KR100391376B1 - 내열성 트레할로오스 방출효소와 그 제조방법 및 용도 - Google Patents

내열성 트레할로오스 방출효소와 그 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

(목적) 환원성 전분 부분 분해물로 부터 트레할로오스틀 제조하기 위한 트레할로오스 방출 효소와 그 제조 방법 및 그 용도의 확립을 목적으로 함.
(구성) 본 발명은 신규의 내열성 트레할로오스 방출 효소와 그 제조 방법 및 환원성 전분 부분 분해물로 부터 비환원성 당질 생성 효소와 트레할로오스 방출 효소를 사용하여 트레할로오스 및 이것을 함유하는 당질과 트레할로오스를 함유시킨 조성물을 구성으로 한다.

Description

내열성 트레할로오스 방출 효소와 그 제조 방법 및 용도{THERMOSTABLE TREHALOSE-RELEASING ENZYME, AND ITS PREPARATION AND USES}
본 발명은 내열성 트레할로오스 방출 효소와 그 제조 방법 및 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가지며, 글루코오스 중합도 3 이상인 비환원성 당질의 트레할로오스 부분과 나머지의 글리코실 부분 사이의 결합을 특이적으로 가수분해하는 신규의 내열성 트레할로오스 방출 효소와 그 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 효소를 사용하여 제조되는 트레할로오스 및 이 트레할로오스를 함유시킨 조성물에 관한 것이다.
글루코오스로 구성된 비환원성 당질로서 트레할로오스 또는 α,α-트레할로오스가 알려져 있는데, 문헌 [Advances in Carbohydrate Chemistry, Vol.18, pp.201∼225 (1963), published by Academic Press, USA 및 Applied and Environmental Microbiology, Vol.56, pp.3,213∼3,215 (1990)] 에 기재되어 있는 바와 같이 그 함량은 비교적 작지만 미생물, 버섯, 곤충 등에 광범위하게 존재하고 있다. 트레할로오스는 비환원성 당질이기 때문에 아미노산이나 단백질 등의 아미노기를 가진 물질과 아미노카르보닐 반응을 일으키지 않고 아미노산 함유 물질을 상하게 하지 않으므로 트레할로오스는 갈변이나 열화 (劣化) 를 일으킬 우려가 없이 사용할 수 있는 것으로 기대되어 그 공업적 제조 방법의 확립이 요망되고 있다.
종래의 트레할로오스 제조 방법으로서는, 예컨대 일본국 특허 공개 제 154,485/75 호 공보에 개시 (開示) 되어 있는 미생물 균체를 이용하는 방법과, 일본국 특허 공개 제 216695/83 호 공보에 제안되어 있는 말토오스-포스포릴라아제와 트레할로오스-포스포릴라아제와의 조합에서 말토오스를 변환하여 트레할로오스를 얻는 방법 등이 알려져 있다. 그러나, 미생물 균체를 사용하는 방법은 이 균체를 출발 원료로 하여, 여기에 함유되는 트레할로오스의 함량이 통상 고형물당 15 w/w %(이하, 본 명세서에서는 별달리 명세하지 않는 한 " w/w % " 을 간단히 " % " 로약칭한다) 이하로서 낮고, 그 외에 이것을 추출, 정제하는 공정이 번잡하여 공업적 제조 방법으로서는 적당하지 않다. 또한, 말토오스-포스포릴라아제와 트레할로오스-포스포릴라아제를 사용하는 방법은 (가) 글루코오스-1-포스페이트를 경유하여 트레할로오스를 생성시키고 있으므로 기질인 말토오스의 농도를 소요의 농도까지 높일 수 없고, (나) 포스포릴라아제의 효소반응계가 가역반응이므로 목적물인 트레할로오스의 수율이 비교적 낮으며, (다) 이들 반응계를 안정하게 유지하여 효소반응을 원활하게 진행시키는 것이 곤란하다는 결점이 있어 공업적 제조 방법으로서 실현되지 않고 있다.
이러한 상황을 고려하여 본 발명자들은 전분 가수분해물에 작용시켰을 경우, 트레할로오스 구조를 가진 당질을 생성하는 효소에 대해 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명자들은 리조븀 (Rhizobium) sp. M-11 또는 아르드로박터 (Arthrobacter) sp. Q36 이 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해물에 작용하면 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 신규의 비환원성 당질을 생성한다는 것을 발견하였고, 이와 동시에 리조븀 sp. M-11 또는 아르드로박터 sp. Q36 에 의해 생성된 트레할로오스 방출 효소는 비환원성 당질을 거의 정량적으로 트레할로오스와 글루코오스 및/또는 말토올리고당으로 가수분해한다는 것을 발견하였다. 이들 효소에 의해 전분을 원료로 사용함으로써 목적으로 하는 양의 트레할로오스를 용이하게 제조할 수 있고, 트레할로오스와 관련된 위에 나온 과제를 해결할 수 있는 것으로 기대된다.
그러나, 리조븀 sp. M-11 또는 아르드로박터 sp. Q36 유래의 효소는 열안정성이 비교적 낮기 때문에, 이들 효소를 사용하여 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질과 트레할로오스를 제조하고자 할 경우, 약 55℃ 이하의 온도에서 효소를 작용시킬 필요가 있다. 이러한 효소반응의 온도에 관하여 문헌[" 효소 응용의 지식 ", 초판, pp.80∼129 (1986), " 당질 관련 효소와 그 응용 " 의 " 당질 관련 효소 " 의 항] 에 있어서 " 공업적인 당화조건에서는 55℃ 이하에서는 잡균오염의 위험성이 따르고 당화반응중에 pH 가 저하한다 " 라고 기재되어 있는 바와 같이, 전분을 원료로 하여 장시간에 걸쳐 효소반응을 시키는 경우에 있어서 55℃ 이하의 온도에서 효소를 작용시키면 잡균오염에 의해 반응액의 pH 가 저하 하여 반응 도중에 효소가 실활할 우려가 있으므로 리소자임 등을 첨가하여 잡균 오염 방지와 반응액의 pH 조정을 필요로 하는 경우도 있다. 더욱이, 전분 부분 분해물의 가수분해율이 낮으면 전분의 노화에 의한 불용성 물질이 생성될 우려도 있다.
한편, 내열성 효소는 비교적 높은 온도에서도 효소반응이 진행하므로 내열성 효소를 사용한 반응에서는 미생물 오염의 우려가 적고, 전분 부분 분해물의 노화도 일어나기 어렵다고 생각된다. 내열성 효소의 공급원으로서는 일반적으로 호열균 (thermophilic mircoorganism) 을 들 수 있다. 효열균을 사용하는 트레할로오스의 제조 방법에 관해서는 문헌 [Biotechnology Letters, Vol.12, pp.431∼432(1990) 및 Biotech Forum Europe, Vol.8, pp.201∼203 (1991)] 에 기재되어 있는 바와 같이 술폴로부스 솔파타리커스 (Sulfolobus solfataricus) (ATCC 49155) 의 균체 및 균체 추출물에서 수득되는 부분 정제 효소가 기질인 아밀로오스와 가용성 전분에 작용하면 글루코오스와 트레할로오스를 생성한다고 보고되어 있다. 그러나, 이러한효소 제품의 정제가 완료되어 있지 않고 수득한 효소의 물리화학적 성질도 불충분하게 되어 있어 효소의 작용 메카니즘이 불명료하며, 단지 트레할로오스가 생성된다는 것만을 나타내고 있는데 불과하다. 따라서, 55℃ 를 초과하는 온도에서의 효소반응이 가능한 내열성 효소를 사용함으로써 트레할로오스의 신규 제조 방법의 확립이 요망된다.
본 발명은 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질 조성물의 신규의 제조 방법을 제공함에 그 목적이 있다. 즉, 본 발명은 55℃ 이상의 온도에서도 작용할 수 있는 내열성 트레할로오스 방출 효소에 의해 환원성 전분 부분 분해물로 부터 제조되는 트레할로오스와 이것을 함유하는 당질 조성물의 신규의 제조 방법 및 이 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질 조성물 및 이들의 용도를 제공하는 것이다.
위에 나온 목적을 달성하기 위해 본 발명자들은 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도 3 이상인 비환원성 당질로 부터 트레할로오스를 방출할 수 있는 신규의 내열성 효소를 확립하고자 상기 효소를 생성할 수 있는 미생물을 호열균을 중심으로 하여 널리 검색하였다.
그 결과, 본 발명자들은 일본국 특허 출원 제 166,011/94 호에 개시된 술폴로부스속 (Sulfolobus屬) 에 속하는 술폴로부스 아시도칼다리우스 (Sulfolobus acidocaldarius) ATCC 33909 및 ATCC 49426 과, 술폴로부스 솔파타리커스(Sulfolobus solfataricus) ATCC 35091 및 ATCC 35092 가 55℃ 이상의 온도에서 작용할 수 있는 내열성 비환원성 당질 생성 효소와 신규의 내열성 트레할로오스 방출 효소를 산생 (産生) 한다는 것을 발견하였고, 또한 환원성 전분 부분 분해물에 내열성 비환원성 당질 생성 효소와 이 신규의 내열성 트레할로오스 방출 효소를 작용시킴으로써 목적으로 하는 55℃ 이상의 고온에서 트레할로오스의 제조를 용이하게 실시할 수 있다는 것도 발견하였다. 그리고, 본 발명자들은 환원성 전분 부분 분해물에 내열성 비환원성 당질 생성 효소와 신규의 내열성 트레할로오스 방출 효소를 작용시킨 다음 글루코아밀라아제 또는 α-글루코시다아제를 작용시킴으로써 고순도의 트레할로오스 함유 반응액을 얻을 수 있어 용이하게 트레할로오스를 제조할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 신규의 내열성 트레할로오스 방출 효소와 그 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 효소를 생성할 수 있는 미생물과, 이 효소로 제조된 트레할로오스 및 이것을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질의 트레할로오스 부분과 그 외의 글리코실 부분과의 사이의 결합을 특이적으로 가수분해하는 신규의 내열성 트레할로오스 방출 효소를 생성할 수 있는 미생물을 널리 검색한 결과, 목적으로 하는 미생물을 발견하였다.
따라서, 본 발명자들은 술폴로부스속 미생물들인 술폴로부스 아시도칼다리우스 ATCC 33909 및 ATCC 49426 과 술폴로부스 솔파타리커스 ATCC 35091 및 ATCC 35092 가 신규의 내열성 비환원성 당질 생성 효소를 산생할 수 있음을 발견한 것이다.
위에 나온 미생물외에도 술폴로부스속에 속하고, 글루코오스 중합도 3 이상으로서 말단 단위로서 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질의 트레할로오스 부분과 그 외의 글리코실 부분과의 사이의 결합을 특이적으로 가수분해하는 내열성 비환원성 당질 생성 효소를 생성하는 기타의 균주 및 이들 균주의 변이주 등도 본 발명에서 적절히 사용할 수 있다.
본 발명의 미생물의 배양에 사용하는 배지는 미생물이 생육할 수 있고 본 발명의 내열성 트레할로오스 방출 효소를 생산할 수 있는 영양 배지이면 좋고, 합성 배지와 천연 배지 어느것이라도 좋다. 탄소원으로서는 미생물이 자화 (資化) 할 수 있는 물질이면 좋은데, 예컨대 글루코오스, 프룩토오스, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 당밀, 환원성 전분 부분 분해물 등의 당질, 그리고 시트르산, 숙신산 등의 유기산도 사용할 수가 있다. 배지에서의 이들 탄소원의 농도는 탄소원의 종류에 따라 적절히 선택된다. 예를 들자면, 환원성 전분 부분 분해물인 경우에는 통상 20 % 이하가 바람직하고, 균의 생육과 증식의 면에서는 5 % 이하가 바람직하다. 질소원으로서는 예컨대 암모늄 염, 질산 염 등의 무기 질소 화합물과, 예컨대 우레아, 콘 스티프 리커, 카제인, 펩톤, 효모 엑스, 육 (肉) 엑스 등의 유기 질소 화합물이 사용된다.
또한, 무기 성분으로서는 예컨대 칼슘 염, 마그네슘 염, 칼륨 염, 나트륨 염, 인산 염, 망간 염, 아연 염, 철 염, 구리 염, 몰리브덴 염, 코발트 염 등이 적절히 사용된다. 본 발명에서 사용되는 미생물의 배양은 통상, 온도 40℃∼95℃, 바람직하게는 50℃∼90℃, pH 1∼7, 바람직하게는 pH 2∼6 에서 선택되는 조건에서 호기적으로 실시한다. 배양 시간은 미생물이 증식하기 시작하는 시간 이상의 시간이면 좋고, 바람직하게는 10∼100 시간이다. 그리고, 배양액의 용존 산소 농도에는, 특히 제한은 없으나 통상은 0.5∼20 ppm 이 바람직하다.
따라서, 영양 배지에서 용존 산소를 유지하기 위해 통기량을 조절하거나 교반하거나 통기에 산소를 추가하거나, 또한 퍼어멘터 (fementer) 내의 압력을 높이는 등의 수단을 채용할 수 있다. 또한, 배양 방식은 회분식 (batchwise) 배양 또는 연속식 배양중 어느것이라도 좋다.
이와 같이 하여 미생물을 배양한 후, 본 발명의 효소를 배양물로 부터 회수한다. 이 효소의 활성은 배양물의 균체에서 주로 나타난다. 이들 균체를 통상적인 방법으로 정제하여 조효소액으로 하여 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들자면, 조효소액을 황산 암모늄 염석하여 농축한 조효소 표품 (標品) 을 투석한 후, 투석 액을 " DEAE-TOYOPEARL " (음이온 교환 수지 ; 일본국 Tosoh 사제) 을 사용한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 이어서 " BUTYL-TOYOPEARL " (소수성 수지 ; 일본국 Tosoh 사제) 을 사용한 소수 (疎水) 칼럼 크로마토그래피, " TOYOPEARL HW-55 " (겔 여과용 수지 ; 일본국 Tosoh 사제) 을 사용한 겔 여과 크로마토그래피, 다시 " BUTYL-TOYOPEARL " (소수성 수지 ; 일본국의 Tosoh 사제) 을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피, " SUPER ROSE 12 " (겔 여과용 수지 ; 스웨덴국의 Pharmacia LKB 사제) 를 사용한 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제함으로써 전기 영동적으로 단일의 밴드를 나타내는 정제 효소를 얻을 수 있다.
이와 같이 하여 얻게 되는 본 발명의 내열성 트레할로오스 방출 효소는 아래와 같은 물리화학적 성질을 가진다.
(1) 작용
말단에 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질의 트레할로오스 부분과 그 외의 글리코실 부분과의 사이의 결합을 특이적으로 가수분해함.
(2) 분자량
소디움 도데실술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 의하여 약 54,000∼64,000 달톤
(3) 등전점 (pI)
양쪽성 전해질 함유 전기 영동법에 의하여 약 5.5∼6.0
(4) 최적 온도
pH 6.0 에서 30 분간 인큐베이트에서 약 75℃
(5) 최적 pH
60℃ 에서 30 분간 인큐베이트에서 약 5.5∼6.0
(6) 열적 안정성
pH 7.0 에서 60 분간 유지하여 85℃ 에서 안정
(7) pH 안정성
25℃ 에서 16 시간 유지하여 pH 약 4.5∼9.5 에서 안정
본 발명의 내열성 트레할로오스 방출 효소의 활성은 다음과 같이 측정한다. 기질로서 말토트리오실 트레할로오스 (α-말토테트라오실α-글루코시드) 1.25 w/v% (50 mM 인산 완충액, pH 6.0) 4 mℓ에 효소액을 1 mℓ가하고 60℃ 에서 30 분간 반응시킨 후 소모기 구리액 (Somogyi copper liquor) 을 가하여 효소반응을 정지시키고, 환원력을 소모기-넬슨법 (Somogyi-Nelson's method) 으로 측정한다. 대조로서 미리 100℃ 에서 30 분간 가열하여 효소를 실활 (失活) 시킨 효소액을 사용하여 위와 마찬가지로 측정한다. 위의 측정 방법을 사용하여 1 분간에 1 μmole 의 글루코오스에 상당하는 환원력을 증가시키는 효소량을 1 단위로 정의한다.
이 효소의 기질로서 말단에 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도 3 이상의 비환원성 당질이면 좋은데, 예컨대 이 효소의 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스 및 말토헵타오스 등에 비환원성 당질 생성 효소를 작용시켜 수득되는 글루코실 트레할로오스, 말토실 트레할로오스, 말토트리오실 트레할로오스, 말토테트라오실 트레할로오스 및 말토펜타오실 트레할로오스 등이 있다. 더욱이 전분, 아밀로펙틴, 아밀로오스 등의 전분질을 아밀라아제 또는 산 등에 의해 부분적으로 가수분해하여 제조되는 환원성 전분 부분 분해물에 비환원성 당질 생성 효소를 작용시켜 제조한 말단에 트레할로오스 구조를 가진 글루코오스 중합도 3 이상의 비환원성 당질을 함유하는 저환원성의 전분 부분 분해물을 사용할 수 있다.
전분을 가수분해하는 아밀라아제로서는, 예컨대 문헌 [Handbook of Amylases and Related Enzymes, published by Pergamon Press, Tokyo, Japan (1988)] 에 기재되어 있는 α-아밀라아제, 말토펜타오스 생성 아밀라아제, 말토헥사오스 생성 아밀라아제 등을 사용한다. 이들 아밀라아제를 풀룰라나아제 및 이소아밀라아제 등의지절 효소 (debranching enzyme) 와 병용하는 것도 가능하다.
환원성 전분 부분 분해물에 작용할 경우, 트레할로오스 구조를 가진 글루코오스 중합도 3 이상의 비환원성 당질을 생성하는 비환원성 당질 생성 효소로서는 일본국 특허 출원 제 349,216/93 호에 개시되어 있는 리조븀 sp. M-11 또는 아르드로박터 sp. Q36 등의 비환원성 당질 생성 효소를 사용할 수 있으나, 효소반응 온도가 55℃ 이상인 경우에는 일본국 특허 출원 제 166,011/94 호에 개시된 술폴로부스속에 속하는 내열성 비환원성 당질 생성 효소를 유리하게 사용할 수가 있다.
본 발명에서의 기질 농도는 특히 한정되지 않는다. 예컨대 0.1 % 또는 50 % 의 기질 용액으로 하여 사용할 경우에서도 이 효소반응은 진행하여 트레할로오스를 생성한다. 그리고 기질 용액중에 완전히 용해되지 않은 과잉량의 기질을 함유하는 용액이더라도 본 발명에서 사용할 수 있다. 본 발명의 효소반응 온도는 효소가 실활하지 않는 온도, 즉 85℃ 부근까지의 온도, 바람직하게는 55∼70℃ 의 온도범위를 이용한다. 본 발명의 효소반응에서의 반응 pH 는 4∼10 의 범위로 조정하지만 바람직하게는 pH 약 5∼7 의 범위로 조정한다. 반응시간은 효소 반응의 진행에 따라 적절히 선택한다.
환원성 전분 부분 분해물을 사용하는 본 발명에 의한 트레할로오스의 제조 방법은 일본국 특허 출원 제 349,216/93 호 명세서에 기재된 방법, 즉 비환원성 당질 생성 효소와 글루코아밀라마제의 반응에 의해 수득되는 반응액과 비교하면 현저하게 트레할로오스의 생성량이 증가하고 있다. 더욱 구체적으로는 상기 일본국 특허 출원에서의 비환원성 당질 생성 효소와 글루코아밀라아제의 반응에 의해 제조되는 트레할로오스 생성율은 약 30 % 인데 반하여, 본 발명의 비환원성 당질 생성 효소와 트레할로오스 방출 효소를 함께 작용시키는 반응에서는 트레할로오스 생성율이 약 60 % 또는 그 이상이다.
본 발명의 효소반응은 다음과 같다. 즉, 먼저 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해물 1 분자가 비환원성 당질 생성 효소에 의해 말단에 트레할로오스 구조를 가진 1 분자의 비환원성 당질로 변환되고, 이 비환원성 당질이 트레할로오스 방출 효소의 가수분해반응에 의해 1 분자의 트레할로오스와 글루코오스 중합도가 2 감소된 1 분자의 환원성 전분 부분 분해물을 생성한다. 새로 생성된 환원성 전분 부분 분해물의 글루코오스 중합도가 3 이상인 경우에는 이 환원성 전분 부분 분해물이 다시 비환원성 당질 생성 효소에 의해 말단에 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질로 변환된 다음 트레할로오스 방출 효소에 의해 1 분자의 트레할로오스와 환원성 전분 부분 분해물을 생성한다. 이 비환원성 당질 생성 효소의 반응과 트레할로오스 방출 효소의 반응을 반복함으로써 1 분자의 환원성 전분 부분 분해물로 부터 복수 분자의 트레할로오스를 생성시킬 수 있다.
위에서 설명한 효소반응에서 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해물에 비환원성 당질 생성 효소와 본 발명의 트레할로오스 방출 효소를 동시에 작용시킬 수 있고, 이 환원성 전분 부분 분해물에 먼저 비환원성 당질 생성 효소를 작용시킨 다음 본 발명의 트레할로오스 방출 효소를 작용시킬 수도 있다. 필요에 따라 다시 글루코아밀라아제를 작용시켜 트레할로오스 함량을 증가시킬 수도 있다.
반응액은 통상적인 방법으로 여과, 원심 분리 등에 의해 불용물을 제거한 후활성탄으로 탈색하고, H 형 및 OH 형 이온 교환 수지로 탈염해서 정제하여 농축한 다음 시럽상 제품으로 한다. 더욱이, 건조하여 분말상 제품으로 할 수도 있다. 필요에 따라서는 분말상 제품을 고도의 정제를 하는 것도 마음데로이다. 예를 들자면, 이온 교환 칼럼 크로마토 그래피, 활성탄 칼럼 크로마토그래피, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 등의 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획, 알코올과 아세톤 등의 유기 용매에 의한 분별, 알칼리 처리에 의한 잔존 환원성 당질의 분해 제거 등의 방법으로 정제함으로써 고순도의 트레할로오스 제품을 얻는 것도 용이하다.
이와 같이 해서 제조된 트레할로오스 구조를 가진 본 발명의 비환원성 당질을 필요에 따라 아밀라아제, 예컨대 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 글루코아밀라아제 등과, α-글루코시다아제, 트레할라아제로 가수분해하거나, 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제 및/또는 글루코실트란스퍼라아제 등으로 당전이반응시켜 감미성, 환원력 등을 조정하거나 점성을 저하시키며, 또한 수소 첨가하여 잔존하는 환원성 당질을 당알코올로 하여 환원력을 소멸시키는 등의 가공 처리를 할 수도 있다. 앞서 나온 정제 방법, 예컨대 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 등으로 글루코오스를 제거하여 트레할로오스 고함유 획분을 채취한 다음 이것을 정제, 농축하여 시럽상 제품을 얻는 것도, 더욱이 시럽상 제품을 농축하여 과포화 용액으로 하여 결정화하여 트레할로오스 함수 결정 또는 무수 결정 트레할로오스를 얻는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 이온 교환 칼럼 크로마토그래피로서는 일본국 특허 공개 제 23,799/83 호 공보와 특허 공개 제 72,598/83 호 공보 등에 개시되어 있는강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 예로 들 수 있다. 이 방법을 사용하여 트레할로오스 조 (粗) 생성물중에 함유된 협잡당류를 용이하게 제거하여 트레할로오스 고함유 제품을 얻을 수 있다. 이 경우에 있어서 고정상 방식, 이동상 방식, 의사 (擬似) 이동상 방식중 어느 방식을 채용해도 좋다.
트레할로오스 함수 결정을 제조하자면, 예컨대 순도 약 60 % 이상, 농도 약 65∼90 % 의 트레할로오스 함유액을 결정화기에 넣고, 필요에 따라 0.1∼20 % 의 종정 존재하에 온도 95℃ 이하, 바람직하게는 10∼90℃ 의 범위에서 교반하면서 서서히 냉각하여 트레할로오스 함수 결정을 함유하는 매스키트 (massecuite) 를 제조한다. 또한, 트레할로오스 용액을 감압 농축하면서 트레할로오스 함수 결정을 제조하는 연속 결정화법을 채용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 매스키트로 부터 트레할로오스 함수 결정 또는 이것을 함유하는 당질 결정을 제조하는 방법은, 예컨대 분리 방법, 블록 물체 방법, 유동 조립 (造粒) 방법, 분무 건조 방법 등 공지의 방법을 채용하면 좋다.
분리 방법의 경우에는 통상, 매스키트를 바스켓형 원심 분리기에서 처리하여 트레할로오스 함수 결정과 모액을 분리하고, 필요에 따라 이 결정에 소량의 냉수를 분무하여 트레할로오스 함수 결정을 세척하여 보다 고순도의 트레할로오스 함수 결정을 용이하게 제조할 수 있다. 분무 건조 방법의 경우에는 통상, 농도 60∼85 %, 결정화율 약 20∼60 % 정도의 매스키트를 고압 펌프로 노즐로 부터 분무하여 결정 분말이 용해하지 않는 온도, 예컨대 60∼100℃ 의 열중으로 건조한 다음 30∼60℃ 의 온풍으로 약 1∼20 시간 숙성하면 비흡습성 또는 난 (難) 흡습성의 당질 결정을용이하게 제조할 수 있다. 그리고, 블록 분쇄 방법의 경우에는 통상, 수분 10∼20 %, 결정화율 10∼60 % 정도의 매스키트를 약 수시간 내지 약 3 일간 정치하고 결정화하여, 블록상으로 고화시킨 다음 이것을 분쇄 또는 절삭 등의 방법으로 분말화하여 건조하면 비흡습성 또는 난흡습성의 당질 결정을 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 무수 결정 트레할로오스를 제조하자면 트레할로오스 함수 결정을 건조하여 무수 상태의 것으로 변환시킬 수도 있으나, 일반적으로는 수분 10 % 미만의 고농도 트레할로오스 고함유 용액을 결정화기에 넣고 종정 존재하에 50∼160℃, 바람직하게는 80∼140℃ 의 범위에서 교반하면서 무수 결정 트레할로오스를 함유하는 매스키트를 제조하고, 이것을 비교적 고온 건조 조건하에서, 예컨대 블록 분쇄 방법, 유동 조립 (造粒) 방법, 분무 건조 방법 등의 방법으로 결정화하고 분말화하여 무수 결정 트레할로오스를 제조한다.
이와 같이 하여 제조되는 본 발명의 트레할로오스는 실질적으로 환원력이 없고 안정하여 기타 소재, 특히 아미노산 및 올리고펩티드, 단백질 등의 아미노산 함유 물질과 혼합 가공하여도 갈변하는 일도 없고 악취를 발생하는 일도 없으며, 혼합한 다른 소재를 상하게 하는 일도 없다. 또한, 트레할로오스 자체가 양질로서 상품의 감미를 가지고 있다. 더욱이, 트레할로오스는 트레할라아제에 의하여 용이하게 가수분해되어 글루코오스로 되므로, 트레할로오스는 경구 섭취에 의하여 소화 흡수되어 칼로리원으로서 이용된다. 또한, 트레할로오스는 충치 유발균 등에 의하여 발효되기 어려우므로 충치를 일으키기 어려운 감미료로서도 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 트레할로오스는 경관 (經管) 영양제, 수액제 (輪液劑) 등으로 하여 비경구적으로 사용되며, 독성, 부작용의 우려도 없이 대사, 이용되어 생체에의 에너지 보급에 유리하게 이용할 수 있다. 그리고, 본 발명의 트레할로오스는 안정한 감미료이므로 트레할로오스 결정 제품의 경우에는 풀룰란, 히드록시에틸 스타아치, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제와 병용하여 정제 (tablet) 의 당의제로서 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 더욱이, 트레할로오스는 삼투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성 부여성, 기타의 결정화 방지성, 난발효성, 전분 노화방지성 등의 성질을 가지고 있다.
따라서, 본 발명의 트레할로오스 및 이것을 함유하는 당질은 감미료, 정미 (呈味) 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 음식물, 기호물, 사료, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명의 트레할로오스 밀 이것을 함유하는 당질은 그대로 감미 부여를 위한 조미료로서 사용할 수 있다. 필요하다면, 예컨대 분말 시럽, 글루코오스, 말토오스, 수크로오스, 이성화당, 꿀, 메이플 슈거, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α-글리코실 스테비오시드, 레바우디오시드, 글리시리진, L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르, 사카린, 글리신 및 알라닌 등과 같은 기타 감미료의 1 종 또는 2 종 이상의 적당량과 혼합해서 사용하여도 좋고, 또한 필요하다면 덱스트린, 전분, 락토오스 등과 같은 증량제와 혼합하여 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 트레할로오스 및 이것을 함유하는 당질의 분말상 내지 결정상 제품은 그대로 또는 필요에 따라 증량제, 희석제, 부형제, 결합제 등과 혼합하여 과립, 구상, 단봉상, 판상, 입방체, 정제 등 각종 형상으로 성형하여 사용할 수도 있다. 그리고, 본 발명의 트레할로오스 및 이것을 함유하는 당질 조성물은 신맛, 짠맛, 떫은 맛, 단맛, 쓴맛 등의 기타 정미를 가진 각종 물질과 잘 조화하고, 내산성과 내열성도 크다. 따라서, 일반적인 음식물의 감미료, 맛 개선제 및 품질 개량제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명의 트레할로오스 및 이것을 함유하는 당질 조성물은, 예를 들자면 간장, 분말 간장, 된장, 분말 된장, 정제술, 정제 간장, 어육 조미품, 마요네즈, 드레싱, 식초, 산바이주 (설탕, 간장, 식초로 된 소오스), 초밥용 분말 식초, 츄가 노 모토 (중화 요리용 인스탄트 믹스), 텐츠유 (일본식 튀김 식품용 소오스), 멘츠유 (일본식 버어미 셀리용 소오스), 소오스, 켓찹, 야구니쿠 노 타레 (일본식 불고기용 소오스), 커리 루우, 인스탄트 스튜우 믹스, 인스탄트 수우프 믹스, 다시 노 모토 (인스탄트 스톡 믹스), 복합 조미료, 미린 (감미나는 술), 신미린 (합성 미린), 테이블 슈거, 커피 슈거 등 각종 조미료로서 유리하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 트레할로오스 및 이것을 함유하는 당질 조성물은, 예컨대 각종 일본식 과자류 [예 : 센베이 (쌀 크래커), 아라레모치 (입방체의 쌀떡), 오코시 (기장과 쌀로 된 케이크), 모치 (쌀풀), 만주 (팥 잼 넣은 만두), 우이로 (단맛의 젤리), 안 (팥 잼), 요캉 (단맛의 팥 젤리), 미즈요캉 (연질의 아즈키 팥 젤리), 킹요쿠 (요캉의 일종), 젤리, 파오드 카스텔라, 아메다마 (일본식 토피)] ; 양과자류 [예 : 빵, 비스켓, 크래커, 쿠우키, 파이, 푸딩, 버터 크리임, 커스터드 크리임, 크리임 퍼프, 와플, 스폰지 케이크, 도우넛, 초콜렛, 츄잉 검, 카라멜, 캔디] ; 빙과류 [예 : 아이스 크리임, 셔어벳] ; 시럽류 [예 : 과실의 시럽 절임, 빙수용 설탕 시럽] ; 페이스트류 [예 : 플라워 페이스트, 피이넛 페이스트, 푸루트 페이스트, 스프레드] ; 과실과 야채의 가공 식품류[예 : 잼, 마아멀레이드, 시럽 즈케 (과실 피클류), 토카 (당과)] ; 절임 및 절임 제품 [예 : 푸쿠진 즈께 (적색의 무우 피클), 베타라 츠케 (통무우 피클), 센마이 즈케 (썰은 무우 절임), 라쿄 즈케 (파 절임)] ; 절임 및 절임 제품의 프리믹스 [예 : 단무지 프리믹스, 배추절임 프리믹스] ; 축육 제품류 [예 : 햄, 소오세지] ; 어육제품 [예 : 어육햄, 어육소오세지, 어묵, 치쿠와 (어묵의 일종), 튀김] ; 각종 진미류 [예 : 성게 내장젓, 오징어젓, 가공된 다시마, 말린 오징어채, 미린으로 조미된 말린 복어] ; 츠쿠다니 (간장에 끓인 음식) [예 : 김, 산채, 말린 오징어, 소어 (小魚), 조개] ; 평상시 식품 [볶은 팥, 감자 샐러드, 다시 말이] ; 우유 제품 ; 축육, 어육, 과실, 야채 등의 통조림, 병조림 ; 주류 [예 : 합성주, 와인, 양주 등] ; 청량 음료수 [예 : 커피, 차, 코코아, 주우스, 탄산 음료, 유산 음료, 유산균 음료 등] ; 즉석 식품 [예 : 인스탄트 푸딩 믹스, 인스탄트 핫 케이크 밀스, 즉석 시루코, 즉석 수우프 믹스] ; 각종 음식물 [예 : 이유식, 치료식, 드링크제, 펩티드 식품, 냉동식품 등] 에 대한 감미 부여, 맛 개량, 품질 개량 등에 유리하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 트레할로오스 및 이것을 함유하는 당질 조성물은 가축, 가금, 꿀벌, 누에, 물고기 등의 사육 동물을 위한 사료, 이료 등의 기호성을 향상시킬 목적으로 사용할 수 있다. 그리고 본 발명의 트레할로오스 및 이것을 함유 하는 당질 조성물은 담배, 치약, 입술 연지, 립 크림, 내복액, 정제, 트로치, 간유 드롭, 구중 청량제, 구중 향제, 가아글제 등 각종 고형물, 페이스트상, 액상 등으로 하여 기호물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 대한 감미제로서 또는 정미 개량제, 교미제로서, 더욱이는 품질 개량제, 안정제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명의 트레할로오스 및 이를 함유하는 당질 조성물은 유효 성분, 활성 등을 상실하기 쉬운 각종 생리 활성 물질 또는 이것을 함유한 건강 식품, 의약품 등에 품질 개량제와 안정제로서 유리하게 적용할 수 있다. 예를 들자면, 림포카인류 [예 : α-, β- 및 r-인터페론, 종양 괴사인자-α(TNF-α), 종양 괴사인자-β(TNF-β), 대식세포 유주 (遊走) 저지인자, 콜로니 자극인자, 트랜스퍼 팩터, 인터로이킨 II (IL-2) 등] ; 호르몬류 [예 : 인슐린, 성장 호르몬, 프로락틴, 에리트로포이에틴, 난세포 자극 호르몬 등] ; 생물제제 [예 : BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 폴리오 생백신, 천연두 백신, 파상풍 톡소이드, 반시뱀 항독소, 인간 면역 글로불린 등] ; 항생 물질 [예 : 페니실린, 에리드로마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 황산 카나마이신 등] ; 비타민류 [예 : 티아민, 리보플라빈, L-아스코르브산, 간유, 카로티노이드, 에르고스테롤, 토코페롤 등] ; 효소류 [예 : 리파아제, 엘라스타아제, 우로키나아제, 프로테아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제 등] ; 에스류 [예 : 약용 인삼 엑스, 자라 엑스, 글로렐라 엑스, 알로에 엑스, 프로폴리스 엑스 등] ; 생균류 [예 : 바이러스, 유산균, 효모 등] ; 기타 생리활성 물질 [예 : 로얄젤리 등] 도 그 유효 성분, 활성을 상실함이 없이 안정하고도 고품질의 건강 식품이나 의약품등을 용이하게 제조할 수 있게 된다.
이상 설명한 각종 물질과 조성물에 본 발명의 트레할로오스 및 이것을 함유하는 당질 조성물을 함유시키는 방법은 그 제품이 완성되기 까지의 공정에서 함유시키면 좋은데, 예를 들자면 혼화, 용해, 융해, 침지, 침투, 살포, 도포, 피복, 분무, 주입, 결정화, 고화 등 공지의 방법이 적절히 선택된다. 트레할로오스와 당질 조성물의 첨가량은 통상적으로 0.1 % 이상, 바람직하게는 1 % 이상 함유시키는 것이 바람직하다.
이하 실험에 의하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
실험 1 : 효소의 제조
펩톤 0.1 w/v %, 효모 엑스 0.1 w/v %, 황산 암모늄 0.2 w/v %, 인산 칼륨 0.05 w/v %, 황산 마그네슘 0.02 w/v %, 염화 칼륨 0.02 w/v % 및 물로 된 액체 영양 배지를 용량 500 mℓ의 삼각 플라스크에 약 100 mℓ에 넣고 오토클레이브에서 120℃ 에서 20 분간 멸균하여 냉각후 황산으로 pH 3.0 으로 조정하였다. 이 액체 배지에 술폴로부스 아시도칼다리우스 ATCC 33909 를 접종하고 75℃, 130 r.p.m. 에서 24 시간 교반하에 배양한 것을 제 1 차 종배양액으로 사용하였다. 용량 10 ℓ의 퍼어멘터 (fermenter) 에 제 1 차 종배양액의 경우와 동일한 조정의 영양 배지 약 5 ℓ을 넣고 살균 후 75℃ 로 냉각한 다음 pH 3.0 으로 조정하여 제 1 차 종배양액 1 v/v % 을 접종하고 75℃ 에서 48 시간 동안 통기량 500 mℓ/min 에서 통기 교반 배양한 것을 제 2 차 종배양액으로 하였다. 용량 300 ℓ의 퍼어먼터에 제 1 차 종배양액의 경우와 동일한 조성의 배지 약 250 ℓ을 넣고 살균하여 75℃ 로 냉각한후 pH 3.0 으로 조정하여 75℃ 에서 42 시간 동안 통기량 100 mℓ/min 에서 통기 교반 배양하였다. 배양액중에 축적된 트레할로오스 방출 효소의 효소활성은 약 0.03 단위/mℓ이었다.
실험 2 : 효소의 정제
실험 1 의 방법으로 수득한 배양액 약 170 ℓ을 원심분리하여 균체를 습중량으로 258 g 을 회수하였다. 이 균체에 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 을 300 mℓ가하고 현탁한 후 초음파 파쇄기 (일본국의 주식회사 日本精機 제작소제의 모델 " US 300 ") 에서 균체를 파쇄하였다. 파쇄액을 10,000 r.p.m. 에서 30 분간 원심분리하여 상청액 약 300 mℓ을 얻고, 이 상청액에 포화도 0.7 이 되도록 황산 암모늄을 가해 용해시킨 다음 4℃ 에서 24 시간 방치한 후 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 수득한 침전물을 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.5) 에 용해시킨 후 동일한 염산 완충액에 대해 24 시간 투석하고 원심분리하여 불용물을 제거하였다. 수득한 투석액 (약 600 mℓ) 을 두 부분으로 나누어 " DEAE-TOYOPEARL " (일본국의 Tosoh 사제의 이온 교환 수지) 을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양 : 약 350 mℓ) 를 하였다.
" DEAE-TOYOPEARL " 에 흡착된 목적의 내열성 트레할로오스 방출 효소와 내열성 비환원성 당질 생성 효소를 0.1 M 염화 나트륨 함유의 10 mM Tris-HCl 완충액으로 칼럼으로 부터 용출시켜 용출된 효소활성 획분을 회수하였다.
수득한 효소활성 획분을 1 M 황산 암모늄을 함유한 동일한 10 mM Tris-HCl 완충액에 대해 투석하였다. 수득한 투석액을 원심분리하여 불용물을 제거하고, 수득한 상청액을 " BUTYL-TOYOPEARL 650 " (일본국의 Tosoh 사제의 소수 (疎水) 겔) 을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양 : 350 mℓ) 로 처리하였다. 겔에 흡착된 효소를 1 M 로 부터 0 M 까지의 황산 암모늄 농도의 직선 기울기에서 칼럼으로 부터 용출시킨 결과, 내열성 트레할로오스 방출 효소와 내열성 비환원성 당질 생성 효소는 상이한 황산 암모늄 농도에서 각각 용출하였다. " BUTYL-TOYOPEARL " 칼럼의 용출 패턴은 제 1 도에 나와 있다. 내열성 비환원성 당질 생성 효소는 황산 암모늄 농도 약 0.2 M 에서, 그리고 트레할로오스 방출 효소는 약 0.8 M 에서 칼럼으로 부터 용출되었다. 각각의 효소 활성 획분을 회수하여 정제하였다.
내열성 비환원성 당질 생성 효소 제품을 0.2 M 염화 나트륨을 함유한 동일한 10 mM Tris-HCl 완충액에 대해 투석하고, 이 투석액을 원심분리하여 불용물을 제거하였다. 수득한 상청액을 " ULTROGEL AcA 44 " (미합중국의 Sepracor 사제의 겔 여과용 수지) 을 사용한 겔 여과 크로마토그래피 (겔의 양 : 350 mℓ) 처리하여 효소활성 획분을 회수한 후, 동일한 10 mM Tris-HCl 완충액에 대해 투석하고, 수득한 상청액을 " MONO Q " (스웨덴국의 Pharmacia LKB 사제의 이온 교환 수지) 을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양 : 10 mℓ) 처리하였다. 이온 교환 수지에 흡착된 효소를 0 M 으로 부터 0.2 M 까지의 염화 나트륨 농도의 직선 기울기에서 칼럼으로 부터 용출시켜 0.1 M 염화 나트륨 농도 부근에서 용출한 획분을 회수하였다.
목적의 내열성 트레할로오스 방출 효소는 " BUTYL-TOYOPEARL " 칼럼으로 부터 용출된 획분들을 " TOYOPEARL HW-55 " 를 사용한 겔 여과 크로마토그래피하여효소 활성 획분을 회수함으로써 정제하였다. 수득한 획분을 다시 " BUTYL-TOYOPEARL 650 " 을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피한 다음 " SUPER ROSE 12HR 10/30 " 칼럼 (Pharmacia 사제) 을 사용한 겔 여과 크로마토그래피하여 내열성 트레할로오스 방출 효소의 효소활성 획분을 회수하였다.
그리고, 본 명세서에서 본 발명의 내열성 비환원성 당질 생성 효소의 효소활성은 별달리 명시하지 않는 한 다음의 방법으로 측정한 활성치 (단위) 로 나타낸다. 즉, 말토펜타오스를 1.25 w/v % 함유하는 50 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) 4 mℓ에 효소액 1 mℓ을 가하고 60℃ 에서 60 분간 인큐베이트하였다. 이 반응액을 100℃ 에서 100 분간 가열하여 효소반응을 정지시키고, 이 반응액을 증류수로 정확히 10 배 희석한 후 소모기-넬슨법으로 희석액의 환원력을 측정하였다. 이 효소의 1 단위는 위의 조건하에서 1 분간에 말토펜타오스 1 μmol 에 상당하는 환원력을 저하시키는 효소의 양으로 정의하였다.
정제의 각 공정에서의 효소 활성, 비활성 (比活性) 및 수율을 내열성 비환원성 당질 생성 효소의 경우는 표 1 에, 그리고 분 발명의 내열성 트레할로오스 방출 효소의 경우는 표 2 에 나타내었다.
표 1
표 2
표 1 과 표 2 의 공정에서 각각 겔 여과 용출액으로서 수득한 정제 내열성 비환원성 당질 생성 효소 제품과 정제 내열성 트레할로오스 방출 효소 제품을 폴리아크릴아미드 겔 (겔 농도 : 7.5 %) 을 사용하는 전기 영동법으로 순도를 검정한 결과, 각 효소에서는 단백질 밴드는 단 하나가 나타났는데, 이것은 수득한 효소 제품이 고순도인 것을 뜻한다.
실험 3 : 물리화학적 성질
실험 3-1 : 내열성 트레할로오스 방출 효소의 성질
실험 2 에서 수득한 정제 내열성 트레할로오스 방출 효소 제품을 소디움 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 (겔 농도 : 10 %) 을 사용하는 전기 영동법으로 처리하고, 동시에 영동 처리된 분자량 마아커 (marker) (일본국의 Bio-Rad Laboratories 주식회사제) 와 비교하여 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 54,000∼64,000 달톤이었다.
이 정제 효소 제품을 폴리아크릴아미드 겔 (2 v/v % " Ampholine " 함유, 스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology 사제의 양쪽성 전해질) 을 사용하는 등전점 전기 영동법으로 처리한 후, 겔의 pH 를 측정하여 이 효소의 등전점 (pI) 을 구한 결과, 등전점은 약 5.6∼6.6 이었다.
본 발명의 효소 활성에 대한 온도의 영향과 pH 의 영향을 활성 측정 방법에 준하여 조사하였다. 그 결과는 제 2 도 (온도의 영향) 와 제 3 도 (pH 의 영향)에 각각 나와 있다. 이 효소의 최적 온도는 pH 6.0 에서 30 분간 반응에서는 약 75℃ 이었고, 최적 pH 는 60℃ 에서 30 분간 반응에서 약 5.5 ∼ 6.0 이었다. 이 효소의 열적 안정성은 효소 용액 (50 mM 인산 완충액을 함유, pH 7.0) 을 각 온도에서 60 분간 유지하고 물로 냉각한 후 각 완충액에 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 그리고, 이 효소의 pH 안정성은 이 효소를 각 pH 의 50 mM 인산 완충액 중에서 25℃ 에서 16 시간 유지한 후 pH 를 7 로 조정하고 각 완충액에 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과는 제 4 도 (열적 안정성) 와 제 1 도 (pH 안정성) 에 나와 있다. 이 효소의 안정성은 약 85℃ 까지 안정하였고, pH 안정성은 약 5.5∼9.5 이었다.
이 효소의 아미노산 배열을 미합중국의 Perkin Elmer 사제의 Protein Sequencer " MODEL 473A " 를 사용하여 N 말단으로 부터 10 아미노산 잔기까지 분석한 결과, 이 효소의 N 말단 부분 아미노산 배열은 메티오닌-페닐알라닌-세린-페닐알라닌-글리신-글리신-아스파라긴-이소로이신-글루타민-리신이었다.
실험 3-2 : 내열성 비환원성 당질 생성 효소의 성질
실험 2 의 방법으로 얻은 정제 내열성 비환원성 당질 생성 효소를 SDS-폴리아크릴아미드 겔(겔 농도 : 10 %) 을 사용하는 전기 영동법으로 처리하고, 동시에 영동 처리한 분자량 마아커와 비교하여 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량은 약 69,000∼79,000 달톤에 상응한 전기 영동적으로 단일의 밴드를 나타내었다. 이 정제 효소를 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 등전점 전기 영동법으로 처리하고 수득한 겔의 pH 를 측정하여 이 효소의 등전점 (pI) 을 구한 결과, 등전점은 약 5.4∼6.4 이었다.
이 효소의 활성에 대한 온도의 영향과 pH 의 영향을 효소 활성 측정 방법에 준하여 조사하였다. 이 효소의 최적 온도는 약 75℃ 이었고, 최적 pH 는 약 5.0∼5.5 이었다. 이 효소의 열적 안정성과 pH 안정성을 실험 3-1 의 방법에 따라조사한 결과, 이 효소의 온도 안정성은 약 85℃ 까지이었고, pH 안정성은 약 4.0∼9.5 이었다.
이 효소의 아미노산 배열을 실험 3-1 의 방법에 따라 분석한 결과, 이 효소의 N 말단 부분 아미노산 배열은 메티오닌-이소로이신-세린-알라닌-트레오닌-티로신-아르기닌-로이신-글루타민-로이신이었다.
실험 4 : 내열성 트레할로오스 방출 효소에 의한 트레할로오스 제조
실험 4-1 : 비환원성 당질 생성 효소의 제조
말토오스 2.0 w/v %, 펩톤 0.5 w/v %, 효모 엑스 0.1 w/v %, 인산 수소 2 나트륨 0.1 w/v %, 인산 수소 2 칼륨 0.1 w/v % 으로 된 액체 영양 배지를 제조 하였다. 500 mℓ 용량의 삼각 플라스크에 이 배지를 약 100 mℓ의 넣고 오토클레이브에서 120℃ 에서 20 분간 멸균하고 냉각한 다음, 리조븀 sp. M-11 (FERM BP-4130) 을 접종하고, 27℃에서 24 시간 진탕 배양한 것을 종배양액 (seed culture) 으로 하였다. 별도로 용량 30 ℓ의 퍼어멘터 (fermenter) 에 종배양의 경우와 동일한 조성의 영양 배지 약 20 ℓ를 넣고 멸균 후 종배양액 1 w/v % 을 접종하고 온도 30℃, pH 6∼8 로 유지하면서 약 72 시간 통기 교반 배양하였다. 배양물을 초고압 균체 파쇄장치 " MINI-LAB " (일본국의 大日本 제약 주식회사제) 로 처리하여 균체를 파쇄하였다. 수득물을 원심 분리하여 불용물을 제거한 다음 황산 암모늄으로 염석하고, 이어서 " DEAE-TOYOPEARL " (일본국의 Tosoh 사제의 음이온 교환 수지) 을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, " BUTYO-TOYOPEARL " (일본국의 Tosoh 사제의 소수성 수지) 을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피 및 " TOYOPEARL HW-55 " (일본국의 Tosoh 사제의 겔 여과용 수지) 을 사용한 겔 여과 크로마토그래피를 하여 정제 함으로써 비활성 195 단위/mg 단백질의 비환원성 당질 생성 효소를 배양물 1 ℓ당으로 환산하여 약 220 단위의 수득량으로 얻었다.
그리고 리조븀 sp. M-11 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 활성은 실험 2 의 방법중에서 기질인 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 과 반응온도 60℃ 대신에 50 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) 과 반응온도 40℃ 로 바꾸어 분석하였다.
실험 4-2 : 말단에 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질의 제조
말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스 또는 말토헵타오스의 20 % 수용액에 실험 4-1 의 방법으로 제조한 정제 효소 제품을 기질 고형물 1 g 당 2 단위의 비율로 가하여 40℃, pH 7.0 에서 48 시간 효소 반응시킨 후, 통상의 방법에 따라 잔존 효소의 가열 실활, 여과, 탈색, 탈염, 농축하고 알칼리 금속형 강산성 양이온 교환 수지 " XT-1016 " (Na+형, 가교도 4 %, 일본국 東京 유기화학공업 주식회사제) 를 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 하였다. 이 경우에 있어서, 수지를 내경 2.0 cm, 길이 1 m 의 쟈켓부 스테인레스제 칼럼 3 개에 충전하고 직렬로 연결하여 칼럼내 온도를 55℃ 로 유지하면서 반응 당액을 수지에 대하여 5 v/v % 가하고, 여기에 55℃ 의 온수를 SV 0.13 에서 흘려 분획함으로써 말단에 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 고순도 비환원성 당질의 획분을 얻었다. 수득한 고순도 제품중에서 비환원성 당질의 순도는 95.0% 이상이었다. 수득한 0.1 N 획분에 수산화 나트륨을 가하고 100℃ 에서 2 시간 가열하여 잔존하는 환원성 당질을 분해하였다. 이 용액을 활성탄으로 탈색하고 이온 교환 수지 (H 형, OH 형) 로 탈염하여 순도 99.0 % 이상의 α-글루코실 트레할로오스, α-말토실 트레할로오스, α-말토트리오실 트레할로오스, α-말토테트라오실 트레할로오스 및 α-말토펜타오실 트레할로오스의 비환원성 당질 고함유 제품을 제조하였다.
실험 4-3 : 내열성 트레할로오스 방출 효소에 의한 비환원성 당질로 부터의 트레할로오스의 제조
실험 4-2 의 방법으로 제조한 상기 5 종의 비환원성 당질 각각의 5 % 수용액을 제조하고, 각각에 실험 2 에서 제조한 정제 내열성 트레할로오스 방출 효소를 기질 고형물 1 g 당 2 단위의 비율로 가하여 60℃, pH 5.5 에서 48 시간 효소반응시킨 후 탈염하고, " WAKOBEADS WB-T-330 " 칼럼 (일본국 和光鈍藥공업 주식회사제) 을 사용한 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 로 반응 생성물을 분석하였다. 대조로서 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스에 정제 내열성 트레할로오스 방출 효소를 마찬가지로 작용시켜 고속 액체 크로마토그래피로 분석하였다. 이들의 결과를 표 3 에 나타내었다.
표 3
표 3 의 결과로 부터 명백한 바와 같이,
1. 내열성 트레할로오스 방출 효소는 말단에 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질의 트레할로오스 부분과 글리코실 부분 사이의 결합을 특이적으로 가수분해하여 트레할로오스와 글루코오스 중합도가 1 이상인 환원성 당질을 생성한다.
2. 말토올리고당은 본 발명의 내열성 트레할로오스 방출 효소에 의하여 전혀 작용을 받지 않는다.
이들의 결과로 부터 본 발명의 내열성 트레할로오스 방출 효소는 말단에 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질의 트레할로오스 부분과 기타의 글리코실 부분과의 사이의 결합을 극히 특이적으로 가수 분해하여 트레할로오스를 유리하는 전혀 새로운 작용기구를 가진 효소인 것으로 판단된다.
실험 5 : 환원성 전분 부분 분해물로 부터의 트레할로오스의 제조
5 % 왁시 콘 스타아치 (waxy corn starch) 현탁액을 가열 호화시킨 후, pH 4.5, 온도 50℃ 로 조정하고, 여기에 이소아밀라아제 (주식회사 林原생물화학 연구소제)를 전분 1 g 당 4,000 단위의 비율이 되도록 가하고 20 시간 효소 반응시켰다. 이 반응액을 오토크레이브 처리 (120℃, 10 분간) 한 다음 60℃ 로 냉각하고 이것을 " TOYOPEARL HW-50 수지 " (일본국 Tosoh 사제) 를 사용한 겔 여과 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양 : 750 mℓ) 처리하여 글루코오스 중합도 37∼11 의 환원성 전분 부분 분해물을 제조하였다.
수득한 환원성 전분 부분 분해물 또는 글루코오스 중합도 3 의 말토트리오스를 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 1 % 농도로 조정하고, 여기에 실험 2 의 방법으로 제조한 정제 내열성 비환원성 당질 생성 효소 제품 및 정제 내열성 트레할로오스 방출 효소 제품을 각각 기질 고형물당 4 단위의 비율로 가하고 40℃ 에서 24 시간 효소반응시킨 후 반응액중의 일부를 채취하여 탈염하고 고속 액체 크로마토그래피로 반응 생성물을 분석하였다. 나머지의 반응액은 다시 50℃, pH 4.5 로 조정한 후 글루코아밀라아제 (일본국의 生化學공업 주식회사제) 를 기질 고형물당 50단위의 비율로 가하고 10 시간 효소반응시켜 마찬가지로 탈염하고 고속 액체 크로마토그래피로 반응 생성물을 분석하였다. 이들의 결과는 표 4 에 나와 있다.
표 4
표 4 에 있는 바와 같이 내열성 비환원성 당질 생성 효소와 내열성 트레할로오스 방출 효소를 작용시킨 후의 트레할로오스 생성율은 글루코오스 중합도 3 의 말토트리오스에서는 2.2 % 로 비교적 낮은 값이었으나, 글루코오스 중합도 10.8∼36.8 의 전분 부분 분해물에서는 63.3∼81.2 % 의 높은 값이 얻어졌다. 원료인 환원성 전분 부분 분해물의 글루코오스 중합도가 높을수록 수득되는 트레할로오스 순도가 높은 것도 판명되었다. 더욱이, 이들 두가지 효소를 작용시킨 반응액에 글루코아밀라아제를 작용시켜 말단에 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3 이상인 잔존하는 비환원성 당질을 트레할로오스와 글루코오스로 분해 함으로써 생성하는 트레할로오스 순도가 보다 높아지는 것도 판명하였다.
실험 6 : 기타의 술폴로부스속 미생물 유래의 내열성 트레할로오스 방출 효소의 제조 및 그 성질
술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 대신에 술폴로부스 아시도칼다리우스(ATCC 49426), 술폴로부스 술파타리커스 (ATCC 35091) 및 술폴로부스 솔파타리커스(ATCC 35092) 를 사용한 이외는 실험 1 과 마찬가지로 영양 배지를 만들어 미생물을 접종하여 퍼어멘터에서 42 시간 배양하였다. 각각의 배양액 약 170 ℓ로 부터 균체를 회수하여 실험 2 의 방법으로 초음파 파쇄하여 상청액을 얻어 이것을 황산 암모늄으로 염석한 다음 투석하고, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피와 소수 칼럼 크로마토그래피로 처리하여 부분 정제 효소 제품을 얻어 그 성질을 조사하였다.
그 결과는 위에 나온 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 의 경우와 함께 표 5 에 나와 있다.
표 5
그리고, 이들 부분 정제 효소를 사용하여 실험 4-3 의 방법에 따라 트레할로오스를 제조하여 그 구조를 조사한 결과, 술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 유래의 내열성 트레할로오스 방출 효소와 마찬가지로 모든 효소가 글루코오스 중합도 3 이상이고 말단에 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 방출함이 판명되었다.
이하, 본 발명의 내열성 트레할로오스 방출 효소의 제조 방법과 이것을 이용한 트레할로오스 및 이것을 함유하는 당질의 제조 방법을 실시예 A 에서 설명하고, 트레할로오스 및 이것을 함유하는 당질을 함유시킨 조성물을 실시예 B 에서 설명한다.
실시예 A-1
술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 를 실험 1 의 방법에 준하여 퍼어멘터에서 약 42 시간 동안 배양하였다. 배양후 SF 막을 사용하여 배양액을 농축하여 약 5 ℓ의 균체 현탁액을 회수하였다. 수득한 현탁액을 고초압 균체 파쇄장치 " MINI-LAB " (일본국의 大日本 제약 주식회사제) 로 처리하여 수득한 액을 원심분리하여 약 4.8 ℓ의 상청액을 얻었다. 이 상청액에 황산 암모늄을 가하여 과포화도 약 0.7 로 하고 이 용액을 염석하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 10 mM Tris-염산 완충액 (pH 8.5) 에 용해하여 동일한 염산 완충액에 대해 투석하였다. 수득한 투석액에 대해 동일한 완충액으로 평형화시켜 둔 " SEPABEADS FP-DA13 " 겔 (일본국 三菱化學공업 주식회사제) 을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양 : 2 ℓ) 를 5 회 하였다. 이온 교환 수지에 흡착된 목적의 효소를 0 M 으로 부터 0.5 M 까지의 염화 나트륨 농도의 직선 기울기로 칼럼에서 용출시킨 다음 0.15 M 염화 나트륨 농도 부근에서 용출하는 효소 활성 획분을 회수한 후 SF 막으로 농축하여 내열성 비환원성 당질 생성 효소 32.6 단위/mℓ와 내열성 트레할로오스 방출 효소 58.5 단위/mℓ을 함유하는 농축 효소액 약 300 mℓ를 회수하였다. 이어서, 이들 효소 활성 획분을 1 M 황산 암모늄을 함유한 10 mM Tris-염산 완충액에 대해 투석하고, 수득한 투석액을 원심분리하여 불용물을 제거하였다. 상청액에 대해 " BUTYL-TOYOPEARL 650 " (일본국 Tosoh 사제의 소수성 겔) 을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양 : 350 mℓ) 를 5 회 하여 내열성 비환원성 당질 생성 효소와 내열성 트레할로오스 방출 효소를 분리하였다. 농도 15 w/w % 의 감자 전분 현탁액에 최종 농도 0.1 w/w % 되게 탄산 칼슘을 가하고 pH 6.0 으로 조정후 "TERMAMYL 60L " (스웨덴 Novo Industri 사제의 α-아밀라아제) 를 전분 1 g 당0.2 w/w % 되도록 가하고 95℃ 에서 15 분간 효소반응시켰다. 이 반응액을 30 분간 오토클레이브 (2 kg/cm2) 하고 58℃ 로 냉각하여 pH 5.5 로 조정후 이소아밀라아제 (일본국의 주식회사 林原생물화학연구소제) 를 전분 1 g 당 2000 단위와, 위의 내열성 비환원성 당질 생성 효소를 전분 1 g 당 0.5 단위와, 위의 내열성 트레할로오스 방출 효소를 전분 1 g 당 0.5 단위 가하고 96 시간 효소 반응시켰다. 이 반응액을 97℃ 에서 30 분간 유지한 후 냉각하고 여과하였다. 여액을 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색하고 이온 교환 수지 (H 형 및 OH 형) 로 탈염하여 정제하였다. 수득한 용액을 농축하여 농도 약 60 w/v % 의 시럽을 약 93 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 고형물당 트레할로오스를 71.2 %, 글루코실 트레할로오스를 3.0 %, 말토실 트레할로오스를 1.3 %, 글루코오스를 2.9 %, 말토오스를 11.1 %, 말토트리오스를 8.5 %, 그리고 말토테트라오스 이상의 말토올리고당을 2.0 % 함유하고 있다. 이 제품은 온화하고 고품질의 감미, 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있어서 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-2
실시예 A-1 의 방법으로 제조한 당액을 원당액으로 하고, 강산성 양이온 교환 수지 " XT-1016 " (Na+형, 가교도 4 %, 일본국의 東京유기화학공업 주식회사 제)를 사용한 칼럼 분획을 하였다. 수지를 내경 5.4 cm 의 자켓부 스테인레스제 칼럼 4 개에 충전하고 직렬로 연결하여 수지층 전체 길이를 20 m 로 하였다. 칼럼내온도를 55℃로 유지하면서 당액을 수지에 대하여 5 v/v % 가하고, 여기에 55℃ 의 온수를 SV 0.13 으로 공급하여 분획함으로써 글루코오스와 말토오스 등의 협잡 당류를 제거하여 트레할로오스 고함유 획분을 회수하였다. 이 획분을 정제 농축하고 진공 건조한 다음 분쇄하여 트레할로오스 고함유 분말을 고형분당 약 57 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 고형분당 트레할로오스를 약 97 % 함유하고 있으며, 온화하고 고품질의 감미, 적당한 점도와 극히 낮은 환원성을 가지므로 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-3
실시예 A-2 의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 획분을 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고 이온 교환 수지로 탈염하여 농도 약 70 % 로 농축한 후 결정화기에 넣고 종정으로서 트레할로오스 함수 결정 약 2 % 를 가하고 서냉하여 결정화율 약 45 % 의 매스키트를 얻었다. 이 매스키트를 건조탑위의 노즐로 부터 150 kg/cm2의 고압으로 분무하였다. 이와 동시에 85℃ 의 열풍을 건조탑 상부로 부터 송풍하고 저부에 설치된 이송 금망 컨베이어 위에 결정 분말을 포집하며, 컨베이어의 밑으로 부터 45℃ 의 온풍을 보내면서 이 분말을 건조탑 밖으로 서서히 이동시켜 배출하였다. 이 결정 분말을 숙성탑에 충전하여 온풍을 보내면서 10 시간 숙성시켜 결정화와 건조를 완료하여 트레할로오스 함수 결정 분말을 원료인 트레할로오스 고함유 당액에 대해 고형물당 약 90 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 실질적으로 흡습성을 나타내지 않아 취급이 용이하므로 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-4
실시예 A-2 의 방법으로 얻은 트레할로오스 고함유 획분을 실시예 A-3 과 마찬가지로 정제한 다음 이 용액을 증발 가마에 넣고 감압하에 끓여 수분 약 3.0 % 의 시럽으로 하였다. 이 시럽을 결정화기에 옮겨 여기에 종정으로서 무수 결정 트레할로오스를 시럽 고형물당 1 % 가하고 120℃ 에서 5 분간 교반하여 결정화한 다음 알루미늄제 용기에 넣어 100℃ 에서 6 시간 숙성시켜 블록을 얻었다. 이 블록을 절삭기로 분쇄하고 유동 건조하여 수분 약 0.3 % 의 무수 결정 트레할로오스 분말을 원료인 트레할로오스 고함유액에 대해 약 85 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 식품, 의약품, 화장품, 이들의 원재료 또는 가공 중간물 등의 함수물의 탈수제로서 뿐만아니라 온화하고도 고품질의 감미를 가진 백색 분말 감미료로서도 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-5
술폴로부스 아시도칼다리우스 (ATCC 33909) 의 변이주를 실시예 A-1 의 방법에 준하여 퍼어멘터에서 약 42 시간 배양한 후 SF 막을 사용하여 균체를 농축하여 약 5 ℓ의 균체 현탁액을 회수한 다음, 다시 이 현탁액을 초고압 균체 파쇄장치 " MINI-LAB " (일본국의 大日本제약 주식회사제) 로 처리하여 균체를 파쇄하였다. 처리액을 원심분리하여 약 4.8 ℓ의 상청액을 얻었다. 이 상청액에 포화도 약 0.7 이되도록 황산 암모늄을 가하고 효소를 염석하여 원심분리해서 침전물을 회수한 다음 10 mM 인산 완충액 (pH 6.5) 에 용해후 동일 완충액에 대해 투석하여 내열성 비환원성 당질 생성 효소 (약 15 단위/mℓ) 와 내열성 트레할로오스 방출 효소 (약 12 단위/mℓ) 를 함유한 효소액 약 600 mℓ을 회수하였다. 이어서, 소수성 칼럼 크로마토그래피를 하여 내열성 비환원성 당질 생성 효소를 5850 단위, 내열성 트레할로오스 방출효소를 3960 단위 회수하였다. 감자 전분 1 중량부에 물 6 중량부와 " NEO-SPITASE " (일본국의 Nagase 생화학 공업 주식회사제의 α-아밀라아제) 0.01 중량부를 가해 교반 혼합하여, 이 현탁액의 pH 를 6.2 로 조정후 85∼90℃ 로 유지하여 전분의 호화와 액화를 하였다. 이 액화액을 120℃ 에서 10 분간 가열하여 α-아밀라아제를 실활시킨후 60℃ 로 냉각하여 pH 를 5.5 로 조정하고 여기에 " PROMOZINE " (덴마크국의 Novo Nordisk Bioindustry 사제의 폴룰라나아제) 를 전분 1 g 당 500 단위, 위의 내열성 비환원성 당질 생성 효소를 전분 1 g 당 1 단위, 그리고 위의 내열성 트레할로오스 방출 효소를 전분 1 g 당 1 단위 가하고 72 시간 효소 반응시켰다. 반응액을 97℃ 에서 30 분간 가열하여 잔존 효소를 실활시키고 50℃ 및 pH 5.0 으로 조정후 여기에 " GLUCOZYME " (일본국의 Nagase 생화학공업 주식회사제의 글루코아밀라아제) 를 전분 1 g 당 10 단위 가하여 24 시간 효소반응시킨 다음 가열하여 효소를 실활시켰다. 반응액을 통상의 방법으로 탈색하고 이온 교환 수지로 탈염하여 농축함으로써 농도 약 60 % 의 시럽을 얻었다. 수득한 당액에는 고형분당 79.5 % 의 트레할로오스를 함유하고 있었다. 이 당액을 분획용 수지로서 강산성 양이온 교환 수지 " CG 6000 " (일본국의 Japan Organo 사제, Na+형) 를 사용한 외에는 실시예 A-2 의 방법으로 칼럼 크로마토그래피하여 트레할로오스 고함유 획분을 회수하였다. 이 획분은 고형분당 약 95 % 의 트레할로오스를 함유하고 있었다. 이 획분을 농축하여 농도 약 75 % 의 용액을 얻어 이것을 결정화기에 넣고, 여기에 트레할로오스 함수 결정을 씨결정으로 하여 약 2 % 가한 다음 교반하에 서서히 결정화하였다. 이어서, 플라스틱제 용기에 옮겨 주위온도에서 3 일간 방치하여 블록을 얻었다. 이 블록을 절삭기로 분쇄하여 트레할로오스 함수 결정 분말을 원료 전분에 대해 약 70 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 실질적으로 흡습성을 나타내지 않아 취급이 용이하므로 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제, 희석제 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-6
술폴로부스 솔파타리커스 (ATCC 35091) 를 실험 1 의 방법으로 퍼어멘터에서 약 42 시간 배양한 후 실시예 A-1 의 방법에 준하여 SF 막을 농축하고 균체를 파쇄하여 그 원심 상청액을 황산 암모늄으로 염석하여 침전물을 얻었다.
이 침전물을 투석한 다음 이온 교환 칼럼 크로마토그래피하여 효소 활성 획분을 회수하였다. 이 획분을 UF 막으로 농축하여 내열성 비환원성 당질 생성 효소 26.4 단위/mℓ와 내열성 트레할로오스 방출 효소 57.5 단위/mℓ을 함유하는 농축 효소액 약 150 mℓ을 얻었다. 이 효소액을 소수성 칼럼 크로마토그래피하여 내열성비환원성 당질 생성 효소 2,650 단위와 내열성 트레할로오스 방출 효소 5,950 단위를 회수하였다. 농도 6 % 의 감자 전분 현탁액을 가열하여 호화하고 pH 4.5 및 50℃로 조정후 여기에 이소아밀라아제를 전분 1 g 당 500 단위 가하고 20 시간 효소반응시켰다. 이 반응액을 pH 6.5 로 조정하고, 120℃ 에서 10 분간 오토클레이브한 후 95℃ 로 냉각하고 여기에 " TERMAMYL 60L " (덴마크국의 Novo Industri 사제의 α-아밀라아제) 를 전분 1 g 당 0.1 w/w % 가하여 15 분간 효소반응시켰다. 이 반응액을 130℃ 에서 10 분간 오토클레이브하고 65℃ 로 냉각한 후 여기에 전분 1 g 당 각각 위의 비환원성 당질 생성 효소 1 단위와 위의 트레할로오스 방출 효소 1 단위를 가하고 72 시간 효소반응시켰다. 이 반응액을 97℃ 에서 30 분 유지한 후 pH 5.0 및 50℃ 로 조정하고 여기에 " GLUCOZYME " (일본국의 Nagase 생화학 공업주식회사제의 글루코아밀라아제) 를 전분 1 g 당 10 단위 가하고 24 시간 효소반응시킨 다음 가열하여 효소를 실활시켰다. 반응액을 통상의 방법으로 탈색하고 이온 교환 수지로 탈염하여 농축함으로써 농도 약 60 % 의 시럽을 얻었다. 수득한 당액에는 고형분당 80.9 % 의 트레할로오스를 함유하고 있었다. 이 당액을 농축하여 농도 약 84 % 의 용액을 얻어 이것을 결정화기에 넣고, 여기에 트레할로오스 함수 결정을 씨결정으로 하여 약 2 % 가한 다음 교반하에 서서히 결정화하였다. 이어서, 플라스틱제 용기에 옮겨 주위온도에서 3 일간 방치 하여 블록을 얻었다. 이 블록을 절삭기로 분쇄하여 트레할로오스 함수 결정 분말을 원료 전분에 대해 약 90 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 실질적으로 흡습성을 나타내지 않아 취급이 용이하므로 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제, 희석제 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-1 : 감미료
실시예 A-3 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 1 중량부에 " αG SWEET " (일본국의 東洋精糖 주식회사 판매의 α-글리코실 스테비오시드) 0.01 중량부와 " ASPARTAME " [일본국의 Ajinomoto 주식회사 판매의 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르] 0.01 중량부를 균일히 혼합하여 과립 성형기에서 과립상 감미료를 제조하였다. 이 제품은 감미의 질이 우수하여 수크로오스의 약 2.5 배의 감미도를 가지며 감미도당 칼로리는 수크로오스의 약 1/2.5 로 저하되어 있다. 이 감미료는 여기에 배합된 고감미도 감미물의 분해도 없고 안정성이 우수하여 저칼로리 감미료로서 칼로리 섭취를 제한하고 있는 비만자, 당뇨병자 등을 위한 저칼로리 음식물 등에 대한 감미 부여에 적당하다. 또한, 이 감미료는 불용성 글루칸의 생성도 적으므로 충치를 억제하는 음식물 등에 대한 감미 부여에도 적당하다.
실시예 B-2 : 하아드 캔디
농도 55 % 수크로오스 용액 100 중량부에 실시예 A-1 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 시럽 30 중량부를 가열 혼합한 다음 감압하에 수분 2 % 이하가 될 때까지 가열 농축하고, 여기에 시트르산 1 중량부와 레몬 향료 적당량과 착색료를 혼화하여 통상의 방법에 따라 성형하여 표제의 제품을 얻었다. 이 제품은 깨물기와 맛이 양호하고 수크로오스의 결정화와 변형을 일으키지 않는 고품질의 하아드 캔디이다.
실시예 B-3 : 츄잉 검
검 베이스 3 중량부를 유연하게 될 정도로 가열 용융하고, 여기에 수크로오스 4 중량부와 실시예 A-3 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 3 중량부를 가하고, 적당량의 향료와 착색료를 혼합한 후 통상의 방법에 따라 로울에서 반죽하여 성형, 포장함으로써 제품을 얻었다. 이 제품은 텍스처와 풍미가 모두 양호한 츄잉 검이다.
실시예 B-4 : 가당 연유
원유 100 중량부에 실시예 A-1 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 시럽 3 중량부와 수크로오스 1 중량부를 용해하고 플레이트 히이터에서 가열 살균한 다음 70 % 로 농축하고 무균 상태에서 통조림하여 제품을 얻었다. 이 제품은 온화한 감미로서 풍미도 좋아서 유아 식품, 과실, 커피, 코코아, 차 등의 조미용으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-5 : 유산균 음료
탈지 분유 175 중량부, 실시예 A-1 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 시럽 130 중량부 및 일본국 특허 공개 제 281,795/92 호 공보에 개시되어 있는 락토수크로오스 고함유 분말 50 중량부를 물 1,150 중량부에 용해하고, 65℃ 에서 30 분간 살균하여 40℃ 로 냉각한 후 여기에 통상의 방법에 따라 스타아터 (starter) 로서의 유산균을 30 중량부 식균 (植菌) 하고 37℃ 에서 8 시간 배양하여 유산균 음료를 제조하였다. 이 제품은 풍미가 양호한 유산균 음료이고, 또한 이 제품은 올리고당을 함유하여 유산균을 안정하게 유지할 뿐만아니라 비피도스균 증식 촉진 작용을 가지고 있다.
실시예 B-6 : 분말 쥬우스
분무 건조에 의해 제조한 오렌지 과즙 분말 33 중량부에 대하여 실시예 A-2 의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 분말 50 중량부, 수크로오스 10 중량부, 무수 시트르산 0.65 중량부, 말산 0.1 중량부, L-아스코르브산 0.1 중량부, 시트르산 나트륨 0.1 중량부, 폴룰란 0.5 중량부 및 분말 향료 적당량을 잘 혼합, 교반하고 분쇄하여 미분말로 한 후, 이것을 유동층 조립기 (造粒機) 에서 배풍 온도 40℃, 중량 150 m3로 하여 여기에 실시예 A-1 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 시럽을 바인더로 하여 분무해서 30 분간 조립 (造粒) 하고 계량, 포장해서 제품을 얻었다. 이 제품은 과즙 함유율이 약 30 % 인 분말 쥬우스이고 만족하지 못한 맛과 냄새가 없으며 장기간 안정하였다.
실시예 B-7 : 커스타드 크리임
옥수수 전분 100 중량부, 실시예 A-1 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 시럽 100 중량부, 말토오스 80 중량부, 수크로오스 20 중량부 및 식염 1 중량부를 충분히 혼합하고 계란 280 중량부를 가하여 교반하였다. 여기에 끓인 우유 1000 중량부를 서서히 가한 후 교반하면서 계속 가열하여 옥수수 전분이 완전히 호화하여 전체가 반투명하게 되었을 때 가열을 중지하고 냉각하여 적당량의 바닐라 향료를 가하고 계량, 충전, 포장하여 제품을 얻었다. 이 제품은 평활한 표면과 광택을 가지며 온화한 감미를 가지고 있다.
실시예 B-8 : 우이로-노-모토 (우이로용 즉석 믹스)
쌀가루 90 중량부에 옥수수 전분 20 중량부, 수크로오스 40 중량부, 실시예 A-3 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 80 중량부 및 풀룰란 4 중량부를 균일히 혼합하여 우이로-노-모토를 제조하였다. 이것을 적당량의 녹차 분말 및 물과 혼련하고 용기에 나누어 넣어 60 분간 증기찜하여 녹차 우이로를 제조하였다. 이 제품은 광택과 깨물기가 양호하고 풍미도 양호하다. 또한, 전분의 노화도 억제되어 비교적 장기간 보존할 수 있다.
실시예 B-9 : 안 (An : 팥 페이스트)
원료인 아즈키 (adzuki) 팥 10 중량부에 통상의 방법에 따라 물을 가하여 끓인 다음 팥의 고유한 불만족스런 냄새와 떫은 맛을 제거하고 수용성 협잡물을 제거하여 " 아즈키-쯔부-안 (adzuki-tsubu-an) " 약 21 kg 을 얻었다.
여기에 수크로오스 14 중량부와 실시예 A-1 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 시럽 5 중량부 및 물 4 중량부를 가하고 끓인 다음, 여기에 소량의 샐러드 오일을 가하고 조심스럽게 반죽하여 제품인 안 (an : 팥 페이스트) 약 35 kg 을 얻었다. 이 제품은 끓일 때 생기는 탈색도 없고 맛과 풍미가 양호하여 팥잼 만두, 팥빵, 빙과, 셔어벳 등의 재료로서 적당하다.
실시예 B-10 : 빵
밀가루 100 중량부, 효모 2 중량부, 설탕 5 중량부, 실시예 A-2 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 분말 1 중량부와 무기 이스트 푸우드 0.1 중량부를 통상의 방법에 따라 물과 반죽하여 26℃ 에서 2 시간 동안 발효시킨 다음 다시 30 분 숙성한 후 불에 구웠다. 이 제품은 색상도 좋고 양호하게 부풀어 올라 있어 적당한탄력, 온화한 감미를 가진 고품질의 빵이다.
실시예 B-11 : 햄
돼지 넓적다리 고기 1000 중량부에 식염 15 중량부와 질산 칼륨 3 중량부를 균일히 갈아 냉실에서 하룻밤 퇴적한 후 물 500 중량부, 식염 100 중량부, 질산 칼륨 3 중량부, 실시예 A-6 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 40 중량부 및 페퍼민트 적당량으로 된 염지액에 냉실에서 7 일간 침지한 다음 통상의 방법에 따라 냉수로 세척하고 끈으로 말아 훈연하여 쿠킹해서 냉각 포장하여 제품을 얻었다. 이 제품은 색상, 맛, 풍미가 양호한 고품질의 햄이다.
실시예 B-12 : 분말 펩티드
40 % 식품용 대두 펩티드 용액 " Hinute S " (일본국의 不二製油 주식회사제) 1 중량부에 실시예 A-6 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 2 중량부를 혼합하고 플라스틱제 용기에 넣어 50℃ 에서 감압 건조하고 분쇄하여 분말 펩티드를 제조하였다. 이 제품은 풍미가 양호하여 프리믹스, 냉과 등의 제과용 재료로서 뿐만아니라 경구 유동식, 경관 유동식 등의 이유식, 치료용 영양제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있으며, 피부 정화제, 육모제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-13 : 분말 된장
적색 된장 1 중량부에 실시예 A-4 의 방법으로 제조한 무수 결정 트레할로오스 분말 3 중량부를 혼합하고 다수의 반구상 凹부를 가진 금속판에 부어 넣어 이것을 실온하에서 하룻밤 정치하여 고화한 후 이형하여 1 개당 약 4 g 되는 고형 된장을 얻어 이것을 분쇄기에서 분쇄하여 분말 된장을 얻었다. 이 제품은 즉석 라면, 즉석 수우프 등의 조미료로서 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 고형 된장은 고형 조미료로서 뿐만아니라 된장 과자 등으로서도 이용할 수 있다.
실시예 B-14 : 분말 난황
생란 (生卵) 으로 부터 제조한 난황을 플레이트 히이터식 가열 살균기에서 60∼64℃ 에서 살균하여 얻은 액상 난황 1 중량부에 대하여 실시예 A-4 의 방법으로 제조한 무수 결정 트레할로오스 분말 4 중량부의 비율로 혼합한 후 용기에 옮겨 하룻밤 방치하여 트레할로오스 함수 결정으로 변환시켜 블록을 제조하였다. 이 블록을 절삭기에서 분말화하여 분말 난황을 얻었다. 이 제품은 프리 믹스, 냉과, 유화제 등의 제과용 재료로서 뿐만아니라 경구 유동식, 경관 유동식 등의 이유식, 치료용 영양제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있으며, 피부 정화제, 육모제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-15 : 화장용 크리임
폴리옥시에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 2 중량부, 자기 유화형 글리세릴 모노스테아레이트 5 중량부, 실시예 A-2 의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 분말 2 중량부, α-글리코실루틴 1 중량부, 유동 파라핀 1 중량부, 글리세린 트리-2-에틸헥사노에이트 10 중량부 및 적당량의 방부제를 통상의 방법에 따라 가열 용해하였다. 여기에 L-락트산 2 중량부, 1,3-부틸렌 글리콜 5 중량부 정제수 66 중량부를 가하여 오모게나이저로 유화하여 향료를 적당량 가하고 교반 하여 크리임을 제조하였다. 이 제품은 황산화성을 가지며 안정성이 높아 고품질의 햇빛 그을음 방지제, 피부 정화제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-16 : 분말 약용 인삼 엑스
약용 인삼 엑스 0.5 중량부에 실시예 A-4 의 방법으로 제조한 무수 결정 트레할로오스 분말 1.5 중량부를 혼합한 후 용기에 옮겨 2 일간 방치하여 트레할로오스 함수 결정으로 변환시켜 블록을 제조하였다. 이 블록을 절삭기에서 분말화하고 분급하여 분말 약용 인삼 엑스를 제조하였다. 이 제품을 적당량의 비타민 B1 및 비타민 B2 와 함께 과립 성형기에서 비타민 함유 과립상 약용 인삼 엑스로 하였다. 이 제품은 피로회복제, 강장제 등으로 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 육모제 등으로서도 이용할 수 있다.
실시예 B-17 : 고체 제제
인간의 천연형 인터페론-α 제품 (일본국의 주식회사 林原생물화학연구소제) 을 통상의 방법에 따라 고정화 항인터페론-α 항체 칼럼에다 가하여 이 제품에 함유된 인간의 천연형 인터폐론-α를 흡착시키고, 안정제인 소혈청 알부민을 함유한 완충액을 가한 다음 과잉량의 알부민을 제거한 후, 인간의 천연형 인터페론-α를 실시예 A-2 의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 분말을 5 % 함유하는 생리 식염수를 사용하여 생리 식염수의 pH 를 변화시키면서 용출하였다. 이 용출액을 정밀 여과하고 여액을 약 20 배량의 " FINETOSE " (일본국의 주식회사 林原상사 판매의 무수 결정 말토오스 분말) 에 가하여 탈수, 분말화한 다음 이것을 타정기에서 타정하여 1 정 (약 200 mg) 당 인간의 천연형 인터페론-α를 약 150 단위 함유하는 정제를 제조하였다. 이 제품은 설하정 등으로 하여 하루에 성인 1∼10 정 정도를 경구 투여하여 바이러스성 질환, 알레르기성 질환, 류머티즘, 당뇨병, 악성 종양 등의 치료에 유리하게 이용할 수 있다. 특히, 근년에 와서 환자수가 급증하고 있는 에이즈, 간염 등의 치료제로서 유리하게 이용할 수 있다. 이 제품은 본 발명의 비환원성 당질과 무수 결정 말토오스가 함께 인간의 천연형 인터페론-α의 안정제로서 작용하여 실온에서 방치하더라도 그 활성을 장기간 잘 유지한다.
실시예 B-18 : 당의정
중량 150 mg 의 소정 (索錠) 을 심제 (core material) 로 하고, 여기에 실시예 A-3 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 40 중량부, 풀룰란 (평균 분자량 200,000) 2 중량부, 물 30 중량부, 탈크 25 중량부 및 산화 티탄 3 중량부로 된 용액을 코우팅하여 정제 중량이 약 230 mg 되게 한 다음 동일한 트레할로오스 함수 결정 분말 65 중량부, 풀룰란 1 중량부 및 물 34 중량부로 된 용액을 사용하여 코우팅한 후 왁스액으로 광택을 나게 해서 외관이 우수한 당의정을 제조하였다. 이 제품은 내충격성도 우수하며 고품질을 장기간 유지한다.
실시예 B-19 : 치약
배합
위에 나온 재료를 통상의 방법에 따라 혼합하여 치약을 제조하였다. 이 제품은 적당한 감미를 가지고 있어 특히 어린이용 치약으로 적당하다.
실시예 B-20 : 경관 영양제
실시예 A-3 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 500 중량부, 분말 난황 270 중량부, 탈지 분유 209 중량부, 염화 나트륨 4.4 중량부, 염화 칼륨 1.8 중량부, 황산 마그네슘 4 중량부, 티아민 0.01 중량부, 아스코르브산 나트륨 0.1 중량부, 비타민 E 아세테이트 0.6 중량부 및 니코틴산 아미드 0.04 중량부로 된 배합율을 제조하고, 이 배합물 25 g 씩을 방습성 라미네이트 소형 봉지에 충전하고 히이트 시일하여 제품을 얻었다. 이 제품은 봉지 하나를 약 150∼300 mℓ의 물에 용해하여 유동식으로 해서 경구적 또는 비강 (鼻腔), 위, 장 등에 경관적 사용 방법에 따라 이용되며 생체에의 에너지 보급용으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-21 : 외상 치료용 연고
실시예 A-3 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 200 중량부와말토오스 300 중량부에 요오드 3 중량부를 용해한 메탄올 50 중량부를 가하여 혼합하고, 여기에 10 w/v % 풀풀란 수용액 200 중량부를 가하여 혼합해서 적당한 확포성과 부착성을 가진 외상 치료용 연고를 제조하였다. 이 제품은 요오드에 의한 살균 작용 뿐만아니라 트레할로오스에 의한 세포에의 에너지 보급제로서도 작용하기 때문에 치유 기간이 단축되고 상처난 곳도 깨끗이 아문다.
이상에서 명백한 바와 같이 본 발명의 신규 내열성 트레할로오스 방출 효소는 말단에 트레할로오스 구조를 가진 글루코오스 중합도 3 이상의 비환원성 당질로 부터 트레할로오스를 방출하며, 열안정성도 우수하고, 또한 환원성 전분 부분 분해물에 내열성 비환원성 당질 생성 효소와 더불어 작용시킴으로써 고수율로 트레할로오스를 생성한다. 이 트레할로오스의 분리, 정제도 용이하고, 이와 같이 하여 제조되는 트레할로오스 및 이것을 함유한 당질은 안정성이 우수하고 양질의 고품위 감미를 가지고 있다. 또한, 경구섭취에 의해 소화 흡수되어 칼로리원으로 된다. 트레할로오스 및 이것을 함유한 당질은 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제, 희석제, 증량제 등으로서 각종 음식물, 의약품 등 각종 조성물의 제조에 유리하게 이용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 확립은 값싸고 무한한 자원인 전분에서 유래하는 전분 부분 분해물로 부터, 종래 필요는 하였으나 쉽사리 제조할 수 없었던 트레할로오스 및 이것을 함유한 당질을 공업적으로 대량으로 값싸게 공급할 수 있는 아주 새로운 길을 개척하게 되어, 이것이 미치는 영향은 전분 과학, 효소 과학, 생화학 등의 학문 분야는 말할 것도 없고, 산업계 특히 식품, 화장품, 의약품 분야는 물론이고,농수축산업, 화학 공업에도 미쳐 이들 산업계에 기여하는 공업적 의의는 헤아릴 수 하겠다.
제 1 도는 DEAE-TOYOPEARL 겔 칼럼으로 부터의 본 발명의 내열성 트레할로오스 방출 효소와 비환원성 당질 생성 효소의 용출 패턴을 나타내는 그래프.
제 2 도는 본 발명의 내열성 트레할로오스 방출 효소의 활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 그래프.
제 3 도는 본 발명의 내열성 트레할로오스 방출 효소의 활성에 미치는 pH 의 영향을 나타내는 그래프.
제 4 도는 본 발명의 내열성 트레할로오스 방출 효소의 안정성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 그래프.
제 5 도는 본 발명의 내열성 트레할로오스 방출 효소의 안정성에 미치는 pH 의 영향을 나타내는 그래프.

Claims (9)

  1. 술폴로부스속(Sulfolobus屬)에 속하는 미생물과 이들의 변이주로 된 군으로부터 선택되는 1종의 미생물로부터 수득되고, 아래의 물리화학적 성질 (1)∼(7)을 가진 내열성 트레할로오스 방출 효소
    (1) 작용
    말단에 트레할로오스 구조를 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 비환원성 당질의 트레할로오스 부분과 그 외의 글리코실 부분 사이의 결합을 특이적으로 가수분해함.
    (2) 분자량
    소디움 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE)에 의하여 54,000 ∼ 64,000 달톤
    (3) 등전점 (pI)
    양쪽성 전해질 함유 등전점 전기 영동법에 의하여 5.6 ∼ 6.6
    (4) 최적 온도
    pH 6.0에서 30분간 인큐베이트에서 75℃
    (5) 최적 pH
    60℃에서 30분간 인큐베이트에서 5.5 ∼ 6.0
    (6) 열적 안정성
    pH 7.0에서 60분간 유지하여 85℃에서 안정
    (7) pH 안정성
    25℃에서 16시간 유지하여 pH 4.0 ∼ 9.5에서 안정
  2. 제1항에 있어서, 글리코실 부분이 중합도 1 이상의 글루코오스 잔기 하나 이상으로 구성되어 있는 내열성 트레할로오스 방출 효소.
  3. 제1항 기재의 효소를 생산할 수 있는 술폴로부스속 (Sufolobus屬) 에 속하는 미생물 혹은 이들의 변이주를 영양 배지에서 배양하고, 생산된 효소를 수득된 배양물로 부터 회수하는 것을 특징으로 하는 제 1 항 기재의 내열성 트레할로오스 방출 효소의 제조 방법.
  4. 말단에 트레할로오스 구조를 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 비환원성 당질을 함유하는 용액에 제1항 기재의 효소를 작용시키는 단계를 포함하는 트레할로오스의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 환원성 전분 부분 분해물 1 종 이상과 제1항 기재의 효소를 함유하는 용액에 비환원성 당질 생성 효소를 작용시키는 제조 방법.
  6. 제4항에 있어서, 트레할로오스는 트레할로오스 함수 결정, 트레할로오스 무수 결정 및 이들의 혼합물로 된 군으로 부터 선택되는 1 종인 제조방법.
  7. 제4항 기재의 제조방법으로 제조된 트레할로오스를 음식물 재료에 함유 시키는 단계를 포함하는 음식물의 제조방법.
  8. 제4항 기재의 제조방법으로 제조된 트레할로오스를 화장품 재료에 함유 시키는 단계를 포함하는 화장품의 제조방법.
  9. 제4항 기재의 제조방법으로 제조된 트레할로오스를 의약품 재료에 함유시키는 단계를 포함하는 의약품의 제조방법.
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