JPWO2013180306A1 - ステビオール配糖体化酵素およびそれをコードする遺伝子 - Google Patents
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Abstract
Description
UGT74G1は、ステビオールモノシドの19位のグルコシル化を触媒することが知られている(非特許文献1)。UGT74G1は、また、ステビオールビオシドをグルコシル化し、ステビオール三糖配糖体のステビオシド(Stevioside)を生じる。このステビオシドがステビア葉で最も含有量が多く、砂糖の250〜300倍程の甘味を呈することが知られている。このステビオシドがさらにUGT76G1によってグルコシル化されて、最も甘味が高く(砂糖の350〜450倍)、且つ味質が良いとされるステビオール四糖配糖体であるレバウディオシドA(Rebaudioside A)が生成する。
[1] 以下の(a)〜(c)よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質。
(a)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号2のアミノ酸配列において、1〜7個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子を付加する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2のアミノ酸配列に対して、99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子を付加する活性を有するタンパク質
[2] 前記糖分子が、ヘキソースである、前記[1]に記載のタンパク質。
[3] 前記糖分子が、グルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるものである、前記[1]に記載のタンパク質。
[4] 前記化合物が、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド又はコンパウンドY
[5] 以下の(a)〜(d)よりなる群より選ばれるポリヌクレオチド。
(a)配列番号1の塩基配列を含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号2のアミノ酸配列において、1〜7個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2のアミノ酸配列に対して、99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
[6] 前記糖分子が、ヘキソースである、前記[5]に記載のポリヌクレオチド。
[7] 前記糖分子が、グルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるものである、前記[5]に記載のポリヌクレオチド。
[8] 前記化合物が、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド又はコンパウンドY
[9] 前記[5]に記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
[10] 前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記[9]に記載の形質転換体。
[11] 植物体である、前記[9]に記載の形質転換体。
[12] 前記[9]に記載の形質転換体の抽出物。
[13] 前記[12]に記載の抽出物を含む食品、医薬品又は工業原料。
[14] 前記[9]に記載の非ヒト形質転換体を培養することを特徴とするタンパク質の製造方法であって、前記タンパク質が下記一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子を付加する活性を有する、方法。
[15] 前記[9]に記載の非ヒト形質転換体を用いることを特徴とするステビオール配糖体の製造方法。
[16]
前記ステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、ルブソシド、コンパウンドX
[17] 前記[1]に記載のタンパク質と、UDP−糖と、下記一般式(I)で示される化合物とを反応させる工程を含む、ステビオール配糖体の製造方法。
[18] 前記UDP−糖における糖が、グルコースである、前記[17]に記載の方法。
[19] 前記ステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、ルブソシド、コンパウンドX
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる2012年5月30日に出願された日本国特許出願(特願2012−123349号)の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
UGT73E1ホモログプロテイン1のCDS配列及び推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号1及び2である。前記ポリヌクレオチド及び酵素は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。
本発明は、以下の(a)〜(c)よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質(以下、「本発明のタンパク質」という)を提供する。
(a)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号2のアミノ酸配列において、1〜7個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子を付加する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2のアミノ酸配列に対して、99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子を付加する活性を有するタンパク質
LC−MS分析の結果、一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子が付加した化合物が検出された場合、前記被検タンパク質は一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子を付加する活性を有するものと言える。
本発明はタンパク質が有する、一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子を付加する活性を利用することにより、ステビオール配糖体を容易かつ多量に製造することが可能である。
そこで、別の実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質と、UDP−糖と、下記一般式(I)で示される化合物とを反応させて、一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1若しくは19位の−COOR2、又は13位の−OR1及び19位の−COOR2の両方に糖分子を付加する工程を含む、ステビオール配糖体の第1の製造方法を提供する。
コンパウンドXの構造は以下の通り。
ステビオール配糖体は、本発明のタンパク質を用いて細菌(大腸菌又は酵母など)、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などの細胞内で生成することもできる。本発明のタンパク質は、ステビアに由来する酵素又はその変異体であるため、細胞内環境においても高い活性を有することが期待されるからである。この場合、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド(後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照)を、細菌、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して本発明のタンパク質を発現させ、本発明のタンパク質と、前記細胞内に存在するUDP−糖及び一般式(I)で示される化合物とを反応させることによりステビオール配糖体を生成することができる。
(a)配列番号1の塩基配列を含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号2のアミノ酸配列において、1〜7個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2のアミノ酸配列に対して、99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(i)宿主細胞内で転写可能なプロモーター;
(ii)該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド;及び
(iii)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
好ましくは、宿主細胞は、一般式(I)に示される化合物を生成することのできる宿主細胞である。ここで、宿主細胞は、天然状態で一般式(I)に示される化合物を生成することのできるものに限定されず、例えば、一般式(I)に示される化合物を生成することができるように公知の遺伝子で組換操作されたものであってもよい。
一般式(I)に示される化合物の合成に寄与する酵素をコードする遺伝子としては、EK13H、UGT74G1及びUGT76G1(非特許文献2)等が公知のものとして挙げられるがこれらに限定されるものではない。
従って、本発明は、本発明の形質転換体を用いることを特徴とするステビオール配糖体の第2の製造方法を提供する。適切な培養培地及び条件は当分野で周知である。また、ステビオール配糖体の抽出・精製方法については既に述べた通りである。
本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換体の抽出物を提供する。本発明の形質転換体は、適切な基質を有する場合、もしくは、適切な基質を外部から添加した場合、その野生型と比べてステビオール配糖体の含有量が高いので、その抽出物には、ステビオール配糖体が高濃度で含まれると考えられる。
栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等を含む。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用途食品と同義である。幼児用食品とは、約6歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。
本発明の食品は、甘味料としてカロリーレスのステビオール配糖体を使用している。このため、本発明の食品は低カロリーであり、健康増進又は健康維持に寄与するというメリットを有する。
本発明は、ステビオール配糖体含有量の高い植物をスクリーニングする方法を提供する。具体的には、前記方法は、以下の(1)〜(3)の工程を含む。
(1)被検植物からmRNAを抽出する工程
(2)前記mRNA又は前記mRNAから調製したcDNAと、本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程
(3)前記ハイブリダイゼーションを検出する工程
先行研究(非特許文献2)ではステビオール配糖体に対して配糖体活性が認められなかったと報告されているUGT73E1(AY345979)と相同性の高い遺伝子を得るために、下記のプライマーセット(配列番号3および4)でステビア葉から調製したcDNAを鋳型にPCRを行った。
ステビア葉cDNAについてはステビア葉からRNeasy Plant Miniキット(QIAGEN)を用いて総RNAを抽出し、そのうち0.5μgをRandom Oligo−dTプライマーで逆転写(RT)反応することによって得た。
CACC−NdeI−SrUGT73E1−Fw:
BamHI−SrUGT73E1−Rv:
PCR反応液(50μl)は、ステビア葉由来cDNA 1μ1、1×ExTaq buffer(TaKaRaBio)、0.2mM dNTPs、プライマー各0.4pmol/μl、ExTaq polymerase 2.5Uからなる組成とした。PCR反応は、94℃で3分間反応させた後、94℃で1分間、50℃で1分間、72℃で2分間の反応を計30サイクルの増幅を行った。PCR産物を0.8%アガロースゲルによる電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した結果、それぞれの鋳型DNAから推定された約1.5kbのサイズに増幅バンドが得られた。
このPCR産物はpENTR−TOPO Directionalベクター(Invitrogen)に製造業者が推奨する方法でサブクローニングした。DNA Sequencer model 3100(Applied Biosystems)を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって配列を決定した。
クローン化したcDNA(「UGT73E1ホモログプロテイン1」とする)の配列を解読した結果、報告のあるUGT73E1とはDNAレベルで98%の配列同一性(16塩基の違い)、アミノ酸レベルで98%配列同一性(8アミノ酸の違い)を示した(CDS配列:配列番号1、アミノ酸配列:2)。
プライマーに付加したNdeIおよびBamHIの制限酵素部位(配列番号3および4の下線部)を利用して約1.5kbのUGT73E1ホモログプロテイン1のORF断片を切り出し、大腸菌発現ベクターであるpET15b(Novagen社)のNdeIおよびBamHIサイトへ連結し、本酵素遺伝子の大腸菌発現ベクターを得た。本ベクターNdeIサイト上流にあるHisタグとUGT73E1ホモログプロテイン1遺伝子のオープンリーディングフレームが合っており、UGT73E1ホモログプロテイン1とHisタグの融合したキメラタンパク質が発現するよう設計した。
本酵素の生化学的な機能を明らかにするために、本酵素を大腸菌において発現させた。上記で得られたUGT73E1ホモログプロテイン1大腸菌発現用プラスミドを用い定法に従って大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。得られた形質転換体を、50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地(10g/l typtone pepton,5g/l yeastextract,1g/l NaCl)4mlにて、37℃で一晩振盪培養した。静止期に達した培養液4mlを同組成の培地80mlに接種し、37℃で振盪培養した。菌体濁度(OD600)がおよそ0.5に達した時点で終濃度0.5mMのIPTGを添加し、18℃で20hr振盪培養した。
以下のすべての操作は4℃で行った。培養した形質転換体を遠心分離(5,000×g,10min)にて集菌し、Buffer S[20mM HEPESバッファー(pH7.5),20mM imidazol,14mM β−メルカプトエタノール]1ml/g cellを添加して、懸濁した。続いて、超音波破砕(15sec×8回)を行い、遠心分離(15,000×g,15min)を行った。得られた上清を粗酵素液として回収した。粗酵素液をBuffer Sにて平衡化したHis SpinTrap(GE Healthcare)に負荷し、遠心(70×g,30sec)した。Bufferで洗浄後、100mMおよび500mMのimidazoleを含むBuffer S各5mlにて、カラムに結合したタンパク質を段階的に溶出した。各溶出画分をMicrocon YM−30(Amicon)を用いて20mM HEPESバッファー(pH7.5)、14mM β−メルカプトエタノールにバッファー置換した(透析倍率1000倍)。
SDS−PAGE分離後のCBB染色の結果、200mM imidazole溶出画分においてHisTag融合UGT73E1ホモログプロテイン1キメラタンパク質の推定分子量約50kDa付近にタンパク質を確認した(図3のアステリスク)。この画分を酵素解析に用いた。なお、図3においてパネルAはペレット画分、パネルBはイミダゾール溶液による溶出画分のCBB染色図を示す。
標準的な酵素反応条件は以下の通りである。反応液(2mM UDP−グルコース,0.1mM 糖受容体基質(ステビオール),100mM リン酸カリウムバッファー(pH7.0),精製UGT73E1ホモログプロテイン1酵素溶液25μl)を蒸留水で50μlに調製し、30℃、1時間反応させた。酵素反応液5μlを下記の条件でLC−MS分析を行った。
LC condition
カラム:Waters Sunfire C18 3.5um 2.0mm I.D.×20mm
移動相:A:MilliQ Water(+0.05% formic acid),B:MeCN
グラジエント:B濃度15%から55%への直線濃度勾配(20分間)
流速:毎分0.2ml
カラムオーブン:40℃
MS condition
ESI(negative mode)
Selected ion monitoring:m/z 317,479,641,687,803 and 849
一方、残りの2つのピークについては、MSクロマトグラムからコンパウンドY(Compound Y)はモノグルコシド、コンパウンドX(Compound X)はジグルコシドであることが判明した。コンパウンドYは標準品のステビオールモノシドとは保持時間が一致しなかったことから、ステビオールの19位のカルボキシル基がモノグルコシル化されたモノグルコシドと示唆された(図6)。また、コンパウンドXはステビオールのジグルコシドであるステビオールビオシドやルブソシドとは保持時間が一致しなかったことから、19位のカルボキシル基がグルコシル化されたものであることが強く示唆された(図6)。UGT73E1ホモログプロテイン1とUGT85C2を同時にステビオール(ピークA)と反応させた場合、コンパウンドYおよびコンパウンドXのピークは著しく減少した(図4:パネル2)。これは両酵素がステビオールを共通基質とする競合関係にあり、ステビオール(ピークA)がUGT85Cによって速やかにステビオールモノシド(ピークB)に変換されたことが原因と考えられる。
さらに、UGT73E1ホモログプロテイン1とルブソシド(ピークE)と反応により新たにステビオールのトリグルコシドと思われるコンパウンドZ(Compound Z)が生成された(図4:パネル3)。コンパウンドZはステビオールのトリグルコシドであるステビオシドおよびレバウディオシドB(ピークFおよびD)と保持時間が一致しなかったため、ルブソシドの19位のグルコースにさらにグルコシル化されたものであることが示唆された(図6)。
これらの結果から、UGT73E1ホモログプロテイン1はステビオールの13位水酸基をグルコシル化し、ステビオールモノシドを生成し、さらにその13位グルコースをグルコシル化し、ステビオールビオシドを生成し、さらにその19位カルボキシル基をグルコシル化し、ステビオシドを生成する。前述のようにステビオールモノシドの19位をグルコシル化してルブソシドを生成する活性が認められるが、ルブソシドとUGT73E1ホモログプロテイン1との反応液中に顕著なステビオシドのピークが認められないことから、UGT73E1ホモログプロテイン1の反応生成物のステビオシドはステビオールビオシド経由で生成していることが示唆される(図6)。
配列番号4:合成DNA
[配列表]
Claims (19)
- 以下の(a)〜(c)よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質。
(a)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号2のアミノ酸配列において、1〜7個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子を付加する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2のアミノ酸配列に対して、99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子を付加する活性を有するタンパク質
- 前記糖分子が、ヘキソースである、請求項1に記載のタンパク質。
- 前記糖分子が、グルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるものである、請求項1に記載のタンパク質。
- 前記化合物が、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド又はコンパウンドY
- 以下の(a)〜(d)よりなる群より選ばれるポリヌクレオチド。
(a)配列番号1の塩基配列を含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号2のアミノ酸配列において、1〜7個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2のアミノ酸配列に対して、99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
- 前記糖分子が、ヘキソースである、請求項5に記載のポリヌクレオチド。
- 前記糖分子が、グルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるものである、請求項5に記載のポリヌクレオチド。
- 前記化合物が、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド又はコンパウンドY
- 請求項5に記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
- 前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項9に記載の形質転換体。
- 植物体である、請求項9に記載の形質転換体。
- 請求項9に記載の形質転換体の抽出物。
- 請求項12に記載の抽出物を含む食品、医薬品又は工業原料。
- 請求項9に記載の非ヒト形質転換体を培養することを特徴とするタンパク質の製造方法であって、前記タンパク質が下記一般式(I)で示される化合物の13位の−OR1及び19位の−COOR2に糖分子を付加する活性を有する、方法。
- 請求項9に記載の非ヒト形質転換体を用いることを特徴とするステビオール配糖体の製造方法。
- 前記ステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、ルブソシド、コンパウンドX
- 請求項1に記載のタンパク質と、UDP−糖と、下記一般式(I)で示される化合物とを反応させる工程を含む、ステビオール配糖体の製造方法。
- 前記UDP−糖における糖が、グルコースである、請求項17に記載の方法。
- 前記ステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、ルブソシド、コンパウンドX
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