JPS62155096A - β−１，３−グリコシルステビオ−ル配糖体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はβ−１，３−グリコシルステビオール配糖体を
製造する方法に関し、さらに詳しくはステビオール配糖
体とβ−１，３−グルコシル糖化合物を含有させ良木溶
液又は懸濁液を固定化させ念β−１，３−グルコシル転
移酵素もしくは微生物に接触させることｔ”％徴とし光
β−１．３−グリコシルステビオール配糖体の製造法に
関する。

近年、人工甘味料であるサッカリン酸ナトリウム、サッ
カリン酸ナトリウム、ズルテン等が安全性の見地から一
般食品への使用禁止、あるいは使用制限されるようにな
り、一方では砂糖の摂りすぎによる健康上への悪影響が
問題とされるようになって〆ることなどから、これに代
わる天然甘味料の開発が熱望されている。このような状
況下において、ステビオシトは砂糖と違い低カロリー甘
味料であり、しかも甘味倍率が砂糖に比べ約３００倍と
高いことから、その需要は急速に高まりてきている。ス
テビオシトはキク科に属するステビア　レパウディアナ
　ベルトニー（５ｔｓｖｉａ　ｒｅｂａｕｄｉａｎａＢ
ＥＲＴＯＮＩ　）から抽出される甘味成分であシ、ステ
ビオールをアグリコンとするβ−グルコシル配糖体であ
る。ステビオシトは現在、飲食品の甘味性に使用されて
いるが、ステビオシトの甘味は、砂糖に比べると遅く現
われ、しかもそれが残味として長く残るという欠点以外
に苦味、嫌味が伴うなどの欠点も持っており、そのまま
では使用量、用途に限界があり、何らかの甘味質の改良
が必要であると言われている。

（従来の技術及びその問題点） ステビオサイドの甘味質の改良方法については、これま
での砂糖、ぶどう糖、果糖等の天然甘味料を加える方法
の他に、糖転移酵素によりステビオサイドにグルコース
あるいはガラクトースを付加し、糖転移ステビオサイド
誘導体を製造する方法が知られている。（特公昭５７−
１８７７９号公報、Ｂ＃開昭５８−９４３６７号公報、
％開昭５８−７８５６２号公報、特開昭５８−１４９６
９７号公報）この中でもとくに甘味質が良好とされてい
るレバウディオサイドＡは、ステビオールの水酸基に結
合したβ−グルコシＮ基にβ−１，３結合し友β−グル
コシルｉ’ｔ”有するβ−１，３モノグルコシルステビ
オサイドであることから、β−１，３−グリコシルステ
ビオール配糖体の製造は、従来にない良好な味質のステ
ビア甘味料が得られることよりその開発の意義は大きい
。しかしながら、これまでの方法は、特開昭５８−１４
９６９７号公報、特開昭５９−１７９＋？６号公報、％
開昭５９−１２００７３号公報、特開昭６０−３７９５
０号公報で示されているこのいずれも微生物一体より得
られる可溶性酵素を、ステビオール配糖体とβ−１，３
グルコシル糖化合物の含有し沈水溶液又は水懸濁液に作
用させて、β−１，３グリコジルステビオ一ル配糖体を
生成させるものであった。

しかしながらこれらの方法では、酵素の回収は不可能で
あり、甘味料への精製工程でタンノ母りを除く必要がお
りまた連続生産システムは望めない。

（問題点を解決する為の手段） そこで本発明者らは、上記の問題を解決すべく。

β−１，３グルコシルステビオ一ル配糖体の効率のよい
連続生産方法について鋭意研究を重ねた結果。

使用すべきβ−１，３グルコシル転移酵素及び／又は微
生物を例えば天然又は合成高分子ｒル等の担体に包括法
又はイオン結合法により固定化することにより、ステビ
オール配糖体とβ−１，３グルコシル糠化合物を含有し
た水溶液もしくは水懸濁液を接触せしめると、連続して
β−１，３グリコジルステビオ一ル配糖体を得ることが
でき、しかも酵素の回収が容易に行なわれるので、生産
物の精製工程が簡便であることを見い出し、本発明を完
成するに至っ几。

即ち、本発明は、ステビオール配糖体とβ−１，３−グ
ルコシル糖化合物とを含有する水溶液又は水懸濁液にβ
−１，３−グルコシル転移活性を有する酵素及び／又は
微生物を作用させるに際し、β−１，３−グルコシル転
移活性を有する酵素及び／又は微生物が担体に固定化さ
れていることを特徴とスルβ−１，３−グルコシルステ
ビオール配糖体の製造法を提供する。

（発明の構成） 本発明の方法において基質として用いられるステビオー
ル配糖体とは、下記式 式中Ｒ，＝／’ルコース又ｉ）（、Ｒ２＝グルコース、
ラムノース又はＨで示されるステビオール骨格を有する
配糖体を総称するものであり、例えば、ステビオサイド
、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＣ，レバ
ウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、ズルコサイ
ド人もしくはこれらの糖の一部が加水分解を受は念もの
例えば、ルプソサイド、ステビオールモノサイド、ステ
ビオールバイオサイド等が包含され、これらはそれぞれ
単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。

これらステビオール配糖体は必ずしも高度に精製され友
形で用いる必要はなく、他の夾雑物を含有している粗製
品であっても、又ステビア等抽出液そのものでありて屯
、本発明の甘味料を製造することができる。

本発明に用いるβ−１，３グルコ女シル糖化合物とは、
同時に用いるβ−１，３グルコシル転移活性を有する酵
素、あるいはそれらを生産する微生物によってステビオ
ール配糖体からβ−１，３グルコシルステビオ一ル配糖
体を生成するものであればよい。現在容易に入手できる
ものとしてカードランやラミナリンがある。

好適なものとしてはカードランやラミナリンが挙けられ
、これらは入手し易い点からも好ましい。

尚、カードランとはβ−１，３グルコシド結合を主体と
する水不溶性のβ−グルカンであり、その懸濁液を加熱
するとか友い弾力性のある熱不可逆性のグルをつくる多
砧類の総称である。このものは現在のところ微生物によ
ってつくられたものが市販されている（　Ａｇｒ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２９　、７５７．’６５又は発酵
と工業廷、　２．　’７８参照）。

β−１，３グルコシル転枠活性を有する酵素は、β−１
，３グルカナーゼとしてのラミナリナーゼ（Ｅ、Ｃ，３
，２，１・６）、チモリエース（商品名、生化学工業社
製）、セルラーゼ製剤としてのトリラーゼ（商品名、協
和発酵社製）などが挙げられる。

ま念、本発明に用いられる微生物としては、β−１，３
グルコシル転移活性を有するものであれば良く、カビ、
放線菌、細菌、酵母菌、担子菌のうち、トリコデルマ属
、リゾパス域、カエトミウム属、ミリオコキューム属、
サーモミセス属、アスペルギルス属、ペニシリウム楓、
ミロセシューム属、ムコール属、スポロトリキューム属
、スクレロチニア属、リゾクトニア属、スクレロチウム
属。

ペリキュラリア属等に属する各種のカビ類及びストレプ
トマイセス属、ミクロポリスポラ属、オオスコピア属等
に属する各種の放線菌類、及び・々シルス属、グレピパ
クテリウム属、アースロノ々クター属、フラデパクテリ
ウム属等に属する各種の細菌類、及びシゾサツカロミセ
ス属の酵母、及びトラメテス属、イルイクス属、コプリ
ナス属等に属する各種の担子菌類が挙げられる。とくに
ノ９シルス属、イルイクス属、アースロパクター属、ス
トレプトマイセス属等に属するものが優れている。

本発明に用いうる微生物の広範な分布は第−表に示した
結果に見られる如くである。

本発明で使用される微生物菌体は上記に示し九棟に限定
されるものでなく、これらの菌株を親株として放射線や
紫外線、あるいはニトロソグアニジン等の変異誘発剤な
どで処理して得られる突然変異株を用いることも可能で
ある。

本発明によると、ラミナリナーゼやドリセラーゼ等の酵
素、あるいは上記微生物菌体より得られるβ−１，３グ
ルコシル転移酵素もしくは菌体を包括もしくはイオン結
合によ）固定化し、ステビオール配糖体をβ−１，３グ
リコジルステビオ一ル配糖体に変換させるのであるから
、これら一連の酵素反応に悪影響を及ぼさず、β−１，
３グリコシルステビオール配糖体の製造過程で崩壊しな
い程度の機械的強度をもつ天然又は合成の高分子物が適
している。そのような高分子物質としては、例えばポリ
アクリルアミド、ポリスチレン、ポリブタジェン、ポリ
ウレタン、Ｉリエチレングリコール、ポリプロピレング
リコールなどの包括用合成高分子物質や、ＤＥＡＥ−セ
ルロース、ＤＥＡＥ−セファデックス、セファロジル、
ト蚕ヨナパール、セルロファインなどのイオン結合用高
分子物質及び、アルギン酸、コラーゲン、セルロース、
Ｋ−カラギーナン、寒天などの天然高分子物質を挙げる
ことができる。

中でも、包括法ではポリアクリルアミド、アルギン酸が
特に適しておシ、イオン結合法ではＤＥＡＥ−セファデ
ックス、トヨパール等が特に適している。かかる高分子
物質への前記酵素の固定化は、包括法では、一連の酵素
反応に悪影響を与えない限り、一般に緩和な条件下に、
それ自体公知の任意の方法によって行なうことができる
。

例えば、適当な緩衝液に溶解させた酵素と上記天然高分
子体、例えば、アルイン酸ナトリウム、Ｋ−カラギーナ
／、コラーゲン等の水溶液を、冷却させるか、もしくは
カルシウムイオン、カリウムイオン、アルミニウムイオ
ン、鉄イオン、等の金属イオンを適当な濃度で含む冷却
水溶液に滴下することによシグル化し、そのダル内に酵
素を固定化する方法Ｂｉｏｔｅｃｈ　＆　Ｂｉｏａｎｇ
、Ｖｏｔ、ＸＸ［Ｐ　１６９７（’７９）、酵素を溶解
させた合成高分子の水溶液に、近紫外線や紫外線、Ｘ線
を照射することによシ固定化する方法（４９開昭５２−
１１０８８９号公報）、あるいは半透膜性のポリマーの
皮膜によシ酵素をカプセル化して固定化する方法（工業
化学雑誌、７２、４９３（’６９））等があげられるが
、これらはほんのヤ例にすぎない。またイオン結合法も
包括法と同様に、公知の任意の方法によって行うことが
できる。

例えば、適当な緩衝液に懸濁させた市販のイオン交換樹
脂、（例えばＤＥＡＥセファデックス、　ＤＥＡＥ−セ
ルロース、セファロジル（いずれもファルマシア社製）
、及びトヨノ！−ル（東洋ソーダ社製））中に酵素溶液
を加えてよく攪拌し、その後、プ７ナー上に樹脂を集め
、適当な緩衝液にてよく洗浄することによシ、目的酵素
を固定化する方法、又はイオン交換樹脂をカラムに充て
んさせた状態で、酵素溶液をチャージさせ、目的とする
酵素をイオン結合させて固定化する方法（Ｅｎｚ）＋ｍ
ｏｌｏｇｉｍ、　３１　。

２１４　（’６６）　）等があげられるが、これらもほ
んの＋側に過ぎない。要は、ステビオール配糖体をβ−
１，３グリコジルステビオ一ル配糖体に糖転移させるβ
−１，３グルコシル転移酵素反応に悪影響を及ぼさない
イオン結合法であれば任意に用いることができる。

酵素を包括固定化した場合は、一般にピース状、タブレ
ット状、立方体状、フィルム状等の形状に成型した後使
用に供される。

このようにして包括、もしくはイオン結合されたβ−１
，３グリコジル転移酵素又は微生物は担体乾物当シ、約
０．００１〜５０　ｖｒ／ｗ　％の範囲に及ぶ。

次に、本発明による固定化酵素をその基質溶液に接触せ
しめる方法は、約０．１〜約１０重量％のステビオール
配糖体と約０．１〜約３０ｉ量チのβ−１，３グルコシ
ル糖化合物を含有した水溶液又は水懸濁液を、通常ＰＨ
３〜１０．温度２０〜７０℃の範囲よシ選ばれる条件で
、約０．１〜１０００時間接触させて反応を行う方法が
採用される。使用形式はパッチ式でもいいし、もちろん
、充てんカラムによる連続式も任意に行いうるが、この
場合、β−１，３グルコシル糖化合物はあらかじめ加水
分解によシ水溶性にした方がよシ効果的であることは言
うまでもない。β−１，３−グルコシル糖化合物より、
水溶性ラミナリオリゴ糖を得る有力な手法としては、ラ
ミナリペンタオースを生成する酵素により製造する方法
を既に％願昭５９−２１２７１６号として出願済である
。こうした糖の使用も有用である。

このようにしてβ−１，３グリコジルステビオ一ル配糖
体を生成せしめた反応溶液は、そのままでも甘味料とし
て使用できる。また、スチレンとジビニルベンゼンの重
合吸着樹脂例えばダイヤイオンＨＰ−２０４（商品名、
三菱化成社製）アンバーライトＸＡＤ　−２（商品名、
オルガノ社製品）等、又はイオン交換樹脂（例えばＨ型
強酸性イオン交換樹脂およびＯＨ型弱塩基性イオン交換
樹脂）を用いて脱塩し、これを濃縮してシラツブ状の甘
味料とするか、又は乾燥、粉末化して粉末状の甘味料と
することもできる。

更に脱塩した反応溶液を精製してβ−１，３グリコジル
ステビオ一ル配糖体を分離採取して甘味料とすることも
できる。この際、濃縮、乾燥、粉末化は公知の方法、例
えば減圧濃縮、膜濃縮、真空乾燥、噴霧乾燥等の各種の
方法が自由に用いられる。このようにして得られたβ−
１，３グリコジルステビオ一ル配糖体の甘味度は、甘味
度の測定条件によっても異なるが一般には、反応に用い
たステビオール配糖体の固型物重量に見合う甘味度よシ
わずかに弱い程度である。またその甘味の質は、苦味や
渋味等の嫌味がなく、まろやかな甘味であって砂糖に似
ておシ、残米の切れもよい。

このβ−１，３グリコジルステビオ一ル配糖体は、苦味
、嫌味、アク味等が全くない無臭、白色の粉末で水に可
溶であるためステビオサイド及びグリチルリチンの共存
比率、又液体、粉末状の条件下で任意に共存させること
ができる。また、β−１，３グリコジルステビオ一ル配
糖体は、サッカリン及びその塩類、サイクラミン酸ナト
リウム、ジヒドロカルコン、アスパラテーム等の周知の
合成甘味物質と共用してその呈味特性を有効利用するこ
とが可能であシ、これらの合成甘味物質の１種又は２種
以上に本化合物を添加使用すれば、合成甘味物質特有の
苦味、嫌味等の不快味を改良することが可能となる。

またβ−１，３グリコジルステビオ一ル配糖体を賦形剤
、稀釈剤、吸着剤的に使用されている砂糖、果糖、ブド
ウ糖、乳糖、水飴、デキストリン、デンプン等の周知の
糖類甘味に添加使用することによシ、甘味が増強され、
従来の使用量よシも、大幅にその使用量を削減すること
が可能となる。更に本化合物をソルビット、マルチトー
ル、マンニトール、キシＩＪ　）−ル等の砂糖よシも甘
味度が低い低カロリー甘味物質に添加使用すれば甘味物
質の長所を損うことなく甘味を増強することが出来、良
質の低カロリー甘味料が得られる。

β−１，３グリコジルステビオ一ル配糖体はこの様に一
般食品及びダイエツト食品、医薬、医薬部外品、煙草、
飼料等の甘味源として使用できることはいうまでもない
。

例えば、しょう油、粉末しょう油、みそ、粉末みそ、も
ろみ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末
すし酢、中華の素、天つゆ、めんつゆ、ソース、ケチャ
ツプ、焼肉のタレ、カレールー、シチューの素、スープ
の素、ダシの素、複合調味料、みシん、新みシん、テー
ブルシラツブ等の各種の調味料、せんべい、あられ、シ
こし、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊かん、
永年かん、ゼリー、カステラ、飴等の各種和菓子、パン
、ビスケット、クラッカー、クツキー、ノ々イ、プリン
、パタークリーム、カスタードクリーム、シュークリー
ム、ワツフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレー
ト、チューイングガム、キャラメル、キャンデー等の各
種洋菓子、アイスクリーム、シャーベット、アイスキャ
ンデー等の氷菓、果実のシロップ漬、水密等のシロップ
類、フラワーイースト、ビーナツツペースト、フルーツ
ペースト等ノヘース）［、ジャム、マーマレード、シロ
ップ漬、糖菓などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、
千枚漬、らっきょう漬等の漬物類、ハム、ソーセージ等
の畜肉製品類、食肉ハム、魚肉ソーセージ、カマがコ、
チクワ、天ぷら等の魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、さき
するめ、ふぐのみシん干等の各種珍味類、のシ、山菜、
するめ、小魚、貝等で製造されるつくだ煮類、煮豆、ポ
テトサラダ、コンブ巻等のそう菜食品、魚肉、畜肉、果
実、野菜のビン詰、缶詰類、合成酒、果実酒、洋酒等の
酒類、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲
料、乳酸菌飲料等の清涼飲料水、プリンミックス、ホッ
トケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席
しるこ等即席飲食品等の各種飲食物、嗜好物の甘味性に
使用できる。その他、医薬品及び医薬外品としては線画
みがき、口紅、リップクリーム、内服薬、トローチ、肝
油ドロツブ、口中清涼剤、口中香錠、うがい薬等への甘
味剤として使用することも自由に行いうる。

以下に、本発明の方法およびそれによって得られる甘味
料について実施例によシ具体的に説明するが、以下の係
は重量基準とする。

実施例１ （１）　　β−１，３グルコシル転移酵素の調整酵母エ
キス０．２チ、ポリベグトン０．２チ、Ｍｇ５Ｏ４・７
Ｈ２００，１％　、　Ｋ２ＨＰＯ４０，２％　、グルコ
−ス０．５　Ｔ。

ＣＮ３．０）（Ｄ組成からな；ｂ培ｍ４．ｏｌｔ１０１
容ジャーファメンターに仕込み、滅菌後、８ｏＩＩのカ
ードランを無菌的に加え念。これにストレプトマイセス
・エスピーＦＥＢＭＰ−６５９３を植菌し、３７℃で４
０時間、通気攪拌培養を行った。

この培養液を遠心分離した上清にはβ−１，３グルコシ
ル転移酵素を含有しており、その酵素活性は約３．８０
０単位であっ之っ なお、ここでいう活性１単位とは、ｐＨ７，０，０，１
Ｍのリン酸緩衝液中で１％のカーＰランを基質として４
５“Ｃで反応させ友とき、１時間に１ダのグルコースに
相当する還元力を生成させるのに必要な酵素（蛋白）ｔ
である。

この上清を４℃に冷却し、これに硫安を・６０チ飽和に
なるように加えて塩析し、沈殿を遠心分離にて集めた。

これを少量の水に溶解し、−夜透析した後、凍結乾燥し
て粉末の粗酵素標品（約５，９００単位）を得た。

（２）　　β−１，３グルコシル転移酵素の固定化実施
例１の（１）で得几粗酵素１７０１９を５ｍＭのリン酸
緩衝液（ＰＩ−１７，０）３５ｍＪで溶解し、同緩衝液
にて平衡化したＤＥＡＥセファデックスＡ−２５（ファ
ルマシア社製）３０１ＷＡ！にチャージさせた。その後
約５００ｍの同緩衝液にて洗浄して得られたものを固定
化酵素とした。

（３）固定化β−１，３グルコシル転移酵素によるβ−
１，３グルコシルステビオ一ル配糖体の製造ステビア組
成物（ステビオサイド５７チ、レバウディオサイドＡＩ
６％、レバウディオサイドＣ８チ、ズルコサイドＡ３％
、レバウディオサイドＤｉ％、レバウディオサイドＥ　
０．７　％を含有）０．５１１．カードランを加水分解
して得られ几水溶性うミナリオリゴ糖（グルコース重合
度３〜１１を含む）２．０．９を溶解させた水溶液１０
０ｄ中に、実施例１の（２）で得られ几固定化β−１．
３グルコシル転移酵素２０Ｒ１を加え、４５℃で４８時
時間中かに攪拌しながら反応させた。

反応終了後メンブランフィルタ−にて無菌的に口過し几
。口過液は合成吸着樹脂ダイヤイオンＨＰ　−７０（Ｆ
Ｆａ　品名、　三’Ｉｔ　化成社製）　Ｋ　Ｓ、Ｖ、＝
２　テ通し、ステビオール配糖体を吸着させた後、９５
チエタノールで脱着した。脱着液のエタノールを減圧留
去した後、強酸性イオン交換樹脂であるアンバーライト
ＩＲ−１２０Ｂ（Ｈ型、商品名、ローム・アンドハース
社製品）、弱塩基性イオン交換樹脂であるアンバーライ
）　ＩＲＡ−９３（ＯＩ（ｎ、商品名、ロームアンドハ
ース社製品）にＳ、Ｖ、＝２で通して脱塩した。ついで
、これを７０℃以下で減圧濃縮し、真空乾燥して粉末の
β−１，３グルコシルステビオ一ル配糖体含有物’ｔｏ
、６８＃得九。このものの組成物ｉ　ＨＰＬＣにて分析
したところ、ステビオサイド１８チ、レバウディオサイ
ドＡ８％、レバウディオサイドＣ２％、グルコサイドＡ
０．２％。

レバウディオサイドＤ及びレバウディオサイドＥは０．
１％以下で残り５７チはβ−１，３グルコシルステビオ
一ル配糖体であり念。

実施例２ 実施例１の（２）で得られ几固定化酵素３０４をカラム
に充填し、これに実施例１の（３）で用いたと全く同様
の組成の基質溶液を流速１８〜２０　ｍｌ／　ｈｒで通
過させ、同時にカラムを４０℃に加温して反応させた。

反応液を実施例１と全く同様の操作にて精製したところ
、用いたステビオール配糖体に対し６８チの収率でβ−
１，３グルコシルステビオ一ル配機体が得られ友。

実施例３ 実施例２において調製した固定化カラムに、再び実施例
１の（３）で用い友と全く同様の組成の基質を流し続は
九ところ、延べ２０日間の連続反応においテモβ−１．
３グルコシルステビオール配糖体の収率は約５４〜５７
チと低下せず、又その間酵素の失活及び離脱は全く認め
られなかっ几。

実施例４ ラミナリナーゼ０．５１１−５　ｍＭのリン酸緩衝液（
ｐＨ６，０）５００ｍｌに溶解サセ、ｌ［衝ｉＫて平衡
化し几トヨｔ４−ル６５０８（東洋ソーダ社製品）３０
ゴにチャージさせ九。その後、約５００−の同緩衝液に
て洗浄し、トヨパール固定化ラミナリナーゼを調製した
。

この固定化酵素を用いて、実施例２と全く同様の方法に
て反応させ九ところ、β−１，３グルコシルステビオ一
ル配糖体の収率は５３％であった。

緩衝液（ｐＨ５，０）６ゴＩｃ浴解し、あらかじめ５０
℃に加温しておく。次いで０．４１のアルギン酸ソーダ
を１４威の同緩衝液に加えて５０℃で加温しながら溶解
させ、これが溶解した時点で酵素液と混合させる。混合
液は注射器につめて、冷却した０、３Ｍ塩化カルシウム
液中に滴下させ、直径約３〜４ｍのビーズ状のグルを調
製した。

このグルを滅菌水で充分洗浄した後、実施例２と全く同
様の方法にて反応させ友ところ、β−１，３グルコシル
ステビオ一ル配糖体が６５チの収率で得られた。

実施例６ チモリエース５０００（商品名、生化学工業製）５０ダ
を８４の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解さ
せた。次いでこの液にポリアクリルアミド０．６＃お工
びＮ’、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミ）１１０、０
２　ｇを溶解させ友。これに過硫酸アンモニウム２．５
ｗ％液１ｍＪ　、　Ｎ、Ｎ、Ｎ、’Ｎ’Ｎチーラメチレ
ンシアミン（ＴＥＭＥＤ　）　５　Ｗチ液１ｄを加えた
後、混合溶液の表面に薄い蒸留水の層をつくり、室温に
て１時間放置した。こうして得られたグルはサイコロ状
に切断後、蒸留水約２０９ｍにて洗浄した。

こうして得られ几固定化酵素を用い、実施例２と全く同
様の方法にて反応させ念ところ、β−１，３グルコシル
ステビオ一ル配糖体が４８チの収率で得られた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ステビオール配糖体とβ−１，３−グルコシル糖化
   合物とを含有する水溶液又は水懸濁液にβ−１，３−グ
   ルコシル転移活性を有する酵素及び／又は微生物を作用
   させるに際し、β−１，３−グルコシル転移活性を有す
   る酵素及び／又は微生物が担体に固定化されていること
   を特徴とするβ−１，３−グリコシルステビオール配糖
   体の製造法。 ２、酵素及び／又は微生物を担体に固定化する方法が、
   包括法もしくはイオン結合法であることを特徴とした特
   許請求の範囲第１項記載のβ−１，３−グリコシルステ
   ビオール配糖体の製造法。 ３、該ステビオール配糖体がステビオサイド、レバウデ
   ィオサイドＡ、レバウデオサイドＣ、ズルコサイドＡ、
   レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥであるこ
   とを特徴とする 特許請求の範囲第１項記載の製造法。