KR100458486B1

KR100458486B1 - 말토올리고실투라노오스와말토올리고실파라티노오스를함유한당조성물,그제조방법및용도

Info

Publication number: KR100458486B1
Application number: KR1019970007145A
Authority: KR
Inventors: 하지메 이가; 다카시 시부야; 시게하루 후쿠다; 도시오 미야케
Original assignee: 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
Priority date: 1996-03-04
Filing date: 1997-03-04
Publication date: 2005-04-06
Also published as: DE69730766T2; JP3778991B2; EP0794258B1; EP0794258A2; KR970065726A; US5863771A; EP0794258A3; DE69730766D1; JPH09294594A; EP0794258B9

Abstract

비환원성 당질생성 효소를 말토올리고실수크로오스 함유의 수용액에 작용시킴으로써 말토올리고실수크로오스로부터 용이하게 비교적 고수율로 생성, 분리 및 정제되는 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 함유하는 당 조성물.

이들 당류는 온화하고 고품질의 감미를 가진 환원성 올리고당이며 경구 및 비경구 투여할 수 있고 생체에서 용이하게 대사되고 이용된다.

Description

말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 함유한 당 조성물, 그 제조방법 및 용도

본 발명은 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 함유한 당 조성물, 그 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 함유한 당 조성물, 비환원성 당질생성 효소를 말토올리고실수크로오스에 작용시키는 단계를 포함하는 당 조성물의 제조방법 및 이 당 조성물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

투라노오스와 팔라티노오스는 글루코오스와 프룩토오스로 구성되어 있으며 3-0-α-D-글루코피라노실-D-프룩토오스와 6-0-α-D-글루코피라노실-D-프룩토오스의 화학구조를 각각 가진 환원성 2당류이다.

일본국 특허공개 제252,974/93호에 개시된 바와 같이 시클로말토덱스트린 글루카노트란스페라아제를 전분물질과 프룩토오스를 함유한 수용액에 작용시켜 투라노오스를 제조하는 것은 공지되어 있다. 팔라티노오스는 문헌[Seito-Gijutsu-Kenkyu-Kaishi, No.34, pp.37～44 (1985)]에 기재된 바와 같이 프로타미노박터 루브룸(Protaminobacter rubrum) 종의 균주 유래의 α-글루코시다아제를 사용하여 수크로오스로부터 제조하는 것이 공지되어 있다. 이들 당류는 (가) 비교적 저감미도이고 충치유발이 거의 없으며, (나) 식품의 감미부여 재료로서의 사용이 기대되고, (다) 쉽사리 결정되며, (라) 고농도의 시럽으로의 제조가 용이하지 않고, (마) 팥잼, 단맛의 팥 젤리 등의 고감미부여 식품에 사용할 경우라도 결정화가 되지 않도록 처리나 취급에 주의해야 한다는 것이 알려져 있다. 분자량이 많고, 양호한 점도 조절성, 습도 조절성 및 바람직한 감미를 가진 비결정질 올리고당의 개발이 크게 요망되고 있다.

본 발명은 말토올리고실수크로오스로부터 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 비교적 고수율로 공업적 생산규모로 용이하게 제조할 수 있는 방법과, 이 방법으로 제조되는 이들 당류를 함유하는 당 조성물 및 그 용도를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스의 제조 방법에 대해 예의 연구를 한 결과, 본 발명자들이 출원한 일본국 특허공개 제 143,876/95호에 개시된 비환원성 당질생성 효소 또는 말토올리고실트레할로오스 생성 효소가 말토올리고사카라이드를 말토올리고실트레할로오스로 변환시키며 말토올리고실수크로오스로부터 비결정질의 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 고수율로 용이하게 산생함을 뜻밖에 발견하여, (가) 말토올리고실수크로오스를 함유하는 용액에 이 효소를 작용시킴을 특징으로 하는 이들 당류를 함유한 당 조성물의 제조방법, (나) 이 제조방법으로 제조된 당 조성물, 및 (다) 이 당 조성물을 함유하는 음식물, 화장품 또는 의약품 등의 조성물을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

일본국 특허공개 제143,876/95호에 개시된 바와 같이 본 발명에서 사용되는 비환원성 당질생성 효소는 리조븀(Rhizobium) sp. M-11(FERM BP-4130), 아르드로박터(Arthrobacter) sp. Q36(FERM BP-4316), 브레비박테륨 헬볼룸(Brevibacterium helvolum)(ATCC 11822), 플라보박테륨 아쿠아틸레(Flavobacterium aquatile)(IFO 3772), 마이크로코커스 로제우스(Micrococcus roseus)(ATCC 186), 쿠르토박테륨 시트레움(Curtobacterium citreum)(IFO 15231), 마이코박테륨 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)(ATCC 19420), 테라박터 투메스센스(Terrabacter tumescens)(IFO 12960) 및 일본국 특허출원 제166,011/94호에 개시된 술폴로부스속(Sulfolobus genus)에 속하는 기타 미생물 유래의 것이다.

이들 효소는 말토올리고사카라이드를 변환 또는 전위시켜 말토올리고실트레할로오스를 생성하는 분자내 당 전이 효소이다. 이들 효소의 평형점은 말토올리고실트레할로오스를 생성하는 쪽으로 주로 치우쳐 있다. 예컨대 이들 효소는 기질인 말토펜타오스로부터 말토트리오실트레할로오스를 고형물 기준으로 최소한 약 90w/w%(본 발명에서 별달리 명시 않는한 " 고형물 기준으로 w/w%"라는 용어를 이하 간단히 " %" 로 표기함)의 수율로 생성한다.

상기한 효소외에 본 발명에서 사용되는 기타의 효소는 리조븀, 아드로박터, 브레비박테륨, 플라보박테륨, 마이크로코커스, 쿠르토박테륨, 마이코박테륨, 테라박터 및 술플로부스속에 속하는 미생물 유래의 것들과 소요의 효소를 산생할 수 있는 이들의 변이체 유래의 것들인데, 효소를 코우드하는 유전자를 도입하는 형질변환된 미생물 유래의 것들도 선택적으로 사용할 수 있다.

예컨대 술폴로부스 아시도칼라다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)(ATCC 33909 및 49426) 및 술폴로부스 솔파타리커스(Sulfolobus solfataricus)(ATCC 35091 및 35092)의 균주 등의 술폴로부스속의 미생물을 유리하게 사용할 수 있다.

미생물이 생육하여 소요의 효소를 산생할 수 있는 합성 및 천연 영양배지이면 어느것이라도 상기한 미생물을 배양하는데 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 탄소원으로는 미생물이 흡수할 수 있는 것들을 포함한다. 예컨대 글루코오스, 프룩토오스, 당밀, 트레할로오스, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨 및 전분 부분 분해물 등의 당류와, 시트르산, 숙실산 등의 유기산과 이들의 염을 사용할 수 있다. 이들 탄소원의 농도는 그 종류에 따라 적절히 선택된다. 예컨대 글루코오스를 탄소원으로 사용할 경우에 있어서 미생물의 생육과 증식을 고려하여 바람직한 농도는 40w/v% 이하이고, 특히 10w/v% 이하의 농도가 보다 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 질소원은 예컨대 암모늄염, 질산염 등의 무기 질소함유 화합물과 우레아, 코온 스티프 리커, 카제인, 펩톤, 효모 엑스, 육 엑스 등의 유기 질소함유 화합물이 있다. 본 발명에서 사용되는 무기 성분의 예로서는 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 인산, 망간, 아연, 철, 구리, 몰리브덴 및 코발트 등의 염이다.

미생물이 생육하여 본 발명에서 사용되는 비환원성 당질생성 효소를 산생할 수 있는한 어떠한 배양조건이라도 본 발명에서 사용할 수 있다. 통상적으로 약 4∼80℃, 바람직하게는 20∼75℃의 온도 및 5∼9의 pH, 바람직하게는 6∼8.5의 pH에서 미생물을 호기적으로 배양한다. 미생물이 증식할 수 있는 한 어떠한 배양 시간이라도 본 발명에서 이용할 수 있는데, 바람직하게는 약 10∼100시간 정도이다. 영양배지의 용존(溶存) 산소(DO)의 농도는 특히 한정되지 않으나 통상적으로 영양배지의 통기속도, 교반속도를 조절하고 배지에 대한 산소의 공급속도를 조절하거나 발효조의 내압을 증가시킴으로써 통상적으로 DO를 약 0.5∼20ppm으로 설정한다. 배양을 뱃치식(batchwise) 또는 연속식으로 실시할 수 있다.

배양종료후 수득한 배양물로부터 소요의 비환원성 당질생성 효소를 채취한다. 효소활성은 균체와 균체 무함유 배양물 양쪽에서 발견되므로 여기서 조효소(crude enzyme)를 얻을 수 있다. 미정제 배양물을 그대로 조효소로 사용할 수도 있다. 종래의 고액(固液)분리법을 이용하여 영양배지와 균체를 분리한다. 예컨대 배양물을 직접 분리하는 원심분리법, 배양물에 여과조제를 프리코우트하거나 첨가하는 여과분리법 및 평필터 또는 중공사(hollow fiber) 등의 멤브레인 필터(membrane filter)를 사용하는 분리법을 선택하여 사용한다. 균체 무함유 배양물을 조효소로 사용할 수 있는데, 보다 바람직하게는 이들을 종래방법으로 농축하여 사용한다. 예컨대 황산 암모늄을 사용하는 염석법, 아세톤과 알코올을 사용하는 침전법 및 평필터, 중공사 등의 멤브레인을 사용하는 농축법을 이용하여 균체 무함유 배양물을 농축한다.

균체로부터 종래방법으로 균체내 효소를 추출하여 조효소를 얻을 수 있다. 예컨대 초음파를 사용하는 파쇄법, 유리 비이드와 알루미나를 사용하는 기계적 파쇄법 및 프렌치 프레스를 사용하는 기타의 파쇄법에 의해 균체로부터 이러한 조효소를 추출할 수 있다. 추출물을 원심분리하거나 멤브레인 여과하여 투명한 조효소액을 얻는다.

균체 무함유 배양물, 그 농축액 및 균체 추출물을 종래방법으로 고정화한다. 예컨대 이온교환 수지에의 결합법, 수지 및 멤브레인에의 공유결합 및 흡착법 및 고분자량 물질을 사용하는 포접법을 이용하여 고정화한다. 미생물 배양액으로부터 분리된 균체를 조효소로 사용할 수 있으며, 균체를 고정화하여 고정화 효소로서 사용할 수도 있다. 예컨대 균체를 알긴산 나트륨과 혼합하고, 이 혼합물을 염화 칼슘용액에 적하하여 겔화된 과립을 형성한 다음, 폴리에틸렌이민과 글루타르알데히드로 처리하여 고정화 효소를 생성시킨다.

수득한 조효소를 그대로 사용하거나 종래방법으로 정제한후 사용한다. 예컨대 파쇄된 균체의 추출물을 황산 암모늄을 사용하여 염석함으로써 조효소 농축물을 얻어 이것을 "SEPABEADS FP-DA13"을 사용하는 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, "DEAE-SEPHADEX A-50"을 사용하는 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, "ULTROGEL AcA44"을 사용하는 겔여과 칼럼 크로마토그래피 및 "BUTYL TOYOPEARL 650M"을 사용하는 소수 크로마토그래피중의 2종 이상의 방법으로 투석, 정제함으로써 전기영동적으로 단일 단백질 밴드를 가진 정제효소를 제조할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 비환원성 당질생성 효소의 활성을 측정하는 방법은 다음과 같다. 즉, 50mM 인산 완충액(pH 7.0)중에 용해시킨 기질로서의 1.25w/v% 말토펜타오스 4ml에 효소액 1ml을 가하고, 이 혼합물을 40℃에서 60분간 반응시킨 후 반응 혼합물을 100℃에서 10분간 가열하여 효소반응을 정지시킨 다음, 이 혼합물을 탈염수로 정확히 10배 희석하여 소모기-넬슨법(Somogyi-Nelson' s method)으로 희석액의 환원력을 측정한다. 대조로서 100℃에서 10분간 가열하여 효소를 실활시켜둔 효소액에 대해서도 위와 마찬가지로 측정한다. 효소활성 1단위는 상기한 방법으로 측정했을 경우 1분당 말토펜타오스 1 마이크로몰의 환원력을 감소시키는 효소량으로 정의된다. 술폴로부스속 미생물 유래의 비환원성 당질생성 효소의 경우에 있어서 60℃ 및 pH 5.5에서 효소를 반응시킨 다음 100℃에서 30분간 가열하여 실활시킨다.

본 발명에서 사용되는 기질 농도는 특히 한정되지 않는데, 예컨대 본 발명의 효소반응은 기질인 0.1% 또는 50% 말토올리고실수크로오스 함유의 용액에서도 진행하여 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 생성한다. 이 효소반응은 불완전하게 용해된 기질을 함유하는 고농도 용액에서도 진행한다. 이 효소반응에 사용되는 반응온도는 효소를 실활하지 않는 온도범위, 즉 약 80℃ 이하, 바람직하게는 약 0∼70℃이다. 특히 아르드로박터속 미생물 유래의 효소에 대해서 약 30∼50℃의 온도를 사용하면 말토올리고실수크로오스로부터 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 효과적으로 생성한다. 이 효소반응에 사용되는 반응 pH는 통상적으로 5.5∼9.0의 pH, 바람직하게는 약 6.0∼8.5의 pH로 설정한다. 이 효소반응에 사용되는 반응시간은 효소반응속도에 따라 적절히 조절하는데, 통상적으로 고형물당 기질 1g에 대해 효소를 약 10∼1,000단위의 양으로 사용할 경우 약 0.1∼200시간이다.

이렇게 하여 수득한 반응 혼합물중에는 당 조성으로서 대해 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 합계량으로 고형물당 10% 이상, 바람직하게는 15% 이상, 보다 바람직하게는 60% 이상을 함유한다.

이 반응 혼합물을 종래의 여과법 및 원심분리법으로 처리하여 불순물을 제거하고, 활성탄으로 탈색하여 H형 및 OH형 이온교환 수지로 발염한후 농축하여 시럽상 제품을 얻고, 필요에 따라 더 건조하여 분말상 제품을 얻는다.

필요한 경우, 이들 시럽상 제품과 분말상 제품을 고도의 정제법으로 처리한다. 예컨대 이들 제품을 이온 교환수지, 활성탄 또는 실리카 겔을 사용하는 칼럼 크로마토그래피 등의 분획법으로 처리하여 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스 고함유 제품을 용이하게 제조할 수 있다. 칼럼 크로마토그래피로 분리된 말토올리고실수크로오스를 비환원성 당질생성 효소용의 기질로 재사용하여 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 유리하게 제조할 수 있다.

이렇게 하여 수득한 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 함유한 당조성물을 글루코아밀라아제 또는 β-아밀라아제로 가수분해하고, 전분 부분 분해물을 혼합한후 시클로말토덱스트린 글루카노트란페라아제 또는 글루코실트란스페라아제를 사용하여 당전이 반응시켜 감미와 점도를 조정하고, 필요에 따라 다시 효모로 처리하여 발효성 당류를 제거한다. 수득할 혼합물을 이온교환 칼럼 크로마토그래피 등의 상기한 정제법으로 처리하여 글루코오스와 프룩토오스를 제거하고 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스 고함유 확분을 회수한 다음, 이들 획분을 정제, 농축하여 시럽상 제품을 얻는다. 필요한 경우, 이 시럽상 제품을 더 건조하여 분말상 제품을 얻는다.

이온교환 칼럼 크로마토그래피의 예로서 일본국 특허공개 제23,799/83호 및 제72,598/83호에 개시된 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 협잡 당류를 제거하고 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스 고함유 획분을 회수한다. 이 경우에 있어서 고정상(固定床) 방식, 이동상 방식 및 의사 이동상 방식을 선택하여 사용할 수 있다.

이렇게 하여 제조한 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 함유하는 본 발명의 당 조성물은 실질적으로 결정화하지 않고 비교적 높은 수용성(水溶性)과 고품질의 온화한 감미를 가지고 있다. 이들 당류는 장내(腸內) 가수분해 효소에 의해 가수분해되어 글루코오스와 프룩토오스를 생성하므로 경구투여할 경우 이들은 인간을 비롯한 동물의 체내에 쉽사리 소화, 흡수되어 에너지원으로 이용할 수 있다. 이들 당류는 충치 유발균에 의해 발효되지 않고 수크로오스로부터의 불용성 글루칸의 생성을 억제하므로 실질적으로 충치 유발성이 없는 감미료로서 사용할 수 있다.

본 발명의 당 조성물은 음식물, 기호물, 사료, 이료, 화장품 및 의약품 등의 각종 조성물에 있어서 감미료, 맛개선제, 품질개선제 또는 안정제 등으로서 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 당 조성물을 그대로 감미용 조미료로 사용할 수 있고, 필요한 경우에는 이 조성물을 기타 감미료, 예컨대 분말 시럽, 글루코오스, 말토오스, 수크로오스, 이성화당, 꿀, 메이플 슈거, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α-글리코실 스테비오시드, 레바우디오시드, 글리시리진, L-아스파르틸 L-페닐알라닌 메틸 에스테르, 사카린, 글리신 및 알라닌 등의 1종 이상의 감미료 적당량 및/또는 덱스트린, 전분 및 락토오스 등의 증량제와 더불어 사용할 수 있다.

본 발명의 당 조성물의 맛은 신맛, 짠맛, 떫은 맛, 단맛, 쓴맛 등의 다른 맛을 가진 각종 물질과 잘 조화하고, 양호한 내산성과 내열성을 가지므로 일반 음식물에 있어서 감미료, 맛 개선제 또는 품질 개선제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명의 당 조성물은 예컨대 간장, 분말 간장, 미소(된장), 훈마츠 미소(분말 된장), 모로미(정제술), 히시오(정제 간장), 후리카케(어육 조미품), 마요네즈, 드레싱, 식초, 산바이 주(설탕, 간장, 식초로 된 소오스), 훈마츠 스시 수(초밥용 분말 식초), 츄카 노 모토(중화 요리용 인스탄트 믹스), 텐츠유(일본식 튀김 식품용 소오스), 멘츠유(일본식 버어미셀리용 소오스), 소오스, 켓찹, 타쿠앙 즈케노 모토(일본 무우의 인스탄트 믹스), 하루사이 즈케 노 모토(배추 겉절임용 인스탄트 믹스), 야구니쿠 노 타레(일본식 불고기용 소오스), 커리 루우, 인스탄트 스튜우 믹스, 인스탄트 수우프 믹스, 다시 노 모토(인스탄트 스톡 믹스), 복합 조미료, 미린(감미나는 술), 신미린(합성 미린), 테이블 슈거, 커피 슈거 등에 대한 각종 조미료로서 유리하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 당 조성물은 예컨대 센베이(쌀 크래커), 아라레(입방체의 쌀떡), 오코시(기장과 쌀로 된 케이크), 모치(쌀풀), 만주(팥 잼 넣은 만두), 우이로(단맛의 젤리), 안(팥 잼), 요캉(단맛의 팥 젤리), 미즈 요캉(연질의 아즈키 팥 젤리), 킹요쿠(요캉의 일종), 젤리, 파오 드 카스텔라, 아메다마(일본식 토피) 등의 각종 일본식 과자; 빵, 비스켓, 크래커, 쿠우키, 파이, 푸딩, 버터 크리임, 커스터드 크리임, 크리임 퍼프, 와플, 스폰지 케이크, 도우넛, 초콜렛, 츄잉 검, 카라멜, 캔디 등의 양과자; 아이스 크리임, 셔어벳 등의 빙과류; 카지츠 노 시럽 츠케(과실의 시럽 절임), 코리미츠(빙수용 설탕 시럽) 등의 시럽류; 플라워 페이스트, 피이넛 페이스트, 푸루트 페이스트, 스프레드 등의 페이스트류; 잼, 마아멀레이드, 시럽 즈케(과실 피클류), 토카(당과) 등의 과실과 야채의 가공 식품류; 푸쿠진 즈케(적색의 무우 피클), 베타라 즈케(통무우 피클의 일종), 센마이 즈케(갖썰은 무우 절임의 일종), 라쿄 즈케(파 절임) 등의 절임 및 절임 제품류; 햄, 소오세지 등의 축육 제품류; 어육햄, 어육 소오세지, 어묵, 치쿠와(어묵의 일종), 튀김 등의 어육제품류; 성게 내장젓, 오징어젓, 가공된 다시마, 말린 오징어채, 미란으로 조미된 말린 복어 등의 각종 진미류; 김, 산채, 말린 오징어, 소어(小魚), 조개 등으로 제조되는 츠쿠다니류(간장에 끓인 음식); 콩자반, 감자 샐러드, 다시마 말이 등의 평상시 식품; 우유 제품; 축육, 어육, 과실, 야채 등의 통조림, 병조림; 술, 합성주, 와인, 양주, 소주 등의 주류; 커피, 차, 코코아, 주우스, 탄산 음료, 유산 음료, 유산균 음료 등의 청량 음료수; 인스탄트 푸딩 믹스, 인스탄트 할 케이크 믹스, 즉석 시루코(아즈키팥 수우프에 떡을 혼합한 안스탄트 믹스), 즉석 수우프 믹스 등의 즉석 식품; 더욱이는 이유식, 치료식, 드링크제, 펩티드식, 냉동식 등의 각종 음식물에의 감미 부여, 맛 개량, 품질 개량 등에 유리하게 이용할 수 있다.

그리고 본 발명의 당 조성물은 가축, 가금, 물고기 등의 사육 동물을 위한 사료, 이료 등의 기호성의 향상의 목적으로 사용할 수도 있다. 또한 본 발명의 당 조성물을 치약, 입술 연지, 립 크림, 내복약, 정제, 트로치, 간유 드롭, 구중 청량제, 구중 향제, 가아글제 등의 각종 고형물, 페이스트상, 액상 등으로서 기호물, 화장품, 의약품 등, 각종 조성물에의 감미제, 맛 개량제, 교미제로서, 더욱이는 품질 개량로서 유리하게 사용할 수 있다.

그리고 상기한 조성물에 본발명의 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스 함유의 당 조성물을 함유시키는 방법은, 예를 들자면 혼합, 반죽, 용해, 용융, 침지, 침투, 살포, 도포, 분무, 주입, 결정화 및 고화 등의 공지의 방법을 포함한다. 본 발명의 당 조성물을 상기한 제품들에 함유시키는 양은 일반적으로 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스로서 고형물 기준으로 0.1% 이상, 바람직하게는 1% 이상이다. 이어서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

실험 1 : 말토텐트라오실수크로오스의 제조

일본국 특허공고 제58,905/82호 공보의 실험예에 개시된 방법에 따라 말토테트라오실수크로오스를 제조하였다. 일본국의 林原 생물화학 연구소(일본국 오카야마 소재) 판매의 말토펜타오스 28 중량부와 시판되고 있는 수크로오스 12 중량부를 물 60 중량에 가열 용해하고, 이 용액을 45℃로 가열하여 pH 6.5로 조정한 다음, 바실루스 속(屬) 균주 유래의 레반수크라아제(EC 2.4.1.10)를 고형물당 기준으로 수크로오스 1g당 1단위의 양으로 혼합한후 20시간 동안 효소반응 시켰다. 이 반응 혼합물을 100℃에서 30분 동안 가열하여 잔존효소를 실활하였다. 이 반응 혼합물의 당조성을 아래의 조건으로 고속 액체 크로마토그래피(이하, "HPLC"라 약칭함)로 분석하였다.

일본국의 Tosoh사 판매의 고속 크로마토그래프 "CCPM" ; 칼럼 "AQ-303 ODS(4.6mmø×25cm)" (일본국의 YMC사 판매의 칼럼);

용리제 : 정제 및 탈염수;

용리제의 유속 : 0.75ml/min;

칼럼 온도 30℃;

검출기 "RI-8020"[일본국의 Tosoh사 판매의 시차 굴절기(differential refractometer)]

그 결과, 반응 혼합물중에는 말토테트라오실수크로오스를 21% 함유한다는 것을 확인하였다. 수산화 나트륨을 가하여 pH 12로 조정한 후 반응 혼합물중의 환원당을 100℃에서 30분동안 가열하여 분해하였다. 수득한 용액을 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염 및 정제하였다. 이 정제 용액은 당조성으로서 말토테트라오실수크로오스 62%와 수크로오스 38%을 함유하고 있었다. 이 용액을 농도 약 40%의 용액으로 농축한 다음 "AMBERLITE XT-1016(Na형)"(일본국의 Organo사 판매의 강산성 양이온 교환수지)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피한 후 순도 약 98%의 말토테트라오실수크로로스 고함유의 분획물을 회수하였다. 도 1은 이 분획물의 HPLC 크로마토그램이다. 이 분획물을 pH 4.5로 조정하여 55℃로 가열한 다음, 여기에 "GLUCOZYME"(일본국 교토소재의 Nagase Biochemicals사 판매의 글루코아밀라아제) 건조물 20단위/g을 혼합 후 16시간 동안 효소반응시켰다. 이 반응 혼합물을 100℃에서 15분 동안 가열하여 잔존효소를 실활하였다. 수득한 생성물을 HPLC 분석한 결과, 수득한 생성물중의 글루코오스와 수크로오스의 몰비가 4 : 1(=글루코오스 : 수크로오스)이었음이 판명되었다.

이 데이터에 근거하여 이 생성물은 말토테트라오실수크로오스, 즉 1-0-α-D-말토펜타오실 2-0-β-D-프룩토푸라노시드임이 확인되었다.

실험 2 : 효소의 제조

말토오스 2.0w/v%, 펩톤 0.5w/v%, 효모 추출물 0.1w/v%, 인산수소 2나트륨 0.2w/v% , 황산마그네슘 0.05w/v% 및 물로 되어 있는 액상의 영양 배지를 pH 7.0으로 조정하고, 100ml씩을 취하여 500ml 삼각 플라스크에 넣고 120℃에서 20분동안 오토클레이브 처리(auto claving)하여 멸균하고 냉각한 다음, 아르드로박터 sp. Q36(FERM BP-4316)의 모배양액으로 접종하고 200rpm의 교반 조건하에 28℃에서 24시간 동안 배양하였다. 수득한 배양물을 한데 모아 종배양물로 하였다.

상기 배양에서 사용된 동일한 신선한 영양 배지를 약 20리터씩을 취하여 각각 30-L 발효조에 넣고 가열하여 멸균한 후 28℃로 냉각하여 이 종배양물 1v/v%로 접종한 다음, 교반 통기 조건 하에 28℃ 및 pH 6.5∼8.0에서 약 22시간 동안 배양하였다.

실험 3 : 효소의 정제

실험 2에서 제조한 배양물을 원심분리하여 미생물의 습균체 약 0.6kg을 얻었다. 이 균체를 10mM 인산 완충액(pH 7.0)중에 현탁하고, 이 균체 현탁액 약 1.9리터를 "ULTRASONIC DISRUPTER MODEL US 300"(일본국의 Nihonseiki Kaisha사 판매의 초음파 파쇄기)로 처리하여 균체를 파쇄하였다. 수득한 혼합물을 15,000g×30min으로 원심분리하여 약 1.8리터의 상청액을 얻었다. 황산 암모늄을 이 상청액에 가하고 용해하여 0.2의 포화도로 한 후 이 용액을 4℃에서 하룻밤동안 방치한 다음 원심분리하여 상청액을 얻었다. 이 상청액에 0.6의 포화도가 되도록 황산 암모늄을 가하여 용해하고, 이 용액을 4℃에서 하룻밤동안 방치한 다음 원심분리하여 침전물을 얻었다.

이 침전물을 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해하고 동일한 완충액에 대해 24시간 동안 투석한 후 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 이렇게 하여 얻은 상청액을 380ml의 "SEPABEADS FP-DA 13 GEL"(일본국의 Mitsubishi Chemical Industries사 판매)을 사용하여 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피 처리하였다.

비환원성 당생성 효소를 "SEPABEADS FP-DA13 GEL"에 흡착시키고 0M로부터 0.5M까지의 범위에 있는 염화 나트륨 함유의 동일한 신선한 완충액의 직선 기울기로 용출하였다. 칼럼에서 용출된 이 효소를 회수하여 동일한 신선한 완충액에 대하여 투석하고, 100ml의 "DEAE-SEPHADEX A-50"(스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 판매)를 사용하여 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피 처리하였다. 이 효소를 이 겔에 흡착시키고 0M에서 0.5M까지의 염화 나트륨 함유의 동일한 신선한 완충액의 직선 기울기로 용출한후, 용출한 효소활성 획분을 회수하고 한데 모아 "ULTRAFILTRATION MODUL PM-10"(미합중국 Amicon Div., W.R. Grace & Co. 판매의 한외 여과기)로 농축하여 6ml 용액을 얻었다.

이 농축액을 630ml의 "ULTROGEL AcA44"(미합중국 Sepracor사 판매의 겔)이 충전된 칼럼을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피 처리하였다. 비환원성 당질생성 효소를 이 겔에 흡착시키지 않고 1M 염화 나트륨 함유의 동일한 신선한 완충액으로 칼럼으로부터 용출시켰다.

이 용출액을 7.8ml의 "BUTYL TOYOPEARL 650M GEL"로 충전된 칼럼을 사용하여 소수 크로마토그래피 처리하고 1M에서 0M까지의 범위에 있는 황산 암모늄 함유의 직선 기울기 용액으로 칼럼으로부터 용출시켜 효소활성 획분을 회수하였다. 이렇게 하여 전기 영동적으로 단일 단백질 밴드를 가진 효소를 얻었다. 이 효소의 비활성(比活性)은 단백질 1mg당 203단위이었다.

실험4 : 비환원성 당질생성 효소의 말토테트라오실수크로오스에 대한 작용

실험 1의 방법으로 제조한 말토테트라오실수크로오스 40 중량부를 물 60 중량에 용해하였다. 이 용액을 40℃로 가열하고 pH 6.5로 조정한 다음, 여기에 실험 3의 방법으로 제조한 아르드로박터 sp. Q36(FERM BP-4316) 유래의 비환원성 당질생성 효소를 고형물당 말토테트라오실수크로오스 1g에 대해 100단위의 양으로 혼합한 후 24시간 동안 효소 반응시키고 100℃에서 30분 동안 가열하여 잔존 효소를 실활하였다. 이 반응 혼합물을 실험 1의 방법에 따라서 HPLC로 분석하였다. 도 2는 이 반응 혼합물의 HPLC 크로마토그램이다. 이 혼합물은 당조성으로서 피이크 1의 당 27.9%와 피이크 2의 당 35.9%를 함유하고 있었다. 피이크 1 및 2의 당을 "YMC-Pack ODS R-355-15"(5cmø×50cm의 칼럼; 일본국의 YMC사 판매의 역상 분획용 칼럼)을 사용하여 각각 회수하였다. 각 당의 2w/v%용액을 pH 4.5와 40℃로 유지하면서 이 용액에 글루코아밀라아제(일본국의 Seikagaku-Kogyo사 판매) 건조물을 20단위/g 가하고 24시간 동안 효소 반응시킨 후 "MOL-CUT"(일본국의 Japan Millipore사 판매의 한외 여과막)을 사용하여 효소를 제거하고, 수득한 용액을 HPLC와 "KIESELGEL 60"(미합중국 Merck사 판매의 알루미늄판, 20cm×20cm)를 사용하는 박층 크로마토그래피(이하, "TLC"로 약칭함)로 처리하여 당조성을 분석하였다. 1-부탄올, 피리딘 및 물(부피비 6 : 4 : 1)의 전개용매계를 사용하여 TLC를 실온에서 1회 하였다. 이 판에 메탄올중의 20v/v% 황산용액을 분무한후 이 판을 110℃에서 10분 동안 가열함으로써 발색시켰다. 피이크 1의 당으로부터 글루코오스와 투라노오스는 몰비 3.81 : 1로 형성되었는데, 이것으로부터 피이크 1의 당이 말토테트라오실투라노오스임을 판명하였다. 피이크 2의 당으로부터 글루코오스, 팔라티노오스 및 트레할룰로오스가 몰비 4.77 : 1 : 0.21로 생성되었다. 말토올리고사카라이드에 대한 비황원성 당질생성 효소의 효소 특이성과 피이크 1의 당의 구조를 고려해 볼때 피이크 2의 당은 다량의 말토테트라오실팔라티노오스와 소량의 말토테트라오실트레할룰로오스를 함유하는 것으로 결론지을 수 있다.

이들 데이터에 근거하여 이 효소는 소량의 말토테트라오실트레할룰로오스와 더불어 말토테트라오실투라노오스와 말토테트라오실팔라티노오스를 주로 생성한다는 것을 확인하였다.

실험 5 : 말토테트라오실투라노오스, 말토테트라오실팔라티노오스 및 말토테트라오실트레할룰로오스의 생성에 사용된 효소량의 영향

40% 말토테트라오실수크로오스 용액에 실험 3의 방법으로 제조한 정제 비환원성 당질생성 효소를 고형물 기준으로 말토테트라오실수크로오스 1 g당 1, 4, 10, 20 또는 100단위의 양으로 혼합하고 40℃ 및 pH 6.5에서 24시간 동안 효소반응시켰다. 반응 혼합물중의 잔존 효소를 "MOL-CUT II"(일본국의 Japan Millipore사 판매의 한외 여과막)으로 제거하고, 한외여과 용액의 당조성을 HPLC로 분석했다. 각각의 효소량에 따라 생성된 피이크 1 및 2의 당의 함량은 표 1에 나와 있다.

주 : 표에서 "A", "B", "C", "D", "E" 및 "F"는 각각 "말토테트라오실수크로오스", "피이크 1의 당", 피이크 2의 당", "말토트리오실트레할로오스 및 말토펜타오스", "프룩토오스" 및 기타의 "다른 당류"를 의미함.

표 1의 결과로부터 명백한 바와 같이 효소를 4단위 이상 사용했을 때 말토테트라오실투라노오스에 대한 피이크 1의 당과 말토테트라오실트레할룰로오스에 대한 피이크 2의 당을 합계 15% 이상 생성하였다.

실험 6 : 기타미생물들의 비환원성 당질생성 효소에 의한 말토테트라오실수크로오스로부터의 말토테트라오실투라노오스, 말토테트라오실팔라티노오스 및 말토테트라오실트레할룰로오스의 생성

실험 2 및 3의 방법에 따라서 아르드로박터 sp. Q36(FERM BP-4316)과 리조븀 sp. M-11(FERM BP-4130) 유래의 정제 비환원성 당질생성 효소를 제조하고, 술폴로부스 아시도칼다리우스(ATCC 33909) 유래의 부분 정제 비환원성 당질생성 효소를 "DEAE-TOYOPEARL 650"을 사용한 칼럼 크로마토그래피로 얻었다. 이 효소들을 표 2에 나온 바와 같은 조건하에서 96시간 동안 20% 말토테트라오실수크로오스 용액에 작용시켰다. 그 결과는 표 2에 나와있다.

주 : 표에서 "수율'"과 "수율^**"은 "말토테트라오실투라노오스의 수율(%)"과 "말토테트라오실팔라티노오스 + 말토테트라오실트레할룰로오스의 수율(%)"을 의미함.

표 2의 결과로부터 명백한 바와 같이 상기의 효소들은 만족할만한 높은 수율로 말토테트라오실투라노오스, 말토테트라오실팔라티노오스 및 말토테트라오실트레할룰로오스를 용이하게 생성한다는 것을 확인하였다.

실험 7 : 비환원성 당질생성 효소의 말토올리고실수크로오스에 대한 작용

당 수용체로서 말토트리오스, 말토테트라오스 및 말토헥사오스(이들은 모두가 일본국 林原 생물화학연구소 판매)와 수크로오스에 실험 1과 마찬가지로 레반수크라아제를 작용시켜 각각 말토실수크로오스, 말토트리오실수크로오스 및 말토펜타오실수크로오스를 생성하였다. 당 분석을 위하여, 실험 1에서 제조된 말토테트라오실수크로오스, 시판되고 있는 수크로오스 및 글루코실수크로오스, 즉 엘루로오스(일본국의 林原생물화학연구소 판매) 등의 수크로오스에 결합한 0∼6개의 글루코오스 성분으로 구성된 당류를 기질로서 제조하였다. 실험 3의 방법으로 제조된 아르드로박터 sp. Q36(FERM BP-4316) 유래의 비환원성 당질생성 효소를 실험 4와 마찬가지로 상기 당류에 작용시켰다. 실험 4와 마찬가지로 반응 혼합물을 HPLC로 분석하고 특이한 중합도를 가진 각각의 기질에 상응하는 말토올리고실투라노오스, 말토올리고실팔라티노오스 및 말토올리고실트레할룰로오스의 수율을 구하였다. 그 결과는 표 3에 나와 있다.

주 : 표에서 "수율'"과 "수율^**"m은 "말토올리고실투라노오스의 수율(%)" 및 "말토올리고실팔라티노오스 + 말토올리고실트레할룰로오스의 수율(%)"를 의미함.

표 3의 결과로부터 명백한 바와 같이 비환원성 당질생성 효소는 말토트리오실수크로오스보다 높은 분자량을 가진 기질로서의 말토올리고실수크로오스에 특이하게 작용하여 말토올리고오실수크로오스의 수크로오스 성분을 분자내에서 변환하여 말토올리고오실투라노오스, 말토올리고오실팔라티노오스 및 말토올리고오실트레할룰로오스로 용이하고도 비교적 고수율로 생성함을 판명하였다.

실험 8 : 말토올리고실수크로오스로부터 말토올리고실투라노오스, 말토올리고실팔라티노오스 및 말토올리고실트레할룰로오스의 제조

α-시클로덱스트린(일본국의 林原생물화학연구소 판매) 25 중량부와 시판되고 있는 수크로오스 25 중량부를 물 50 중량부에 가열용해하였다. 60℃로 가열하고 pH 6.0으로 조정한 후 이 용액에 바실루스 스테아로더어모필러스 균주 유래의 시클로말토덱스트린 글루카노트란스페라제(일본국의 林原생물화학연구소 판매)를 α-시클로덱스트린 1g당 5단위의 양으로 접종하고 20시간 동안 효소반응시켰다. 이 반응 혼합물을 100℃에서 30분 동안 가열하여 잔존효소를 실활하였다. 각종 말토올리고실수크로오스를 함유한 이 혼합물을 40℃로 가열하고 pH 6.5로 조정한 다음, 여기에 아르드로박터 sp. Q36(FERM BP-4316) 유래의 비환원성 당질생성 효소 건조물을 200단위/g 혼합하고 24시간 동안 효소반응시켰다. 그 후, 이 반응 혼합물을 100℃에서 30분 동안 가열하여 잔존효소를 실활하였다. 이 혼합물은 비교적 다량의 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스 및 소량의 말토올리고실트레할룰로오스를 함유하고 있었다.

상기한 바와 같이 본 발명에서 사용된 비환원성 당질생성 효소는 말토올리고사카라이드를 말토올리고실트레할로오스로 변환하고 말토올리고실수크로오스에 작용하여 그것을 분자내에서 변환하여 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 생성함으로써 변환된 당류를 함유하는 당조성을 생성한다.

실험 9 : 급성 독성 테스트

7주령의 dd-계 마우스를 사용하여 후술하는 실시예 A-4의 방법으로 제조된 말토테트라오실투라노오스 및 말토테트라오실팔라티노오스를 함유하는 당조성물을 마우스에게 경구 투여하여 급성독성 시험을 한 결과, 체중 1kg당 15g의 투여량 까지는 사망예가 없었고, 그 이상의 투여량 시험은 불가능하다는 것이 판명되었다. 데이터에 의하면 이 당조성물은 독성이 상당히 낮은 것을 알 수 있다. 실시예 A-2의 방법으로 제조된 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 함유하는 또 다른 당조성물을 마우스에게 경구 투여하여 급성독성 실험을 하였다. 그 결과, 마우스의 체중 1kg 당 15g의 투여량까지는 사망예는 없었는데, 이로부터 이 당질 또한 독성이 극히 낮은 것을 판명하였다.

다음의 참고예는 본 발명에서 사용 가능한 효소의 제조방법을 설명하며, 실시예 A 및 B는 말토오리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 함유하는 당 조성물의 제조방법과 이들의 용도를 각각 설명한다.

참고예 1

아르드로박터 sp. Q36(FERM BP-4316)의 종배양물을 글루코오스 4.0w/v%, 폴리펩톤 0.5w/v%, 효모 추출물 0.1w/v%, 인산수소 2칼륨 0.1w/v%, 인산 2수소 나트륨 0.06w/v%, 황산 마그네슘 7수화물 0.05w/v% 및 물로 되어 있는 액상의 영양배지에 접종하고, 27℃에서 배양하는 것을 제외하고는 실험 2의 방법에 따라 통기교반 조건하에서 약 60시간 동안 발효조에서 배양하였다. 이 배양물 약 18리터를 "MINI-LABO"(일본국의 Dainippon Pharmaceutical사 판매의 초고압 균체 파쇄기)로 처리하여 균체를 파쇄하였다. 이 균체 현탁액을 원심분리하여 상청액을 얻은 다음, 실험 3의 방법에 따라 정제하여 약 30단위/ml의 비환원성 당질생성 효소를 함유하는 부분 정제 용액 약 300ml를 제조하였다.

참고예 2

리조븀 sp. M-11(FERM BP-4130)의 종배양물을 글루코오스 2.0w/v%, 펩톤 0.5w/v%, 효모 추출물 0.1w/v%, 인산수소 2칼륨 0.1w/v%, 인산 2수소 나트륨 0.1w/v% 및 물로 되어 있는 액상의 영양배지에 접종하고, 30℃에서 배양하는 것을 제외하고는 실험 2의 방법에 따라 통기교반 조건하에서 약 24시간 동안 발효조에서 배양하였다. 이 배양물 약 18리터를 원심분리하여 미생물의 습균체를 약 0.4kg 얻은 다음 10mM 인산 완충액 4리터에 현탁하고 초음파 파쇄기로 처리하여 균체를 파쇄하였다. 균체 현탁액을 원심분리하여 상청액을 얻은 다음, 실험 3의 방법에 따라 약 15단위/ml의 비환원성 당질생성 효소를 함유하는 부분 정제 효소용액 약 100ml를 제조하였다.

참고예 3

펩톤 0.1w/v%, 효모 추출물 0.1w/v%, 황산 암모늄 0.2w/v%, 인산 2수소 2칼륨 0.05w/v%, 황산 마그네슘 7수화물 0.02w/v%, 염화 칼륨 0.02w/v% 및 물로 되어있는 액상의 영양배지를 100ml씩을 취하여 500ml 삼각 플라스크에 넣고, 120℃에서 20분 동안 오토클레이브 처리하여 살균하고 냉각한 다음, 황산을 가하여 pH 3.0으로 조정하였다. 수득한 배지를 술폴로부스 아시도칼다리우스(ATCC 33909)의 '모배양액으로 접종한 다음, 130rpm의 진탕 조건하에 75℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이렇게 하여 얻은 배양물을 1차 종배양액으로 사용하였다.

상기에 사용된 동일한 신선한 액상의 영양배지 약 20리터씩을 취하여 각각 30리터 용량의 발효조에 넣고 가열하여 멸균한 후 냉각하고 pH 3.0으로 조정하여 75℃로 가열하였다. 이어서 1v/v%의 1차 종배양액을 각 발효조에 접종하고 통기교반 조건하에 75℃에서 약 48시간 동안 배양하였다. 수득한 배양물을 2차 종배양액으로 사용하였다. 상기에서 사용된 동일한 신선한 액상의 영양배지 약 250리터씩을 취하여 각각 300리터 용량의 발효조에 넣고 가열멸균한 다음, 냉각하여 pH 3.0으로 조정하고 75℃로 가열하였다. 이어서 1v/v%의 2차 종배양액을 각 발효조에 접종하고 통기교반 조건하에 75℃에서 약 42시간 동안 배양하였다. 약 170리터의 배양물을 SF 멤브레인으로 처리하고 원심분리하여 습균체 258g을 얻었다. 이 균체를 10mM 인산 완충액(pH 7.0) 300ml와 혼합하여 현탁한후 초음파 파쇄기로 처리하여 균체를 파쇄하였다. 수득한 균체 현탁액을 원심분리하여 상청액을 얻은 다음, "DEAE-TOYOPEARL"을 사용한 이온 교환 크로마토그래피 및 "BUTYL-TOYOPEARL 650"을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피로 처리하여 약 10단위/ml의 비환원성 당질생성 효소를 함유하는 부분 정제 효소용액을 약 50ml 얻었다.

실시예 A-1

수크로오스 2.5 중량부와 "PENTRUP'"(일본국의 林原사 판매의 말토올리고사카라이드) 3.5 중량부를 물 4중량부에 가열 용해하고, 이 용액을 pH 6.5로 조정하고 45℃로 가열한후 바실루스속 균주 유래의 레반수크라아제(EC 2.4.1.10)를 수크로오스 1g당 1단위 접종하고 20시간 동안 효소반응시켰다. 이 반응 혼합물을 가열하여 잔존효소를 실활하고, 여기에 참고예 1의 방법으로 제조한 아르드로박터속 균주 유래의 비환원성 당질생성 효소 건조물을 50단위/g 혼합후 40℃에서 40시간 동안 배양하여 효소반응시킨 다음 가열하여 잔존효소를 실활하였다. 이렇게 해서 제조된 반응 혼합물을 종래의 방법으로 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온교환수지로 탈염, 정제하고 농축하여 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 약 75%함유하는 시럽을 약 93%의 수율로 얻었다.

비결정성인 이 시럽은 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 약 20% 함유하고 있으며 양호한 감미, 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있어서 음식물, 화장품 및 의약품 등에 유리하게 사용할 수 있다. 말토올리고실투라노오스 및 말토올리고실팔라티노오스 등의 생성물중의 환원당을 수소첨가하여 이들에 각각 상응한 비환원성 당 알코올로 한후 사용할 수도 있다.

실시예 A-2

수크로오스 25중량부와 α-시클로말토덱스트린(일본국 林原 생물화학연구소 판매) 25중량부를 물 50 중량부에 가열 용해하였다. 이 용액을 60℃로 가열하고 pH 5.5로 조정한 후 바실루스 스테아로더어모필러스종 균주 유래의 시클로말토덱스트린 글루카노트란스페라아제(일본국 林原 생물화학연구소 판매)를 고형물당 α-시클로말토덱스트린 1g당 5단위 혼합하고 20시간 동안 효소반응시켰다. 이 반응 혼합물을 가열하여 잔존효소를 실활하고, 참고예 1의 방법으로 제조한 아르드로박터속 균주 유래의 비환원성 당질생성 효소 건조물 100단위/g과 혼합한후 40℃에서 20시간 동안 효소반응시켰다. 이어서 수득한 혼합물을 가열하여 잔존효소를 실활하였다.

이렇게 해서 제조된 혼합물을 종래의 방법으로 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염 및 정제한후 농축하고 감압건조한 다음 분쇄하여 말토올리고실투라노오스 및 말토올리고실팔라티노오스를 함유하는 당분말을 약 90%의 수율로 제조하였다. 비결정성의 이 분말은 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실 팔라티노오스를 약 20% 함유하고 있었다. 실시예 A-1의 생성물과 마찬가지로 이 분말은 양호한 감미, 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있어서 각종 조성물에서 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 A-3

"COUPLING SUGAR"(일본국의 林原사 판매의 수분함량 약 25%의 글리코실수크로오스) 5 중량부에 물 5 중량부를 가하고, 이 용액을 45℃로 가열하고 pH 6.5로 조정한 다음, 참고예 2의 방법으로 제조된 리조븀속 균주 유래의 비환원성 당질생성 효소 건조물 50단위/g과 혼합하고 30시간 동안 효소반응시킨후 가열하여 잔존효소를 실활하였다. 이 반응혼합물을 종래의 방법으로 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염 및 정제한 다음, 농축하여 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 약 75% 함유하는 시럽을 약 93%의 수율로 얻었다. 비결정성을 가진 이 시럽은 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 약 15%함유하고 있었다.

이 시럽은 양호한 감미, 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있으므로 식품, 화장품 및 의약품에 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 A-4

수크로오스 2.5 중량부와 말토펜타오스(일본국의 林原생물화학연구소 판매) 2.5 중량부를 물 5 중량부에 가열용해하고, 이 용액을 pH 6.5 및 45℃로 조정한후 여기에 바실루스속 균주 유래의 레반수크라아제를 수크로오스 1g당 1단위의 양으로 하여 첨가하고 20시간 동안 효소반응시킨 다음에 가열하여 잔존효소를 실활하였다. 이 반응 혼합물을 종래의 방법으로 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염 및 정제한 다음, "ODS" 칼럼을 사용하여 분획함으로써 고순도 말토테트라오실수크로오스 용액을 제조하였다.

이 용액에 참고예 3의 방법으로 제조된 술폴로부스속 균주 유래의 열안정성의 비환원성 당질생성 효소 건조물을 50단위/g 가하고 65℃에서 20시간 동안 효소 반응시킨후 가열하여 잔존효소를 실활하였다. 통상적인 방법으로 이 반응 혼합물을 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염 및 정제하고 농축한 후 분무건조하여 말토테트라오실투라노오스 및 말토테트라오실팔라티노오스를 함유하는 분말을 약 85%의 수율로 얻었다. 비결정성을 가진 이 분말은 말토테트라오실투라노오스 및 말토테트라오실팔라티노오스 약 55%와 말토테트라오실수크로오스 약 18%를 함유하고 있었다. 이 분말은 양호한 감미를 가지므로 식품, 화장품 및 의약품에 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 B-1 : 감미료

실시예 A-4의 방법으로 제조한 말토테트라오실투라노오스와 말토테트라오실팔라티노오스를 함유한 당 분말 1 중량부에 "α-G Sweet"(일본국의 東洋精糖(주) 판매의 α-글리코실 스테비오시드) 0.05 중량부를 균일히 혼합하고, 이 혼합물을 조립기(造粒機)에 가하여 과립상 감미료를 제조하였다. 이 제품은 감미의 질이 만족스러우며 수크로오스보다 약 2배 높은 감미도를 가지며 감미도당 칼로리값은 수크로오스의 약 1/2이다. 이 제품은 저칼로리 감미료로서 칼로리 섭취를 제한하고 있는 비만자, 당뇨병자 등을 위한 저칼로리 음식물 등에 대한 감미 부여에 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 이 감미료는 체내에 흡수되면 충치 유발균에 의한 산의 생성이 적고 불용성 글루칸의 생성도 적으므로 충치를 억제하는 음식물 등에 대한 감미 부여에도 만족스럽게 사용할 수 있다.

실시예 B-2 : 하아드 캔디

농도 55%의 말토올리고실수크로오스 용액 100중량부에 실시예 A-1의 방법으로 제조한 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 함유한 시럽 30 중량부를 가열하면서 혼합한 다음, 감압하에 수분 2% 이하가 될 때까지 가열 농축하고, 여기에 시트르산 1 중량부와 적당량의 레몬향료 및 착색료를 혼합하여 통상의 방법에 따라 성형하여 소요의 제품을 얻었다. 이 제품은 깨물기와 맛이 양호한 고품질의 하아드 캔디이다. 이 제품중의 말토올리고실수크로오스의 결정화는 잘 방지되어 있다.

실시예 B-3 : 딸기 잼

신선한 딸기 150 중량부, 말토올리고실수크로오스 60 중량부, 말토오스 20 중량부, 실시예 A-1의 방법으로 제조한 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 함유한 시럽 40 중량부, 펙틴 5 중량부 및 시트르산 1 중량부를 평평한 냄비중에서 끓여 병에 넣어 포장함으로써 소요의 제품을 얻었다. 이 제품은 맛과 색깔이 좋은 딸기 잼이다.

실시예 B-4 : 유산 음료

탈지 분유 10 중량부를 80℃에서 20 분간 가열하여 살균하고 40℃로 냉각한 후 스타아터(starter) 0.3 중량부를 접종하고 약 37℃에서 10시간 발효시킨 다음, 발효 혼합물을 호모지나이즈한후 실시예 A-2의 방법으로 제조한 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 함유한 당 분말 4 중량부, 말토올리고실수크로오스 1 중량부 및 이성화당 시럽 2 중량부를 혼합하여 균질화하고 70℃에서 가열하여 살균하였다. 수득한 혼합물을 냉각하고 병에 넣어 포장함으로써 소요의 제품을 제조하였다. 이 제품은 맛과 감미가 산과 잘 조화된 고품질의 유산 음료이다.

실시예 B-5 : 가당 연유

원유 100중량부에 실시예 A-3의 방법으로 제조한 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 함유한 시럽 3 중량부와 말토올리고실수크로오스 1 중량부를 가하여 용해하고, 이 용액을 플레이트 히이터에서 가열하여 살균한 다음 약 70% 농도의 용액으로 농축한후 무균상태에서 병조림하여 소요의 제품믈 얻었다. 이 제품은 온화한 감미와 맛을 가지고 있어서 유아 식품, 과실, 커피, 코코아, 차 등의 음식물의 감미용으로 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-6 : 츄잉 검

검 베이스 3 중량부를 유연하게 될 정도로 가열 용융하고, 여기에 말토올리고실수크로오스 6 중량부와 실시예 A-4의 방법으로 제조한 말토테트라오실투라노오스와 말토테트라오실팔라티노오스를 함유한 당 분말 1 중량부를 가하고, 다시 적당량의 향료와 착색료를 혼합한 후 통상의 방법에 따라 로울에서 반죽하여 성형, 포장함으로써 소요의 제품을 얻었다. 이 제품은 텍스쳐와 풍미가 모두 양호한 츄잉 검이다.

실시예 B-7 : 커스타드 크리임

옥수수 전분 100 중량부, 실시예 A-3의 방법으로 제조한 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 함유한 시럽 100 중량부, 말토오스 80 중량부, 말토올리고실수크로오스 20 중량부 및 식염 1 중량부를 충분히 혼합하고, 이 혼합물에 계란 280 중량부를 가하여 혼합하였다. 이 혼합물을 교반하면서, 끓인 우유 1000 중량부와 서서히 혼합하고, 교반하면서 계속 가열하여 내용물이 완전히 호화하여 전체가 반투명하게 되었을 때 가열을 중지하였다. 호화된 혼합물을 냉각하고, 여기에 적당량의 바닐라 향료를 가하고 계량, 충전하여 소요의 제품을 얻었다. 이 제품은 평활한 표면과 온화한 감미 및 양호한 맛을 가지고 있다.

실시예 B-8 : 우이로-노-모토(Uiro-no-moto : 단맛의 쌀 젤리 프리믹스)

쌀가루 90 중량부, 옥수수 전분 20 중량부, 실시예 A-4의 방법으로 제조한 말토테트라오실투라노오스와 말토테트라오실팔라티노오스를 함유한 당 분말 120 중량부 및 풀룰란 4 중량부를 균일히 혼합하여 우이로-노-모토를 제조하였다. 이 제품을 적당량의 분말차 및 물과 혼합, 반죽하여 용기에 넣고 60분간 증기찜하여 분말차 우이로를 얻었다. 이 제품은 광택이 양호하고 깨물기가 좋고 맛이 양호하며 전분의 노화가 잘 억제되므로 저장기간이 비교적 길다.

실시예 B-9 : 경관 공급용 고형 제제

실시예 A-4의 방법으로 제조한 말토테트라오실투라노오스와 말토테트라오실팔라티노오스를 함유한 당 분말 500 중량부, 분말 난황 270 중량부, 탈지 분유 209 중량부, 염화 나트륨 4.4 중량부, 염화 칼륨 1.85 중량부, 황산 마그네슘 4 중량부, 티아민 0.01 중량부, 아스코르브산 나트륨 0.1 중량부, 비타민 E 아세테이트 0.6 중량부 및 니코틴산 아미드 0.04 중량부로 된 조성물을 제조하였다. 이 조성물 25g씩을 취하여 방습성의 소형 라미네이트 봉지예 충전하고 히이트 시일하여 제품을 얻었다. 이 조성물은 봉지 하나를 약 150∼300ml의 물에 용해하여 유동식으로 하여 환자에게 경구적으로 투여하거나, 또는 비강(鼻腔), 위, 장 등에 경관적 사용 방법에 따라 투여한다.

실시예 B-10 : 피부외상 치료용 연고

실시예 A-4의 방법으로 제조한 말토테트라오실투라노오스와 말토테트라오실팔라티노오스를 함유한 당 분말 500 중량부에, 요오드 3 중량부를 용해한 메탄올 50 중량부를 가하여 혼합하고, 여기에 10% 풀룰란 수용액 200 중량부를 가하여 혼합해서 적당한 확포성과 부착성을 가진 피부 외상 치료용 연고를 제조하였다. 이 연고는 치유 기간을 단축하고 상처난 표면도 깨끗이 아물게 한다.

이상으로부터 명백한 바와 같이 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 함유하는 당 조성물은 비환원성 당질생성 효소를 말토올리고실수크로오스를 함유한 수용액에 작용시킴으로써 말토올리고실수크로오스로부터 비교적 교수율로 용이하게 제조하여 분리, 정제한다. 이들 당류는 글루코오스와 프룩토오스 성분으로 구성되어 있고, 온화하고 고품질의 감미를 가진 환원성 올리고당인데, 경구 및 비경구 투여할 경우 독성과 부작용의 우려없이 생체에서 용이하게 대사된다.

본 발명에 의한 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 함유하는 당 조성물은 비결정질 당류이고, 이들의 액상 또는 분말상과는 관계없이 취급이 용이하다. 이 당 조성물은 바람직한 삼투압 조절성, 중량 부여성, 광택 부여성, 보습성, 점도 부여성, 기타 당질의 결정화 방지성 및 난발효성을 가지고 있으므로 이 조성물을 각종 조성물에 있어서 감미료, 맛개선제, 품질 개선제 및 안정제로서 유리하게 사용할 수 있다.

따라서 본 발명에 의한 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노온스를 함유하는 당 조성물과, 그 제조방법 및 그 용도의 확립은 이 분야에 대해 크게 기여하는 것으로 기대된다.

도 1은 고순도 말토테트라오실수크로오스의 HPLC 크로마토그램.

도 2는 비환원성 당질생성 효소로 가수분해한 후의 고순도 말토테트라오실수크로오스의 HPLC 크로마토그램.

Claims

말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 함유하는 당 조성물.
청구항 1에 있어서, 추가로 말토올리고실트레할룰로오스를 함유하는 당 조성물.
청구항 1에 있어서, 말토올리고사카라이드를 말토올리고실트레할로오스로 변환 혹은 전위하는 분자내 당 전이 효소인 비환원성 당질생성 효소를 말토올리고실수크로오스 함유의 용액에 작용시켜 제조되는 당 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 효소가 미생물 유래의 것인 당 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 미생물은 리조븀(Rhizobium)속(屬), 아르드로박터(Arthrobacter)속 및 술폴로부스(Sulfolobus)속에 속하는 미생물로 된 군으로부터 선택되는 1종인 당 조성물.
청구항 1에 있어서, 고형물 기준으로 상기 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 15w/w% 이상 함유하는 당 조성물.
말토올리고사카라이드를 말토올리고실트레할로오스로 변환 혹은 전위하는 분자내 당 전이 효소인 비환원성 당질생성 효소를 말토올리고실수크로오스 함유의 용액에 작용시켜 상기 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 생성시키고, 생성된 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 회수하는 것을 특징으로 하는 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스 함유의 당 조성물의 제조방법.
청구항 7에 있어서, 상기 효소를 건조물 1g당 4단위 이상의 양으로 하여 용액에 작용시키는 제조방법.
청구항 1의 당 조성물을 식품재료에 함유시켜 제조된 음식물.
청구항 9에 있어서, 당 조성물에서 고형물 기준으로 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 0.1% 이상 함유하는 음식물.
청구항 9에 있어서, 상기 당 조성물은, 말토올리고사카라이드를 말토올리고실트레할로오스로 변환 혹은 전위하는 분자내 당 전이 효소인 비환원성 당질생성 효소를 말토올리고실수크로오스 함유의 용액에 작용시켜 제조되는 것인 음식물.
청구항 1의 당 조성물을 화장품용 담체에 함유시켜 제조된 화장용 조성물.
청구항 12에 있어서, 당 조성물에서 고형물 기준으로 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 0.1% 이상 함유하는 화장용 조성물.
청구항 12에 있어서, 상기 당 조성물은, 말토올리고사카라이드를 말토올리고실트레할로오스로 변환 혹은 전위하는 분자내 당 전이 효소인 비환원성 당질생성 효소를 말토올리고실수크로오스 함유의 용액에 작용시켜 제조되는 화장용 조성물.
청구항 1의 당 조성물을 의약용 담체에 함유시켜 제조된 의약 조성물.
청구항 15에 있어서, 당 조성물에서 고형물 기준으로 말토올리고실투라노오스와 말토올리고실팔라티노오스를 0.1% 이상 함유하는 의약 조성물.
청구항 15에 있어서, 상기 당 조성물은, 말토올리고사카라이드를 말토올리고실트레할로오스로 변환 혹은 전위하는 분자내 당 전이 효소인 비환원성 당질생성 효소를 말토올리고실수크로오스 함유의 용액에 작용시켜 제조되는 의약 조성물.