TW201402599A - 甜菊糖苷糖苷轉化酵素及編碼該酵素之基因 - Google Patents

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Abstract

提供甜菊醇糖苷轉化酵素及使用該酵素的甜菊醇糖苷的製造方法。本發明提供甜菊醇糖苷轉化酵素及使用該酵素的甜菊醇糖苷的製造方法。本發明提供有導入甜菊醇糖苷轉化酵素基因的形質轉換體及該形質轉換體的製作方法。

Description

甜菊醇糖苷轉化酵素及編碼該酵素之基因
本發明是關於具有合成甜菊醇糖苷活性的蛋白質及將其編碼的聚核苷酸，利用該蛋白質的甜菊醇糖苷的製造方法，高度表現甜菊醇糖苷轉化酵素的形質轉換體以及前述方法製成的甜菊醇糖苷及其利用。
菊科甜菊(Stevia rebaudiana)的葉中含有類雙帖的一種名為甜菊醇(Steviol)的二次代謝產物，由於甜菊醇糖苷呈現砂糖的約300倍的甜味，而在食品產業上被利用為無熱量(calorie-less)的甜味料。肥胖成為深刻的社會問題而在國際上發展中，由増進健康及削減醫療費的觀點上無熱量的甜味料的要求希望也在日日增大中。現在以人工合成的胺基酸衍生物的阿斯巴甜(Aspartame)及乙醯磺胺酸鉀(Acesulfame Potassium)做為人工甜味料而被利用，但如甜菊醇糖苷等天然存在的無熱量甜味料是可期待更安全並容易得到消費者的接受(Public Acceptance)。
甜菊醇糖苷在最後是以糖修飾到有4個糖附加的名為甜葉菊苷A(Rebaudioside A)的糖苷(第1圖)。 其前驅體的甜菊醇三糖糖苷的甜菊糖苷(Stevioside)在量上也最多，甜葉菊苷A及甜菊糖苷為甜菊的甜味的中心物質。這些以外也已知有可能是反應中間體的糖苷及糖種類不同的類似物的存在。
甜葉菊苷A的生物合成的酵素基因是經由甜菊的表現序列標記(Expressed Sequence Tag(EST))解析而被單離(非專利文獻1及2，專利文獻1)。植物荷爾蒙的類雙萜的吉貝素(Gibberellin)的前驅體的異-貝殼杉烯酸(Ent-kaurenoic acid)的13位由細胞色素(cytochrome)P450酵素的異-貝殼杉烯酸13位羥化酵素(EK13H)受羥化而生成甜菊醇(第2圖)(非專利文獻3，專利文獻1)。甜菊醇是13位的羥基由UGT85C2先受糖苷化(單糖苷化)而生成甜菊醇單糖苷(Steviolmonoside)。甜菊醇單糖苷13位的葡萄糖的2位再受糖苷化而生成甜菊醇雙糖苷(Steviolbioside)，或甜菊醇單糖苷的19位的羧基受糖苷化而生成名為甜茶苷(Rubusoside)的甜菊醇的二糖糖苷。如此生成的甜菊醇雙糖苷及甜茶苷被認為再受糖苷化，而生成甜菊糖苷及甜葉菊苷A等的甜菊醇糖苷。做為甜菊醇糖苷的生成有關的酵素基因而已知有UGT74G1及UGT76G1。
UGT74G1已知會催化甜菊醇單糖苷的19位的糖苷化(非專利文獻1)。UGT74G1又將甜菊醇雙糖苷糖苷化，生成甜菊醇三糖糖苷體的甜菊糖苷(Stevioside)。此甜菊糖苷在甜菊葉中含有量最多，已知呈現砂糖的250至300倍左右的甜味。此甜菊糖苷再由UGT76G1糖苷化，而生成甜味最 高(砂糖的350至450倍)，並且味質良好的甜菊醇四糖糖苷的甜葉菊苷A(Rebaudioside A)。
在甜菊醇糖苷，特別地，有在13位的葡萄糖附加分枝狀糖而可提高味質及甜味度的報告(非專利文獻4，專利文獻2)，催化這些反應的糖苷轉化酵素，可認為是決定甜菊的甜味特牲的重要的酵素。
在先前研究(非專利文獻2)中由甜菊葉的EST解析報告有數種類的糖苷轉化酵素(UGT)，但沒有充分檢討這些的全部的詳細的酵素活性。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]EP 1 897 951 B1
[專利文獻2]特開平5-255372
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Brandle and Telmer (2007) Phytochemistry 68, 1855-1863
[非專利文獻2]Richman et al (2005) Plant J. 41, 56-67
[非專利文獻3]Mizutani and Ohta (2010) Annu. Rev. Plant Biol. 61, 291-315
[非專利文獻4]笠井等(1981)日本化學會誌5, 726-735
本發明者等精心推行研究的結果，成功於鑑定在甜菊的甜菊醇糖苷的13位葡萄糖催化糖的加成反應的酵素及編碼該酵素的基因序列。本發明是基於上述知識的發明。
即，本發明如下。
[1]由以下(a)至(c)所成的群所選的在任一項所述的蛋白質。
(a)包含序列編號2的胺基酸序列的蛋白質；(b)包含在序列編號2的胺基酸序列中，有1至7個胺基酸的短缺，取代，插入，及/或加成的胺基酸序列，且在下述一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1，及19位的-COOR2有加成糖分子的活性的蛋白質；(c)具有對序列編號2的胺基酸序列，有99%以上的序列同一性的胺基酸序列，且在下述一般式(I)表示的化合物的13位的-OR，及19位的-COOR2有加成糖分子的活性的蛋白質
(式中，R1表示H，葡萄糖單體或葡萄糖雙體，R2表示H或葡萄糖單體。)
[2]如前述[1]所述的蛋白質，其前述糖分子是六碳糖。
[3]如前述[1]所述的蛋白質，其前述糖分子是由葡萄糖，甘露糖及半乳糖所成的群所選擇。
[4]如前述[1]所述的蛋白質，其前述化合物是甜菊醇，甜菊醇單糖苷，甜菊醇雙糖苷，甜茶苷或化合物Y。
[5]由以下的(a)至(d)所成的群所選擇的聚核苷酸。
(a)含有序列編號1的鹼基序列的聚核苷酸；(b)編碼包含序列編號2胺基酸序列的蛋白質的聚核苷酸；(c)一種聚核苷酸，係編碼下述蛋白質：包含在序列編號2的胺基酸序列中有1至7個的胺基酸短缺，取代，插入，及/或加成的胺基酸序列，並且在下述一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2有加成糖分子的活性；(d)一種聚核苷酸，係編碼下述蛋白質：具有對序列編號2的胺基酸序列，有99%以上的序列同一性的胺基酸序列，並且在下述一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2有加成糖分子的活性。
(式中，R1表示H，葡萄糖單體或葡萄糖雙體，R2表示H或葡萄糖單體。)
[6]如前述[5]所述的聚核苷酸，其前述糖為六碳糖。
[7]如前述[5]所述的聚核苷酸，其前述糖分子為葡萄糖，甘露糖及半乳糖所成的群所選擇。
[8]如前述[5]所述的聚核苷酸，其前述化合物為甜菊醇，甜菊醇單糖苷，甜菊醇雙糖苷，甜茶苷或化合物Y。
[9]有前述[5]所述的聚核苷酸導入的非人形質轉換體。
[10]如前述[9]所述的形質轉換體，其前述聚核苷酸是插入在表現載體(expression vector)。
[11]如前述[9]所述的形質轉換體，係為植物體。
[12]前述[9]所述的形質轉換體的抽出物。
[13]含前述[12]所述的抽出物的食品，醫藥品或工業原料。
[14]培養前述[9]所述的非人形質轉換體為特徴的蛋白質的製造方法，前述蛋白質係在下述一般式(1)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2有加成糖分子的 活性。
(式中，R1表示H，葡萄糖單體或葡萄糖雙體，R2表示H或葡萄糖單體。)
[15]使用前述[9]所述的非人形質轉換體為特徴的甜菊醇糖苷的製造方法。
[16]如前述[15]所述的方法，其前述甜菊醇糖苷是甜菊醇單糖苷，甜菊醇雙糖苷，甜菊糖苷，甜茶苷，化合物X
化合物Y
化合物Z
或這些的組合。
[17]一種甜菊醇糖苷的製造方法，係含有將前述[1]所述的蛋白質，UDP-糖，及下述一般式(I)表示的化合物反應的步驟。
(式中，R1表示H，葡萄糖單體或葡萄糖雙體，R2表示H或葡萄糖單體。)
[18]如前述[17]所述的方法，其在前述UDP-糖的糖是葡萄糖。
[19]前述[17]所述的方法，其前述甜菊醇糖苷是甜菊醇單糖苷，甜菊醇雙糖苷，甜菊糖苷，甜茶苷，化合物X
化合物Y
化合物Z
或這些的組合。
由利用本發明的蛋白質及將其編碼的聚核苷酸，可以高效率製造甜菊醇糖苷(例如，甜菊醇單糖苷，甜菊醇雙糖苷，甜菊糖苷，甜茶苷，化合物X，化合物Y，化合物Z等)。又，本發明的形質轉換體是甜菊醇糖苷(例如，甜菊醇單糖苷，甜菊醇雙糖苷，甜菊糖苷，甜茶苷，化合物X，化合物Y，化合物Z等)的含有量高之故，由這些的形質轉換體，可以高效率地將甜菊醇糖苷(例如，甜菊醇單糖苷，甜菊醇雙糖苷，甜菊糖苷，甜茶苷，化合物X，化合物Y，化合物Z等)抽出‧精製。
第1圖顯示甜菊醇糖苷群的名稱及構造。在第1圖中 「Glc」是表示葡萄糖。又，「Glc-Glc(β 2→1)是表示「Glc-Glc」以β 2,1糖苷鍵結而結合，「Glc-Glc(β 3→1)」是表示「Glc-Glc」以β 3,1糖苷鍵結而結合。
第2圖顯示推定的甜菊醇糖苷的生物合成路徑。
第3圖顯示在大腸菌表現的UGT713E1同源蛋白質1的SDS-PAGE結果。圖片(panel)A是顆粒部分(pellet fraction)，圖片B是以咪唑溶液溶出部分的CBB染色圖。星號表示所表現的重組蛋白質。
第4圖顯示UGT73E1同源蛋白質的酵素活性。在第4圖中「Glc」是表示葡萄糖。
第5圖顯示甜菊醇及其糖苷的標準品的層析圖。
第6圖顥示UGT73E1同源蛋白質1催化的反應路徑。在第6圖中，「UGT73E1HP1」是表示UGT73E1同源蛋白質1。
以下，詳細說明本發明。以下的實施方式是為說明本發明的例示，並不是將本發明只限定於本實施方式的意思。本發明在不脫離其要旨的範圍內，可以用種種的方式實施。
又，在本說明書中引用的全部的文獻，及公開公報，專利公報及其他的專利文獻，做為參考而編入於本說明書。又，本說明書，包含成為本申請案的主張優先權的基礎的2012年5月30日提申請的日本國申請專利(特願2012-123349號)的說明書及圖式所述的內容。
以下，詳細說明本發明。以下的實施方式是為說明本發明的例示，並不是將本發明只限定於本實施方式的意思。本發明在不脫離其要旨的範圍內，可以用種種的方式實施。
本發明者等，首先解明源自甜菊的UGT73E1同源蛋白質1，承擔對甜菊醇糖苷的13位的羥基及在13位的羥基鍵結的葡萄糖，以及19位的羧基及與19位的羧基鍵結的葡萄糖進行糖加成反應的酵素蛋白質。
UGT73E1同源蛋白質1的CDS序列及推定胺基酸序列，各分別為序列編號1及2。前述聚核苷酸及酵素，可由在後述的實施例所述的手法，公知的基因工學的手法，公知的合成手法等而取得。
1. 甜菊醇糖苷轉化酵素
本發明是提供以下的(a)至(c)所成的群選擇的任一項所述的蛋白質(以下，稱為「本發明的蛋白質」。
(a)包含序列編號2的胺基酸序列的蛋白質；(b)包含在序列編號2的胺基酸序列中有1至7個的胺基酸短缺，取代，插入，及/或加成的胺基酸序列，且以下述一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2有加成糖分子的活性的蛋白質；(c)具有對序列編號2的胺基酸序列，有99%以上的序列同一性的胺基酸序列，並且以下述一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1，及19位的-COOR2有加成糖分子活性的蛋白質 (式中，R1表示H，葡萄糖單體或葡萄糖雙體，R2表示H或葡萄糖單體。)
上述(b)或(c)所述的蛋白質是，代表性的是天然存在的序列編號2的多肽的變異體，但也包含，例如，使用“Sambrook & Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring HarborLaboratory Press 2001”，“Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley &Sons 1987-1997”，“Nuc.Acids.Res.,10,6487(1982)”，“Proc.Natl.Acad.Sci.USA.79,6409(1982)”，“Gene,34,315(1985)”，“Nuc.Acids.Res,13,4431(1985)”，“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)”等所述的位點特異性的變異導入法而可人為取得的變異體。
在本說明書中，「包含在序列編號2的胺基酸序列中有1至7個的胺基酸短缺，取代，插入，及/或加成的胺基酸序列，且以下述一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2有加成糖分子的活性的蛋白質」而言，包含在序列編號2的胺基酸序列中，例如，可舉有1至7個，1至6個，1至5個，1至4個，1至3個，1至2個，或1個的胺基酸殘基的短缺，取代，插入及/或加成的胺基酸序列，並且一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1 及19位的-COOR2有加成糖分子的活性的蛋白質。上述胺基酸殘基的短缺，取代，插入及/或加成的數，一般而言越小越理想。
又，這種蛋白質而言，可舉具有與序列編號2的胺基酸序列有99%以上，99.1%以上，99.2%以上，99.3%以上，99.4%以上，99.5%以上，99.6%以上，99.7%以上，99.8%以上，或99.9%以上的序列同一性的胺基酸序列，並且在下述一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2有加成糖分子的活性的蛋白質。上述序列同一性的數值一般是越大越理想。
在這裏，「在一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2加成糖分子的活性」就是在下述一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2加成糖分子的活性的的意思。
在一般式(I)中，R1表示H，葡萄糖單體(-Glc)或葡萄糖雙體(-Glc-Glc)，R2表示H或葡萄糖單體(-Glc)。理想是R1為葡萄糖雙體時，R2是H。在葡萄糖雙體中，理想是葡萄糖間是以β 2,1糖苷鍵結所結合。又，由本發明的蛋白質在一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2加成的糖分子是R1為葡萄糖單體或葡萄糖雙體 時，然後R2為葡萄糖單體時的任何情況下，理想是以β 2,1糖苷鍵結加成。
理想地，一般式(I)的化合物是甜菊醇，甜菊醇單糖苷，甜菊醇雙糖苷，甜茶苷或化合物Y。
由本發明的蛋白質在一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2加成的糖分子，沒有特別的限定，但1以上的五碳糖，六碳糖或其組合所成的糖分子也可以。五碳糖及六碳糖之例是如上述。理想是前述糖分子是六碳糖，更理想是，由葡萄糖，甘露糖及半乳糖所成的群所選擇的六碳糖。最理想是，前述糖分子是葡萄糖。
在一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2加成糖分子的活性，含被驗蛋白質1至500ng(理想是50至200ng，最理想是100ng)，UDP糖(例如，UDP-葡萄糖)1至1000μM(理想是100至700μM，最理想是500μM)，及基質化合物(一般式(I)的化合物)1至500μM(理想是100至500μM，最理想是250μM)的pH 6.0至8.0的中性領域的緩衝液(例如，磷酸鈉緩衝液或磷酸鉀緩衝液)中，在20至40℃的溫度孵育10分鐘至2小時後，將前述基質化合物精製，可將精製過的單萜以LC-MS分析(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)等的公知的手法分析而驗證。
LC-MS分析的結果，在一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2驗出有加成糖分子的化合物時， 可說前述被驗蛋白質在一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2有加成糖分子的活性。
前述糖加成反應是，一般是在1分鐘至12小時左右完成。
在本發明的蛋白質的胺基酸序列中有1或多數個的胺基酸殘基的短缺，取代，插入及/或加成，表示同一序列中的任意並且在1或複數的胺基酸序列中的位置上，有1或複數個的胺基酸殘基短缺，取代，插入及/或加成的意思，短缺，取代，插入及加成也可有2種以上同時發生。
以下，揭示互相可取代的胺基酸殘基的例。在同一群中所含的胺酸殘基是互相可取代的。A群：白胺酸，異白胺酸，正白胺酸，纈胺酸，正纈胺酸，丙胺酸，2-胺基丁烷酸，甲硫胺酸，o-甲基絲胺酸，三級丁基甘胺酸，三級丁基丙胺酸，環己基丙胺酸；B群：天冬胺酸，麩胺酸，異天冬胺酸，異麩胺酸，2-胺基己二酸，2-胺基辛二酸：C群：天冬醯胺，麩醯胺；D群：賴胺酸，天冬醯胺，鳥胺酸，2,4-二胺基丁烷酸，2,3二胺基丙酸：E群：脯胺酸，3-羥基脯胺酸，4-羥基脯胺酸；F群：絲胺酸，羥基丁胺酸，高絲胺酸；G群：苯基丙胺酸，酪胺酸。
本發明的蛋白質，可將編碼其的聚核苷酸(參照後述的「本發明的聚核苷酸」)在適當的宿主細胞內表現而得，但Fmoc法(芴甲氧羰基法，fluorenylmethyloxycarbonyl method)，tBoc法(三級丁基氧羰 基法，t-butyloxycarbonyl method)等化學合成法也可以製造。又，也可利用Advanced Automation Peptide Protein Technologies公司製，Perkin Elmer公司製，Protein Technologies公司製，PerSeptive公司製，Applied Biosystems公司製，SHIMADZU公司製等的胜肽合成機而化學合成。
2. 甜菊醇糖苷的製造方法
本發明是利用蛋白質所具有的，在一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2加成糖分子的活性，可以容易並且多量地製造甜菊醇糖苷。
於是，在別的實施態樣中，本發明提供甜菊醇糖苷的第1種製造方法，係含有將本發明的蛋白質，與UDP-糖，及下述一般式(I)表示的化合物反應，而在一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2，或13位的-OR1及19位的-COOR2的雙方加成糖分子的步驟。
一般式(1)的R1及R2的定義如同前述。理想地，一般式(I)的化合物是甜菊醇，甜菊醇單糖苷，甜菊醇雙糖苷，甜茶苷或化合物Y。
在本說明書中，「UDP-糖」就是尿核苷二磷酸(UridineDiphosphate：UDP)鍵結型的糖。在UDP-糖的糖部分的理想例而言，可舉1以上的五碳糖，六碳糖或其組 合所成的糖。五碳糖及六碳糖的例如上述。理想是UDP-糖是UDP-六碳糖，更理想是由葡萄糖，甘露糖及半乳糖所成的群所選擇的六碳糖。最理想地，前述UDP-糖是UDP-葡萄糖。
本發明的甜菊醇糖苷的第1製造方法是含有將本發明的蛋白質，與UDP糖，及一般式(I)表示的化合物反應，在一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2雙方加成糖分子的步驟。本發明的第1製造方法，可以再含有將在前述步驟生成的甜菊醇糖苷精製的製程。
由第1製造方法生成的甜菊醇糖苷的例而言，可舉甜菊醇單糖苷，甜菊醇雙糖苷，甜菊糖苷，甜茶苷，化合物X，化合物Y，化合物Z或這些的組合，但不限定於這些。
化合物X的構造如下。
化合物Y的構造如下。
化合物Z的構造如下。
生成的甜菊醇糖苷，可用適當的溶媒(水等水性溶媒或醇，醚及酮等有機溶媒)抽出，乙酸乙酯及其他的有機溶媒：水的梯度、高速液體層析法(High Performance LiquidChromatography：HPLC)，氣體層析法，飛行時間型質譜分析法(Time-of-Flight mass spectrometry：TOF-MS)，超高性能液體層析法(Ultra(High)Performance Liquid chromatography：HPLC)等公知的方法精製。
3. 含有高甜菊醇糖苷的非人形質轉換體
甜菊醇糖苷可於使用本發明蛋白質的細菌(大腸菌或酵母等)，植物，昆蟲，除人以外的哺乳動物等的細胞內生成。本發明的蛋白質，由於是源自甜菊的酵素或其變異體，所以在細胞內環境也可期待有高活性。這時，將編碼本發明蛋白質的聚核苷酸(參照後述的「本發明的聚核苷酸」)導入於源自於細菌，植物，昆蟲，除人以外的哺乳動物等的宿主細胞使其表現本發明蛋白質，將本發明蛋白質，與前述細胞內存在的UDP-糖及一般式(I)表示的化合物反應可生成甜菊醇糖苷。
於是，本發明是提供有導入在以下的(a)至(d)所成的群所選擇的任一項所述的聚核苷酸(以下，稱為「本發明的聚核苷酸」)的非人形質轉換體(以下，稱為「本發明的形質轉換體」)。
(a)含有序列編號1的鹼基序列的聚核苷酸；(b)編碼包含序列編號2的胺基酸序列的蛋白質的聚核苷酸；(c)編碼包含在序列編號2的胺基酸序列中，有1至7個的胺基酸短缺，取代，插入，及/或加成的胺基酸序列，並且在一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2有加成糖分子活性的蛋白質的聚核苷酸；(d)編碼具有對序列編號2的胺基酸序列，有99%以上的序列同一性的胺基酸序列，並且在一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2有加成糖分子活性的蛋白質的聚核苷酸。
一般式(I)的定義及具體例如前述，又，一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2所加成的糖分子的定義及具體例也如前述。
在本說明書中，「聚核苷酸」就是表示DNA或RNA的意思。
這裏，胺基酸序列及鹼基序列的序列同一性，可使用FASTA(Science 227(4693)：1435-1441,(985)),Karlin及Altschul的演算法BLAST(核酸與蛋白質序列比對工具，Basic Local Alignment Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268,1990；Proc Natl Acad Sci USA 90：5873,1993)決定。有根據BLAST的演算法的名為blastn，blastx，blastp，tblastn及tblastx的程式的開發(Altschul SF,et al：J Mol BioI 215：403,1990)。使用blastn解析鹼基序列時，參數例如設定為score=100，wordlength=12。又，使用blastp解析胺基酸序列時，參數例如設定為score=50，wordlength=3。使用BLAST及Gapped BLAST程式時，使用各程式的預設參數。
上述的本發明的聚核苷酸，可依公知的基因工學的手法或公知的合成手法取得。
本發明的聚核苷酸，理想是以插入於適當的表現載體的狀態導入於宿主。
適當的表現載體的構成，通常，含有(i)在宿主細胞內可轉錄的啟動子(promotor)；(ii)與該啟動子結合的本發明的聚核苷酸；及(iii)關連RNA分子的轉錄終結及聚腺苷酸化作用(polyadenylation)，含有在宿主細胞內作用的信號做為構成要素的表現匣(expression cassette)。
表現載體的製成方法而言，可舉使用質體(plasmid)，噬菌體(phage)或黏質體(cosmid)等的方法但沒有 特別的限定。
載體(vector)的具體的種類沒有特別限定，可適宜選擇在宿主細胞中可表現的載體。即，視宿主細胞的種類，為確實使本發明的聚核苷酸表現而選擇適宜的啟動子序列，將該啟動子序列與本發明的聚核苷酸組入至各種質體等的載體做為表現載體而使用即可。
本發明的表現載體，依賴於所導入的宿主種類而含有表現調控領域(例如，啟動子，終結子(terminator)及/或複製起點等)。細菌用表現載體的啟動子而言，可使用慣用的啟動子(例如，trc啟動子，tac啟動子，lac啟動子等)，酵母用啟動子而言，例如，可舉甘油醛3磷酸去氫酵素啟動子，PH05啟動子等，絲狀菌用啟動子而言，例如，可舉澱粉分解酵素，trpC等。又，在植物細胞內用於表現目的基因的啟動子的例而言，可舉花椰菜嵌紋病毒的35S RNA啟動子，rd29A基因啟動子，rbcS啟動子，將前述花椰菜嵌紋病毒的35S RNA啟動子的增強子序列附加於源自農桿菌(agrobacterium)的甘露胺酸(mannopine)合成酵素啟動子序列的5’側的mac-1啟動子等。動物細胞宿主用啟動子而言，可舉病毒性啟動子(例如，SV40初期啟動子，SV40後期啟動子等)。
表現載體，含至少1個篩選標記為理想。這種標記而言，可利用有營養要求性標記(ura5，niaD)，藥劑耐性標記(濕黴素(hygromycine)，博萊黴素(zeocin))，遺傳黴素(geneticin)耐性基因(G418r)，銅耐性基因(CUP1)(Marin et al.,Proe.Natl.Acad.Sci.USA,vol.81,p.337,1984)，淺藍菌素(cerulenin)耐性基因(fas2m，PDR4)(各分別，猪腰淳嗣等人，生化學，vol.64,p.660,1992；Hussain et al.,Gene,vol.101,p.149,1991)等。
本發明的形質轉換體的製作方法(生產方法)沒有特別限定，例如，可舉將含本發明的聚核苷酸的表現載體導入於宿主而形質轉換的方法。
本發明的形質轉換體，可期待以高含量含有甜菊醇糖苷。用於形質轉換的宿主細胞沒有特別限定，可合適使用公知的各種細胞。例如，宿主細胞的例而言，可舉大腸菌(Escherichia coli)等細菌，酵母(出芽酵母(釀酒酵母)(Saccharomyces cerevisiae)，分裂酵母(裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))，植物細胞，除人以外的動物細胞等。
理想地，宿主細胞是能生成一般式(I)表示的化合物的宿主細胞。在這裏，宿主細胞不限定於在天然狀態能生成一般式(I)表示的化合物者，例如，也可為以公知的基因重組操作而成為能生成一般式(I)表示的化合物者。
編碼賦予一般式(I)表示的化合物合成的酵素的基因而言，可舉EK13H，UGT74G1及UGT76G1(非專利文獻2)等公知的基因，但並不限定於這些。
宿主細胞是不能生成一般式(I)表示的化合物者時，在該宿主細胞導入本發明的基因所得的形質轉換體的培養系中，做為基質而添加一般式(I)的化合物或含該 化合物的植物抽出物，則不導入編碼賦予一般式(I)表示的化合物的合成的酵素的基因也可製造甜菊醇糖苷。
上述的宿主細胞所用之適當的培養基及條件是在本領域周知的。又，成為形質轉換的對象的生物也沒有特別限定，可舉在上述宿主細胞例示的各種微生物或植物或除人以外的動物。
宿主細胞的形質轉換方法而言可利用一般所用的公知的方法。例如，以電穿孔法(electroporation,Mackenxie,D.A.et al.,Appl.Environ.Microbiol.,vol.66,p.4655-4661,2000)，顆粒遞送法(particle delivery method，特開2005-287403)，原生質線體法(spheroplast method,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.75,p.1929,1978)，乙酸鋰法(J.Bacteriology,vol.153,p.163,1983)，Methods in yeast genetics,2000 Edition：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等所述的方法)而可實施，但不限定於這些。
其他，關於一般性的分子生物學的手法，可參照“Sambrook & Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001”，“Methods in Yeast Genetics,A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)”等。
培養由如此所得的形質轉換體，而可於形質轉換體內蓄積甜菊醇糖苷。如前述，在形質轉換體的培養系中做為基質而添加一般式(I)的化合物或含該化合物 的植物抽出物，則也可促進甜菊醇糖苷的製造。將所蓄積的甜菊醇糖苷抽出‧精製，而可得目的之甜菊醇糖苷。
因此，本發明提供使用本發明的形質轉換體為特徴的甜菊醇糖苷的第2製造方法。適當的培養培基及條件在本領域是周知的。又，甜菊醇糖苷的抽出‧精製方法則如前述。
甜菊醇糖苷沒有特別的限定，但理想也可選擇自甜菊醇單糖苷，甜菊醇雙糖苷，甜菊糖苷，甜茶苷，化合物X，化合物Y，化合物Z及這些組合所成的群。
本發明的1個態樣中，形質轉換體可以是植物形質轉換體。本實施態樣的植物形質轉換體是將含本發明的聚核苷酸的重組載體，以由該聚核苷酸編碼的多肽能表現的方式導入於植物中而取得。
使用重組表現載體時，用於植物體的形質轉換的重組表現載體，只要是在該植物內可表現本發明的聚核苷酸的載體則沒有特別限定。這種載體而言，例如，可舉有在植物細胞內能構成性的表現聚核苷酸的啟動子的載體，或有由外加的刺激而能引發活性化的啟動子的載體。
在植物細胞內構成性的表現聚核苷酸的啟動子的例而言，可舉花椰菜嵌紋病毒的35S RNA啟動子，rd29A基因啟動子，rbcS啟動子，mac-1啟動子等。
由外加刺激引發活性化的啟動子的例而言，可舉小鼠乳房腫瘤病毒(mouse mammary tumor virus(MMTV))啟動子，四環黴素反應性啟動子(tetracycline responsive promotor)，金屬硫蛋白啟動子(metalothionein promotor)及熱休克蛋白啟動子(heat shock protein promotor)等。
在本發明中成為形質轉換的對象的植物意指植物體全體，植物器官(例如葉，花瓣，莖，根，種子等)，植物組織(例如表皮，韌皮部，軟組織，木質部，維管束，柵狀組織，海綿狀組織等)或植物培養細胞，或種種形態的植物細胞(例如，懸浮培養細胞)，原生質體，葉的切片，癒合組織等任一種。用於形質轉換的植物而言，沒有特別的限定，屬於單子葉植物綱或雙子葉植物綱的植物的任一種都可以。
在植物導入基因是使用本業者公知的形質轉換方法(例如，農桿菌法，基因槍法，PEG法，電穿孔法等)。例如，周知的經由農桿菌的方法及直接導入於植物細胞的方法。使用農桿菌法時，將構成的植物用表現載體導入於適當的農桿菌(例如，農桿腫瘤菌(Agrobacterium tumefaciens)，將此菌株以葉片法(leaf disk method)(內宮博文著，植物基因操作手冊(990)27~31頁，講談社Scientific，東京)等感染無菌培養葉片，而可得形質轉換植物。又，可使用Nagel等人的方法(Microbiol.Lett.,67：325(1990))。此方法是先將例如表現載體導入於農桿菌，繼而，將形質轉換過的農桿菌依照Plant Molecular Biology Manual(Gelvin,S.B.et al.,Academic Press Publishers)所述的方法導入於植物細胞或植物組織的方法。在這裏，「植物組織」 包含經由植物細胞的培養而得的癒合組織。使用農桿菌做形質轉換時，可使用二元載體(binary vector)(pBI121或pPZP202等)。
又，將基因直接導入於植物細胞或植物組織的方法而言，已知有電穿孔法，粒子遞送法(particle gun method)。使用粒子遞送法時，可直接使用植物體，植物器官，植物組織本身，可將切片調製後使用，也可調製原生質體而使用。將如此調製的試料可使用基因導入裝置(例如PDS-1OOO(BIO-RAD公司)等)處理。處理條件是隨植物或試料而有不同，通常是450至2000psi程度的壓力，4至12cm左右的距離實施。
導入基因的細胞或植物組織，先以濕黴素耐性等藥劑耐性篩選，繼而以常法再生植物體。由形質轉換細胞再生植物體，視植物細胞的種類可以本業者公知的方法實施。
用植物培養細胞為宿主時，形質轉換是將重組載體以基因槍，電穿孔法等導入於培養細胞。形質轉換的結果所得的癒合組織及枝梢，毛狀根等，可直接用於細胞培養，組織培養或器官培養，又用以往所知的植物組織培養法，適當濃度的植物荷爾蒙(生長素(auxin)，細胞分裂素(cytokinin)，吉貝素，離層酸(abscisic acid)，乙烯，油菜素內酯(brassinolide)等)的施用等而可再生為植物體。
本發明的聚核苷酸有否導入於植物的確認，可使用PCR法，南方墨點雜交法(southern hybridization)，北方墨點雜交法(northern hybridization)等而實施。例如，由形質轉換植物調製DNA，設計DNA特異性的引子(primer)而進行PCR。PCR可在用於調製前述質體使用的同樣條件下進行。之後，對擴增產物實施瓊膠電泳，聚丙烯醯胺凝膠電泳或毛細管電泳等，以溴化乙菲(ethidium bromide)，SYBR Green液等染色，將該擴增產物做成1條帶而驗出，而可確認形質轉換。又，使用預先以螢光色素等標識的引子實施PCR，也可驗出擴增產物。再者，也可採用在微孔盤(microplate)等的固相將擴增產物鍵結，以螢光或酵素反應等而確認擴增產物的方法。
一旦取得本發明的聚核苷酸組入基因體(genome)內的形質轉換植物體，則可由該植物體的有性生殖或無性生殖而得繼代。又，由該植物體或其繼代，或由這些的純株(clone)獲得例如，種子，果實，切穂，塊莖，塊根，株，癒合組織，原生質體等，以這些為基本可將該植物體量產。因此，在本發明中，也包含導入本發明的聚核苷酸而可表現的植物體，或有與該植物體同一性質的該植物體繼代，或源自於這些的組織。
又，已有對種種的植物的形質轉換方法的報告。本發明的形質轉換體植物而言，可舉茄科植物(例如，茄子，番茄，辣椒，馬鈴薯，菸草，曼陀羅(Datura metel)，酸漿(Physalis alkekengi L.var.franchetii Makino)，矮牽牛(Petunia)，小花矮牽牛(Calibrachoa)，高杯花(Nierembergia)等)，豆科植物(例如，大豆，紅豆，落花生，菜豆(Phaseolus vulgaris)，蠶豆(Vicia faba)，日本百脈根(Lotus japonicus)等)，薔薇科植物(例如，草莓，梅，櫻，薔薇，藍莓，黑莓，山桑子(Bilberry)，茶蔗子(cassis,Ribes nigrum)，覆盆子(raspberry)，甜茶等)，石竹科植物(康乃馨，滿天星等)，菊科植物(菊，非洲菊，向日葵，雛菊(daisy)，甜菊等)，蘭科植物(蘭等)，報春花科(Primulaceae)植物(仙客來等)，龍膽科(Gentianaceae)植物(土耳其桔梗，龍膽等)，鳶尾科植物(小蒼蘭，菖蒲，劍蘭等)，玄參科(Scrophulariaceae)植物(金魚草，夏菫等)景天科(長壽花)，百合科植物(百合，鬱金香等)，旋花科植物(牽牛花，槭葉牽牛，天茄兒，甘薯，蔦蘿，土丁桂屬(Evolvulus)等)，八仙花科(Hydrangeaceae)植物(紫陽花，齒葉溲疏(Deutzia crenata)等)，瓜科植物(瓠瓜等)，牻牛兒苗科(Geraniaceae)植物(天竺葵屬(Pelargonium)，天竺葵(geranium)等)，木犀科植物(連翹等)，葡萄科植物(例如，葡萄等)，茶科植物(山茶花，茶樹等)，稻科植物(例如，稻，大麥，小麥，燕麥，黑麥，玉米，粟，稗，高梁，甘蔗，竹，烏麥，四石稗，高梁，茭白筍，薏苡，牧草等)，桑科植物(桑，啤酒花，楮，橡膠樹，麻等)，茜草科植物(咖啡樹，梔子等)，山毛櫸科植物(楢，山毛櫸，柏等)，胡麻科植物(胡麻等)，芸香科(Rutaceae)植物(例如，苦橙(Citrus aurantium)，柚子，溫州柑，山椒)及十字花科植物(紅甘藍，葉牡丹，蘿蔔，阿拉伯芥，油菜，甘藍，青花菜，花椰菜等)，唇形花科(一串紅(Salvia splendens)，紫蘇，薰衣草，黃岑等)。形質轉換對象的植 物的特別理想的例是使用已知能將甜菊醇做為配醣基而將種種的糖苷生物合成的植物為理想，這種植物而言，可舉甜菊及甜茶(Rubus suauissimus)等。
以本發明的聚核苷酸形質轉換的植物體(以下，稱為「本發明的植物」或「本發明的植物體」)，有適當的基質時，或，由外部添加適當的基質時，比其野生型可生產較多量的甜菊醇糖苷。
本發明的植物，可由本發明的植物種子，插枝，球根等的培育，容易得完整的植物體。
因此，在本發明的植物中，包含植物體整體，植物器官(例如葉，花瓣，莖，根，積子，球根等)，植物組織(例如表皮，韌皮部，軟組織，木質部，維管束，柵狀組織，海綿狀組織等)或植物培養細胞，或種種形態的植物細胞(例如，懸浮培養細胞)，原生質體，葉的切片，癒合組織等。
4. 形質轉換體的抽出物及其利用
本發明又在別的實施形態中，提供上述的形質轉換體的抽出物。本發明的形質轉換體，有適當的基質時，或，由外部添加適當的基質時，比其野生型甜菊醇糖苷的含有量較高，所以可認為在抽出物中含有高濃度的甜菊醇糖苷。
本發明的形質轉換體的抽出物是將形質轉換體以玻璃珠，均質機或音波器等破碎，將該破碎物離心處理，回收上澄液而得。再者，以上述的甜菊醇糖苷的抽出方法，也可再加施抽出步驟。
本發明的形質轉換體的抽出物，可依照常法，例如，在食品，醫藥品，工業原料的製造等的用途上使用。
本發明又在別的實施態樣中，提供含本發明的形質轉換體的抽出物之食品，醫藥，工業原料(食品等的原料)。含本發明的形質轉換體的抽出物之食品，醫藥，工業原料的調製，可依照常法。如此，含本發明的形質轉換體的抽出物的食品，醫藥，工業原料等，含有使用本發明的形質轉換體生成的甜菊醇糖苷。
本發明的醫藥品(組成物)的劑型是沒有特別限定，可以成為溶液狀，膏狀，凝膠狀，固體狀，粉末狀等任意的劑型。又，本發明的醫藥組成物除了油，洗劑，乳油，乳霜，凝膠，洗髮精，洗髮沖洗劑，護髮劑，塗料，粉底，口紅，粉餅，面膜，軟膏，粉劑，牙膏，氣溶膠，洗面乳等皮膚外用藥之外，可用於浴用劑，養毛劑，皮膚美容液，防曬劑等。
本發明的醫藥組成物，必要時，可再含有其他醫藥活性成分(例如，消炎成分)或輔助成分(例如，潤滑成分，承載成分)。
本發明的食品的例而言，可舉營養補充食品，健康食品，機能性食品，幼兒用食品，老人用食品等。本說明書中，食品是固體，流體，及液體，以及這些的混合物，而可以攝食的物質的總稱。
營養補充食品就是加強特定的營養成分的食品。健康 食品就是指健康的或健康上有益的食品而言，包含營養補充食品，自然食品，減肥食品等。機能性食品就是指補充有身體調節機能的營養成分的食品，與特定保健用途食品同義。幼兒用食品就是指給約6歳前的小孩的食品而言。老人用食品就是處理成為比無處理的食品較容易消化及吸收的食品而言。
本發明的食品，使用做為甜味料的無熱量的甜菊醇糖苷。因此，本發明的食品是低熱量，有賦予於増進健康或維持健康的好處。
這些食品的方式的例而言，可舉麵包，麵類，麵糰，飯，糕餅類(蛋糕，冰淇淋，冰棒，甜甜圈，烤餅乾，糖果，泡泡糖，果凍，錠果，以及糰子及饅頭等的日本式糕餅)，豆腐及其加工品等農產食品，清酒，藥用酒，味醂，食用醋，醬油，味噌等醱酵食品，酸酪，火腿，培根，香腸等畜產食品，魚板，天婦羅，魚餅等水產食品，果汁飲料，清涼飲料，運動飲料，酒精飲料，茶等或調味料。
5. 甜菊醇糖苷含有量高的植物的篩選方法
本發明提供甜菊醇糖苷含有量高的植物的篩選方法。具體而言，前述方法包含以下(1)至(3)的步驟。
(1)由被驗植物抽出mRNA步驟
(2)將由前述mRNA或前述mRNA調製的cDNA，與包含與本發明的聚核苷酸為互補的鹼基序列的聚核苷酸在高嚴格條件下會雜交的聚核苷酸加以雜交的步驟
(3)驗出前述的雜交的步驟
上述步驟(1)，可由被驗植物將mRNA抽出而實施。抽出mRNA的被驗植物的部位，沒有特別限定，但理想是花瓣。抽出mRNA時，也可以逆轉錄由mRNA調製cDNA。
步驟(2)是對在上述抽出的mRNA，與包含與 本發明的聚核苷酸為互補的鹼基序列的聚核苷酸或低聚核苷酸做為探針(probe)或引子，在高嚴格的條件下雜交而實施。本說明書中，「高嚴格的條件」，例如，(1)5×SSC，5×Denhardt溶液，0.5% SDS，50%甲醯胺，50℃，(2)0.2×SSC，0.1% SDS，60℃，(3)0.2×SSC，0.1% SDS，62℃，或(4)0.2×SSC，0.1% SDS，65℃的條件，但不限定於此。在這些條件下，溫度越提高越可期待有效率地得到序列同一性高的DNA。但，影響雜交的嚴格度的要素而言，可考慮溫度，探針濃度，探針的長度，離子強度，時間，鹽濃度等複數的因素，如為本業者則由適宜選擇這些因素而可實現同樣的嚴格度。
聚核苷酸或低聚核苷酸，理想是，5至500bp，較理想是10至200bp，更理想是10至100bp的長度。聚核苷酸或低聚核苷酸，可使用各種自動合成裝置(例如，AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare))容易合成，或，也可委託第三者機關(例如，Promega公司或Takara公司)等。
在步驟(2)中使用與包含與本發明的聚核苷 酸為互補的鹼基序列的聚核苷酸做為探針時，步驟(3)可使用通常的南方墨點法(參照Sambrook,Fritsch and Maniatis,“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”2nd Edition(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press)，微陣列(Affymetrix公司；美國專利第6,045,996號，第5,925,525號，及第5,858,659號)，TaqMan PCR(Sambrook，Fritsch and Maniatis,“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”2nd Edition(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press)，或螢光原位雜交(FISH)(Sieben V.J.et al.,(2007-06).IET Nanobiotechnology 1(3)：27-35)等雜交驗出方法而實施。另一方面，在步驟(2)中包含與本發明的聚核苷酸為互補的鹼基序列的聚核苷酸做為引子使用時，步驟(3)是，實施PCR擴增反應，將所得的擴增產物以電泳或定序(Sambrook,Fritsch and Maniatis,“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”2nd Edition(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press)等解析，可驗出雜交。
驗出較多雜交的植物體，與其他的植物體比較，可說在下述一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2有加成糖分子的活性的蛋白質表現較多，可預料甜菊醇糖苷含有量高。
[實施例]
以下，使用實施例將本發明更具體說明，但本發明的範圍不受這些實施例的限定。
[實施例1]甜菊醇雙糖苷糖苷轉化酵素的候補基因的單離
在先前研究(非專利文獻2)為了要得到與UGT73E1(AY345979)相同性高的基因，(有UGT73E1(AY345979)對甜菊醇糖苷沒有糖苷活性的報告)以下述的引子組(序列編號3及4)對由甜菊葉精製的cDNA做為模板而實施PCR。
甜菊葉cDNA是由甜菊葉使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)抽出總RNA，將其中的0.5μg以Random Oligo-dT引子做逆轉錄(RT)反應而得。
CACC-NdeI-SrUGT73E1-Fw：5’-CACCCATATGTCGCCAAAAATGGTGGCACCA-3’(序列編號3)
BamHI-SrUGT73E1-Rv：5’-GGATCCCTAATGTGGTGCTCTAACTGTTTCAGTCACAT-3’(序列編號4)
PCR反應液(50μl)，包含源自甜菊葉的cDNA 1μl，1×ExTaq buffer(TaKaRaBio)，0.2mM dNTPs，引子各0.4pmol/μl，ExTaq polymerase 2.5U的組成。PCR反應，在94℃反應3分鐘後，在94℃ 1分鐘，50℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘的反應實施計30循環擴增。將PCR產物以0.8%瓊凝膠電泳，溴化乙菲染色結果，得到由各分別的模板DNA推定的 約1.5kb大小的擴增帶。
此PCR產物是以製造業者推薦的方法次選殖(subcloning)到pENTR-TOPO Directional載體(Invitrogen)。使用DNA Sequencer model 3100(AppliedBiosystems)，以合成低聚核苷酸引子的引子步查法(primer walking)法決定序列。
解讀純株化的cDNA(做為「UGT73EI同源蛋白質1」)的序列的結果，表示與有報告的UGT73E1在DNA層級有98%的序列同一性(16鹼基的差異)，在胺基酸層級有98%序列同一性(8胺基酸的差異)(CDS序列：序列編號1，胺基酸序列：2)。
[實施例2]表現載體的構成
利用附加於引子的NdeI及BaHI的限制酵素部位(序列編號3及4的下線部)切出約1.5kb的UGT73E1同源蛋白質1的ORF片段，連結於大腸菌表現載體的pET15b(Novagen公司)的NdeI及BamHI部位，得本酵素基因的大腸菌表現載體。設計在本載體NdeI部位上游的His標記與UGT73E1同源蛋白質1基因的開放閱讀框(open reading frame)吻合，而能表現UGT73E1同源蛋白質1與His標記融合的崁合蛋白質(chimera protein)。
[實施例3]重組蛋白質的表現及精製
為闡明本酵素的生物化學的機能，將本酵素在大腸菌上表現。使用在上述所得的UGT73E1同源蛋白質1大腸菌表現用質體依照常法將大腸菌BL21(DE3)株形質轉換。將 所得的形質轉換體，以含50μg/ml的安比西林(ampicillin)的LB培養基(10g/l typtone pepton，5g/l yeast extract，1g/l NaCl)4ml，在37℃振盪培養一夜。將達到静止期培養液4ml接種於同組成的培養基80ml，在37℃振盪培養。菌體濁度(OD600)大約達到0.5時添加終濃度0.5mM的IPTG，在18℃振盪培養20小時。
以下所有操作都在4℃進行。將培養的形質轉換體離心分離(5,000×g,10min)而收集菌體，添加Buffer S[20mM HEPES緩衝液(pH 7.5)，20mM咪唑，14mM β-巰基乙醇]1ml/g cell而懸浮。繼而，以超音波破碎(15sec×8次)，離心分離(15,000×g，15min)。將所得的上澄液做為粗酵素液而回收。將粗酵素液在Buffer S中平衡化的His SpinTrap(GE Healthcare)加入，離心(70×g，30sec)。以Buffer清洗後，以含100mM及500mM的咪唑的Buffer S各5ml，分階段溶出結合於管柱的蛋白質。將各溶出部分使用Microcon YM-30(Amicon)將緩衝液以20mM HEPES緩衝液(pH 7.5)，14mM β-巰基乙醇(透析倍率1000倍)取代。
SDS-PAGE分離後的CBB染色結果，在200mM咪唑溶出部確認，在HisTag融合UGT73E1同源蛋白質1崁合蛋白質的推定分子量約50kDa附近，有蛋白質(第3圖的星號)。將此部分用於酵素解析。在這裏，在第3圖中圖片A表示顆粒部分，圖片B表示由咪唑溶液的溶出部分的CBB染色圖。
[實施例4]UGT73E1同源蛋白質1的酵素活 性測定
標準的酵素反應條件如下。將反應液(2mM UDP-葡萄糖，0.1mM糖受體基質(甜菊醇)，100mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)，精製UGT73E1同源蛋白質1酵素溶液25μl)以蒸餾水調製成為50μl，在30℃反應1小時。將酵素反應液5μl以下述的條件做LC-MS分析。
LC條件
管柱Waters Sunfire C18 3.5um 2.0 mmI.D.×20 mm
移動相：A：MilliQ Water(+0.05%甲酸)，B：MeCN
梯度：由B濃度15%到55%的直線濃度梯度(20分鐘)
流速：每分0.2ml
管柱烤箱：40℃
MS條件
ESI(負模式)
選擇離子偵測：m/z 317，479，641，687，803 and 849
UGT73E1同源蛋白質1與甜菊醇反應結果，UGT73EI同源蛋白質1與甜菊醇(尖峰A)的反應液中發現有新的4種生成物(第4圖：圖片1)。其中尖峰E及尖峰B與標準品的保持時間(第5圖)的比較，分別判明為甜茶苷及甜菊醇單糖苷。
另一方面，關於其餘的2個尖峰，則由MS層析圖判明化合物Y(Compound Y)是單糖苷，化合物X(Compound X)是雙糖苷。化合物Y是與標準品的甜菊醇單糖苷的保持時間不一致，暗示為在甜菊醇的19位的羧基受單糖苷化的單 糖苷(第6圖)。又，化合物X是與甜菊醇的雙糖苷的甜菊醇雙糖苷及甜茶苷的保持時間不一致，強烈暗示為在19位的羧基單糖苷化的糖苷(第6圖)。UGT73E1同源蛋白質1與UGT85C2同時與甜菊醇(尖峰A)反應時，化合物Y及化合物X的尖峰顯著減小(第4圖：圖片2)。這是可認為是由於兩酵素與甜菊醇有共通基質的競爭關係，甜菊醇(尖峰A)被UGT85C迅速變換成甜菊醇單糖苷(尖峰B)為原因。
再者，UGT73E1同源蛋白質1與甜茶苷(尖峰E)的反應生成可能是新的甜菊醇的三糖苷的化合物Z(Compound Z)(第4圖：圖片3)。化合物Z與甜菊醇的三糖苷的甜菊糖及甜茶苷B(尖峰F及D)的保持時間不一致，暗示在甜茶苷的19位葡萄糖再受糖苷化的糖苷(第6圖)。
UGT73E1同源蛋白質1與甜菊醇單糖苷(尖峰B)反應，得到新的2個尖峰(尖峰E及尖峰F)(第4圖：圖片4)。由保持時間判明尖峰E是甜茶苷，然後尖峰F是甜菊糖苷。再者，UGT73E1同源蛋白質1與甜菊醇雙糖苷(尖峰C)反應也驗出可能是甜菊糖苷(尖峰F)的生成物(第4圖：圖片5)。
由這些結果，UGT73E1同源蛋白質1將甜菊醇的13位的羥基糖苷化，生成甜菊醇單糖苷，再在其13位葡萄糖糖苷化，生成甜菊醇雙糖苷，再在其19位的羧基糖苷化，生成甜菊糖苷。如前述可看到將甜菊醇單糖苷的19位糖苷化而生成甜茶苷的活性，但甜茶苷與UGT73E1同源蛋白質1的反應液中不能看到顯著的甜菊醇雙糖苷的尖峰，暗示 UGT73EI同源蛋白質1的反應生成物的甜菊糖苷是經由甜菊醇雙糖苷而生成的(第6圖)。
[產業上利用可能性]
如此可明白UGT73E1同源蛋白質1是與甜菊醇及多樣的其糖苷反應的多機能性糖苷轉化酵素(第6圖)。由此可明白甜菊醇的13位羥基的糖苷化，再在19位羧基的糖苷化，再在19位葡萄糖的糖苷化這樣有不同的位置特異性。利用本酵素，可將已知的甜菊醇糖苷以新穎的方法生產。再者，也可能生產構造上新穎的甜菊醇糖苷。
【無序列表文字】
序列編號3：合成DNA
序列編號4：合成DNA
<110> 三得利控股股份有限公司(SUNTORY HOLDINGS LIMITED)
<120> 甜菊醇糖苷轉化酵素及編碼該酵素之基因 (Steviol Glycosyltransferase and Gene coding the Same)
<130> G13-0023
<150> JP 2012-123349
<151> 2012-05-30
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1488
<212> DNA
<213> 甜菊(Stevia rebaudiana)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1488)
<400> 1
<210> 2
<211> 495
<212> PRT
<213> 甜菊(Stevia rebaudiana)
<400> 2
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 3
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 4

Claims (19)

  1. 一種蛋白質，其係由以下(a)至(c)所成的群選擇的任一者(a)包含序列編號2的胺基酸序列的蛋白質；(b)包含在序列編號2的胺基酸序列中，有1至7個胺基酸的短缺，取代，插入，及/或加成的胺基酸序列，並且下述一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2具有加成糖分子的活性的蛋白質；(c)具有對序列編號2胺基酸序列，有99%以上的序列同一性的胺基酸序列，並且下述一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2有加成糖分子的活性的蛋白質， (式中，R1表示H，葡萄糖單體或葡萄糖雙體，R2表示H或葡萄糖單體)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的蛋白質，其中前述糖分子為六碳糖。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的蛋白質，其中前述糖分子是由葡萄糖，甘露糖及半乳糖所成的群所選擇。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的蛋白質，其中前述化合物是甜菊醇，甜菊醇單糖苷，甜菊醇雙糖苷，甜茶苷 或化合物Y
  5. 一種聚核苷酸，係由以下的(a)至(d)所成的群選擇者(a)含有序列編號1的鹼基序列的聚核苷酸；(b)編碼包含序列編號2的胺基酸序列的蛋白質的聚核苷酸；(c)編碼蛋白質的聚核苷酸，該蛋白質包含在序列編號2的胺基酸序列中，有1至7個的胺基酸的短缺，取代，插入，及/或加成的胺基酸序列，並且在下述一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2有加成糖分子的活性；(d)編碼蛋白質的聚核苷酸，該蛋白質具有對序列編號2的胺基酸序列，有99%以上的序列同一性的胺基酸序列，並且在下述一般式(1)表示的化合物的13位的-OR1及19位的-COOR2有加成糖分子的活性 (式中，R1表示H，葡萄糖單體或葡萄糖雙體，R2表示H或葡萄糖單體)。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的聚核苷酸，其中前述糖分子是六碳糖。
  7. 如申請專利範圍第5項所述的聚核苷酸，其中前述糖分子是由葡萄糖，甘露糖及半乳糖所成的群選擇。
  8. 如申請專利範圍第5項所述的聚核苷酸，其中前述化合物是由甜菊醇，甜菊醇單糖苷，甜菊醇雙糖苷，甜茶苷或化合物Y
  9. 一種非人形質轉換體，係經導入申請專利範圍第5項所述的聚核苷酸。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的形質轉換體，其中前述聚核苷酸是插入於表現載體。
  11. 如申請專利範圍第9項所述的形質轉換體，其係為植物體。
  12. 一種抽出物，其係申請專利範圍第9項所述的形質轉換體的抽出物。
  13. 一種食品、醫藥品或工業原料，係包含申請專利範圍第12項所述抽出物。
  14. 一種方法，係以培養申請專利範圍第9項所述的非人形質轉換體為特徴的蛋白質的製造方法，其中前述蛋白質是有在下述一般式(I)表示的化合物的13位的-OR1 及19位的-COOR2加成糖分子的活性， (式中，R1表示H，葡萄糖單體或葡萄糖雙體，R2表示H或葡萄糖單體)。
  15. 一種甜菊醇糖苷的製造方法，其特徵為使用申請專利範圍第9項所述的非人形質轉換體。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其中前述甜菊醇糖苷是甜菊醇單糖苷，甜菊醇雙糖苷，甜菊糖苷，甜茶苷，化合物X 化合物Y 化合物Z 或這些的組合。
  17. 一種甜菊醇糖苷的製造方法，係含有將申請專利範圍第1項所述的蛋白質，UDP-糖，及下述一般式(I)表示的化合物反應的步驟， (式中，R1表示H，葡萄糖單體或葡萄糖雙體，R2表示H或葡萄糖單體)。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的方法，其中前述UDP-糖的糖是葡萄糖。
  19. 如申請專利範圍第17項所述的方法，其中前述甜苷菊醇糖苷是甜菊醇單糖苷，甜菊醇雙糖苷，甜菊糖，甜茶苷，化合物X 化合物Y 化合物Z 或這些的組合。
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