
术语“多元醇”是指含有多于一个羟基的分子。多元醇可以是分别含有2、3、和4个羟基的二醇、三醇或四醇。多元醇还可含有多于四个的羟基，例如分别含有5、6、或7个羟基的戊醇、己醇、庚醇等等。另外，多元醇还可以是糖醇、多元醇、或聚合醇，它们是碳水化合物的还原形式，其中羰基(醛或酮、还原糖)已被还原为伯醇羟基或仲醇羟基。多元醇的实例包括但不限于，赤藓醇、麦芽糖醇、甘露醇、山梨醇、拉克替醇、木糖醇、肌醇、异麦芽酮糖醇、丙二醇、甘油、苏糖醇、半乳糖醇、氢化异麦芽酮糖、还原的异麦芽糖寡糖、还原的低聚木糖、还原的龙胆低聚糖、还原的麦芽糖浆、还原的葡萄糖浆、氢化的淀粉水解物、聚糖醇和糖醇或能够被还原的任何其他碳水化合物。
术语“碳水化合物”是指被多个羟基取代的醛或酮化合物，具有通式(CH2O)n，其中n为3-30，以及它们的低聚物和聚合物。另外，本发明的碳水化合物可在一个或多个位置被取代或去氧。如本文使用的碳水化合物包括未修饰的碳水化合物、碳水化合物衍生物、取代的碳水化合物、和修饰的碳水化合物。如本文使用的，短语“碳水化合物衍生物”、“取代的碳水化合物”、和“修饰的碳水化合物”是同义的。修饰的碳水化合物意指，其中至少一个原子已被添加、去除、或取代或其组合的任何碳水化合物。因此，碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物包括取代和未取代的单糖、二糖、寡糖、和多糖。碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物任选地可在任何对应的C-位置上被脱氧，和/或可被一个或多个部分取代，所述部分例如氢、卤素、卤代烷基、羧基、酰基、酰氧基、氨基、酰胺基、羧基衍生物、烷氨基、二烷氨基、芳氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺基、巯基、亚胺基、磺酰基、亚氧硫基、亚磺酰基、氨磺酰基、烷氧羰基、甲酰胺基、膦酰基(phosphonyl)、氧膦基(phosphinyl)、磷酰基、膦基、硫酯、硫醚、肟基、肼基、氨甲酰基、二氧磷基(phospho)、膦酸基(phosphonato)或任何其他活性官能团，只要该碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物能够改善甜味剂组合物的甜味。
可按照本发明使用的碳水化合物的实例包括但不限于，塔格糖、海藻糖、半乳糖、鼠李糖、各种环糊精、环状寡糖、各种类型的麦芽糊精、葡聚糖、蔗糖、葡萄糖、核酮糖、果糖、苏糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、艾杜糖、乳糖、麦芽糖、转化糖、异海藻糖、新海藻糖、异麦芽酮糖、赤藓糖、脱氧核糖、古洛糖、艾杜糖、塔洛糖、赤藓酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、松二糖、纤维二糖、支链淀粉、葡糖胺、甘露糖胺、岩藻糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖酸内酯、阿比可糖、半乳糖胺、甜菜寡糖、异麦芽糖寡糖(异麦芽糖、异麦芽三糖、潘糖等)、低聚木糖(木三糖、木二糖等)、木糖末端寡糖(xylo-terminatedoligosaccharides)、龙胆低聚糖(龙胆二糖、龙胆三糖、龙胆四糖等)、山梨糖、黑曲霉寡糖、帕拉金糖寡糖、果糖寡聚体(蔗果三糖、霉菌赤藓醛糖等)、麦芽四醇(maltotetraol)、麦芽三醇(maltotriol)、麦芽低聚糖(麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖等)、淀粉、菊粉、菊粉寡糖、乳果糖、蜜二糖、棉子糖、核糖、异构化液体糖例如高果糖玉米糖浆、偶联糖和大豆寡糖。此外，本文中使用的碳水化合物可以为D或L构型。
起始化合物可以是合成的或纯化的(部分或完全)、可商购的或制备的。
在一个实施例中，有机化合物是甘油。在另一个实施例中，起始组合物包含甘油。
在一个实施例中，有机化合物是葡萄糖。在另一个实施例中，起始组合物包含葡萄糖。
在一个实施例中，有机化合物是蔗糖。在另一个实施例中，起始组合物包含蔗糖。
在一个实施例中，有机化合物是淀粉。在另一个实施例中，起始组合物包含淀粉。
在一个实施例中，有机化合物是麦芽糊精。在另一个实施例中，起始组合物包含麦芽糊精。
一种或多种有机化合物用作用于产生一种或多种靶甜菊醇糖苷的一种或多种底物，如本文中所述。
本发明方法还提供了将一种甜菊醇糖苷生物催化转化为另一种甜菊醇糖苷的方法。相应地，在一些实施例中，该有机化合物是甜菊醇糖苷，包括但不限于，甜菊单苷、甜菊双苷、甜叶悬钩子苷、杜尔可苷B、杜尔可苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷M2、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2、莱鲍迪苷N或莱鲍迪苷O、或其他甜菊醇糖苷。
值得注意的是，用于生物催化转化的底物甜菊醇糖苷与靶甜菊醇糖苷是不相同的，如下文论述。然而，起始组合物可以含有除了底物甜菊醇糖苷以外的甜菊醇糖苷，并且在一些情况下，可以含有一定量的靶甜菊醇糖苷。
靶甜菊醇糖苷
本发明的靶甜菊醇糖苷可以是可通过本文中披露的方法制备的任何甜菊醇糖苷。在一个实施例中，靶甜菊醇糖苷选自下组，该组由以下各项组成：甜菊单苷、甜菊双苷、甜叶悬钩子苷、杜尔可苷B、杜尔可苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷M2、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2、莱鲍迪苷N或莱鲍迪苷O、或其他甜菊醇糖苷。
在一个实施例中，靶甜菊醇糖苷是甜菊苷。在另一个实施例中，靶甜菊醇糖苷是reb A。在再另一个实施例中，靶甜菊醇糖苷是reb E。在又另一个实施例中，靶甜菊醇糖苷是reb D。在又另一个实施例中，靶甜菊醇糖苷是reb D2。在一个另外的实施例中，靶甜菊醇糖苷是reb M。在再另外的另一个实施例中，靶甜菊醇糖苷是reb M2。
靶甜菊醇糖苷可以是任何多态形式或无定形形式，包括水合物、溶剂化物、无水形式或其组合。
在一个实施例中，本发明为用于产生reb A的生物催化法。在一个更具体的实施例中，本发明为用于从包含例如葡萄糖的起始组合物产生reb A的发酵方法。
在另一个实施例中，本发明为用于产生reb E的生物催化法。在一个更具体的实施例中，本发明为用于从包含例如葡萄糖的起始组合物产生reb E的发酵方法。
在再另一个实施例中，本发明为用于产生reb D的生物催化法。在一个更具体的实施例中，本发明为用于从包含例如葡萄糖的起始组合物产生reb D的发酵方法。
在又另一个实施例中，本发明为用于产生reb D2的生物催化法。在一个更具体的实施例中，本发明为用于从包含例如葡萄糖的起始组合物产生reb D2的发酵方法。
在一个另外的实施例中，本发明为用于产生reb M的生物催化法。在一个更具体的实施例中，本发明为用于从包含例如葡萄糖的起始组合物产生reb M的发酵方法。
在再另外的实施例中，本发明为用于产生reb M2的生物催化法。在一个更具体的实施例中，本发明为用于从包含例如葡萄糖的起始组合物产生reb M2的发酵方法。
在另一个另外的实施例中，本发明为用于产生甜菊苷的生物催化法。在一个更具体的实施例中，本发明为用于从包含例如葡萄糖的起始组合物产生甜菊苷的发酵方法。
任选地，本发明的方法还包括，将靶甜菊醇糖苷从介质分离，以提供高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物。靶甜菊醇糖苷可通过任何适当的方法例如结晶、通过膜的分离、离心、提取、色谱分离或这类方法的组合来分离。
在具体的实施例中，本文中描述的方法产生高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物。如本文中使用的，术语“高度纯化的”是指具有按干重计超过约80％的靶甜菊醇糖苷的组合物。在一个实施例中，高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物包含按干重计超过约90％的靶甜菊醇糖苷，例如，像按干重计超过约91％、超过约92％、超过约93％、超过约94％、超过约95％、超过约96％、超过约97％、超过约98％或超过约99％的靶甜菊醇糖苷含量。
在一个实施例中，当靶甜菊醇糖苷是reb M时，本文中描述的方法提供了具有按干重计超过约90％的reb M含量的组合物。在另一个具体的实施例中，当靶甜菊醇糖苷是rebM时，本文中描述的方法提供了包含按干重计超过约95％的reb M含量的组合物。
在另一个实施例中，当靶甜菊醇糖苷是reb M2时，本文中描述的方法提供了具有按干重计超过约90％的reb M2含量的组合物。在另一个具体的实施例中，当靶甜菊醇糖苷是reb M2时，本文中描述的方法提供了包含按干重计超过约95％的reb M2含量的组合物。
在又另一个实施例中，当靶甜菊醇糖苷是reb D时，本文中描述的方法提供了按干重计超过约90％的reb D含量的组合物。在另一个具体的实施例中，当靶甜菊醇糖苷是rebD时，本文中描述的方法提供了包含按干重计超过约95％的reb D含量的组合物。
在再另一个实施例中，当靶甜菊醇糖苷是reb D2时，本文中描述的方法提供了按干重计超过约90％的reb D2含量的组合物。在另一个具体的实施例中，当靶甜菊醇糖苷是reb D2时，本文中描述的方法提供了包含按干重计超过约95％的reb D2含量的组合物。
在一个另外的实施例中，当靶甜菊醇糖苷是reb A时，本文中描述的方法提供了包含按干重计超过约90％的reb A含量的组合物。在另一个具体的实施例中，当靶甜菊醇糖苷是reb A时，本文中描述的方法提供了包含按干重计超过约95％的reb A含量的组合物。
在再另外的实施例中，当靶甜菊醇糖苷是reb E时，本文中描述的方法提供了包含按干重计超过约90％的reb E含量的组合物。在另一个具体的实施例中，当靶甜菊醇糖苷是reb E时，本文中描述的方法提供了包含按干重计超过约95％的reb E含量的组合物。
在又一个另外的实施例中，当靶甜菊醇糖苷是甜菊苷时，本文中描述的方法提供了包含按干重计超过约90％的甜菊苷含量的组合物。在另一个具体的实施例中，当靶甜菊醇糖苷是甜菊苷时，本文中描述的方法提供了包含按干重计超过约95％的甜菊苷含量的组合物。
微生物和生物催化剂
在本发明的一个实施例中，生物催化剂与含有起始组合物的介质接触以产生靶甜菊醇糖苷。在某些实施例中，生物催化剂是一种酶、或包含一种或多种酶的细胞，所述酶能够将有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷。
在一个实施例中，生物催化剂是能够将有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷的酶。酶可以被提供为全细胞悬液、粗裂解物、纯化酶或其组合的形式。在一个实施例中，生物催化剂是能够将有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷的纯化的酶。在另一个实施例中，生物催化剂是包含能够将有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷的至少一种酶的粗裂解物。在再另一个实施例中，生物催化剂是包含能够将有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷的至少一种酶的全细胞悬液。
在另一个实施例中，生物催化剂是包含能够将有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷的酶的一种或多种细胞。酶可位于细胞表面上、细胞内部或既位于细胞表面上又位于细胞内部。
在一个实施例中，在有机化合物到靶甜菊醇糖苷的每一转化中使用一种生物催化剂酶。在另一个实施例中，在每一转化中使用两种或更多种生物催化剂酶。
用于将有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷的适合的酶包括但不限于，甜菊醇生物合成酶和UDP-糖基转移酶(UGT)。
在一个实施例中，甜菊醇生物合成酶包括甲羟戊酸(MVA)途径酶。
在另一个实施例中，甜菊醇生物合成酶包括非甲羟戊酸2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径(MEP/DOXP)酶。
在一个实施例中，甜菊醇生物合成酶选自下组，该组由以下各项组成：香叶基香叶基二磷酸合酶、柯巴基二磷酸合酶、贝壳杉烯合酶、贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)、甜菊醇合成酶、脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)、D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(MCS)、l-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)、l-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶(HDR)、乙酰乙酰-CoA硫解酶、截短的HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和细胞色素P450还原酶。
UDP-葡萄糖基转移酶可以是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜菊醇和/或甜菊醇糖苷底物以提供靶甜菊醇糖苷的任何UDP-葡萄糖基转移酶。
在一个实施例中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜叶悬钩子苷由此产生甜菊苷的任何UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可以是例如UGT91D2。
在另一个实施例中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜叶悬钩子苷从而产生莱鲍迪苷E的任何UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可以是例如UGTSL、UGTSL2或UGTLB。
在再另一个实施例中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至莱鲍迪苷E，从而产生莱鲍迪苷D的任何UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可以是例如UGT76G1。
在又一个实施例中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜菊苷，从而产生莱鲍迪苷A的任何UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可以是例如UGT76G1。
在一个另外的实施例中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至莱鲍迪苷A，从而产生莱鲍迪苷D和/或莱鲍迪苷D2和/或莱鲍迪苷M2的任何UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可以是例如UGT91D2、UGTSL2、UGTLB或EUGT11。
在另一个实施例中，能够将至少一个葡萄糖单位添加至莱鲍迪苷A的UDP-葡萄糖基转移酶选自以下基因信息(GenInfo)识别号的清单，优选来自呈现在表1中的组，并且更优选呈现在表2中的组。
Figure BDA0000906704130000141
Figure BDA0000906704130000151
Figure BDA0000906704130000161
Figure BDA0000906704130000171
Figure BDA0000906704130000181
Figure BDA0000906704130000191
表1
Figure BDA0000906704130000192
Figure BDA0000906704130000201
Figure BDA0000906704130000211
Figure BDA0000906704130000221
表2
GI号 登录号 起源 内标
460409128 XP.004249992.1 番茄 UGTSL
460386018 XP.004238697.1 番茄 -
460409134 XP.004249995.1 番茄 -
460410132 XP.004250485.1 番茄 UGTSL2
460410130 XP.004250484.1 番茄 -
460410128 XP.004250483.1 番茄 -
460378310 XP.004234916.1 番茄 -
209954733 BAG80557.1 宁夏枸杞 UGTLB
209954725 BAG80553.1 宁夏枸杞 -
在又另一个实施例中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至莱鲍迪苷D以形成莱鲍迪苷M和/或莱鲍迪苷M2的任何UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可以是例如UGT76G1。在优选的实施例中，转化率至少超过50％，例如超过60％，超过70％，超过80％或超过90％。
UGT76G1酶还可以含有有益于将莱鲍迪苷D转化为莱鲍迪苷M的一个或多个点突变。适合的突变包括例如，S42A、F46I、I190L、S274G、I295M、K303G、F314S、K316R、K393R、V394I、I407V、N409K、N409R、Q425E、Q432E、S447A和S456L。在优选的实施例中，与在相同条件下使用未突变的UGT76G1相比较，利用含有这样的一个或多个点突变的UGT76G1导致莱鲍迪苷M转化增加至少约5％(其中结果经归一化)。在优选的实施例中，生成莱鲍迪苷M的转化是从约5％增加到约50％，例如像从约10％到约50％，从约20％到约50％，从约30％到约50％或约40％到约50％。
在一些实施例中，微生物包含本发明的酶，即能够将有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷的酶。相应地，本发明方法的一些实施例包括使微生物与含有起始组合物的介质接触以提供包含至少一种靶甜菊醇糖苷的介质。
该微生物可以是具备用于将有机化合物转化为一种或多种靶甜菊醇糖苷的一种或多种必需酶的任何微生物。这些酶在微生物的基因组内被编码。
适合的微生物包括但不限于，大肠杆菌、酵母菌属物种、曲霉菌属物种、毕赤酵母属物种、芽孢杆菌属物种、耶氏酵母属物种等。
在一个实施例中，当与起始组合物接触时，微生物是游离的。
在另一个实施例中，当与起始组合物接触时，微生物是固定的。例如，可将微生物固定至由无机或有机材料制造的固体支持物。适合用于固定微生物的固体支持物的非限制性实例包括，衍生的纤维素或玻璃、陶瓷、金属氧化物或膜。可以例如通过共价附着、吸附、交联、捕获或封装将微生物固定至固体支持物。
在再另一个实施例中，能够将有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷的酶从微生物中分泌出来并且进入反应介质中。
起始组合物/有机化合物与生物催化剂或微生物在包含水和例如各种组分的水性介质中接触，所述组分选自碳源、能源、氮源、微量元素、维生素、核苷、核苷磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸、有机盐和无机盐、有机酸和矿物酸、碱等等。碳源包括甘油、葡萄糖、二氧化碳、碳酸盐、碳酸氢盐。氮源可包括硝酸盐、亚硝酸盐、氨基酸、肽、蛋白胨、或蛋白质。
在一个具体的实施例中，介质包括缓冲液。适合的缓冲液包括但不限于，PIPES缓冲液、醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。在一个具体的实施例中，介质包括磷酸盐缓冲液。
在一个实施例中，介质还可包括有机溶剂。
任选地，本发明的方法还包括，再循环UDP以提供UDP-葡萄糖。相应地，这些方法包括，通过提供再循环催化剂(即，能够使UDP-葡萄糖过量产生的生物催化剂)和再循环底物来伴随地再循环UDP，从而可使用催化量的UDP-葡萄糖基转移酶和UDP-葡萄糖进行底物甜菊醇糖苷至靶甜菊醇糖苷的转化(图2)。
在一个实施例中，UDP-葡萄糖再循环催化剂是蔗糖合酶。
在一个实施例中，该再循环底物是蔗糖。
任选地，从所得的组合物纯化靶甜菊醇糖苷。可通过用以提供高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物的至少一种适合的方法实现从反应介质纯化靶甜菊醇糖苷。适合的方法包括结晶、通过膜的分离、离心、提取(液相或固相)、色谱分离、HPLC(制备型或分析型)或此类方法的组合。
在一个实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含甜叶悬钩子苷的起始组合物的介质与UGT91D2和UDP-葡萄糖接触而产生甜菊苷的方法。
在一个更具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含甜叶悬钩子苷的起始组合物的介质与催化量的UGT91D2和UDP-葡萄糖接触，和(b)通过提供蔗糖合酶和蔗糖再循环UDP-葡萄糖而产生甜菊苷的催化法。
在另一个具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含葡萄糖的起始组合物的介质与包含能够将葡萄糖转化为甜菊苷的至少一种酶的微生物接触而产生甜菊苷的发酵法。
在再另一个具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含葡萄糖的起始组合物的介质与包含能够将葡萄糖转化为甜菊苷的至少一种酶的微生物接触和(b)通过提供UDP-葡萄糖、蔗糖合酶和蔗糖再循环UDP-葡萄糖而产生甜菊苷的发酵法。
上述方法可进一步包括从该介质中纯化甜菊苷以提供包含高度纯化的甜菊苷的组合物。
在另一个实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含甜叶悬钩子苷的起始组合物的介质与UGTSL2和UDP-葡萄糖接触而产生莱鲍迪苷E的方法。
在一个更具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含甜叶悬钩子苷的起始组合物的介质与催化量的UGTSL2和UDP-葡萄糖接触，和(b)通过提供蔗糖合酶和蔗糖再循环UDP-葡萄糖而产生莱鲍迪苷E的催化法。
在另一个具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含葡萄糖的起始组合物的介质与包含能够将葡萄糖转化为莱鲍迪苷E的至少一种酶的微生物接触而产生莱鲍迪苷E的发酵法。
在再另一个具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含葡萄糖的起始组合物的介质与包含能够将葡萄糖转化为莱鲍迪苷E的至少一种酶的微生物接触和(b)通过提供UDP-葡萄糖、蔗糖合酶和蔗糖再循环UDP-葡萄糖而产生莱鲍迪苷E的发酵法。
上述方法可进一步包括从该介质中纯化莱鲍迪苷E以提供包含高度纯化的莱鲍迪苷E的组合物。
在再另一个实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含莱鲍迪苷E的起始组合物的介质与UGT76G1和UDP-葡萄糖接触而产生莱鲍迪苷D的方法。
在一个更具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含莱鲍迪苷E的起始组合物的介质与催化量的UGT76G1和UDP-葡萄糖接触，和(b)通过提供蔗糖合酶和蔗糖再循环UDP-葡萄糖而产生莱鲍迪苷D的催化法。
在另一个具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含葡萄糖的起始组合物的介质与包含能够将葡萄糖转化为莱鲍迪苷D的至少一种酶的微生物接触而产生莱鲍迪苷D的发酵法。
在再另一个具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含葡萄糖的起始组合物的介质与包含能够将葡萄糖转化为莱鲍迪苷D的至少一种酶的微生物接触和(b)通过提供UDP-葡萄糖、蔗糖合酶和蔗糖再循环UDP-葡萄糖而产生莱鲍迪苷D的发酵法。
上述方法可进一步包括从该介质中纯化莱鲍迪苷D以提供包含高度纯化的莱鲍迪苷D的组合物。
在又另一个实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含甜菊苷的起始组合物的介质与UGT76G1和UDP-葡萄糖接触而产生莱鲍迪苷A的方法。
在一个更具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含甜菊苷的起始组合物的介质与催化量的UGT76G1和UDP-葡萄糖接触，和(b)通过提供蔗糖合酶和蔗糖再循环UDP-葡萄糖而产生莱鲍迪苷A的催化法。
在另一个具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含葡萄糖的起始组合物的介质与包含能够将葡萄糖转化为莱鲍迪苷A的至少一种酶的微生物接触而产生莱鲍迪苷A的发酵法。
在再另一个具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含葡萄糖的起始组合物的介质与包含能够将葡萄糖转化为莱鲍迪苷A的至少一种酶的微生物接触和(b)通过提供UDP-葡萄糖、蔗糖合酶和蔗糖再循环UDP-葡萄糖而产生莱鲍迪苷A的发酵法。
上述方法可进一步包括从该介质中纯化莱鲍迪苷A以提供包含高度纯化的莱鲍迪苷A的组合物。
在再另外的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含莱鲍迪苷A的起始组合物的介质与UGT91D2、UGTSL2或EUGT11和UDP-葡萄糖接触而产生莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2和/或莱鲍迪苷M2的方法。
在一个更具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含莱鲍迪苷A的起始组合物的介质与催化量的UGT91D2、UGTSL2或EUGT11、和UDP-葡萄糖接触，和(b)通过提供蔗糖合酶和蔗糖再循环UDP-葡萄糖而产生莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2和/或莱鲍迪苷M2的催化法。
在另一个具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含葡萄糖的起始组合物的介质与包含能够将葡萄糖转化为莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2和/或莱鲍迪苷M2的至少一种酶的微生物接触而产生莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2和/或莱鲍迪苷M2的发酵法。
在再另一个具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含葡萄糖的起始组合物的介质与包含能够将葡萄糖转化为莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2和/或莱鲍迪苷M2的至少一种酶的微生物接触和(b)通过提供UDP-葡萄糖、蔗糖合酶和蔗糖再循环UDP-葡萄糖而产生莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2和/或莱鲍迪苷M2的发酵法。
上述方法可进一步包括从该介质中分离莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2和/或莱鲍迪苷M2以提供包含高度纯化的莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2和/或莱鲍迪苷M2的组合物。
在又另一个实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含莱鲍迪苷D的起始组合物的介质与UGT76G1和UDP-葡萄糖接触而产生莱鲍迪苷M的方法。
在一个更具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含莱鲍迪苷D的起始组合物的介质与催化量的UGT76G1和UDP-葡萄糖接触，和(b)通过提供蔗糖合酶和蔗糖再循环UDP-葡萄糖而产生莱鲍迪苷M的催化法。
在另一个具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含葡萄糖的起始组合物的介质与包含能够将葡萄糖转化为莱鲍迪苷M的至少一种酶的微生物接触而产生莱鲍迪苷M的发酵法。
在再另一个具体的实施例中，本发明提供了通过(a)使含有包含葡萄糖的起始组合物的介质与包含能够将葡萄糖转化为莱鲍迪苷M的至少一种酶的微生物接触和(b)通过提供UDP-葡萄糖、蔗糖合酶和蔗糖再循环UDP-葡萄糖而产生莱鲍迪苷M的发酵法。
上述方法可进一步包括从该介质中分离莱鲍迪苷M以提供包含高度纯化的莱鲍迪苷M的组合物。
在一些实施例中，依次进行了多个生物催化步骤，以便将例如(i)莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D，然后(ii)将莱鲍迪苷D转化为莱鲍迪苷M，或者(i)将甜菊苷转化为莱鲍迪苷A，然后(ii)将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D，然后(iii)将莱鲍迪苷D转化为莱鲍迪苷M，或者(i)将甜叶悬钩子苷转化为甜菊苷，然后(ii)将甜菊苷转化为莱鲍迪苷A，然后(iii)将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D，然后(iv)将莱鲍迪苷D转化为莱鲍迪苷M。
可替代地，可以依次使用发酵和生物催化步骤。例如，可以首先用含有能够将葡萄糖转化为靶甜菊醇糖苷的至少一种酶的微生物对包含葡萄糖的起始组合物进行发酵。然后可以使靶甜菊醇糖苷(现在变为用于下一次生物转化目的的起始材料)与能够将其转化为下一种靶甜菊醇糖苷的生物催化剂接触。
在各转化之间，在使甜菊醇糖苷(现在变为用于下一次生物转化目的的起始甜菊醇糖苷)与下一种生物催化剂接触之前，可任选地将靶甜菊醇糖苷从该介质中分离。
化合物和方法
本发明还提供了分离的且高度纯化的reb D2。Reb D2为reb D的异构体并具有以下结构：
Figure BDA0000906704130000291
13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯]
在另一个实施例中，本发明提供了具有按干重计纯度超过约95％，例如像按重量计纯度超过约96％、按重量计纯度超过约97％、按重量计纯度超过约98％、或按重量计纯度超过约99％的reb D2。
在再另一个实施例中，本发明提供了在甜菊醇糖苷混合物中具有按重量计纯度超过约95％，例如像按重量计纯度超过约96％、按重量计纯度超过约97％、按重量计纯度超过约98％、或按重量计纯度超过约99％的reb D2。
本发明还提供了包含reb D2的组合物。
本发明还提供了用于制备reb D2的方法，该方法包括：
a.使包含reb A的起始组合物与能够将reb A转化为reb D2的酶、UDP-葡萄糖、以及任选的UDP-葡萄糖循环酶接触，以产生包含reb D2的组合物；并且
b.分离包含reb D2的组合物。
在一些实施例中，能够将reb A转化为reb D2的酶是UDP-葡萄糖基转移酶，例如像，UGT91D2、UGTSL、UGTSL_Sc、UGTSL2(GI号460410132版本XP_004250485.1)、GI号460409128(UGTSL)版本XP_004249992.1、GI号115454819版本NP_001051010.1、GI号187373030、版本ACD03249.1、GI号222619587版本EEE55719.1、GI号297795735版本XP_002865752.1或EUGT11。
在一个实施例中，该酶可被提供为含有所述酶的一种或多种细胞的形式。
在其他实施例中，该酶可以被提供为全细胞悬液、粗裂解物、纯化酶或其组合的形式。在一个实施例中，该酶是纯化的酶。在另一个实施例中，该酶被提供为粗裂解物的形式。在再另一个实施例中，该酶被提供为全细胞悬液的形式。
能够将reb A转化为reb D2的酶可被固定。
在另一个实施例中，该酶被提供在微生物中。
在一个实施例中，当与起始组合物接触时，微生物是游离的。
在另一个实施例中，当与起始组合物接触时，微生物是固定的。例如，可将微生物固定至由无机或有机材料制造的固体支持物。适合用于固定微生物的固体支持物的非限制性实例包括，衍生的纤维素或玻璃、陶瓷、金属氧化物或膜。可以例如通过共价附着、吸附、交联、捕获或封装将微生物固定至固体支持物。
适合的微生物包括但不限于，大肠杆菌、酵母菌属物种、曲霉菌属物种、毕赤酵母属物种、芽孢杆菌属物种、耶氏酵母属物种等。
在再另一个实施例中，该酶从微生物中分泌出来并且进入反应介质中。
该起始组合物与该酶或微生物在包含水和各种组分的水性介质中接触，所述组分选自下组，该组包括：碳源、能源、氮源、微量元素、维生素、核苷、核苷磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸、有机盐和无机盐、有机酸和矿物酸、碱等等。碳源包括甘油、葡萄糖、二氧化碳、碳酸盐、碳酸氢盐。氮源可包括硝酸盐、亚硝酸盐、氨基酸、肽、蛋白胨、或蛋白质。
在一个具体的实施例中，介质包括缓冲液。适合的缓冲液包括但不限于，PIPES缓冲液、醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。在一个具体的实施例中，介质包括磷酸盐缓冲液。
在一个实施例中，该介质还可包括有机溶剂。
在一个具体的实施例中，该酶是能够将reb A转化为reb D2的UDP-葡萄糖基转移酶。
在一个更具体的实施例中，该酶选自UGT91D2、UGTSL、UGTSL_Sc、UGTSL2(GI号460410132版本XP_004250485.1)、GI号460409128(UGTSL)版本XP_004249992.1、GI号115454819版本NP_001051010.1、GI号187373030、版本ACD03249.1、GI号222619587版本EEE55719.1、GI号297795735版本XP_002865752.1或EUGT11以及这些酶具有实质性(>85％)序列一致性的UGT。
在再更具体的实施例中，该酶是UGTSL2或通过定向演化产生并且具有更高活性的其改良变体。
在一个实施例中，在转化进展的同时连续地将reb D2从该介质中移除。在又另一个实施例中，在完成反应之后从该反应介质中分离reb D2并且任选地进行纯化。
可以通过任何适合的方法从反应介质中分离reb D2以提供包含reb D2的组合物。适合的方法包括但不限于，裂解、结晶、通过膜的分离、离心、提取(液相或固相)、色谱分离、HPLC(制备型或分析型)或此类方法的组合。在一个具体的实施例中，可以通过裂解和离心实现分离。
在一些实施例中，分离可导致按干重计低于约95％的reb D2纯度，并且该组合物可含有例如甜菊醇糖苷和/或残余反应产物。可将该包含reb D2的组合物进一步纯化以提供高度纯化的reb D2，即，具有按干重计大于约95％的纯度的reb D2。在一些实施例中，可将这些包含reb D2的组合物进一步纯化以提供具有按干重计大于约96％，大于约97％，大于约98％或大于约99％的纯度的reb D2。
纯化可以受到本领域技术人员已知的任何手段的影响，这些手段包括但不限于，结晶、通过膜的分离、离心、提取(液相或固相)、色谱分离、HPLC(制备型或分析型)或此类方法的组合。在一个具体的实施例中，使用HPLC来纯化reb D2。在一个更具体的实施例中，使用半制备型HPLC来纯化reb D2。
例如，可以使用两步半制备型HPLC纯化。第一步利用C18柱，其中流动相含有A(水中的25％MeCN)和B(水中的30％MeCN)，具有以下梯度：
Figure BDA0000906704130000311
Figure BDA0000906704130000321
第二步利用相同的柱子和条件，不过仅仅具有一个等度流动相：水中的20％MeCN。
本领域中技术人员将认识到，特定的柱子、流动相、注射体积和其他HPLC参数可以变化。
本发明提供了分离的且高度纯化的reb M2。Reb M2为reb M的异构体并具有以下结构：
Figure BDA0000906704130000322
(13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯])
在另一个实施例中，本发明提供了具有按干重计纯度超过约95％，例如像按重量计纯度超过约96％、按重量计纯度超过约97％、按重量计纯度超过约98％、或按重量计纯度超过约99％的reb M2。
在再另一个实施例中，本发明提供了在甜菊醇糖苷混合物中具有按重量计纯度超过约95％，例如像按重量计纯度超过约96％、按重量计纯度超过约97％、按重量计纯度超过约98％、或按重量计纯度超过约99％的reb M2。
在又另一个实施例中，本发明提供了在甜叶菊提取物中具有按重量计纯度超过约95％，例如像按重量计纯度超过约96％、按重量计纯度超过约97％、按重量计纯度超过约98％、或按重量计纯度超过约99％的reb M2。
本发明还提供了包含reb M2的组合物。
已经发现在reb A到reb D的生物转化过程中产生了reb M2。如上所述，reb A到reb D的生物转化还产生了reb D2。相应地，本发明还提供了用于制备reb M2的方法，该方法包括：
a.使包含reb A和/或reb D2的起始组合物与能够将reb A和/或reb D2转化为rebM2的酶、UDP-葡萄糖、以及任选的UDP-葡萄糖循环酶接触，以产生包含reb M2的组合物；并且
b.分离包含reb M2的组合物。
不希望受理论的束缚，当前认为该途径以reb A到reb D2的转化开始，随后为rebD2到reb M2的转化。相应地，本发明提供了用于制备reb M2的方法，该方法包括：
a.使包含reb D2的起始组合物与能够将reb D2转化为reb M2的酶、UDP-葡萄糖、以及任选的UDP-葡萄糖循环酶接触，以产生包含reb M2的组合物；并且
b.分离包含reb M2的组合物。
在又另一个实施例中，用于制备reb M2的方法包括：
a.使包含reb A的起始组合物与能够将reb A转化为reb D2的酶、UDP-葡萄糖、以及任选的UDP-葡萄糖循环酶接触，以产生包含reb D2的组合物；
b.任选地，分离包含reb D2的组合物；
c.使包含reb D2的组合物与能够将reb D2转化为reb M2的酶、UDP-葡萄糖、以及任选的UDP-葡萄糖循环酶接触，以产生包含reb M2的组合物；并且
d.分离包含reb M2的组合物。
该酶可以是UDP-葡萄糖基转移酶，例如像，UGT91D2、UGTSL、UGTSL_Sc、UGTSL2(GI号460410132版本XP_004250485.1)、GI号460409128(UGTSL)版本XP_004249992.1、GI号115454819版本NP_001051010.1、GI号187373030、版本ACD03249.1、GI号222619587版本EEE55719.1、GI号297795735版本XP_002865752.1或EUGT11。
在一个实施例中，该酶可被提供为含有所述酶的一种或多种细胞的形式。
在其他实施例中，该酶可以被提供为全细胞悬液、粗裂解物、纯化酶或其组合的形式。在一个实施例中，该酶是纯化的酶。在另一个实施例中，该酶被提供为粗裂解物的形式。在再另一个实施例中，该酶被提供为全细胞悬液的形式。
在一些实施例中，该酶可以被固定。
在另一个实施例中，该酶被提供在微生物中。
在一个实施例中，当与起始组合物接触时，微生物是游离的。
在另一个实施例中，当与起始组合物接触时，微生物是固定的。例如，可将微生物固定至由无机或有机材料制造的固体支持物。适合用于固定微生物的固体支持物的非限制性实例包括，衍生的纤维素或玻璃、陶瓷、金属氧化物或膜。可以例如通过共价附着、吸附、交联、捕获或封装将微生物固定至固体支持物。
适合的微生物包括但不限于，大肠杆菌、酵母菌属物种、曲霉菌属物种、毕赤酵母属物种、芽孢杆菌属物种、耶氏酵母属物种等。
在再另一个实施例中，该酶从微生物中分泌出来并且进入反应介质中。
该起始组合物与该酶或微生物在包含水和各种组分的水性介质中接触，所述组分选自下组，该组包括：碳源、能源、氮源、微量元素、维生素、核苷、核苷磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸、有机盐和无机盐、有机酸和矿物酸、碱等等。碳源包括甘油、葡萄糖、二氧化碳、碳酸盐、碳酸氢盐。氮源可包括硝酸盐、亚硝酸盐、氨基酸、肽、蛋白胨、或蛋白质。
在一个具体的实施例中，介质包括缓冲液。适合的缓冲液包括但不限于，PIPES缓冲液、醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。在一个具体的实施例中，介质包括磷酸盐缓冲液。
在一个实施例中，该介质还可包括有机溶剂。
在一个具体的实施例中，该酶是能够将reb A和/或reb D2转化为reb M2的UDP-葡萄糖基转移酶并且被包含在大肠杆菌中。
在一个更具体的实施例中，该酶选自UGT91D2、UGTSL、UGTSL_Sc、UGTSL2(GI号460410132版本XP_004250485.1)、GI号460409128(UGTSL)版本XP_004249992.1、GI号115454819版本NP_001051010.1、GI号187373030、版本ACD03249.1、GI号222619587版本EEE55719.1、GI号297795735版本XP_002865752.1或EUGT11。
在再更具体的实施例中，该酶是UGTSL2或通过定向演化产生并且具有更高活性的其改良变体。
在一个实施例中，在转化进展的同时可以连续地将reb M2从该介质中移除。在又另一个实施例中，在完成反应之后从该反应介质中分离reb M2并且任选地进行纯化。
可以通过任何适合的方法从反应介质中分离reb M2以提供包含reb M2的组合物。适合的方法包括但不限于，裂解、结晶、通过膜的分离、离心、提取(液相或固相)、色谱分离、HPLC(制备型或分析型)或此类方法的组合。在一个具体的实施例中，可以通过裂解和离心实现分离。
在一些实施例中，分离可导致按干重计低于约95％的reb M2纯度，并且该组合物可含有例如甜菊醇糖苷和/或残余反应产物。
可将该包含reb M2的组合物进一步纯化以提供高度纯化的reb M2，即，具有按干重计大于约95％的纯度的reb M2。在一些实施例中，可将这些包含reb M2的组合物进一步纯化以提供具有按干重计大于约96％、大于约97％、大于约98％或大于约99％的纯度的rebM2。
纯化可以受到本领域技术人员已知的任何手段的影响，这些手段包括但不限于，结晶、通过膜的分离、离心、提取(液相或固相)、色谱分离、HPLC(制备型或分析型)或此类方法的组合。在一个具体的实施例中，使用HPLC来纯化reb M2。在一个更具体的实施例中，使用半制备型HPLC来纯化reb M2。
例如，可以使用两步半制备型HPLC纯化。第一步利用C18柱，其中流动相含有A(水中的25％MeCN)和B(水中的30％MeCN)，具有以下梯度：
时间(min) ％A ％B
0.0-5.0 100 0
20 20 80
25 20 80
30 100 0
第二步利用相同的柱子和条件，不过仅仅具有一个等度流动相：水中的20％MeCN。
本领域中技术人员将认识到，特定的柱子、流动相、注射体积和其他HPLC参数可以变化。
按照本发明制备的纯化的甜菊醇糖苷可用于多种可消费产品中，包括但不限于食品、饮料、药物组合物、烟草产品、营养制品组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物。
在本发明中获得的高纯度reb M具有1291.29的分子量，分子式为C56H90O33，CAS登记号为1220616-44-3，其结构呈现在图1中，其处于白色无味粉末的形式。当与10％蔗糖溶液相比较时，该化合物比糖甜约200倍。
纯reb M化合物的其他性质包括，249℃-250℃的熔点和在50％乙醇中[α]D 25-19.0°的比旋光度(C＝1.0)。reb M在水中的溶解度为大约0.3％，并且随着温度的增加而增加。
Reb M可溶于甲醇、乙醇、正丙醇、和异丙醇的稀释溶液中。然而，它不溶于丙酮、苯、氯仿、和醚中。
根据本发明获得的Reb M是热稳定的和pH稳定的。
根据本发明获得的一种或多种高度纯化的靶糖苷，尤其是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2可“按原样”使用，或与其他甜味剂、香料和食品成分及其组合进行组合使用。
香料的非限制性实例包括但不限于，石灰、柠檬、柑橘、水果、香蕉、葡萄、梨、菠萝、芒果、浆果、苦杏仁、可乐、肉桂、糖、棉花糖、香草及其组合。
其他食物成分的非限制性实例包括但不限于酸化剂、有机酸和氨基酸、着色剂、填充剂(bulking agent)、改性淀粉、树胶、组织改良剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂、胶凝剂及其组合。
根据本发明获得的一种或多种高度纯化的靶糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，可以制备为各种多态形式，包括但不限于水合物、溶剂化物、无水形式、无定形形式和其组合。
可将根据本发明获得的一种或多种高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、rebD2、reb M和/或reb M2，作为高强度天然甜味剂掺入食品、饮料、药物组合物、化妆品、口香糖、桌面产品(table top product)、谷物、乳制品、牙膏和其他口腔组合物等中。
一种或多种高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是作为甜味化合物的reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，可以作为唯一的甜味剂采用，或者可以彼此一起使用，或者与至少一种其他天然存在的高强度甜味剂一起使用，这些高强度甜味剂例如甜叶菊、甜叶菊提取物、甜菊单苷、甜菊双苷、甜菊苷、reb A、reb B、reb C、reb E、reb F、reb G、reb I、reb E、reb H、reb L、reb K、reb J、reb N、reb O、甜菊双苷、杜尔可苷A、杜尔可苷B、甜叶悬钩子苷、或发现于甜叶菊中的其他甜菊醇糖苷、罗汉果苷、布拉齐因(brazzein)、新橙皮苷二氢查耳酮、甘草酸及其盐、索马甜、紫苏葶、pernandulcin、无患子倍半萜苷、白云参苷、糙苏苷-I、二甲基-六氢芴-二羧酸、相思子苷(abrusoside)、巴西甘草甜素、肉花雪胆苷(carnosifloside)、青钱柳苷、蝶卡苷(pterocaryoside)、聚波朵苷(polypodoside)A、巴西木素、贺兰甜精(hernandulcin)、叶甜素(phillodulcin)、菝葜苷、根皮苷、三叶苷、二氢黄酮醇、二氢槲皮素-3-乙酸酯、新落新妇苷(neoastilibin)、反式肉桂醛、莫那汀(monatin)及其盐、修蕨素A(selligueain A)、苏木精、应乐果甜蛋白(monellin)、欧亚水龙骨甜素、蝶卡苷A、蝶卡苷B、马槟榔甜蛋白、潘塔亭(pentadin)、神秘果蛋白、仙茅甜蛋白、宽叶仙茅甜蛋白(neoculin)、绿原酸、洋蓟酸、罗汉果甜味剂、罗汉果苷V、罗汉果苷VI、光果木鳖皂苷(grosmomomside)、赛门苷、或发现于罗汉果(Siraitia grosvenorii)中的其他罗汉果醇糖苷及其组合。
在一个具体的实施例中，reb D2和/或reb M2可以与包含选自下组的化合物的甜味剂组合物一起使用，该组由以下各项组成：reb A、reb B、reb D、NSF-02、罗汉果苷V、罗汉果(Luo Han Guo)、阿洛酮糖、阿洛糖、D-塔格糖、赤藓糖醇及其组合。
一种或多种高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，还可以与合成的高强度甜味剂组合使用，这些合成的高强度甜味剂例如三氯蔗糖、乙酰磺胺酸钾、阿斯巴甜、阿力甜、糖精、新橙皮苷二氢查耳酮、甜蜜素、纽甜、甘素、对硝基苯基脲基丙酸钠(suosan)爱德万甜(advantame)、它们的盐，及其组合。
而且，一种或多种高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，可与天然甜味剂抑制剂，例如匙羹藤酸、勿甜素、枣素(ziziphin)、拉克替醇(lactisole)等组合使用。reb D、reb D2、reb M和/或reb M2还可与各种鲜味增强剂组合。reb D、reb D2、reb M和/或reb M2可与鲜味和甜味氨基酸，例如谷氨酸盐、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丝氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸及其组合相混合。
一种或多种高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M，可与选自下组的一种或多种添加剂组合使用，该组由以下各项组成：碳水化合物、多元醇、氨基酸及其相应的盐、聚氨基酸及其相应的盐、糖酸及其相应的盐、核苷酸、有机酸、无机酸、有机盐(包括有机酸盐和有机碱盐)、无机盐、苦味化合物、调味剂和调味成分、涩味化合物、蛋白质或蛋白质水解物、表面活性剂、乳化剂、类黄酮、醇类、聚合物及其组合。
一种或多种高度纯化的靶甜菊醇糖苷特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2可与多元醇或糖醇组合。术语“多元醇”是指含有多于一个羟基的分子。多元醇可以是分别含有2、3、和4个羟基的二醇、三醇或四醇。多元醇还可含有多于四个的羟基，例如分别含有5、6、或7个羟基的戊醇、己醇、庚醇等等。另外，多元醇还可以是糖醇、多元醇、或聚合醇，它们是碳水化合物的还原形式，其中羰基(醛或酮、还原糖)已被还原为伯醇羟基或仲醇羟基。多元醇的实例包括但不限于，赤藓醇、麦芽糖醇、甘露醇、山梨醇、拉克替醇、木糖醇、肌醇、异麦芽酮糖醇、丙二醇、甘油、苏糖醇、半乳糖醇、氢化异麦芽酮糖、还原的异麦芽糖寡糖、还原的低聚木糖、还原的龙胆低聚糖、还原的麦芽糖浆、还原的葡萄糖浆、氢化的淀粉水解物、聚糖醇和糖醇或能够被还原的不会不利地影响甜味剂组合物的味道的任何其他碳水化合物。
一种或多种高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，可与降卡路里甜味剂组合，这些降卡路里甜味剂例如像D-塔格糖、L-糖、L-山梨糖、L-阿拉伯糖及其组合。
一种或多种高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，还可以与各种碳水化合物组合。术语“碳水化合物”通常是指经多个羟基取代的醛或酮化合物，具有通式(CH2O)n，其中n为3-30，以及它们的低聚物和聚合物。另外，本发明的碳水化合物可在一个或多个位置被取代或去氧。如本文使用的碳水化合物包括未修饰的碳水化合物、碳水化合物衍生物、取代的碳水化合物、和修饰的碳水化合物。如本文使用的，短语“碳水化合物衍生物”、“取代的碳水化合物”、和“修饰的碳水化合物”是同义的。修饰的碳水化合物意指，其中至少一个原子已被添加、去除、或取代或其组合的任何碳水化合物。因此，碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物包括取代和未取代的单糖、二糖、寡糖、和多糖。碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物任选地可在任何对应的C-位置上被脱氧，和/或可被一个或多个部分取代，所述部分例如氢、卤素、卤代烷基、羧基、酰基、酰氧基、氨基、酰胺基、羧基衍生物、烷氨基、二烷氨基、芳氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺基、巯基、亚胺基、磺酰基、亚氧硫基、亚磺酰基、氨磺酰基、烷氧羰基、甲酰胺基、膦酰基(phosphonyl)、氧膦基(phosphinyl)、磷酰基、膦基、硫酯、硫醚、肟基、肼基、氨甲酰基、二氧磷基(phospho)、膦酸基(phosphonato)或任何其他活性官能团，只要该碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物能够改善甜味剂组合物的甜味。
可按照本发明使用的碳水化合物的实例包括但不限于，阿洛酮糖、松二糖、阿洛糖、塔格糖、海藻糖、半乳糖、鼠李糖、各种环糊精、环状寡糖、各种类型的麦芽糊精、葡聚糖、蔗糖、葡萄糖、核酮糖、果糖、苏糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、艾杜糖、乳糖、麦芽糖、转化糖、异海藻糖、新海藻糖、异麦芽酮糖、赤藓糖、脱氧核糖、古洛糖、艾杜糖、塔洛糖、赤藓酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、松二糖、纤维二糖、支链淀粉、葡糖胺、甘露糖胺、岩藻糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖酸内酯、阿比可糖、半乳糖胺、甜菜寡糖、异麦芽糖寡糖(异麦芽糖、异麦芽三糖、潘糖等)、低聚木糖(木三糖、木二糖等)、木糖末端寡糖(xylo-terminatedoligosaccharides)、龙胆低聚糖(龙胆二糖、龙胆三糖、龙胆四糖等)、山梨糖、黑曲霉寡糖、帕拉金糖寡糖、果糖寡聚体(蔗果三糖、霉菌赤藓醛糖等)、麦芽四醇(maltotetraol)、麦芽三醇(maltotriol)、麦芽低聚糖(麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖等)、淀粉、菊粉、菊粉寡糖、乳果糖、蜜二糖、棉子糖、核糖、异构化液体糖例如高果糖玉米糖浆、偶联糖和大豆寡糖。此外，本文中使用的碳水化合物可以为D或L构型。
根据本发明获得的一种或多种高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，可与各种生理学活性物质或功能成分组合使用。功能成分通常被分成多个种类，例如类胡萝卜素、膳食纤维、脂肪酸、皂苷、抗氧化剂、营养制品、类黄酮、异硫氰酸盐类、酚类、植物甾醇和甾烷醇(植物甾醇和植物甾烷醇)；多元醇；益生元、益生菌；植物雌激素；大豆蛋白；硫化物/硫醇；氨基酸；蛋白质；维生素；和矿物质。功能成分还可基于它们的健康益处而分类，例如在心血管、降胆固醇、和抗炎方面的益处。示例性功能成分提供在WO 2013/096420中，将其内容通过引用特此结合。
可将根据本发明获得的一种或多种高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、rebD2、reb M和/或reb M2，作为高强度甜味剂用于生产零卡路里、降卡路里或糖尿病饮料和食品(具有改善的味道特征)。其还可用于饮料、食品、药物以及其中不能使用糖的其他产品。另外，一种或多种高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，还可作为甜味剂，不仅可用于饮料、食品和专门用于人消费的其他产品，而且还可用于具有改善的特征的动物饲料和草料。
其中可将一种或多种高度纯化的靶甜菊醇糖苷特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2用作增甜化合物的可消费产品的实例包括但不限于，酒精性饮料例如伏特加酒、葡萄酒、啤酒、酒(liquor)和清酒(sake)等；天然汁；提神饮料；碳酸软饮料；减肥饮料；零卡路里饮料；降卡路里饮料和食品；酸奶饮料；速溶汁液(instant juices)；速溶咖啡；粉末型速溶饮料；罐头产品；糖浆；发酵豆酱；酱油；醋；调味品；蛋黄酱；蕃茄酱；咖喱食品；汤；即时肉汤(instant bouillon)；酱油粉；醋粉；各种类型的饼干；米饼；薄脆饼干(cracker)；面包；巧克力；焦糖；糖果；口香糖；果冻；布丁；果脯及腌菜；鲜奶油；果酱；桔子酱；糖花膏(flowerpaste)；奶粉；冰淇淋；冰糕；包装在瓶中的蔬菜和水果；水煮豆罐头(canned and boiledbeans)；甜酱中煮的肉类和食品；农业蔬菜食品；海产食品；火腿；香肠；鱼火腿；鱼香肠；鱼酱；炸鱼制品；干海产品；冷冻食品；腌制海藻(preserved seaweed)；腌肉；烟草；药品；等等。原则上它可具有不受限制的应用。
在产品例如食品、饮料、药物、化妆品、桌面产品(tabletopproduct)和口香糖的制造过程中，可使用常规方法例如混合、捏和、溶出、浸酸、渗透、渗滤、喷洒、雾化、灌注等方法。
而且，在本发明中获得的一种或多种高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、rebD2、reb M和/或reb M2，可以以干燥形式或液体形式使用。在一个实施例中，提供了包含rebD2的桌面甜味剂(tabletop sweetener)。在另一个实施例中，提供了包含reb M2的桌面甜味剂。
可在食品加热处理之前或之后添加高度纯化的靶甜菊醇糖苷。一种或多种高度纯化的靶甜菊醇糖苷特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2的量取决于使用目的。如上所述，其可单独地添加，或与其他化合物组合地添加。
本发明还针对使用reb D2和/或reb M2在饮料中进行甜味增强。相应地，本发明提供了包含甜味剂和作为甜味增强剂的reb D2和/或reb M2的饮料，其中reb D2和/或reb M2以处于它们的对应甜味识别阈值或该阈值之下的浓度存在。
如本文中使用的，术语“甜味增强剂”是指能够增强或强化组合物例如饮料中的甜味的感知的化合物。术语“甜味增强剂”与术语“甜味道增效剂”、“甜味增效剂”、“甜味放大剂”和“甜味强化剂”是同义的。
如本文中通常使用的术语“甜味识别阈值浓度”是可被人类味觉感知到的甜味化合物的最低已知浓度，典型地约1.0％蔗糖当量(1.0％SE)。通常，当在给定甜味增强剂的甜味识别阈值浓度或该甜味识别阈值浓度之下存在时，甜味增强剂可以增强或加强甜味剂的甜味而通过它们自身并不提供任何显著的甜味；然而，当甜味增强剂处于它们的甜味识别阈值浓度之上时，它们自身可提供甜味。甜味识别阈值浓度对于特定的增强剂是特异性的并且可基于饮料基质而变化。通过给定增强剂在给定饮料基质中直到大于1.0％蔗糖当量的渐增浓度的味道测试，可以容易地确定甜味识别阈值浓度。提供约1.0％的蔗糖当量的浓度被视为甜味识别阈值。
在一些实施例中，甜味剂在饮料中以按重量计从约0.5％到到约12％，例如像，按重量计约1.0％、按重量计约1.5％、按重量计约2.0％、按重量计约2.5％、按重量计约3.0％、按重量计约3.5％、按重量计约4.0％、按重量计约4.5％、按重量计约5.0％、按重量计约5.5％、按重量计约6.0％、按重量计约6.5％、按重量计约7.0％、按重量计约7.5％、按重量计约8.0％、按重量计约8.5％、按重量计约9.0％、按重量计约9.5％、按重量计约10.0％、按重量计约10.5％、按重量计约11.0％、按重量计约11.5％或按重量计约12.0％的量存在。
在一个具体的实施例中，甜味剂在饮料中以按重量计从0.5％到约10％，例如像，从约2％到约8％、从约3％到约7％或从约4％到约6％的量存在。在一个具体的实施例中，甜味剂在饮料中以按重量计约0.5％到约8％的量存在。在另一个具体的实施例中，甜味剂在饮料中以按重量计从约2％到约8％的量存在。
在一个实施例中，甜味剂是传统的卡路里甜味剂。适合的甜味剂包括但不限于，蔗糖、果糖、葡萄糖、高果糖玉米糖浆和高果糖淀粉糖浆。
在另一个实施例中，甜味剂是赤藓糖醇。
在再另一个实施例中，甜味剂是稀有糖。适合的稀有糖包括但不限于，D-阿洛糖、D-阿洛酮糖、L-核糖、D-塔格糖、L-葡萄糖、L-岩藻糖、L-阿拉伯糖(arbinose)、D-松二糖、D-明串珠菌二糖(D-leucrose)及其组合。
预期甜味剂可以单独使用，或者可以与其他甜味剂组合使用。
在一个实施例中，稀有糖是D-阿洛糖。在一个更具体的实施例中，D-阿洛糖在饮料中以按重量计约0.5％到约10％，例如像从约2％到8％的量存在。
在另一个实施例中，稀有糖是D-阿洛酮糖。在一个更具体的实施例中，D-阿洛酮糖在饮料中以按重量计约0.5％到约10％，例如像从约2％到8％的量存在。
在再另一个实施例中，稀有糖是D-核糖。在一个更具体的实施例中，D-核糖在饮料中以按重量计约0.5％到约10％，例如像从约2％到8％的量存在。
在又另一个实施例中，稀有糖是D-塔格糖。在一个更具体的实施例中，D-塔格糖在饮料中以按重量计约0.5％到约10％，例如像从约2％到8％的量存在。
在一个另外的实施例中，稀有糖是L-葡萄糖。在一个更具体的实施例中，L-葡萄糖在饮料中以按重量计约0.5％到约10％，例如像从约2％到8％的量存在。
在一个实施例中，稀有糖是L-岩藻糖。在一个更具体的实施例中，L-岩藻糖在饮料中以按重量计约0.5％到约10％，例如像从约2％到8％的量存在。
在另一个实施例中，稀有糖是L-阿拉伯糖。在一个更具体的实施例中，L-阿拉伯糖在饮料中以按重量计约0.5％到约10％，例如像从约2％到8％的量存在。
在又另一个实施例中，稀有糖是D-松二糖。在一个更具体的实施例中，D-松二糖在饮料中以按重量计约0.5％到约10％，例如像从约2％到8％的量存在。
在又另一个实施例中，稀有糖是D-明串珠菌二糖。在一个更具体的实施例中，D-明串珠菌二糖在饮料中以按重量计约0.5％到约10％，例如像从约2％到8％的量存在。
与不存在甜味增强剂时的相应饮料相比较，以其甜味识别阈值或低于它的浓度添加甜味增强剂增加了包含该甜味剂和该甜味增强剂的饮料的检测的蔗糖当量。而且，在不存在任何甜味剂的情况下，甜味可以按大于含有相同浓度的至少一种甜味增强剂的溶液的可检测甜味的量增加。
相应地，本发明还提供了用于增强包含甜味剂的饮料的甜味的方法，该方法包括提供包含甜味剂的饮料并且添加选自reb D2、reb M2或其组合的甜味增强剂，其中reb D2和reb M2以其甜味识别阈值或低于其甜味识别阈值的浓度存在。
以其甜味识别阈值或低于其甜味识别阈值的浓度向含有甜味剂的饮料中添加rebD2和/或reb M2可以按从约1.0％到约5.0％，例如像，约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％、约3.0％、约3.5％、约4.0％、约4.5％或约5.0％增加检测的蔗糖当量。
以下实例展示了用于制备一种或多种高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2的本发明的优选实施例。应当理解，本发明并不限于在这些实例中的材料、比例、条件和程序，它们仅仅是说明性的。
实例1
UGT76G1的体内产生
将NcoI和NdeI限制性位点添加至描述于Genbank登录号AAR06912.1中的原始核酸序列。在密码子优化之后，获得了下列核酸序列：
CCATGGCCCATATGGAAAACAAAACCGAAACCACCGTTCGTCGTCGTCGCCGTATTATTCTGTTTCCGGTTCCGTTTCAGGGTCATATTAATCCGATTCTGCAGCTGGCAAATGTGCTGTATAGCAAAGGTTTTAGCATTACCATTTTTCATACCAATTTTAACAAACCGAAAACCAGCAATTATCCGCATTTTACCTTTCGCTTTATTCTGGATAATGATCCGCAGGATGAACGCATTAGCAATCTGCCGACACATGGTCCGCTGGCAGGTATGCGTATTCCGATTATTAACGAACATGGTGCAGATGAACTGCGTCGTGAACTGGAACTGCTGATGCTGGCAAGCGAAGAAGATGAAGAAGTTAGCTGTCTGATTACCGATGCACTGTGGTATTTTGCACAGAGCGTTGCAGATAGCCTGAATCTGCGTCGTCTGGTTCTGATGACCAGCAGCCTGTTTAACTTTCATGCACATGTTAGCCTGCCGCAGTTTGATGAACTGGGTTATCTGGATCCGGATGATAAAACCCGTCTGGAAGAACAGGCAAGCGGTTTTCCGATGCTGAAAGTGAAAGATATCAAAAGCGCCTATAGCAATTGGCAGATTCTGAAAGAAATTCTGGGCAAAATGATTAAACAGACCAAAGCAAGCAGCGGTGTTATTTGGAATAGCTTTAAAGAACTGGAAGAAAGCGAACTGGAAACCGTGATTCGTGAAATTCCGGCACCGAGCTTTCTGATTCCGCTGCCGAAACATCTGACCGCAAGCAGCAGCAGCCTGCTGGATCATGATCGTACCGTTTTTCAGTGGCTGGATCAGCAGCCTCCGAGCAGCGTTCTGTATGTTAGCTTTGGTAGCACCAGCGAAGTTGATGAAAAAGATTTTCTGGAAATTGCCCGTGGTCTGGTTGATAGCAAACAGAGCTTTCTGTGGGTTGTTCGTCCGGGTTTTGTTAAAGGTAGCACCTGGGTTGAACCGCTGCCGGATGGTTTTCTGGGTGAACGTGGTCGTATTGTTAAATGGGTTCCGCAGCAAGAAGTTCTGGCACACGGCGCAATTGGTGCATTTTGGACCCATAGCGGTTGGAATAGCACCCTGGAAAGCGTTTGTGAAGGTGTTCCGATGATTTTTAGCGATTTTGGTCTGGATCAGCCGCTGAATGCACGTTATATGAGTGATGTTCTGAAAGTGGGTGTGTATCTGGAAAATGGTTGGGAACGTGGTGAAATTGCAAATGCAATTCGTCGTGTTATGGTGGATGAAGAAGGTGAATATATTCGTCAGAATGCCCGTGTTCTGAAACAGAAAGCAGATGTTAGCCTGATGAAAGGTGGTAGCAGCTATGAAAGCCTGGAAAGTCTGGTTAGCTATATTAGCAGCCTGTAATAACTCGAG(SEQ ID NO:1)。
在合成基因并将该基因利用NdeI和XhoI克隆位点亚克隆到pET30A+载体之后，通过电穿孔将UGT76G1_pET30a+质粒引入到大肠杆菌Bl21(DE3)和大肠杆菌EC100中。将获得的细胞在卡那霉素存在的情况下培养在培养皿中，并选择适当的菌落，并让其在液体LB培养基(埃伦迈尔烧瓶)中生长。将甘油作为冷冻保护剂添加到悬浮液中并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将含有pET30A+_UGT76G1质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的贮存等分试样解冻，并添加至30mL的LBGKP培养基(20g/L Luria Broth Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)。在135rpm振摇下在30℃进行此培养持续8h。
该生产培养基含有60g/L的过夜快速表达TB培养基(Novagen公司)、10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素。将该培养基在20℃搅拌，同时取样品测量OD和pH。培养物产生显著的生长并获得了良好的OD。40小时后，通过离心收获细胞，并将其冷冻，以产生12.7g的细胞湿重。
通过添加Bugbuster母混合物(Novagen公司)进行裂解，并通过离心回收裂解物，且保持冷冻。对解冻的裂解物进行活性测试。
实例2
UGT76G1的体外产生
使用来自普洛麦格(Promega)的S30 T7高产率蛋白质表达系统试剂盒。将4μg的来自大肠杆菌EC100的UGT76G1_pET30a+质粒与80μL的S30预混物plus混合，并且添加72μL的S30 T7提取物。添加不含核酸酶的水以获得200μL的总体积，并将所得的溶液在30℃孵育2h。将180μL用于催化测试反应。
实例3
UGT91D2的体外产生
将NcoI和NdeI限制性位点添加至描述于Genbank登录号ACE87855.1中的原始核酸序列。在密码子优化之后，获得了下列核酸序列：
CCATGGCACATATGGCAACCAGCGATAGCATTGTTGATGATCGTAAACAGCTGCATGTTGCAACCTTTCCGTGGCTGGCATTTGGTCATATTCTGCCGTATCTGCAGCTGAGCAAACTGATTGCAGAAAAAGGTCATAAAGTGAGCTTTCTGAGCACCACCCGTAATATTCAGCGTCTGAGCAGCCATATTAGTCCGCTGATTAATGTTGTTCAGCTGACCCTGCCTCGTGTTCAAGAACTGCCGGAAGATGCCGAAGCAACCACCGATGTTCATCCGGAAGATATTCCGTATCTGAAAAAAGCAAGTGATGGTCTGCAGCCGGAAGTTACCCGTTTTCTGGAACAGCATAGTCCGGATTGGATCATCTATGATTATACCCATTATTGGCTGCCGAGCATTGCAGCAAGCCTGGGTATTAGCCGTGCACATTTTAGCGTTACCACCCCGTGGGCAATTGCATATATGGGTCCGAGCGCAGATGCAATGATTAATGGTAGTGATGGTCGTACCACCGTTGAAGATCTGACCACCCCTCCGAAATGGTTTCCGTTTCCGACCAAAGTTTGTTGGCGTAAACATGATCTGGCACGTCTGGTTCCGTATAAAGCACCGGGTATTAGTGATGGTTATCGTATGGGTCTGGTTCTGAAAGGTAGCGATTGTCTGCTGAGCAAATGCTATCATGAATTTGGCACCCAGTGGCTGCCGCTGCTGGAAACCCTGCATCAGGTTCCGGTTGTTCCGGTGGGTCTGCTGCCTCCGGAAGTTCCGGGTGATGAAAAAGATGAAACCTGGGTTAGCATCAAAAAATGGCTGGATGGTAAACAGAAAGGTAGCGTGGTTTATGTTGCACTGGGTAGCGAAGTTCTGGTTAGCCAGACCGAAGTTGTTGAACTGGCACTGGGTCTGGAACTGAGCGGTCTGCCGTTTGTTTGGGCATATCGTAAACCGAAAGGTCCGGCAAAAAGCGATAGCGTTGAACTGCCGGATGGTTTTGTTGAACGTACCCGTGATCGTGGTCTGGTTTGGACCAGCTGGGCACCTCAGCTGCGTATTCTGAGCCATGAAAGCGTTTGTGGTTTTCTGACCCATTGTGGTAGCGGTAGCATTGTGGAAGGTCTGATGTTTGGTCATCCGCTGATTATGCTGCCGATTTTTGGTGATCAGCCGCTGAATGCACGTCTGCTGGAAGATAAACAGGTTGGTATTGAAATTCCGCGTAATGAAGAAGATGGTTGCCTGACCAAAGAAAGCGTTGCACGTAGCCTGCGTAGCGTTGTTGTTGAAAAAGAAGGCGAAATCTATAAAGCCAATGCACGTGAACTGAGCAAAATCTATAATGATACCAAAGTGGAAAAAGAATATGTGAGCCAGTTCGTGGATTATCTGGAAAAAAACACCCGTGCAGTTGCCATTGATCACGAAAGCTAATGACTCGAG(SEQ ID NO:2)
在合成基因并将该基因利用NcoI和XhoI克隆位点亚克隆到pET30A+载体之后，通过电穿孔将UGT91D2_pET30a+质粒引入到大肠杆菌EC100中。将获得的细胞在卡那霉素存在的情况下培养，选择适当的菌落，让其在液体LB培养基(埃伦迈尔烧瓶)中生长。将甘油作为冷冻保护剂添加到悬浮液中并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将来自普洛麦格的S30 T7高产率蛋白质表达系统试剂盒用于蛋白质的体外合成。
将4μg的UGT91D2_pET30a+质粒与80μL的S30预混物plus混合，并且添加72μL的S30T7提取物。添加不含核酸酶的水以获得200μL的总体积，并将所得的溶液在30℃孵育2h。5μL用于SDS-PAGE分析，而剩余45μL用于催化测试反应中。
实例4
具有体内产生的UGT76G1的催化反应
反应总体积为5.0mL，具有下列组成：50mM磷酸钠缓冲液pH 7.2、3mM MgCl2、2.5mMUDP-葡萄糖、0.5mM甜菊苷和500μL的UGT76G1解冻裂解物。在30℃在轨道摇床上在135rpm下运行反应。对于每个样品，用40μL的2N H2SO4和420μL的甲醇/水(6/4)将460μL的反应混合物淬灭。立即将样品离心并在10℃下维持，之后通过HPLC(CAD)进行分析。HPLC指示甜菊苷几乎完全转化为莱鲍迪苷A(图4)。
实例5
具有体外产生的UGT91D2的催化反应
反应总体积为0.5mL，具有下列组成：50mM磷酸钠缓冲液pH 7.2、3mM MgCl2、3.8mMUDP-葡萄糖、0.1mM莱鲍迪苷A和180μL的体外产生的UGT91D2。在30℃在轨道摇床上在135rpm下运行反应。对于每个样品，用45μL的2N H2SO4和405μL的60％MeOH将450μL的反应混合物淬灭。离心后，通过HPLC(CAD)分析上清液。HPLC指示在120h之后4.7％的莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D。
实例6
具有体外产生的UGT76G1的催化反应
反应总体积为2mL，具有下列组成：50mM磷酸钠缓冲液pH 7.2、3mM MgCl2、3.8mMUDP-葡萄糖、0.5mM莱鲍迪苷D和180μL的体外产生的UGT76G1。在30℃在轨道摇床上在135rpm下运行反应。对于每个样品，用40μL的2N H2SO4和360μL的60％MeOH将400μL的反应混合物淬灭。离心后，通过HPLC(CAD)分析上清液。HPLC指示在120h之后80％的莱鲍迪苷D转化为莱鲍迪苷M(图5)。
对于实施例7到12，使用了以下缩写：
LBGKP培养基：20g/L Luria Broth Lennox；50mM PIPES缓冲液pH7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L的卡那霉素或氨苄青霉素LB培养基：(20g/LLuria Broth Lennox)
实例7
通过pET30a+质粒和BL21(DE3)表达菌株制备的UGT76G1的制备和活性
将pET30a+_UGT76G1质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中(Lucigen E.
Figure BDA0000906704130000471
EXPRESS电感受态细胞)。使获得的细胞在卡那霉素的存在下在培养皿中的LB琼脂培养基上生长。选择适合的菌落，并使其在含有卡那霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将储存等分试样解冻并添加到30mL的LBGKP培养基中。在30℃振摇下将该培养进行8h，随后将其用于接种400mL的含60g/L的“过夜快速表达TB培养基”(Novagen公司，参考71491-5)、10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素的生产培养基。将该培养基在20℃搅拌，同时取样品测量OD(600nm)和pH。40小时后，通过离心收获细胞，并将其冷冻。获得的细胞湿重为10.58g。
通过添加8.1mL的“Bugbuster母混合物”(Novagen公司，参考71456)和3.5mL的水将3.24g获得的沉淀裂解。通过离心回收裂解物并保持冷冻。
实例8
通过pET30a+质粒和Tuner(DE3)表达菌株制备的UGT76G1的制备和活性
通过热激处理将pET30a+_UGT76G1质粒转化到Tuner(DE3)表达菌株(NovagenTunertm(DE3)感受态细胞)中。使获得的细胞在卡那霉素的存在下在培养皿中的LB琼脂培养基上生长。选择适合的菌落，并使其在含有卡那霉素的液体LBGKP培养基中生长)。添加甘油并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将储存等分试样解冻并添加到100mL的含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中。在30℃振摇下进行此培养持续15h。4.4mL的该培养物用来接种200mL含有LB的生产培养基。在37℃搅拌该培养基直至获得0.9的OD(600nm)，随后添加400μL的100mM IPTG溶液，并在30℃搅拌该培养基4小时。通过离心收获细胞，并将其冷冻。获得的细胞湿重为1.38g。
通过添加4.9mL的“Bugbuster母混合物”(Novagen公司，参考71456)和2.1mL的水将获得的沉淀裂解。通过离心回收裂解物并保持冷冻。
实例9
通过pMAL质粒和BL21表达菌株制备的UGT76G1的制备和活性
使用Nde1和Sal1克隆位点将合成的UGT76G1基因亚克隆到pMAL质粒后，通过热激处理将pMAL_UGT76G1质粒转化到BL21表达菌株(New England Biolabs BL21感受态大肠杆菌)中。使获得的细胞在氨苄青霉素的存在下在培养皿中的LB琼脂培养基上生长。选择适合的菌落，并使其在含有氨苄青霉素的液体LBGKP培养基中生长)。添加甘油并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将储存等分试样解冻并添加到30mL的LBGKP培养基中。在30℃振摇下将该培养进行8h，随后将其用于接种400mL的含60g/L的“过夜快速表达TB培养基”(Novagen公司，参考71491-5)、10g/L的甘油和50mg/L的氨苄青霉素的生产培养基。将该培养基在20℃搅拌，同时取样品测量OD和pH。40小时后，通过离心收获细胞，并将其冷冻。获得的细胞湿重为5.86g。
通过添加9.6mL的“Bugbuster母混合物”(Novagen公司，参考71456)和4.1mL的水将2.74g获得的沉淀裂解。通过离心回收裂解物并保持冷冻。
实例10
通过pMAL质粒和ArcticExpress表达菌株制备的UGT76G1的制备和活性
通过热激处理将pMAL_UGT76G1质粒转化到ArticExpress表达菌株(安捷伦(Agilent)ArcticExpress感受态细胞)中。使获得的细胞在氨苄青霉素和遗传霉素的存在下在培养皿中的LB琼脂培养基上生长。选择适合的菌落，并使其在含有氨苄青霉素和遗传霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将储存等分试样解冻并添加到30mL的LBGKP培养基(含有氨苄青霉素和遗传霉素)中。在30℃振摇下将该培养进行8h，随后将其用于接种400mL的含60g/L的“过夜快速表达TB培养基”(Novagen公司，参考71491-5)、10g/L的甘油和50mg/L的氨苄青霉素的生产培养基。将该培养基在12℃搅拌，同时取样品测量OD(600nm)和pH。68小时后，通过离心收获细胞，并将其冷冻。获得的细胞湿重为8.96g。
通过添加8.73mL的“Bugbuster母混合物”(Novagen公司，参考71456)和3.79mL的水将2.47g获得的沉淀裂解。通过离心回收裂解物并保持冷冻。
实例11
通过pCOLDIII质粒和ArcticExpress表达菌株制备的UGT76G1的制备和活性
使用Nde1和Xho1克隆位点将合成的UGT76G1基因亚克隆入pCOLDIII质粒后，通过热激处理将pCOLDIII_UGT76G1质粒转化到ArcticExpress表达菌株(安捷伦ArcticExpress感受态细胞)中。使获得的细胞在氨苄青霉素和遗传霉素的存在下在培养皿中的LB琼脂培养基上生长。选择适合的菌落，并使其在含有氨苄青霉素和遗传霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将储存等分试样解冻并添加到30mL的LBGKP培养基(含有氨苄青霉素和遗传霉素)中。在30℃振摇下将该培养进行8h，随后将其用于接种400mL的含60g/L的“过夜快速表达TB培养基”(Novagen公司，参考71491-5)、10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素的生产培养基。将该培养基在12℃搅拌，同时取样品测量OD(600nm)和pH。63小时后，通过离心收获细胞，并将其冷冻。获得的细胞湿重为6.54g。
通过添加9.8mL的“Bugbuster母混合物”(Novagen公司，参考71456)和4.2mL的水将2.81g获得的沉淀裂解。通过离心回收裂解物并保持冷冻。
实例12
通过pCOLDIII质粒和Origami2(DE3)表达菌株制备的UGT76G1的制备和活性
通过热激处理将pCOLDIII_UGT76G1质粒转化到Origami2(DE3)表达菌株(NovagenOrigamiTM2(DE3)感受态细胞)中。使获得的细胞在氨苄青霉素的存在下在培养皿中的LB琼脂培养基上生长。选择适合的菌落，并使其在含有氨苄青霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将储存等分试样解冻并添加到30mL的LBGKP培养基(含有氨苄青霉素)中。在30℃振摇下将该培养进行8h，随后将其用于接种400mL的含60g/L的“过夜快速表达TB培养基”(Novagen公司，参考71491-5)、10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素的生产培养基。将该培养基在12℃搅拌，同时取样品测量OD(600nm)和pH。68小时后，通过离心收获细胞，并将其冷冻。获得的细胞湿重为2.53g。
通过添加6.0mL的“Bugbuster母混合物”(Novagen公司，参考71456)和1.9mL的水将1.71g获得的沉淀裂解。通过离心回收裂解物并保持冷冻。
实例13
活性测定
使用在pH 7.2的50mM磷酸钠缓冲液中的0.5mM的底物、2.5mM的UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，利用500μL解冻裂解物，以5mL规模进行关于甜菊苷至莱鲍迪苷A以及莱鲍迪苷D至莱鲍迪苷M的转化的活性测试。取得样品并通过HPLC进行分析。UGT76G1的不同制备结果概括在下表中。
Figure BDA0000906704130000511
*注释
甜菊苷和莱鲍迪苷M的转化活性是对于每mL的裂解物提及的。1U即为在30℃和pH7.2下在1小时内转化1μmol的底物。
实例14
对于莱鲍迪苷D到莱鲍迪苷M的转化的50mL规模的反应
使用5mL的实例12的裂解物进行在50mL规模上的莱鲍迪苷D到鲍迪苷M的转化。反应介质由50mM磷酸钠缓冲液pH 7.2、3mM的MgCl2、2.5mM的UDP-葡萄糖和0.5mM的莱鲍迪苷D组成。在30℃振摇下进行此反应90小时之后，添加50mL的乙醇，并且将所得混合物在-20℃下搅拌1小时。在以5000g离心10分钟之后，经由超滤(Vivaflow MWCO 30000)将上清液纯化。获得78mL的渗透物，将9mL的渗余物用9mL的乙醇稀释并再进行超滤(Vivaflow MWCO30000)。获得另一份14mL的滤液，将其与第一次的渗透物合并。将合并的渗透物在30℃在减压下浓缩，直到获得32mL的澄清溶液。
产物混合物的HPLC轨迹显示在图3中。在配备有二元泵、自动进样器、和恒温柱箱的安捷伦1200系列上进行HPLC。该方法是等度的，其中流动相由70％水(0.1％甲酸):30％乙腈组成。流速是0.1μL/min。使用的柱子为菲罗门(Phenomenex)Prodigy 5μ ODS(3)100A；250x 2mm。柱温维持在40℃。注射体积为20-40μl。
分离在31.325分钟处洗脱的物质。通过HPLC、1H NMR和HRMS与已知的reb M标准品比较，证实该物质为reb M。
实例15
使用pMAL质粒和BL21表达菌株制备UGT91D2
使用Nde1和Sal1克隆位点将合成的UGT91D2基因亚克隆到pMAL质粒中后，通过热激处理将pMAL_UGT91D2质粒转化到BL21表达菌株(New England Biolabs BL21感受态大肠杆菌)中。使获得的细胞在氨苄青霉素的存在下在培养皿中的LB琼脂培养基上生长。选择适合的菌落，并使其在含有氨苄青霉素的液体LBGKP培养基中生长)。添加甘油并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将储存等分试样解冻并添加到30mL的LBGKP培养基中。在30℃振摇下将该培养进行8h，随后将其用于接种400mL的含60g/L的“过夜快速表达TB培养基”(Novagen公司，参考71491-5)、10g/L的甘油和50mg/L的氨苄青霉素的生产培养基。将该培养基在20℃搅拌，同时取样品测量OD和pH。40小时后，通过离心收获细胞，并将其冷冻。获得的细胞湿重为12.32g。
通过添加7.7mL的“Bugbuster母混合物”(Novagen公司，参考71456)和3.2mL的水将2.18g获得的沉淀裂解。通过离心回收裂解物并且直接将其用于活性测试。
实例16
使用pMAL质粒和ArcticExpress表达菌株制备UGT91D2
通过热激处理将pMAL_UGT91D2质粒转化到ArcticExpress表达菌株(安捷伦ArcticExpress感受态细胞)中。使获得的细胞在氨苄青霉素和遗传霉素的存在下在培养皿中的LB琼脂培养基上生长。选择适合的菌落，并使其在含有氨苄青霉素和遗传霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将储存等分试样解冻并添加到30mL的LBGKP培养基(含有氨苄青霉素和遗传霉素)中。在30℃振摇下将该培养进行8h，随后将其用于接种400mL的含60g/L的“过夜快速表达TB培养基”(Novagen公司，参考71491-5)、10g/L的甘油和50mg/L的氨苄青霉素的生产培养基。将该培养基在20℃搅拌16小时，然后在12℃另外搅拌50小时，同时取样品测量OD(600nm)和pH。通过离心收获细胞，并将其冷冻。获得的细胞湿重为15.77g。
通过添加9.0mL的“Bugbuster母混合物”(Novagen公司，参考71456)和3.8mL的水将2.57g获得的沉淀裂解。通过离心回收裂解物并且直接将其用于活性测试。
实例17
使用pET30a+质粒和Tuner(DE3)表达菌株制备UGT91D2
通过热激处理将pET30a+_UGT91D2质粒转化到Tuner(DE3)表达菌株(NovagenTunertm(DE3)感受态细胞)中。使获得的细胞在卡那霉素的存在下在培养皿中的LB琼脂培养基上生长。选择适合的菌落，并使其在液体LBGKP培养基(含有卡那霉素)中生长。添加甘油并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将储存等分试样解冻并添加到100mL的含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中。在30℃振摇下进行此培养持续15h。6.2mL的该培养物用来接种500mL含有LB的生产培养基。在37℃搅拌该培养基直至获得0.9的OD(600nm)，随后添加500μL的100mM IPTG溶液(培养基中的IPTG浓度为100μM)，并在30℃搅拌培养基4小时，通过离心收获细胞，并将其冷冻。获得的细胞湿重为4.02g。
通过添加6.8mL的“Bugbuster母混合物”(Novagen公司，参考71456)和2.8mL的水将1.92g获得的沉淀裂解。通过离心回收裂解物并且直接将其进行活性测试。
实例18
使用pET30a+质粒和ArcticExpress表达菌株制备UGT91D2
通过热激处理将pET30a+_UGT91D2质粒转化到ArcticExpress(DE3)表达菌株(安捷伦ArcticExpress感受态细胞)中。使获得的细胞在卡那霉素和遗传霉素的存在下在培养皿中的LB琼脂培养基上生长。选择适合的菌落，并使其在含有卡那霉素和遗传霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将储存等分试样解冻并添加到30mL的LBGKP培养基(含有卡那霉素和遗传霉素)中。在30℃振摇下将该培养进行8h，随后将其用于接种400mL的含60g/L的“过夜快速表达TB培养基”(Novagen公司，参考71491-5)、10g/L的甘油和50mg/L的氨苄青霉素的生产培养基。将该培养基在20℃搅拌16小时，然后在12℃另外搅拌50小时，同时取样品测量OD(600nm)和pH。60小时后，通过离心收获细胞，并将其冷冻。获得的细胞湿重为16.07g。
通过添加11.4mL的“Bugbuster母混合物”(Novagen公司，参考71456)和4.8mL的水将3.24g获得的沉淀裂解。通过离心回收裂解物并且直接将其用于活性测试。
实例19
UGT91D2的体内制剂的活性测定
使用在pH 7.2的50mM磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM的UDP-葡萄糖和3mM的MgCl2，利用1000μL的裂解物，以5mL规模进行关于甜叶悬钩子苷至甜菊苷的转化的活性测试。取得样品并通过HPLC进行分析。UGT91D2的不同制备结果概括在下表中。
Figure BDA0000906704130000541
*注释：以每mL的裂解物提及活性。1U即为在30℃和pH 7.2下在1小时内转化1μmol的底物。
实例20
用于将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的其他酶
从公用数据库中鉴定了下列UDP-葡萄糖基转移酶的基因，通过DNA2.0合成，并且随后亚克隆到pET30a+载体中。
Figure BDA0000906704130000542
Figure BDA0000906704130000551
氨基酸序列如下：
>gi|115454819|ref|NP_001051010.1|Os03g0702500[粳稻亚种]
MDDAHSSQSPLHVVIFPWLAFGHLLPCLDLAERLAARGHRVSFVSTPRNLARLPPVRPELAELVDLVALPLPRVDGLPDGAEATSDVPFDKFELHRKAFDGLAAPFSAFLDTACAGGKRPDWVLADLMHHWVALASQERGVPCAMILPCSAAVVASSAPPTESSADQREAIVRSMGTAAPSFEAKRATEEFATEGASGVSIMTRYSLTLQRSKLVAMRSCPELEPGAFTILTRFYGKPVVPFGLLPPRPDGARGVSKNGKHDAIMQWLDAQPAKSVVYVALGSEAPMSADLLRELAHGLDLAGTRFLWAMRKPAGVDADSVLPAGFLGRTGERGLVTTRWAPQVSILAHAAVCAFLTHCGWGSVVEGLQFGHPLIMLPILGDQGPNARILEGRKLGVAVPRNDEDGSFDRGGVAGAVRAVVVEEEGKTFFANARKLQEIVADREREERCIDEFVQHLTSWNELKNNSDGQYP(SEQ ID NO:3)。
>gi|187373030|gb|ACD03249.1|UDP-糖基转移酶[糙伏毛燕麦]
MAVKDEQQSPLHILLFPFLAPGHLIPIADMAALFASRGVRCTILTTPVNAAIIRSAVDRANDAFRGSDCPAIDISVVPFPDVGLPPGVENGNALTSPADRLKFFQAVAELREPFDRFLADNHPDAVVSDSFFHWSTDAAAEHGVPRLGFLGSSMFAGSCNESTLHNNPLETAADDPDALVSLPGLPHRVELRRSQMMDPKKRPDHWALLESVNAADQKSFGEVFNSFHELEPDYVEHYQTTLGRRTWLVGPVALASKDMAGRGSTSARSPDADSCLRWLDTKQPGSVVYVSFGTLIRFSPAELHELARGLDLSGKNFVWVLGRAGPDSSEWMPQGFADLITPRGDRGFIIRGWAPQMLILNHRALGGFVTHCGWNSTLESVSAGVPMVTWPRFADQFQNEKLIVEVLKVGVSIGAKDYGSGIENHDVIRGEVIAESIGKLMGSSEESDAIQRKAKDLGAEARSAVENGGSSYNDVGRLMDELMARRSSVKVGEDIIPTNDGL(SEQ ID NO:4)。
>gi|460409128|ref|XP_004249992.1|预测的：花青素-3-O-葡萄糖苷2-O-葡糖醛酸基转移酶-样[番茄]
MSPKLHKELFFHSLYKKTRSNHTMATLKVLMFPFLAYGHISPYLNVAKKLADRGFLIYFCSTPINLKSTIEKIPEKYADSIHLIELHLPELPQLPPHYHTTNGLPPNLNQVLQKALKMSKPNFSKILQNLKPDLVIYDILQRWAKHVANEQNIPAVKLLTSGAAVFSYFFNVLKKPGVEFPFPGIYLRKIEQVRLSEMMSKSDKEKELEDDDDDDDLLVDGNMQIMLMSTSRTIEAKYIDFCTALTNWKVVPVGPPVQDLITNDVDDMELIDWLGTKDENSTVFVSFGSEYFLSKEDMEEVAFALELSNVNFIWVARFPKGEERNLEDALPKGFLERIGERGRVLDKFAPQPRILNHPSTGGFISHCGWNSAMESIDFGVPIIAMPMHLDQPMNARLIVELGVAVEIVRDDDGKIHRGEIAETLKGVITGKTGEKLRAKVRDISKNLKTIRDEEMDAAAEELIQLCRNGN(SEQ ID NO:5)。
>gi|222619587|gb|EEE55719.1|假设蛋白OsJ_04191[粳稻亚种]
MHVVMLPWLAFGHILPFAEFAKRVARQGHRVTLFSTPRNTRRLIDVPPSLAGRIRVVDIPLPRVEHLPEHAEATIDLPSNDLRPYLRRAYDEAFSRELSRLLQETGPSRPDWVLADYAAYWAPAAASRHGVPCAFLSLFGAAALCFFGPAETLQGRGPYAKTEPAHLTAVPEYVPFPTTVAFRGNEARELFKPSLIPDESGVSESYRFSQSIEGCQLVAVRSNQEFEPEWLELLGELYQKPVIPIGMFPPPPPQDVAGHEETLRWLDRQEPNSVVYAAFGSEVKLTAEQLQRIALGLEASELPFIWAFRAPPDAGDGDGLPGGFKERVNGRGVVCRGWVPQVKFLAHASVGGFLTHAGWNSIAEGLANGVRLVLLPLMFEQGLNARQLAEKKVAVEVARDEDDGSFAANDIVDALRRVMVGEEGDEFGVKVKELAKVFGDDEVNDRYVRDFLKCLSEYKMQRQG(SEQ ID NO:6)。
>gi|297795735|ref|XP_002865752.1|UDP-葡萄糖醛酸基/UDP-葡萄糖基转移酶家族蛋白[琴叶拟南芥琴叶亚种]
MDDKKEEVMHIAMFPWLAMGHLLPFLRLSKLLAQKGHKISFISTPRNILRLPKLPSNLSSSITFVSFPLPSISGLPPSSESSMDVPYNKQQSLKAAFDLLQPPLTEFLRLSSPDWIIYDYASHWLPSIAKELGISKAFFSLFNAATLCFMGPSSSLIEESRSTPEDFTVVPPWVPFKSTIVFRYHEVSRYVEKTDEDVTGVSDSVRFGYTIDGSDAVFVRSCPEFEPEWFSLLQDLYRKPVFPIGFLPPVIEDDDDDTTWVRIKEWLDKQRVNSVVYVSLGTEASLRREELTELALGLEKSETPFFWVLRNEPQIPDGFEERVKGRGMVHVGWVPQVKILSHESVGGFLTHCGWNSVVEGIGFGKVPIFLPVLNEQGLNTRLLQGKGLGVEVLRDERDGSFGSDSVADSVRLVMIDDAGEEIREKVKLMKGLFGNMDENIRYVDELVGFMRNDESSQLKEEEEEDDCSDDQSSEVSSETDEKELNLDLKEEKRRISVYKSLSSEFDDYVANEKMG(SEQ IDNO:7)。
测试的质粒被接收在微量滴定板中，该微量滴定板在每个单独的孔中含有作为冻干固体的质粒。
质粒悬液。向每个孔中添加24μL的超纯无菌水，并且在室温下将该微量滴定板振摇30分钟。随后，将该板在4℃下孵育1小时。通过上下吹打进一步混合每个孔的内容物。使用1μL的悬液通过Qubit2.0分析进行质粒定量。测定的质粒的量为：
微量滴定板 位置 内标 [质粒]ng/μL
C908201 A1 S115N01 A1 32.8
C908201 G2 S115N01 G2 41.0
C908201 A7 S115N05 A7 56.6
C912666 E1 S115N06 E1 64.0
C912666 C2 S115N06 C2 31.4
用质粒转化感受态细胞。从处于-80℃的冰箱中取得化学感受态EC100细胞的等分试样，并将其储存在冰上。使细胞在冰上解冻10分钟。将10μL的上述质粒溶液的稀释物添加到1.5mL的无菌微型管(为了用50pg的DNA转化每个细胞)中并在冰上储存。向每个微型管中加入100μL的化学感受态细胞。在冰上孵育化学感受态细胞质粒混合物持续20min之后，在42℃进行热击30秒。
在冰上进行进一步孵育持续2分钟。向每个微型管加入300μL的SOC培养基，并将所得混合物转移到15mL的无菌管中。在37℃在135rpm振摇下孵育1小时之后，将混合物涂布在含有卡那霉素50μg/mL的固体Luria肉汤培养基上。将培养皿在37℃孵育16小时。
在甘油中的储备溶液的制备和质粒的纯化。向50mL的无菌离心管(Falcon Tube)中加入10mL的含有50μg/mL卡那霉素的Luria肉汤培养基。将该培养基接种从上述培养皿中分离的菌落，并允许培养物在37℃在135rpm振摇下孵育16小时。
向含有300μL的60％无菌甘油溶液的1.5mL的无菌微型管中加入600μL的培养物。将储备溶液在-80℃下储存。
将培养物的剩余部分在5,525g下在10℃离心10分钟，并且在移除上清液之后，将沉淀储存在冰上。根据凯杰(Qiagen)Qiaprep Spin Miniprep试剂盒(参考：27106)纯化产生的质粒，并在260nm测量质粒产率。将质粒溶液在4℃下储存。质粒的量确定如下：
Figure BDA0000906704130000571
Figure BDA0000906704130000581
酶的体外表达。18μL的质粒溶液(含有大约1.5μg的质粒)用于根据普洛麦格S30T7高产率蛋白质表达系统(High-Yield Protein Expression System(参考：L1110))试剂盒的体外表达。表达培养基产生如下：
S30预混物Plus T7 S30提取物 总计
试验 30μL 27μL 57μL
参考 20μL 18μL 38μL
将制备的表达培养基混合物添加到质粒溶液中，并将该溶液在30℃孵育3小时，同时每45分钟将该混合物混合一次。将5μL的混合物冷冻，而剩余物用于将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的催化测试。
莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的催化测试。将含有0.5mM莱鲍迪苷A、3mM MgCl2、50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)和2.5mM UDP-葡萄糖的430μL的反应混合物添加到1.5mL的无菌微型管中。添加52μL的酶表达培养基，并允许所得混合物在30℃反应24小时。在2小时、16小时和24小时之后取125μL的样品，并将其添加到115μL的60％甲醇和10μL的2N H2SO4中。将淬灭的样品在18,000g在室温下离心2分钟。将200μL转移到HPLC瓶并进行分析。
HPLC分析如下进行HPLC测定：
设备
Figure BDA0000906704130000582
Figure BDA0000906704130000591
仪器条件
Figure BDA0000906704130000592
流动相梯度程序
时间(min) 含0.04％乙酸的水的％ 甲醇％
0 40 60
8 25 75
10 25 75
11 40 60
15 40 60
酶S115N05 A7对于Reb A到Reb D的转化具有最高的活性(大约22.4％)。至少三种酶产生了显著量的未知糖苷(标记为Reb UNK；随后鉴定为reb D2)连同reb D。在约4.5分钟处的未知峰随后被鉴定为reb M2。
HPLC测定结果提供如下：
Figure BDA0000906704130000593
Figure BDA0000906704130000601
实例21
体外产生的EUGT11的活性
通过DNA2.0合成了描述于WO/2013/022989 A2中的EUGT11基因，并且随后亚克隆到pET30a+载体中。
Figure BDA0000906704130000602
氨基酸序列如下：
>gi|41469452|gb|AAS07253.1|假定UDP-葡糖醛酸基和UDP-葡萄糖基转移酶[粳稻亚种]EUGT11酶，来自专利申请WO/2013/022989 A2
MHVVICPLLAFGHLLPCLDLAQRLACGHRVSFVSTPRNISRLPPVRPSLAPLVSFVALPLPRVEGLPNGAESTHNVPHDRPDMVELHLRAFDGLAAPFSEFLGTACADWVMPTSSAPRQTLSSNIHRNSSRPGTPAPSGRLLCPITPHSNTLERAAEKLVRSSRQNARARSLLAFTSPPLPYRDVFRSLLGLQMGRKQLNIAHETNGRRTGTLPLNLCRWMWKQRRCGKLRPSDVEFNTSRSNEAISPIGASLVNLQSIQSPNPRAVLPIASSGVRAVFIGRARTSTPTPPHAKPARSAAPRAHRPPSSVMDSGYSSSYAAAAGMHVVICPWLAFGHLLPCLDLAQRLASRGHRVSFVSTPRNISRLPPVRPALAPLVAFVALPLPRVEGLPDGAESTNDVPHDRPDMVELHRRAFDGLAAPFSEFLGTACADWVIVDVFHHWAAAAALEHKVPCAMMLLGSAHMIASIADRRLERAETESPAAAGQGRPAAAPTFEVARMKLIRTKGSSGMSLAERFSLTLSRSSLVVGRSCVEFEPETVPLLSTLRGKPITFLGLMPPLHEGRREDGEDATVRWLDAQPAKSVVYVALGSEVPLGVEKVHELALGLELAGTRFLWALRKPTGVSDADLLPAGFEERTRGRGVVATRWVPQMSILAHAAVGAFLTHCGWNSTIEGLMFGHPLIMLPIFGDQGPNARLIEAKNAGLQVARNDGDGSFDREGVAAAIRAVAVEEESSKVFQAKAKKLQEIVADMACHERYIDGFIQQLRSYKD(SEQ ID NO:8)。
测试的质粒被接收在微量滴定板中，该微量滴定板在单独的孔中含有作为冻干固体的质粒。
质粒悬液向孔中添加24μL的超纯无菌水，并且在室温下将该微量滴定板振摇30分钟。随后，将该板在4℃下孵育1小时。通过上下吹打进一步混合孔的内容物。使用1μL的悬液通过Qubit2.0分析进行质粒定量。质粒的量确定如下：
微量滴定板 位置 测试的内标 [质粒]ng/μL
C912666 G4 S115N08 G4 19.2
用质粒转化感受态细胞。从处于-80℃的冰箱中取得化学感受态EC100细胞的等分试样，并将其储存在冰上。使细胞在冰上解冻10分钟。将10μL的上述质粒溶液的稀释物添加到1.5mL的无菌微型管(为了用50pg的DNA转化每个细胞)中并在冰上储存。向微型管中加入100μL的化学感受态细胞。在冰上孵育化学感受态细胞/质粒混合物持续20min之后，在42℃进行热击30秒。
在冰上进行进一步孵育持续2分钟。向微型管加入300μL的SOC培养基，并将所得混合物转移到15mL的无菌管中。在37℃在135rpm振摇下孵育1小时之后，将混合物涂布在含有卡那霉素50μg/mL的固体Luria肉汤培养基上。将培养皿在37℃孵育16小时。
在甘油中的储备溶液的制备和质粒的纯化。向50mL的无菌离心管(Falcon Tube)中加入10mL的含有50μg/mL卡那霉素的Luria肉汤培养基。将该培养基接种从上述培养皿中分离的菌落，并允许培养物在37℃在135rpm振摇下孵育16小时。
向含有300μL的60％无菌甘油溶液的1.5mL的无菌微型管中加入600μL的培养物。将储备溶液在-80℃下储存。
将培养物的剩余部分在5,525g下在10℃离心10分钟，并且在移除上清液之后，将沉淀储存在冰上。根据凯杰(Qiagen)Qiaprep Spin Miniprep试剂盒(参考：27106)纯化产生的质粒，并在260nm测量质粒产率。将质粒溶液在4℃下储存。质粒的量确定如下：
微量滴定板 位置 测试的内标 [质粒]ng/μL
C912666 G4 S115N08 G4 38.4
EUGT11的体外表达18μL的稀释的质粒溶液(含有大约1.5μg的质粒)用于根据普洛麦格S30 T7高产率蛋白质表达系统(High-Yield Protein Expression System(参考：L1110))试剂盒的体外表达。表达培养基产生如下：
Figure BDA0000906704130000611
Figure BDA0000906704130000621
将制备的表达培养基混合物添加到质粒溶液中，并将该溶液在30℃孵育3小时，同时每45分钟将该混合物混合一次。将5μL的混合物冷冻，而剩余物用于将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的催化测试。
莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的催化测试。将含有0.5mM莱鲍迪苷A、3mM MgCl2、50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)和2.5mM UDP-葡萄糖的430μL的反应混合物添加到1.5mL的无菌微型管中。添加52μL的酶表达培养基，并允许所得混合物在30℃反应24小时。在2小时、16小时和24小时之后取125μL的样品，并将其添加到115μL的60％甲醇和10μL的2N H2SO4中。将淬灭的样品在18,000g在室温下离心2分钟。将200μL转移到HPLC瓶并进行分析。
HPLC分析。如在实例20中所述，进行HPLC测定。
HPLC测定结果提供如下：
化合物 保留时间 积分(面积)
莱鲍迪苷D 5.797 54,654,810
莱鲍迪苷A 9.157 633,926,835
总计 688,581,645
实例22
酶的体内产生
在体内产生实例20中描述的酶。
通过热激将含有相应于该酶的基因的pET30A+载体引入到大肠杆菌BL21(DE3)中。将获得的细胞在卡那霉素存在的情况下培养在培养皿中，并且选择适当的菌落，并让其在液体LB培养基(埃伦迈尔烧瓶)中生长。将甘油作为冷冻保护剂添加到悬液中并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将含有pET30A+_UGT质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的贮存等分试样解冻，并添加至30mL的LBGKP培养基(20g/L Luria Broth Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)。在135rpm振动下在30℃进行此培养8小时。
该生产培养基含有60g/L的过夜快速表达TB培养基(Novagen公司)、10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素。将预培养物添加到400mL的该培养基中并且将该溶液在20℃搅拌，同时取样品测量OD和pH。培养物产生显著的生长并获得了良好的OD。40小时后，通过离心收获细胞，并将其冷冻。在下文提及下列细胞湿重(CWW)的产率。
GI号 版本 CWW
115454819 NP_001051010.1 9.2g
187373030 ACD03249.1 7.4g
460409128 XP_004249992.1 6.8g
222619587 EEE55719.1 7.5g
297795735 XP_002865752.1 8.8g
通过添加Bugbuster母混合物(Novagen公司)进行裂解，并通过离心回收裂解物，且趁新鲜使用。
活性测定。使用在pH 7.2的50mM磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM的UDP-葡萄糖和3mM的MgCl2，利用1,000μL解冻的裂解物，以5mL规模进行关于莱鲍迪苷A的转化的活性测试。取得样品并通过HPLC进行分析。
HPLC分析。如在实例20中所述，进行HPLC测定。
对于不同酶的结果提供如下。
GI号 版本 在45小时后的转化 Reb D选择性
115454819 NP_001051010.1 1.1％ 100％
187373030 ACD03249.1 0.8％ 100％
460409128 XP_004249992.1 62.1％ 43.6％
222619587 EEE55719.1 2.9％ 未检测到Reb D
297795735 XP_002865752.1 0.0％ 未检测到Reb D
HPLC分析还显示了两个未知峰。在约4.5分钟处的峰随后被鉴定为reb M2。在约7.6分钟处的峰随后被鉴定为reb D2。
实例23
糖苷的鉴定
另外，通过LC-MS测定了代表实例20(下文的S115N05A7)和实例22(下文的S129N04)的GI号460409128的反应混合物，以便鉴定未知的糖苷。使用与安捷伦(Agilent)6110A MSD连接并且接合“LC/MSD Chemstation”软件的装备有二元泵(G1312B)、自动进样器(G1367D)、恒温柱箱(G1316B)、DAD检测器(G1315C)的安捷伦1200系列HPLC系统。
仪器条件
Figure BDA0000906704130000641
流动相梯度程序
时间(min) A(％)：甲酸0.1％ B(％)：乙腈
0 75 25
8.5 75 25
10.0 71 29
16.5 70 30
在LCMS系统上在3.5分钟处观察到的化合物相对应于实例20和22中在约4.5分钟处的未知峰。LCMS数据表明，这种化合物在其结构中具有六个糖苷残基(C56H90O33)，并且发现其为reb M的异构体形式，即reb M2(参见实例40中的论述)。
在LCMS系统上在7.6分钟处观察到的化合物相对应于实例20和22中在约7.6分钟处的未知峰。LCMS数据表明，这种化合物在其结构中具有五个糖苷残基(C50H80O28)，并且发现其为reb D的异构体形式，即reb D2(参见实例39中的论述)。这些化合物的比率提供如下。
Figure BDA0000906704130000651
实例24
糖苷的鉴定
另外，通过LC-MS测定代表实例22(下文的S129N04)的GI号460409128的反应混合物连同由谱赛科(PureCircle)Sdn Bhd(马来西亚)生产的甜叶菊叶提取物“MLD1”，以确定S129N04糖苷在自然界中的存在。
测定显示，在实例23中在LCMS系统上在3.5分钟处观察到的化合物(C56H90O33；随后证实为reb M2)、以及在实例23中在LCMS系统上在7.6分钟处观察到的化合物(C50H80O28；rebUNK；随后证实为reb D2)在甜叶菊植物提取物中存在。
实例25
莱鲍迪苷E到莱鲍迪苷D的转化
反应总体积为5.0mL，具有下列组成：100mM磷酸钾缓冲液pH 7.5、3mM MgCl2、2.5mM UDP-葡萄糖、0.5mM莱鲍迪苷E和500μL的解冻的UGT76G1裂解物，UGT76G1基因克隆到pET30a+载体中并且在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。在30℃在轨道摇床上在135rpm下进行反应。对于取样，用30μL的2N H2SO4和270μL的甲醇/水(6/4)将300μL的反应混合物淬灭。立即将样品离心并在10℃下维持，之后通过HPLC(CAD检测)进行分析。获得了相应于莱鲍迪苷E到莱鲍迪苷D的完全转化的下列反应曲线。
实例26
用于莱鲍迪苷D到莱鲍迪苷M的转化的UGT76G1的定向演化
从如描述于Genbank(AAR06912.1)中的UGT76G1的氨基酸序列开始，鉴定了在各个氨基酸位置处的不同突变，这些突变可改变用于莱鲍迪苷D(Reb D)到莱鲍迪苷M(Reb M)的转化的酶的活性。通过DNA2.0ProteinGPSTM策略设计的突变的这个清单随后用于合成96个变体基因，这些变体基因含有针对在大肠杆菌中表达经密码子优化的这些突变中的3个、4个或5个。这些基因被亚克隆到pET30a+质粒中并且用于转化大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞。使获得的细胞在卡那霉素的存在下在培养皿中在固体LB琼脂培养基上生长。选择适合的菌落，并使其在试管中的液体LB培养基中生长。将甘油作为冷冻保护剂添加到悬液中并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将含有pET30a+_UGT76G1var质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的这些贮存等分试样解冻，并将其添加至LBGKP培养基(20g/L Luria Broth Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)。在135rpm在30℃下，在振摇下在96微量滴定板中进行此培养持续8h。
用50μL的上述培养物接种含有60g/L的过夜快速表达TB培养基(OvernightExpressTM Instant TB medium)
Figure BDA0000906704130000661
10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素的3.95mL的生产培养基。在20℃在48深孔板中搅拌所得培养物。培养物产生显著的生长并获得了良好的OD(600nm；1cm)。44小时后，通过离心收获细胞，并将其冷冻。
通过向解冻的细胞添加
Figure BDA0000906704130000662
母混合物
Figure BDA0000906704130000663
进行裂解，并通过离心回收裂解物。用100μL的新鲜裂解物进行活性测试，该裂解物被添加到在50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中的莱鲍迪苷D(终浓度0.5mM)、MgCl2(终浓度3mM)和UDP-葡萄糖(终浓度2.5mM)的溶液中。
使反应在30℃下进行，并且在2、4、7和24小时之后取样。为了通过HPLC(CAD检测)确定转化和初始速率，使用上述的用于莱鲍迪苷D到莱鲍迪苷M的转化的分析方法。结果描绘于下表中。
Figure BDA0000906704130000671
Figure BDA0000906704130000681
Figure BDA0000906704130000691
Figure BDA0000906704130000701
*突变标注如下：原始氨基酸-位置-新的氨基酸：例如在位置33处的丙氨酸突变为甘氨酸被标注为A33G。
实例27
UGTSL2的体内产生
UGTSL2(GI_460410132/XP_004250485.1)氨基酸序列：
MATNLRVLMFPWLAYGHISPFLNIAKQLADRGFLIYLCSTRINLESIIKKIPEKYADSIHLIELQLPELPELPPHYHTTNGLPPHLNPTLHKALKMSKPNFSRILQNLKPDLLIYDVLQPWAEHVANEQNIPAGKLLTSCAAVFSYFFSFRKNPGVEFPFPAIHLPEVEKVKIREILAKEPEEGGRLDEGNKQMMLMCTSRTIEAKYIDYCTELCNWKVVPVGPPFQDLITNDADNKELIDWLGTKHENSTVFVSFGSEYFLSKEDMEEVAFALELSNVNFIWVARFPKGEERNLEDALPKGFLERIGERGRVLDKFAPQPRILNHPSTGGFISHCGWNSAMESIDFGVPIIAMPIHNDQPINAKLMVELGVAVEIVRDDDGKIHRGEIAETLKSVVTGETGEILRAKVREISKNLKSIRDEEMDAVAEELIQLCRNSNKSK(SEQ IDNO:9)。
通过热激将含有UGTSL2基因的pET30A+载体引入到大肠杆菌Bl21(DE3)中。将获得的细胞在卡那霉素存在的情况下培养在培养皿中，并选择适当的菌落，并让其在液体LB培养基(埃伦迈尔烧瓶)中生长。将甘油作为冷冻保护剂添加到悬液中并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将含有pET30A+_UGTSL2质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的贮存等分试样解冻，并将其添加至30mL的LBGKP培养基(20g/L Luria Broth Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)。在135rpm振摇下在30℃进行此培养持续8h。
该生产培养基含有60g/L的过夜快速表达TB培养基(Novagen公司)、10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素。将预培养物添加到200mL的该培养基中并且将该溶液在20℃搅拌，同时取样品测量OD和pH。培养物产生显著的生长并获得了良好的OD。40小时后，通过离心收获细胞，将其冷冻，获得6.22g的细胞湿重。
通过在1.4g的细胞上添加Bugbuster母混合物(Novagen公司)进行裂解，并通过离心回收裂解物，且趁新鲜使用。
实例28
关于用UGTSL和UGTSL2将甜菊苷转化为莱鲍迪苷E的活性的测定
根据实例22制备UGTSL，并根据实例27制备UGTSL2。
使用在pH 7.2的50mM磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM的UDP-葡萄糖和3mM的MgCl2，利用600μL的裂解物，以3mL规模进行关于甜菊苷的转化的活性测试。取得样品并通过HPLC进行分析。HPLC分析。如在实例20中所述，进行HPLC测定。
对于不同酶的结果和相应的色谱图提供如下。
Figure BDA0000906704130000721
注释：1基于甜菊苷的初始浓度
实例29
关于用UGTSL和UGTSL2将甜叶悬钩子苷转化为莱鲍迪苷E的活性的测定
根据实例22制备UGTSL，并根据实例27制备UGTSL2。
使用在pH 7.2的50mM磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM的UDP-葡萄糖和3mM的MgCl2(，利用600μL的裂解物，以3mL规模进行关于甜叶悬钩子苷的转化的活性测试。取得样品并通过HPLC进行分析。如在实例20中所述，进行HPLC测定。
对于不同酶的结果和相应的色谱图提供如下。
Figure BDA0000906704130000722
注释：1基于甜叶悬钩子苷的初始浓度
实例30
关于用UGTSL2将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的活性的测定
根据实例27制备UGTSL2。
使用在pH 7.2的50mM磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM的UDP-葡萄糖和3mM的MgCl2，利用60μL的裂解物，以3mL规模进行关于莱鲍迪苷A的转化的活性测试。取得样品并通过HPLC进行分析。如在实例20中所述，进行HPLC测定。
在反应23小时之后的结果提供如下。
Figure BDA0000906704130000723
Figure BDA0000906704130000731
注释：1基于莱鲍迪苷A的初始浓度
实例31
糖苷的鉴定
通过LC-MS分析根据实例30制备并且孵育45小时的反应混合物、连同由谱赛科(PureCircle)Sdn Bhd(马来西亚)生产的甜叶菊叶提取物“MLD1”，以便确定形成的未知糖苷(约4.5分钟、约6.7分钟、约7.0分钟、约7.3分钟和约7.7分钟)在自然界中的存在。
使用与安捷伦(Agilent)6110A MSD连接并且接合“LC/MSD Chemstation”软件的装备有二元泵(G1312B)、自动进样器(G1367D)、恒温柱箱(G1316B)、DAD检测器(G1315C)的安捷伦1200系列HPLC系统。
仪器条件
Figure BDA0000906704130000732
流动相梯度程序
时间(min) A(％)：甲酸0.1％ B(％)：乙腈
0 75 25
30 75 25
33 68 32
75 68 32
测定显示，在LC-MS系统上在11.77分钟处观察到的化合物与在实例23中在3.5分钟处的化合物(C56H90O33；随后证实为reb M2)是一样的，并且在26.64分钟处观察到的化合物与在实例23中在7.6分钟处观察到的化合物(C50H80O28；reb UNK；随后证实为reb D2)是一样的。在13.96分钟处观察到reb M的其他异构体，并且在25.06分钟处观察到reb D的另一种异构体形式。所有观察到的化合物都在甜叶菊植物提取物中存在。
实例32
UGTLB的体内制备和活性测定
UGTLB(GI_209954733/BAG80557.1)氨基酸序列
MGTEVTVHKNTLRVLMFPWLAYGHISPFLNVAKKLVDRGFLIYLCSTAINLKSTIKKIPEKYSDSIQLIELHLPELPELPPHYHTTNGLPPHLNHTLQKALKMSKPNFSKILQNLKPDLVIYDLLQQWAEGVANEQNIPAVKLLTSGAAVLSYFFNLVKKPGVEFPFPAIYLRKNELEKMSELLAQSAKDKEPDGVDPFADGNMQVMLMSTSRIIEAKYIDYFSGLSNWKVVPVGPPVQDPIADDADEMELIDWLGKKDENSTVFVSFGSEYFLSKEDREEIAFGLELSNVNFIWVARFPKGEEQNLEDALPKGFLERIGDRGRVLDKFAPQPRILNHPSTGGFISHCGWNSVMESVDFGVPIIAMPIHLDQPMNARLIVELGVAVEIVRDDYGKIHREEIAEILKDVIAGKSGENLKAKMRDISKNLKSIRDEEMDTAAEELIQLCKNSPKLK(SEQ ID NO:10)。
通过热激将含有UGTLB基因的pET30A+载体引入到大肠杆菌Bl21(DE3)中。将获得的细胞在卡那霉素存在的情况下培养在培养皿中，并选择适当的菌落，并让其在液体LB培养基(埃伦迈尔烧瓶)中生长。将甘油作为冷冻保护剂添加到悬液中并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将含有pET30A+_UGTLB质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的贮存等分试样解冻，并将其添加至30mL的LBGKP培养基(20g/L Luria Broth Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)。在135rpm振摇下在30℃进行此培养持续8h。
该生产培养基含有60g/L的过夜快速表达TB培养基(Novagen公司)、10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素。将预培养物添加到200mL的该培养基中并且将该溶液在20℃搅拌，同时取样品测量OD和pH。培养物产生显著的生长并获得了良好的OD。40小时后，通过离心收获细胞，将其冷冻，获得5.7g的细胞湿重。
通过在1.2g的细胞上添加6mL的Bugbuster母混合物(Novagen公司)进行裂解，并通过离心回收裂解物，且趁新鲜使用。
关于用UGTLB将甜菊苷转化为莱鲍迪苷E的活性的测定
使用在pH 7.2的50mM磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM的UDP-葡萄糖和3mM的MgCl2，利用600μL的裂解物，以3mL规模进行关于甜菊苷的转化的活性测试。取样并根据实例20的方法通过HPLC进行分析。结果提供如下。
Figure BDA0000906704130000751
注释：1基于甜菊苷的初始浓度
关于用UGTLB将甜叶悬钩子苷转化为莱鲍迪苷E的活性的测定
使用在pH 7.2的50mM磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM的UDP-葡萄糖和3mM的MgCl2(利用600μL的裂解物，以3mL规模进行关于甜叶悬钩子苷的转化的活性测试。取样并根据实例20的方法通过HPLC进行分析。结果提供如下。
Figure BDA0000906704130000752
Figure BDA0000906704130000761
注释：1基于甜叶悬钩子苷的初始浓度
关于用UGTLB将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的活性的测定
使用在pH 7.2的50mM磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM的UDP-葡萄糖和3mM的MgCl2，利用600μL的裂解物，以3mL规模进行关于莱鲍迪苷A的转化的活性测试。取样并根据实例20的方法通过HPLC进行分析。在反应23小时之后的结果提供如下。
Figure BDA0000906704130000762
注释：1基于莱鲍迪苷A的初始浓度
实例33
关于用UGTSL、UGTSL2、和UGTLB转化甜叶悬钩子苷和甜菊苷的反应产物的测定
以类似于实例28的方式进行用UGTSL和UGTSL2转化甜菊苷，并且类似于实例29进行用UGTSL和UGTSL2转化甜叶悬钩子苷。类似于实例32进行用UGTLB转化甜叶悬钩子苷和甜菊苷。
通过LCMS分析反应混合物以确定所有反应产物。
甜叶悬钩子苷转化产物
Figure BDA0000906704130000763
甜菊苷转化产物
Figure BDA0000906704130000764
Figure BDA0000906704130000771
可以看出，在甜叶悬钩子苷转化产物中，除了甜菊苷、reb E和reb D之外，还存在至少3种另外的分子量为804的化合物。这些化合物的保留时间与reb B(也已知具有与甜菊苷相同的分子量)不匹配。
在甜菊苷转化产物中，除了reb E和reb D之外，还存在至少3种另外的分子量为966的化合物。这些化合物的保留时间与reb A(也已知具有与reb E相同的分子量)不匹配。
实例34
在酿酒酵母中的UGT76G1的体内生产
UGT76G1[甜叶菊](gi_37993653/gb_AAR06912.1)
MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL(SEQ ID NO:11)。
上述氨基酸序列针对在酿酒酵母中表达进行了密码子优化。此外，在ATG起始密码子之前添加了酵母共有序列AACACA。使用Hind III和Xba I限制性位点将合成基因亚克隆到pYES2载体中。使用pYES2_UGT76G1_Sc载体来转化化学感受态酿酒酵母INVSc1细胞(英杰公司)。
使细胞在缺乏尿嘧啶的含有2％葡萄糖的固体合成基本培养基上生长，并挑选单个菌落，且使其在缺乏尿嘧啶的液体合成基本培养基(含有2％葡萄糖的SC-U)上生长。在离心之后，将细胞用SC-U(含有2％葡萄糖)和60％甘油/水悬浮。将等分试样在-80℃下储存，并且使用一个等分试样来开始在SC-U(含有2％葡萄糖)中培养，在30℃持续43小时。将此培养物的一部分离心，并将其悬浮在诱导培养基(含有2％半乳糖的SC-U)中，在30℃持续19小时。
通过离心获得细胞并且用五倍体积的CelLyticTM Y细胞裂解试剂(西格玛公司)进行裂解。将裂解物直接用于活性测试(UGT76G1_Sc)。
实例35
用于莱鲍迪苷D转化为莱鲍迪苷M的UGT76G1_Sc的活性的测定
根据实例34制备UGT76G1_Sc。使用在pH 7.2的50mM磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM的UDP-葡萄糖和3mM的MgCl2，利用200μL的裂解物，以3mL规模进行关于莱鲍迪苷D的转化的活性测试。取样并根据实例20的方法通过HPLC进行分析。结果如下所示。
Figure BDA0000906704130000781
注释：1基于莱鲍迪苷D的初始浓度
实例36
在酿酒酵母中的UGTSL的体内生产
UGTSL[番茄](gi_460409128/XP_004249992.1
MSPKLHKELFFHSLYKKTRSNHTMATLKVLMFPFLAYGHISPYLNVAKKLADRGFLIYFCSTPINLKSTIEKIPEKYADSIHLIELHLPELPQLPPHYHTTNGLPPNLNQVLQKALKMSKPNFSKILQNLKPDLVIYDILQRWAKHVANEQNIPAVKLLTSGAAVFSYFFNVLKKPGVEFPFPGIYLRKIEQVRLSEMMSKSDKEKELEDDDDDDDLLVDGNMQIMLMSTSRTIEAKYIDFCTALTNWKVVPVGPPVQDLITNDVDDMELIDWLGTKDENSTVFVSFGSEYFLSKEDMEEVAFALELSNVNFIWVARFPKGEERNLEDALPKGFLERIGERGRVLDKFAPQPRILNHPSTGGFISHCGWNSAMESIDFGVPIIAMPMHLDQPMNARLIVELGVAVEIVRDDDGKIHRGEIAETLKGVITGKTGEKLRAKVRDISKNLKTIRDEEMDAAAEELIQLCRNGN(SEQ ID NO:12)。
上述氨基酸序列针对在酿酒酵母中表达进行了密码子优化。此外，在ATG起始密码子之前添加了酵母共有序列AACACA。使用Hind III和Xba I限制性位点将合成基因亚克隆到pYES2载体中。使用pYES2_UGTSL_Sc载体来转化化学感受态酿酒酵母INVSc1细胞(英杰公司)。
使细胞在缺乏尿嘧啶的、含有2％葡萄糖的固体合成基本培养基上生长，并挑选单个菌落，且使其在缺乏尿嘧啶的液体合成基本培养基(含有2％葡萄糖的SC-U)上生长。在离心之后，将细胞用SC-U(含有2％葡萄糖)和60％甘油/水悬浮。将等分试样在-80℃下储存，并且使用一个等分试样来开始在SC-U(含有2％葡萄糖)中培养，在30℃持续43小时。将此培养物的一部分离心，并将其悬浮在诱导培养基(含有2％半乳糖的SC-U)中，在30℃持续19小时。
通过离心获得细胞并且用五倍体积的CelLyticTM Y细胞裂解试剂(西格玛公司)进行裂解。将裂解物直接用于活性测试(UGTSL_Sc)。
实例37
用于莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的UGTSL_Sc的活性的测定
根据实例36制备UGTSL_Sc。使用在pH 7.2的50mM磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM的UDP-葡萄糖和3mM的MgCl2，利用200μL的裂解物，以2mL规模进行关于莱鲍迪苷A的转化的活性测试。取样并根据实例20的方法通过HPLC进行分析。结果提供如下。
酶内标 莱鲍迪苷A转化<sup>1</sup>(反应时间) 莱鲍迪苷D选择性<sup>1</sup>
UGTSL_Sc 46％(4h) 42％
注释：1基于莱鲍迪苷A的初始浓度
实例38
莱鲍迪苷M的分离
实例14的产物混合物的量不够大，以至不足以通过制备型HPLC方法进行分离。相应地，使用具有一系列注射的分析型HPLC来分离该混合物的组分。根据以上实例14中描述的方法进行分离，以提供相应于图3的HPLC轨迹中的两个主峰的两个部分：部分A(保留时间24.165分钟)和部分B(保留时间31.325分钟)。
部分A的保留时间与reb D一致，指示来自该生物转化反应的未反应的起始物质。
纯化的部分B的保留时间与reb M一致，指示从reb D的成功生物转化。通过纯化的部分B和reb M标准品(可获自谱赛科)的共同注射，证实在部分B中收集的物质身份为rebM。发现部分B和reb M标准品两者都在相同的保留时间处被洗脱(图7)，表明部分B为reb M。
还通过NMR和HRMS独立地证实部分B的身份为reb M。为了取样，在旋转蒸发器下将部分B浓缩，冷冻干燥，并且在40℃下干燥40小时。
将NMR样品溶解在氘代吡啶(C5D5N)中，并且使用标准脉冲序列在Varian UnityPlus 600MHz仪器上获得光谱。将部分B的NMR光谱与reb M的NMR光谱进行比较。两种光谱的重叠表明了部分B与reb M的一致性。关于reb M的NMR指定的表格显示如下：
对于在C5D5N中的莱鲍迪苷M的1H和13C NMR光谱数据a-c
Figure BDA0000906704130000801
Figure BDA0000906704130000811
Figure BDA0000906704130000821
a在COSY、HMQC和HMBC关联基础上进行的指定；b化学位移值表示为δ(ppm)；c耦合常数表示为Hz。
用装备有在正离子模式下运行的电喷雾电离源的沃特斯(Waters)Premier四极杆飞行时间(Q-TOF)质谱仪产生HRMS。将样品溶解在甲醇中，并且在2:2:1的甲醇:乙腈:水中洗脱，并使用机载的(onboard)注射泵经由灌注引入。通过处于m/z 1313.5265的[M+Na]+加合物证实了reb M的存在，其相对应于分子式C56H90O33。
实例39
Reb D2的分离和表征
粗反应样品。根据实例22用UGTSL(GI#460409128)制备了用于分离的批号为CB-2977-106的样品。
HPLC分析。使用沃特斯(Waters)2695Alliance系统按照下列方法进行了样品的初步HPLC分析：菲罗门Synergi Hydro-RP，4.6×250mm，4μm(p/n 00G-4375-E0)；柱温：55℃；流动相A：在水中的0.0284％乙酸铵(NH4OAc)和0.0116％乙酸(HOAc)；流动相B：乙腈(MeCN)；流速：1.0mL/min；注射体积：10μL。通过UV(210nm)和CAD进行检测。
梯度：
时间(min) ％A ％B
0.0-8.5 75 25
10.0 71 29
16.5 70 30
18.5-24.5 66 34
26.5-29.0 48 52
31-37 30 70
38 75 25
按照下列方法进行半制备型纯化部分的分析：沃特斯(Waters)Atlantis dC18，4.6×100mm，5μm(p/n 186001340)；流动相A：在水中的25％MeCN；流动相B：在水中的30％MeCN；流速：1.0mL/min；注射体积：10μL。通过CAD进行检测。
梯度：
时间(min) ％A ％B
0.0-5.0 100 0
20 20 80
25 20 80
30 100 0
LC-MS。在具有以负离子模式运行的沃特斯(Waters)3100质量检测器的沃特斯(Waters)自动纯化HPLC/MS系统上进行半合成甜菊醇糖苷混合物的初步分析。使用下列方法进行样品的分析：菲罗门Synergi Hydro-RP，4.6×250mm，4μm(p/n 00G-4375-E0)；柱温：55℃；流动相A：在水中的0.0284％NH4OAc和0.0116％HOAc；流动相B：乙腈；流速：1.0mL/min；注射体积：10μL。通过UV(210nm)、和MSD(-ESI m/z 500-2000)进行检测。梯度条件如上文列出。
通过HPLC分离。纯化分两步进行。用于半制备纯化的第一种方法概括如下。柱子：沃特斯(Waters)Atlantis dC18，30×100mm，5μm(p/n 186001375)；流动相A：在水中的25％MeCN；流动相B：在水中的30％MeCN；流速：45mL/min；注射负荷：溶解在20mL水中的160mg。通过UV(205nm)进行检测。
梯度：
时间(min) ％A ％B
0.0-5.0 100 0
20 20 80
25 20 80
30 100 0
第二次纯化使用相同的柱子和条件，但是为等度流动相：水中的20％MeCN。
从天然提取物进行纯化。纯化分三步进行。用于制备纯化的第一种方法概括如下。主要工艺：沃特斯(Waters)Symmetry C18，50×250mm，7μm(p/n WAT248000)；等度流动相：具有0.05％HOAc的在水中的50％甲醇(MeOH)；流速：85mL/min；注射负荷：溶解在50mL流动相中的6g粗提取物。通过UV(210nm)进行检测。在洗脱靶分析物之后，用在水中的85％MeOH冲洗柱子。
次级工艺：沃特斯(Waters)Symmetry Shield RP18，50×250mm，7μm(p/nWAT248000)；等度流动相：在水中的20％MeCN；流速：100mL/min；注射负荷：溶解在30mL水中的0.5g主要部分。通过UV(210nm)进行检测。
三级工艺：沃特斯(Waters)Symmetry Shield RP18，50×250mm，7μm(p/nWAT248000)；等度流动相：在水中的20％MeCN；流速：100mL/min；注射负荷：溶解在30mL水中的0.5g次级部分。通过UV(210nm)进行检测。
MS和MS/MS。用装备有电喷雾电离源的Premier质谱仪的沃特斯(Waters)QT产生MS和MS/MS数据。通过负ESI分析样品。用H2O:乙腈(1:1)以50倍稀释样品，并且使用机载的注射泵经由灌注将其引入。将样品稀释以产生良好的s/n，其在大约0.01mg/mL浓度时出现。
NMR。通过将1-2mg溶解在150μL的吡啶-d5中来准备样品，并且在具有2.5mm反式检测探头的Bruker Avance 500MHz仪器上获得NMR数据。1H NMR光谱以残余溶剂信号(对于吡啶-d5的δH 8.74和δC 150.35)为参考。
结果和讨论
分离和纯化。对根据实例22用UGTSL(GI#460409128)制备的批号为CB-2977-106的甜菊醇糖苷混合物进行分离。使用上述方法通过LC-MS对物质进行分析，并且将结果提供在图6中。感兴趣的目标峰是在TIC色谱图中的7.7分钟处的峰。这个峰的质谱提供了处于m/z1127.6的[M-H]-离子。使用以上提供的第一方法条件，以单次注射(160mg)初步处理提供的样品。这种方法将该物质分级为‘极性’和‘非极性’糖苷混合物。然后使用以上第二步条件再处理该‘极性’混合物。从该半制备收集物中分离到具有>99％(CAD，AUC)纯度的化合物。纯化之后，通过在35℃旋转蒸发将合并的部分浓缩，并冻干。获得大约1-2mg，用于表征。
质谱分析法。通过灌注样品获得的ESI-TOF质谱显示出处于m/z 1127.4709的[M-H]-离子。[M-H]-离子的质量与分子式C50H80O28很好地一致(对C50H79O28计算为：1127.4758，误差：-4.3ppm)。MS数据证实1128道尔顿的标称质量，具有分子式C50H80O28。
MS/MS谱(选择处于m/z 1127.5的[M-H]-离子进行碎片化(fragmentation))指示两个葡萄糖单元的损失和处于m/z 641.3187、479.2655和317.2065的三个葡萄糖部分的后续损失。
NMR光谱学。进行一系列NMR实验，包括1H NMR(图8)、13C NMR(图9和10)、1H-1H COSY(图11)、HSQC-DEPT(图12)、HMBC(图13和14)、NOESY(图15)和1D-TOCSY，以允许对该化合物的指定。在样品制备约46小时之后获得的1H NMR中，解析了在δH 5.04处的端基共振，其在原始谱(图8)中被溶剂(HOD)掩盖。
1H、1H-1H COSY、1H-13C HSQC-DEPT和1H-13C HMBC NMR数据表明，该糖苷的中心核是二萜。在1H和1H-13C HSQC-DEPT谱中观察到五个端基质子的存在证实了结构中的五糖单元。在1H-13C HSQC-DEPT谱中的δC 69.9处的亚甲基13C共振表明结构中的1→6糖键的存在。使用1H-13C HMBC和1D-TOCSY关联对糖单元的连接进行指定。
从在δH 1.29处的甲基质子到在δC 177.7处的羰基的HMBC关联允许指定叔甲基基团(C-18)以及C-19之一，并且提供了用于指定其余糖苷配基的起点。从甲基质子(H-18)到在δC 38.9、45.0、和57.8处的碳的另外的HMBC关联允许指定C-3、C-4、和C-5。1H-13C HSQC-DEPT数据的分析表明，在δC 38.9处的碳为亚甲基并且在δC 57.8处的碳为次甲基，其分别指定为C-3和C-5。这留下在δC 45.0处的碳，其未显示在HSQC-DEPT谱中的关联，被指定为季碳，C-4。使用HSQC-DEPT数据指定对于C-3(δH 0.98和2j.36)和C-5(δH 1.04)的1H化学位移。在H-3质子之一(δH 0.98)与在δH 1.43处的质子之间的COSY关联允许指定H-2质子之一，所述H-2质子之一进而显示出与被指定为C-1的在δH 0.75处的质子的关联。然后，基于另外的COSY和HSQC-DEPT关联，对C-1和C-2的剩余1H和13C化学位移进行指定，并概括在下表中。
1H和13C NMR(500和125MHz，吡啶-d5)，Reb D2的指定。
Figure BDA0000906704130000861
Figure BDA0000906704130000871
在δH 1.30处观察到的其他叔甲基单峰显示出与C-1和C-5的HMBC关联并且被指定为C-20。甲基质子显示出与分别被指定为C-10和C-9的季碳(δC 40.3)和次甲基碳(δC 54.5)的另外的HMBC关联。然后，在H-5(δH 1.04)与在δH 1.92和2.43处的质子之间的COSY关联允许H-6质子的指定，该H-6质子进而显示出与被指定为C-7的在δH 1.22和1.30处的质子的关联。然后根据HSQC-DEPT数据确定关于C-6(δC 22.7)和C-7(δC 42.2)的13C化学位移。在H-9(δH 0.88)与在δH 1.65和1.69处的质子之间的COSY关联允许H-11质子的指定，该H-11质子进而显示出与被指定为H-12质子的在δH 1.99和2.25处的质子的COSY关联。然后使用HSQC-DEPT数据来指定C-11(δC 21.1)和C-12(δC 37.5)。从H-12质子(δH 2.25)到在δC 87.1和154.7处的碳的HMBC关联允许分别指定C-13和C-16。在δH 5.01和5.64处观察到的烯属质子显示出与C-13的HMBC关联并且被指定为C-17(经由HSQC-DEPT为δC 105.2)。烯属质子H-17和次甲基质子H-9显示出与被指定为C-15的在δC 48.3处的碳的HMBC关联。然后，从H-9到在δC 44.5处的亚甲基碳的另外的HMBC关联允许指定C-14。使用HSQC-DEPT数据指定在C-14(δH1.80和2.65)和C-15(δH 1.31和2.04)处的1H化学位移。
使用在NOESY谱中观察到的关联来指定中心二萜核的相对立体化学。在该NOESY谱中，在H-14与H-20之间观察到的NOE关联表明H-14和H-20在环的同一面上。类似地，在H-9与H-5；H-9与H-18以及H-5与H-18之间观察到NOE关联，但是在H-9与H-14之间未观察到NOE关联，表明与H-14和H-20相比，H-5、H-9和H-18位于环的相对面上。这些数据表明，在中央核中的相对立体化学在糖基化步骤过程中被保留。
用来指定糖苷配基区域的关键HMBC和COSY关联提供如下：
Figure BDA0000906704130000881
1H-13C HSQC-DEPT数据的分析证实了五个端基质子的存在。这些端基质子中的三个在1H NMR谱中的δH 6.02(δC 96.1)、5.57(δC 105.3)、和5.34(δC 105.3)处良好解析。在δH5.04(δC 105.6)和5.07(δC 98.7)处观察到的在1H谱中被溶剂(HOD)共振掩盖的剩余两个端基质子通过1H-13C HSQC-DEPT数据进行鉴定。在δH 6.02处观察到的端基质子显示出与C-19的HMBC关联，表明它相对应于GlcI的端基质子。类似地，在δH 5.07处观察到的端基质子显示出与C-13的HMBC关联，从而允许它被指定为GlcII的端基质子。
GlcI端基质子(δH 6.02)显示出与在δH 4.07处的质子(被指定为GlcI H-2)的COSY关联，该在δH 4.07处的质子进而显示出与在δH 4.22处的质子(GlcI H-3)的COSY关联，该在δH 4.22处的质子显示出与在δH 4.12处的质子(GlcI H-4)的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱不允许H-5或H-6质子的指定。因此，使用GlcI端基质子的选择性照射以若干不同的混合时间进行一系列的1D-TOCSY实验。除了证实对GlcI H-2到H-4的指定之外，1D-TOCSY数据还显示出在δH 4.04处被指定为GlcI H-5的质子和在δH 4.68处被指定为GlcI H-6质子之一的质子。后面的质子还用于1D-TOCSY实验。在若干不同的混合时间的情况下H-6的选择性照射还证实了GlcI H-1到H-5以及H-6(δH 4.30)的剩余亚甲基质子的指定。使用1H-13C HSQC-DEPT数据，确定关于GlcI C-2(δC 74.2)、C-3(δC 79.1)、C-4(δC 72.1)、C-5(δC 78.5)、和C-6(δC 69.9)的13C化学位移的指定，从而完成GlcI的指定。此外，在1H-13C HSQC-DEPT谱中的δC69.9处的亚甲基13C共振的存在表明结构中GlcI的1→6糖键。
在四个剩余的未指定葡萄糖部分中，基于1H-13C HSQC-DEPT、HMBC、和1D-TOCSY关联，一个被指定为在GlcI的C-6处的取代基。在HSQC-DEPT谱中的δC 69.9处的GlcI的亚甲基13C共振的相对低场位移指示了GlcI的1→6糖键。在δH 5.04处观察到的端基质子显示出与GlcI C-6的HMBC关联并且被指定为GlcV的端基质子。类似地，GlcI的亚甲基质子显示出与GlcV的端基碳的HMBC关联，证实了在GlcI与GlcV之间的1→6糖键的存在。GlcV端基质子显示出与在δH 4.00处的质子(被指定为GlcV H-2)的COSY关联，该在δH 4.00处的质子进而显示出与在δH 4.22处的质子(GlcV H-3)的COSY关联。由于数据重叠，该COSY谱不允许基于GlcVH-3的COSY关联的GlcV H-4的指定。然而，在HMBC谱中，GlcV H-3显示出与GlcV C-5(δC78.9)的关联。在HSQC-DEPT谱中，GlcV C-5显示出与δH 3.89(GlcV H-5)的关联。GlcV H-5显示出与δH 4.21、4.37、和4.48的COSY关联。在HSQC-DEPT谱中，δH 4.21显示出与δC 71.4(GlcV H-4)的关联，而δH 4.37和4.48显示出与δC 63.1的关联并且分别被指定为GlcV H-6a和H-6b。使用1H-13C HSQC-DEPT数据，确定关于GlcV C-2(δC 75.7)和C-3(δC 79.1)的13C化学位移的指定，从而完成GlcV的指定。
关于在C-19处的糖苷的1H和13C化学位移的总结显示在下列表中：
1H和13C NMR(500和125MHz，吡啶-d5)，reb D2 C-19糖苷的指定。
Figure BDA0000906704130000891
Figure BDA0000906704130000901
1H和13C值可在位置Glc1-3、GlcV-3和GlcIV-3之间互换。
用来指定C-19糖苷区域的关键HMBC、COSY、和1D-TOCSY关联的总结提供如下。
Figure BDA0000906704130000902
以类似的方式进行GlcII的指定。GlcII端基质子(δH 5.07)显示出与在δH 4.37处的质子(被指定为GlcII H-2)的COSY关联，该在δH 4.37处的质子进而显示出与在δH 4.18处的质子(GlcII H-3)的COSY关联。此后者质子显示出与在δH 3.88处的质子(GlcII H-4)的额外关联，该在δH 3.88处的质子还显示出与在δH 3.79处的质子(GlcII H-5)的COSY关联。GlcIIH-5还显示出与GlcII H-6质子(δH 4.08和4.46)的COSY关联。使用HSQC-DEPT数据，确定关于GlcII C-2(δC 81.3)、C-3(δC 88.4)、C-4(δC 71.1)、C-5(δC 77.9)、和C-6(δC 63.2)的13C化学位移的指定。从GlcII H-3到C-2和C-4以及还有从GlcII H-4到C-2和C-5的HMBC关联证实了以上做出的指定。GlcII H-4与GlcII C-6的额外HMBC关联进一步支持完成GlcII的指定。
基于HMBC关联，剩余未指定的葡萄糖部分中的两个被指定为在GlcII的C-2和C-3处的取代基。在δH 5.57处观察到的端基质子显示出与GlcII C-2的HMBC关联并且被指定为GlcIII的端基质子。在δH 5.34处观察到的端基质子显示出与GlcII C-3的HMBC关联并且被指定为GlcIV的端基质子。还观察到从GlcII H-2到GlcIII的端基碳以及从GlcII H-3到GlcIV的端基碳的相互HMBC关联。
GlcIII(δH 5.57)的端基质子显示出与在δH 4.19处的被指定为GlcIII H-2的质子的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱不允许H-3到H-6质子的指定。因此，使用GlcIII端基质子的选择性照射以若干不同的混合时间进行一系列的1D-TOCSY实验。除了证实关于GlcIII H-2的指定之外，该1D-TOCSY数据还显示出在δH 4.24(GlcIII H-3)、δH 4.27(GlcIII H-4)、和δH3.94(GlcIII H-5)处的质子。一旦使用1D-TOCSY数据将H-4指定，就使用从H-4到H-5以及进而到H-6的COSY关联来指定H-6。在COSY谱中，GlcIII H-4显示出与GlcIII H-5的关联，该GlcIII H-5进而显示出对应地与GlcIII H-6a和H-6b的δH 4.41和4.50的COSY关联。然后使用1H-13C HSQC-DEPT关联，确定关于GlcIII C-2(δC 76.8)、C-3(δC 78.9)、C-4(δC 72.4)、C-5(δC 78.8)、和C-6(δC 63.5)的13C化学位移，从而完成GlcIII的指定。
GlcIV(δH 5.34)的端基质子显示出与在δH 4.06处的被指定为GlcIV H-2的质子的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱不允许H-3到H-6质子的指定。因此，使用GlcIV端基质子的选择性照射以若干不同的混合时间进行一系列的1D-TOCSY实验。除了证实关于GlcIV H-2的指定之外，该1D-TOCSY数据显示出在δH 4.22(GlcIV H-3)、δH 4.18(GlcIV H-4)、和δH 4.10(GlcIV H-5)处的质子。一旦使用1D-TOCSY数据将H-4指定，就使用从H-4到H-5以及进而到H-6的COSY关联来指定H-6。在COSY谱中，GlcIV H-4显示出与GlcIV H-5的关联，该GlcIV H-5进而显示出对应地与δH 4.32和4.58(GlcIV H-6a和H-6b)的COSY关联。然后使用1H-13C HSQC-DEPT关联，确定关于GlcIV C-2(δC 75.8)、C-3(δC 78.9)、C-4(δC 72.0)、C-5(δC 79.3)、和C-6(δC 62.9)的13C化学位移，从而完成GlcIV的指定。
对于在δH 6.02(d,J＝8.1Hz)、5.57(d,J＝7.6Hz)、5.34(d,J＝7.9Hz)和δH 5.04(d,J＝8.1Hz)处的葡萄糖部分的端基质子观察到大的耦合常数，提示了它们的β-定向。虽然在δH 5.07处的剩余端基质子被溶剂共振(HDO)掩盖，从1D TOCSY数据明显可见的其耦合常数(J＝约8Hz)也指示了β-定向。
关于在C-13处的糖苷的1H和13C化学位移的总结显示在下列表中：
1H和13C NMR(500和125MHz，吡啶-d5)，Reb D2 C-13糖苷的指定。
Figure BDA0000906704130000921
Figure BDA0000906704130000931
*端基质子被溶剂(HDO)共振掩盖，从1D-TOCSY数据获得耦合常数。
#1H和13C值可在Glc1-3、GlcV-3和GlcIV-3之间互换。
用来指定C-13糖苷区域的关键HMBC、COSY、和1D-TOCSY关联的总结提供如下：
Figure BDA0000906704130000932
该化合物的化学名称是13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯](莱鲍迪苷D2或reb D2)。该化合物是莱鲍迪苷D的异构体。
实例40
Reb M2的分离和表征
粗反应样品。根据实例22用UGTSL(GI#460409128)制备了用于分离的批号为CB-2977-106的样品。
HPLC分析。使用沃特斯(Waters)2695 Alliance系统按照下列方法进行了初步HPLC分析：菲罗门Synergi Hydro-RP，4.6×250mm，4μm(p/n 00G-4375-E0)；柱温：55℃；流动相A：在水中的0.0284％NH4OAc和0.0116％HOAc；流动相B：乙腈(MeCN)；流速：1.0mL/min；注射体积：10μL。通过UV(210nm)和CAD进行检测。
梯度：
时间(min) ％A ％B
0.0-5.0 100 0
20 20 80
25 20 80
30 100 0
按照下列方法进行半制备型纯化部分的分析：沃特斯(Waters)Atlantis dC18，4.6×100mm，5μm(p/n 186001340)；流动相A：在水中的25％MeCN；流动相B：在水中的30％MeCN；流速：1.0mL/min；注射体积：10μL。通过CAD进行检测。
梯度：
时间(min) ％A ％B
0.0-8.5 75 25
10.0 71 29
16.5 70 30
18.5-24.5 66 34
26.5-29.0 48 52
31-37 30 70
38 75 25
LC-MS。在具有以负离子模式运行的沃特斯(Waters)3100质量检测器的沃特斯(Waters)自动纯化HPLC/MS系统上进行半合成甜菊醇糖苷混合物的初步分析。使用下列方法进行样品的分析：菲罗门Synergi Hydro-RP，4.6×250mm，4μm(p/n 00G-4375-E0)；柱温：55℃；流动相A：在水中的0.0284％NH4OAc和0.0116％HOAc；流动相B：MeCN；流速：1.0mL/min；注射体积：10μL。通过UV(210nm)、和MSD(-ESI m/z 500-2000)进行检测。梯度条件如上文列出。
通过HPLC分离。纯化分两步进行。用于半制备纯化的第一种方法概括如下。柱子：沃特斯(Waters)Atlantis dC18，30×100mm，5μm(p/n 186001375)；流动相A：在水中的25％MeCN；流动相B：在水中的30％MeCN；流速：45mL/min；注射负荷：溶解在20mL水中的160mg。通过UV(205nm)进行检测。
梯度：
时间(min) ％A ％B
0.0-5.0 100 0
20 20 80
25 20 80
30 100 0
第二次纯化使用相同的柱子和条件，但是为等度流动相：水中的20％MeCN。
MS和MS/MS。用装备有电喷雾电离源的Premier质谱仪的沃特斯(Waters)QT产生MS和MS/MS数据。通过负ESI分析样品。用H2O:MeCN(1:1)以50倍稀释样品，并且使用机载的注射泵经由灌注将其引入。将样品稀释以产生良好的s/n，其在大约0.01mg/mL浓度时出现。
NMR。通过将约1.0mg溶解在150μL的D2O中来准备样品，并在具有2.5mm反式检测探头的Bruker Avance 500MHz仪器上获得NMR数据。1H NMR和13C NMR谱分别参考残余溶剂信号HDO(δH 4.79ppm)和TSP(δC 0.00ppm)。
结果和讨论
分离和纯化。对根据实例22用UGTSL(GI#460409128)制备的批号为CB-2977-106的甜菊醇糖苷混合物进行分离。使用上述方法通过LC-MS对物质进行分析(图6)。感兴趣的目标峰是在TIC色谱图中的4.1分钟处的峰。这个峰的质谱提供了处于m/z 1289.7的[M-H]-离子。使用以上提供的第一方法条件，以单次注射(160mg)初步处理提供的样品。这种方法将该物质分级为‘极性’和‘非极性’糖苷混合物。然后使用以上提供的第二步条件再处理该‘极性’混合物。从该半制备收集物中分离到具有>99％(CAD，AUC)纯度的峰。纯化之后，通过在35℃旋转蒸发将这些部分浓缩，并冻干。获得大约1mg。
质谱分析法。通过灌注CC-00300的样品获得的ESI-TOF质谱显示出处于m/z1289.5266的[M-H]-离子。[M-H]-离子的质量与针对reb M2所预期的分子式C56H90O33很好地一致(对C56H89O33计算为：1289.5286，误差：-1.6ppm)。MS数据证实CC-00300具有1290道尔顿的标称质量，具有分子式C56H90O33。
MS/MS谱(选择处于m/z 1289.5的[M-H]-离子进行碎片化)指示处于m/z 803.3688的三个葡萄糖单元的损失和处于m/z 641.3165、479.2633和317.2082的三个葡萄糖部分的后续损失。
NMR光谱学。进行一系列NMR实验，包括1H NMR(图18)、13C NMR(图19和20)、1H-1HCOSY(图21)、HSQC-DEPT(图22)、HMBC(图23和24)、和1D-TOCSY，以允许对reb M2的指定。
1H、1H-1H COSY、1H-13C HSQC-DEPT和1H-13C HMBC NMR数据表明，该糖苷的中心核是二萜。在1H和1H-13C HSQC-DEPT谱中观察到六个端基质子的存在证实了结构中的六糖单元。在1H-13C HSQC-DEPT谱中的δC 70.9处的亚甲基13C共振表明结构中的1→6糖键的存在。使用1H-13C HMBC和1D-TOCSY关联对糖单元的连接进行指定。
从在δH 1.29处的甲基质子到在δC 181.5处的羰基的HMBC关联允许指定叔甲基基团(C-18)以及C-19之一，并且提供了用于指定其余糖苷配基的起点。从甲基质子(H-18)到在δC 39.8、43.7、和59.2处的碳的另外的HMBC关联允许指定C3、C4、和C5。1H-13C HSQC-DEPT数据的分析表明，在δC 39.8处的碳为亚甲基并且在δC 59.2处的碳为次甲基，其分别指定为C-3和C-5。这留下在δC 43.7处的碳，其未显示在HSQC-DEPT谱中的关联，被指定为季碳，C-4。使用HSQC-DEPT数据指定对于C-3(δH 1.16和2.28)和C-5(δH 1.24)的1H化学位移。在H-3质子之一(δH 1.16)与在δH 1.49处的质子之间的COSY关联允许指定H-2质子之一，所述H-2质子之一进而显示出与被指定为C-1的在δH 0.92处的质子的关联。然后，基于另外的COSY和HSQC-DEPT关联，对C-1和C-2的剩余1H和13C化学位移进行指定，并概括在下表中。
Reb M2糖苷配基的1H NMR(500MHz，D2O)和13C NMR(125MHz，D2O/TSP)指定。
Figure BDA0000906704130000971
Figure BDA0000906704130000981
在δH 0.92处观察到的其他叔甲基单峰显示出与C-1和C-5的HMBC关联并且被指定为C-20。甲基质子显示出与分别被指定为C-10和C-9的季碳(δC 42.4)和次甲基(δC 55.5)的另外的HMBC关联。然后，在H-5(δH 1.24)与在δH 1.73和1.94处的质子之间的COSY关联允许H-6质子的指定，该H-6质子进而显示出与被指定为C-7的在δH 1.49和1.56处的质子的关联。然后根据HSQC-DEPT数据确定关于C-6(δC 24.4)和C-7(δC 44.2)的13C化学位移。在H-9(δH 1.09)与在δH 1.66和1.70处的质子之间的COSY关联允许H-11质子的指定，该H-11质子进而显示出与被指定为H-12质子的在δH 1.60和2.00处的质子的COSY关联。然后使用HSQC-DEPT数据来指定C-11(δC 22.6)和C-12(δC 39.9)。在δH 4.98和5.16处观察到的烯属质子显示出与C-13(δC 90.9)的HMBC关联并且被指定为C-17(经由HSQC-DEPT为δC 107.0)。烯属质子H-17显示出与被指定为C-15的在δC 49.4处的碳的HMBC关联。然后，从H-9到在δC 46.9处的亚甲基碳的另外的HMBC关联允许指定C-14。使用HSQC-DEPT数据指定在C-14(δH 1.53和2.21)和C-15(δH 2.15和2.18)处的1H化学位移。
用来指定糖苷配基区域的关键HMBC和COSY关联的总结提供如下：
Figure BDA0000906704130000982
1H-13C HSQC-DEPT数据的分析证实了六个端基质子的存在。这些端基质子中的三个在1H NMR谱中的δH 5.65(δC 95.5)、4.92(δC 104.9)、和4.50(δC 105.7)处良好解析。在δH4.85(δC 98.4)、4.84(δC 105.0)、和4.83(δC 105.3)处观察到的剩余三个端基质子在1H谱中与残余溶剂共振重叠。在δH 5.65处观察到的端基质子显示出与C-19的HMBC关联，表明它相对应于GlcI的端基质子。类似地，在δH 4.85处观察到的端基质子显示出与C-13的HMBC关联，从而允许它被指定为GlcII的端基质子。
GlcI端基质子(δH 5.65)显示出与在δH 3.96处的质子(被指定为GlcI H-2)的COSY关联，该在δH 3.96处的质子进而显示出与在δH 3.89处的质子(GlcI H-3)的COSY关联，该在δH 3.89处的质子显示出与在δH 3.71处的质子(GlcI H-4)的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱不允许H-5或H-6质子的指定。因此，使用GlcI端基质子的选择性照射以若干不同的混合时间进行一系列的1D-TOCSY实验。除了证实对GlcI H-2到H-4的指定之外，1D-TOCSY数据还显示出在δH 3.73处被指定为GlcI H-5的质子和在δH 4.15处被指定为GlcI H-6质子之一的质子。后面的质子还用于1D-TOCSY实验。在若干不同的混合时间的情况下H-6的选择性照射还证实了GlcI H-1到H-5以及H-6(δH 4.00)的剩余亚甲基质子的指定。使用1H-13C HSQC-DEPT数据，确定关于GlcI C-2(δC 80.5)、C-3(δC 79.0)、C-4(δC 71.5)、C-5(δC 79.0)、和C-6(δC 70.9)的13C化学位移的指定，从而完成GlcI的指定。此外，在1H-13C HSQC-DEPT谱中的δC70.9处的亚甲基13C共振的存在表明结构中GlcI的1→6糖键。
基于HMBC关联，未指定的葡萄糖部分中的两个被指定为在GlcI的C-2和C-6处的取代基。在δH 4.83处观察到的端基质子显示出与GlcI C-2的HMBC关联并且被指定为GlcV的端基质子。在δH 4.50处观察到的端基质子显示出与GlcI C-6的HMBC关联并且被指定为GlcVI的端基质子。还观察到从GlcI H-2到GlcV的端基碳以及从GlcI H-6到GlcVI的端基碳的相互HMBC关联。
GlcV(δH 4.83)的端基质子显示出与在δH 3.32处的被指定为GlcV H-2的质子的COSY关联。GlcV H-2进而显示出与在δH 3.51处的质子(GlcV H-3)的COSY关联。此后者质子显示出与在δH 3.38处的质子(GlcV H-4)的另外的关联。H-4还显示出与在δH 3.55处的质子(GlcV H-5)的COSY关联，并且GlcV H-5进而显示出与GlcV H-6质子(δH 3.76和3.97)的COSY关联。使用HSQC-DEPT数据，确定关于GlcV C-2(δC 78.5)、C-3(δC 78.7)、C-4(δC 72.9)、C-5(δC 78.8)、和C-6(δC 63.6)的13C化学位移的指定。从GlcV H-3到C-2和C-4以及还有从GlcVH-4到C-3和C-6的HMBC关联证实了以上做出的指定，从而完成GlcV的指定。
基于1H-13C HSQC-DEPT和HMBC关联，另一个葡萄糖部分被指定为在GlcI的C-6处的取代基。在HSQC-DEPT谱中的δC 70.9处的GlcI的亚甲基13C共振的相对低场位移指示了GlcI的1→6糖键。在δH 4.50处观察到的端基质子显示出与GlcI C-6的HMBC关联并且被指定为GlcVI的端基质子。类似地，GlcI的亚甲基质子显示出与GlcVI的端基碳的HMBC关联，并且这证实了在GlcI与GlcVI之间的1→6糖键的存在。GlcVI端基质子显示出与在δH 3.33处的质子(被指定为GlcVI H-2)的COSY关联，该在δH 3.33处的质子进而显示出与在δH 3.49处的质子(GlcVI H-3)的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱不允许基于COSY关联对GlcVH-4到H-6质子的指定。因此，使用GlcVI端基质子的选择性照射以不同的混合时间进行一系列的1D-TOCSY实验。除了证实关于GlcVI H-2到H-3的指定之外，该1D-TOCSY数据还显示出在δH 3.45(GlcVIH-4)和δH 3.48(GlcVI H-5)处的质子以及被指定针对GlcVI H-6质子的在δH 3.92和3.94处的质子。使用1H-13C HSQC-DEPT数据，确定关于GlcVI C-2(δC 78.1)、C-3(δC 78.6)、C-4(δC72.3)、C-5(δC 78.8)、和C-6(δC 64.1)的13C化学位移的指定，从而完成GlcVI的指定。
关于在C-19处的糖苷的1H和13C化学位移的总结发现在下列表中：
Reb M2糖苷的1H NMR(500MHz，D2O)和13C NMR(125MHz，D2O/TSP)指定。
Figure BDA0000906704130001001
Figure BDA0000906704130001011
*1H和13C值可与下表的GlcIV-1互换。
用来指定C-19糖苷区域的关键HMBC、COSY、和1D-TOCSY关联的总结提供如下：
Reb M2糖苷的1H NMR(500MHz，D2O)和13C NMR(125MHz，D2O/TSP)指定。
Figure BDA0000906704130001012
Figure BDA0000906704130001021
以类似的方式进行GlcII的指定。GlcII端基质子(δH 4.85)显示出与在δH 3.75处的质子(被指定为GlcII H-2)的COSY关联，该在δH 3.75处的质子进而显示出与在δH 3.98处的质子(GlcII H-3)的COSY关联。此后者质子显示出与在δH 3.54处的质子(GlcII H-4)的另外的关联。H-4也显示出与在δH 3.96处的质子(GlcII H-5)的COSY关联。GlcII H-5还显示出与GlcII H-6质子(δH 3.77和3.45)的COSY关联。使用HSQC-DEPT数据，确定关于GlcII C-2(δC81.7)、C-3(δC 88.0)、C-4(δC 71.3)、C-5(δC 80.5)、和C-6(δC 63.6)的13C化学位移的指定。从GlcII H-3到C-2和C-4以及还有从GlcII H-4到C-3和C-6的HMBC关联证实了以上做出的指定，从而完成GlcII的指定。
基于HMBC关联，剩余未指定的葡萄糖部分中的两个被指定为在GlcII的C-2和C-3处的取代基。在δH 4.92处观察到的端基质子显示出与GlcII C-2的HMBC关联并且被指定为GlcIII的端基质子。在δH 4.84处观察到的端基质子显示出与GlcII C-3的HMBC关联并且被指定为GlcIV的端基质子。还观察到在GlcII H-2与GlcIII的端基碳之间以及在GlcII H-3与GlcIV的端基碳之间的相互HMBC关联。
GlcIII(δH 4.92)的端基质子显示出与在δH 3.32处的被指定为GlcIII H-2的质子的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱不允许H-3到H-6质子的指定。因此，使用GlcIII端基质子的选择性照射以不同的混合时间进行一系列的1D-TOCSY实验。除了证实关于GlcIII H-2的指定之外，该1D-TOCSY数据还显示出在δH 3.51(GlcIII H-3)、δH 3.26(GlcIII H-4)、和δH 3.44(GlcIII H-5)处的质子。一旦使用1D-TOCSY数据将H-4指定，就使用从H-4到H-5以及进而到H-6的COSY关联来指定H-6。在COSY谱中，GlcIII H-4显示出与GlcIII H-5的关联，该GlcIII H-5进而显示出对应地与GlcIII H-6a和H-6b的δH 3.94和3.75的COSY关联。然后使用1H-13CHSQC-DEPT关联，确定关于GlcIII C-2(δC 76.3)、C-3(δC 78.8)、C-4(δC 73.3)、C-5(δC78.8)、和C-6(δC 64.4)的13C化学位移，从而完成GlcIII的指定。
显示出与在δH 3.41的质子的COSY关联的GlcIV的端基质子(δH 4.84)被指定为GlcIV H-2，该GlcIV H-2进而显示出与在δH 3.46处的质子(GlcIV H-3)的COSY关联。此后者质子显示出与在δH 3.45处的质子(GlcIV H-4)的额外关联，该在δH 3.45处的质子还显示出与在δH 3.75处的质子(GlcIV H-5)的COSY关联。GlcIV H-5还显示出与GlcIV H-6质子(δH3.55和3.78)的COSY关联。使用HSQC-DEPT数据，确定关于GlcIV C-2(δC 76.1)、C-3(δC78.8)、C-4(δC 72.5)、C-5(δC 81.7)、和C-6(δC 65.8)的13C化学位移的指定。从GlcIV H-3到C-4和C-5以及还有从GlcIV H-4到C-3和C-6的HMBC关联证实了以上做出的指定，从而完成GlcIV的指定。
关于在C-13处的糖苷的1H和13C化学位移的总结发现在下列表中：
Reb M2糖苷的1H NMR(500MHz，D2O)和13C NMR(125MHz，D2O/TSP)指定。
Figure BDA0000906704130001031
Figure BDA0000906704130001041
用来指定C-13糖苷区域的关键HMBC、COSY、和1D-TOCSY关联的总结提供如下：
Figure BDA0000906704130001042
NMR和MS分析允许以下显示的其结构中的完全指定。该化合物的化学名称是13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯](莱鲍迪苷M2或reb M2)。该化合物是莱鲍迪苷M的异构体。
Figure BDA0000906704130001051
实例41
用于莱鲍迪苷D到莱鲍迪苷M的转化的UGT76G1的定向演化(第2轮)
选择来自UGT76G1的第一轮定向演化的最有活性的克隆(参见实例26，含有突变Q266E_P272A_R334K_G348P_L379G的UGT76G1var94)作为第2轮的基线克隆。建立了53种突变的清单，该清单含有来自第一轮的鉴定的不同正突变和通过DNA2.0ProteinGPStm策略获得的新突变。这个突变清单随后用于设计92个变体基因，这些变体基因各自含有3个不同的突变。针对在大肠杆菌中表达进行密码子优化之后，合成了这些基因，将其亚克隆到pET30a+质粒中并且用于转化大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞。使获得的细胞在卡那霉素的存在下在培养皿中在固体LB琼脂培养基上生长。选择适合的菌落，并使其在试管中的液体LB培养基中生长。将甘油作为冷冻保护剂添加到悬液中并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将含有pET30a+_UGT76G1var质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的这些贮存等分试样解冻，并将其添加至LBGKP培养基(20g/L Luria Broth Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)。在30℃下，在振摇下在96微量滴定板中进行此培养持续8h。
用50μL的上述培养物接种含有60g/L的过夜快速表达TB培养基(OvernightExpressTM Instant TB medium)
Figure BDA0000906704130001062
10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素的3.95mL的生产培养基。在20℃在48深孔板中搅拌所得培养物。培养物产生显著的生长并获得了良好的OD(600nm)。44小时后，通过离心收获细胞，并将其冷冻。
通过向解冻的细胞添加
Figure BDA0000906704130001063
母混合物
Figure BDA0000906704130001064
进行裂解，并通过离心回收裂解物。用100μL的新鲜裂解物进行活性测试，该裂解物被添加到在50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中的莱鲍迪苷D(终浓度0.5mM)、MgCl2(终浓度3mM)和UDP-葡萄糖(终浓度2.5mM)的溶液中。
使反应在30℃下进行，并且在2、4、7和24小时之后取样。为了通过HPLC(CAD检测)确定转化和初始速率，使用上述的用于莱鲍迪苷D到莱鲍迪苷M的转化的分析方法。用基线克隆第1轮-Var94并行地进行实验。在22h之后转化。并且，针对这个基线克隆的初始速率被定义为100％，且对于第2轮克隆的归一化转化率和初始速率描绘在下表中：
Figure BDA0000906704130001061
Figure BDA0000906704130001071
Figure BDA0000906704130001081
Figure BDA0000906704130001091
Figure BDA0000906704130001101
*突变标注如下：参考基因-原始氨基酸-位置-新的氨基酸：例如，对于来自UGT76G1的第一轮定向演化的变体94，在位置33处的丙氨酸突变为甘氨酸被标注为第1轮-Var94(A33G)
这些结果的建模允许获得每个突变的效应的分级。以下突变被确定为对于活性是有益的：S42A、F46I、I190L、S274G、I295M、K303G、F314S、K316R、K393R、V394I、I407V、N409K、N409R、Q425E、Q432E、S447A、S456L。
实例42
AtSUS的体内产生
AtSUS
>gi|79328294|ref|NP_001031915.1|蔗糖合酶1[拟南芥]
MANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQIIAEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLKFLRLHSHQGKNLMLSEKIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLDMIRLLLDLLEAPDPCTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDIYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEIEELLYSDVENKEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRELANLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDRVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVPLAQDD(SEQ ID NO:13)。
将合成的AtSuS基因针对在大肠杆菌中表达进行密码子优化并使用NdeI和XhoI限制性位点将其亚克隆到pET30a+质粒中。使用含有AtSUS基因的pET30A+载体来转化电感受态的大肠杆菌Bl21(DE3)细胞。将获得的细胞在卡那霉素存在的情况下培养在培养皿中，并选择适当的菌落，并让其在液体LB培养基(埃伦迈尔烧瓶)中生长。将甘油作为冷冻保护剂添加到悬液中并且将400μL的等分试样在-20℃和在-80℃下储存。
将含有pET30A+_AtSUS质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的贮存等分试样解冻，并将其添加至30mL的LBGKP培养基(20g/L Luria Broth Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)。在135rpm振摇下在30℃进行此培养持续8h。
该生产培养基含有60g/L的过夜快速表达TB培养基(Novagen公司)、10g/L的甘油和50mg/L的卡那霉素。将预培养物添加到800mL的该培养基中并且将该溶液在20℃搅拌，同时取样品测量OD和pH。培养物产生显著的生长并获得了良好的OD。40小时后，通过离心收获细胞，将其冷冻，获得30.1g的细胞湿重。
通过Fastprep(MP Biomedicals，裂解基质B，速度6.0，3x 40秒)用细胞悬液进行裂解，该细胞悬液具有在1.0mL的50mM Tris缓冲液(pH 7.5)中的200mg细胞。通过离心回收裂解物并趁新鲜使用。
实例43
使用UGTSL2、UGT76G1-R1-F12和AtSUS以原位制备的UDP-葡萄糖进行莱鲍迪苷A到莱鲍迪苷M的转化
使用在磷酸钾缓冲液(50mM终浓度，pH 7.5)中的100mM的蔗糖、3mM的MgCl2、0.25mM的UDP和0.5mM的莱鲍迪苷A，以1mL规模进行反应。通过添加15μL的UGTSL2(参见实例27)裂解物(2U/mL)、150μL的UGT76G1var94(参见实例26)(2.5U/mL)和15μL的AtSUS(参见实例42)(400U/mL)开始反应。反应后，用10μL的2N H2SO4和115μL的60％甲醇淬灭125μL样品，之后进行HPLC。在反应时间21小时之后，获得68％的莱鲍迪苷M和26％的莱鲍迪苷M2。
Figure IDA0000906704220000011
Figure IDA0000906704220000021
Figure IDA0000906704220000031
Figure IDA0000906704220000041
Figure IDA0000906704220000051
Figure IDA0000906704220000061
Figure IDA0000906704220000071
Figure IDA0000906704220000081
Figure IDA0000906704220000091
Figure IDA0000906704220000101
Figure IDA0000906704220000111
Figure IDA0000906704220000121
Figure IDA0000906704220000131
Figure IDA0000906704220000141
Figure IDA0000906704220000151
Figure IDA0000906704220000161
Figure IDA0000906704220000171
Figure IDA0000906704220000181
Figure IDA0000906704220000191
Figure IDA0000906704220000201
Figure IDA0000906704220000211
Figure IDA0000906704220000221
Figure IDA0000906704220000231

Claims (4)

1.一种用于制备reb M的方法，所述方法包括：
a.提供包含reb D的起始组合物；
b.提供UDP-葡萄糖基转移酶；以及
c.使该UDP-葡萄糖基转移酶与含有该起始组合物的介质接触以产生包含reb M的介质，
其中该UDP-葡萄糖基转移酶能够将至少一个葡萄糖单位添加至reb D，以形成reb M。
2.如权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：
d.从该包含reb M的介质纯化reb M以提供高度纯化的reb M组合物。
3.如权利要求1所述的方法，其中该UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。
4.如权利要求2所述的方法，其中该高度纯化的reb M组合物具有按干重计超过95％的reb M纯度。
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