TW507008B

TW507008B - Thermostable trehalose-releasing enzyme, and its preparation and uses

Info

Publication number: TW507008B
Application number: TW084106021A
Authority: TW
Inventors: Shoji Ikegami; Michio Kubota; Toshiyuki Sugimoto; Toshio Miyake
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 1994-06-25
Filing date: 1995-06-13
Publication date: 2002-10-21
Also published as: JP3557277B2; EP0688866B1; DK0688866T3; EP0688866A1; US5723327A; DE69504584T2; CA2151438C; US6150153A; DE69504584D1; JPH0866187A; AU694213B2; KR100391376B1; CA2151438A1; KR960001112A; AU2323995A; ATE170920T1

Description

507008 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（i ) 發明背景 1 .發明節_ 本發明關於一種對熱安定之海藻糖釋出酵素，其製法及用途’特言之，本發明係關於一種新穎的對熱安定之海藻糖釋出酵素及該酵素之製法，該酵素可專一地水解非還原醣中海藻糖部份與其餘糖基部份之間的鍵結，該非還原醣具有海藻糖結構作爲終端單位且具有至少三個葡萄糖之聚合狀態。本發明進一步關於可利用，該酵素製得之海藻糖及含有該海藻糖之組成物。 2.先前技藝之說明海藻糖，或α，α -海藻糖是已知之由葡萄糖單元組成的非還原醣。誠如Acaemic Press，USA出版之Advances in Carbohydrate Chemistry,Vol. 18，pp. 2 0 1 -2 2 5 ( 1 9 6 3 ) 與 Applied and Enuirornental Microbielogy,Vol.56, pp. 3,2 1 3- 3,2 1 5 ( 1 9 9 0 )中所述，海藻糖廣泛存在於微生物，覃類，昆蟲等，縱然其中含量相當低。海藻糖是非還原醣，故其不與含氨基之受質（例如胺基酸及蛋白質）反應，不引發氨基一羰基反應，亦不使含有胺基酸之物質變質。因此，預期使用海藻糖可無懼造成令人不滿意的棕化與變質反應。緣是之故，工業規模製備海藻糖之建立乃極爲需要。海藻糖之習知製法包括，舉例而言，於日本專利先公開案第1 5 4，4 8 5 / 7 5揭示者，其中係利用微生物 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (9> 507008 A7 B7 五、發明説明（2 ) :及日本專利先公開案第216，695/83號中記載者，其中利用麥芽糖磷酸酶與海藻糖磷酸酶之組合，將麥芽糖轉化爲海藻糖。然而，前一製法不適用於工業規模之製備，因爲用來作爲起始物之微生物中的海藻糖含量通常低於佔乾固重（d. s . b)之15w/v% (、w/w %"乙詞在本文說明書將縮寫爲’除非另有說明），並且萃取與純化步驟複雜。復一製法有如下缺點：（i )由於海藻糖是經由葡萄糖- 1 -磷酸形成的，作爲受質之麥芽糖的濃度不能設定在所欲量上；）i i)磷酸酶之酵素反應系統是可逆反應，且標的海藻糖之產量相當低；及（i i i)維持反應系統安定且保持酵素反應平和有實質上的困難。因此，這些習知製法從未真正用來作爲工業規模之製法。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 顧及上述種種狀況，本發明積極地研究酵素，當此酵素作用在澱粉水解物上時能夠形成海藻糖結構之醣類。結果，本發明發現根廇菌Μ - 1 1或節桿菌Q 3 6能夠產生一種新穎之形成非還原醣的酵素，該酵素作用在具有至少二個葡萄糖之聚合程度的运原性激粉水解物上時，可形成具有海藻糖作爲終端單位的非還原醣，並同時發現由根廇菌Μ - 1 1或節桿菌Q 3 6製得之海藻糖釋出酵素可將非還原醣水解爲固定量的海藻糖及葡萄糖及/或麥芽糖寡糖。這些酵素顯示，利用澱粉作爲原料十分容易製得所欲量的海藻糖’且預期可製得關於海藻糖之上述標的物。然而，源自根廇菌Μ - 1 1或節桿菌q 3 6之酵素之紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公餐） 5 - 507008 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (η 五、發明説明（3 ) 溫度安定性相當低。因此，一旦這些酵素用來製備海藻糖及具有海藻糖結構作爲終端單位的非還原醣，有必要令該酵素在低於5 5 °C之溫度下作用。關於酵素反應的溫度，、Koso-Ouyou-no-Chishiki"(酵素應用的知識）第一版，第80—129頁（1986)乙書，標題爲、醣類有關之酵素及其應用 > 乙章中標題爲〃醣類有關酵素〃乙節中記載著〜於糖化作用之工業規模的酵素反應條件中，溫度低於5 5 °C之反應涉及反應過程中污染與PH降低的危機，於使用澱粉作爲原料之長時間酵素反應中，當酵素係在；低於5 5 °C之溫度下作用時，有必要添加溶菌酶來防止反應混合物的污染及p Η控制，因爲反應混合物之污染與Ρ Η降低會使這類酵素之活性鈍化。再者，當澱粉部份水解物之水解作用相當低時，不溶物質由於澱粉的退減作用會形成不溶物質。另一方面，由於對熱安定之酵素可在相當高的溫度下作用，此酵素反應過程中的污染現象極少列入考慮，且部份澱粉水解物之退減作用幾乎不發生。一般考慮嗜熱性微生物作爲對熱安定之酵素的來源。有關使用嗜熱性微生物製備海澡糖’如 Biotechnology Lettes,V〇l· 12, ρρ. 431-4 32(1990)及Biotech Forum Europe，Vol.8,pp.201-203( 1991)中所述，其中記載火山口硫化葉菌（Sul folobus solfatariciKs，ATCC 49155)之細胞與細胞萃取物製得之部份純化的酵素製劑，作用在受質（例如直鏈澱粉及可溶性澱粉）時，可形成葡萄糖與海藻糖。然而，本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 6 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 ___ B7 五、發明説明（4 ) 這種酵素製劑之純化不能完成，故如此製得之酵素的物化特性不能充分鑑定，且此酵素的作用尙未明確，所鑑知的只有海藻糖之製法。因此，極需要建立使用對熱安定之酵素製備海藻糖的新穎方法，該酵素能在超過5 5 °C之溫度下作用。本發明要點本發明提供一種海藻糖之新穎製法，以形成海藻糖或含有海藻糖之醣組成物。藉由能夠在5 5 °C以上之溫度下作用且其作用已明確之對熱安定之海藻糖釋出酵素，可由還原性之澱粉部份水解物製得海藻糖。本發明亦提供由該製法製得之海藻糖，及含有海藻糖之組成物，以及其用途〇爲了達到上述相的，本案發明人企圖鑑定出一種新穎之對熱安定的酵素，其可自非還原醣釋出海藻糖，該非還原醣具有海藻糖結構作爲終端單位且具有至少三個葡萄糖之聚合狀態，故本案發明人大量篩選能夠製造該酵素的微生物，同時重心放在嗜熱性微生物。結果，本案發明人發現揭示於日本專利申請案第 1 6 6，0 1 1/9 4號中的硫化葉菌屬之微生物，命名爲 A 酸熱硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldarius, ATCC33909及ATCC 49426)及命名爲、火山口硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus. A T C C 35091及ATCC 35092)，可產生一種對熱本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -7 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7___ 五、發明説明（5 ) 安定之形成非還原醣的酵素，以及一種新穎之對熱安定的海藻糖釋出酵素，其能夠在5 5 °C以上之溫度作用；本案發明人另發現溫度超過5 5 °C之海藻糖標的製法十分容易達成，其係令對熱安定之非還原醣酵素與此新穎之對熱安定的海藻糖釋出酵素一起作用在還原性之澱粉部份水解物。本案發明人亦發現，令對熱安定之形成非還原醣的酵素與新穎之對熱安定的海藻糖釋出酵素一起作用在還原性之澱粉部份水解物上並接受葡糖澱粉酶或α -配糖酶之作用而獲得純度相當高之含有海藻糖的經反應溶液，十分容易製得海藻糖。因此，本案發明人完成了本發明。附圖之簡沭圖1表示本發明之對熱安定的海藻糖釋出酵素及非還原醣，形成酵素自填充有'DEAE-T0Y0PEARL® 〃之凝膠的管柱溶離的溶離圖。圖2表示溫度對本發明之對熱安定之海藻糖釋出酵素之活性的影響。圖3表示pH對本發明之對熱安定之海藻糖釋出酵素之活性的影響。圖4表示溫度對本發明之對熱安定之海藻糖釋出之安定性的影響。圖5表示p Η對本發明之對熱安定之海藻糖釋出酵_ 之安定性的影響。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） " "' 一 8 — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

507008 A7 B7 五、發明説明（6 ) 蝥Jg之詳細說明本發明係關於一種對熱安定之海藻糖釋出酵素，其製法及其用途。本發明進一步關於夠製造該酵素之微生物，由該酵素製得之海藻糖，及含海藻糖之組成物。本發明大量篩選能夠製造新穎之對熱安定之海藻糖釋出酵素的微生物，該酵素能夠專一地水解非還原醣中海藻糖部份與其餘糖基部份之間的鍵結，該非還原醣具有海藻糖結構作爲終端單位且具有至少三個葡萄糖之聚合狀態，最後終於發現標的微生物。本案發明人發現，硫化葉菌屬之微生物，命名爲 > 酸熱硫化葉菌"ATCC 35091及 ATCC49426，及命名爲 ''火山口硫化葉菌A ATCC35091 及 ATCC35092，能夠製造新穎之對熱安定的海藻糖釋出酵素。上述微生物之外，硫化葉菌屬之其它菌株及其變種毫無疑問地可用於本發明中，只要這些菌生產對熱安定之海藻糖釋出酵素，而該酵素能夠專一地水解非還原醣中海藻糖部份其餘糖基部份之間的鍵結，該非還原醣具有海藻糖結構作爲終端單位且具有至少三個葡萄糖之聚合狀態。本發明可用任何營養培養基，只要這些微生物能在其中生長且產製本發明之對熱安定的海藻糖釋出酵素：例如，合成及天然之營養培養可用來作爲此營養培養基。本發明可用任何含碳物質作爲碳源，只要該碳源能爲該微生物本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇^297公釐) 一 9 一 ^8_1ϋ 1^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（7 ) 所用：這類碳源之範例有醣類，例如葡萄糖，果糖，乳糖 ’蔗糖’甘露醇，山梨糖醇，糖蜜及還原性澱粉部份水解物；及有機酸，例如檸檬酸，琥珀酸及其塩。這些碳源於螢養培養基中的濃度可適當選擇。舉例而言，當使用還原性澱粉部份水解物時，較佳濃度通常是2 0%或更低，更好是5 %或更低，視微生物之生長性情形而定。可用於本發明的氮源有舉例而言，無機氮源例如銨塩及硝酸塩；含有有機氮之物質，例如尿素，玉米浸漬液，酪蛋白，臃，酵母萃取物及牛肉萃取物。可用於本發明的無機組成份，舉例而言，有鈣塩，鎂塩，鉀塩，鈉塩，磷酸塩及鎂，鋅，鐵，銅，錳及鈷組成之其它塩類。可用於本發明的微生物係培養在需氧條件下，溫度通常在4 0 — 9 5 °C之間，較佳在5 0 — 9 0 °C之間，且 P Η在1 — 7之間，較佳在2 _ 6之間。本發明所用之培養時間設定爲微生物生長開始所需的時間，較佳爲1 0 -1 0 0小時。營養培養基中的溶氧濃度並非特別限制，但通常介於0. 5_20ppm。爲了保留營養培養基中的溶氧，可使用控制需氧狀態、攪拌，添加氧氣的需氧狀態，及增加醱酵槽內壓的儀器及方法。培養反應是分批進行或以連續方式進行。培養反應完成後，自培養物回數本發明酵素。本發明酵素之活性主要是發現於細胞中。較佳使用一般方法純化這些細胞並使用所生成者作爲粗製酵素製劑。舉例而言，使用硫酸銨塩析所製備與濃縮之粗製酵素製劑經過透析後 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2H)X297公釐） 507008 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Gt A7 B7__五、發明説明（8 ) ，令此透析後的溶液在使用A DEAE-TOYOPEARL ® "(—種陰離子交換樹脂）之陰離子交換管柱層析上充分純化，並使用&BUTYL-T0Y0PEARL®"(—種壓水性樹脂）之厭水性管柱層析；使用’ T0Y0PEARL ® HW— 55〃（一種凝膠過濾所用的樹脂）之凝膠過濾層析；及使用’ BUTYL T0Y0PEARL ® (—種厭水性樹脂）之厭水性管柱層析予以進一步純化）上述樹脂爲 Tosoh Corporation, Tokyo, Japan之商品；凝膠過濾所用的樹脂是Pharmacis LKB，Uppsala， S w e d e η的商品，如此可製得呈現電泳上單一帶之經純化的酵素製劑。本發明經此製得之對熱安定的海藻糖釋出酵素具有下列物化特性： (1 )作用專一地水解非還原醣中海藻糖部份與其餘糖基部份之間的鍵結’該非還原醣具有海澡糖結構作爲終端單位且具有至少三個葡萄糖之聚合狀態； (2 )分子量於十二酯硫酸鈉一聚丙烯醯胺凝膠電泳（S D s 一 PAGE)上約54，000至64，〇〇〇道耳吞； (3 )等電點（p I ) 於使用兩性電解質之等電點電泳上約5. 6至6· 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）-- -11 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 ?84\〇6〇21 號專利申諳案 u rap-, ftA.7 a AfcΛ 文説明嘗修苽頁氐,7月修正五、發明説明（Q ) fj ； — (4 )最佳溫度當培養於pH於6· 0，歷30分鐘，最佳溫度約 7 5 °C ； (5 )最佳P Η 當培養於60 °C，歷30分鐘，最佳pH約5. 5至 6.0; (6 )溫度安定性當培養於PH7. 0，歷60分鐘，溫度高至約85 °C仍安定；及 (7 ) P Η安定性當培養於25 °C，·歷16小時，在pH約4. 5至 9 . 5之間呈安定。本發明對熱安定性之海藻糖釋出酵素的活性分析如下 :將1本發明毫升之酵素溶液添加至作爲受質之含有4毫升之1· 2 5w/v%麥芽三基海藻糖（α —麥芽四基α 一葡萄糖苷）的50mM磷酸塩緩衝液（ΡΗ6· 0)，並令此混合溶液於6 0°C培養3 0分鐘。令此反應溶液與 Somogyi銅溶液混合以懸浮該酵素反應，然後根據s〇m〇gyi —Nelson’ s法測定此溶液之還原力。作爲對照之酵素溶液處理如上，但其事實先於1 〇〇°C加熱3 0分鐘以鈍化酵素活性。根據這種測定法，本發明酵素之一單位活性被定義爲：每分鐘增加每毫莫耳葡萄糖之還原力的酵素量。可用來作爲本發明酵素之受質的非還原醣爲具有海藻本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-12 - 0Cο 70ο 5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製年( -si A7 B7 五、> 發明説明（ 10 ) 糖結稱作爲終端單位且具有至少二個葡萄糖之聚合狀態者〇這類受質的範例有葡萄糖基海藻糖麥牙糖基海藻糖 > 麥牙三基海藻糖麥芽四基海藻糖及麥牙五基海藻糖，這些受質可由非還原醣形成酵素作用在麥芽 -- 糖，麥芽四糖麥芽五糖麥芽一Γ. /\ 糖及麥芽七糖而製得 Ο 此外亦可使用含有非還原醣之相對低還原的澱粉部份水解物 > 該非還原醣具有海藻糖結稱及至少三個葡萄糖之聚合狀態，這類澱粉部份水解物之製備係令非還原醣形成酵素作用在還原性澱粉部份水解物，其可藉由澱粉酶或酸部份水解物澱粉類物質 ( 例如澱粉支鏈澱粉及直鏈澱粉 ) 而製得〇當使用澱粉酶水解澱物時舉例而言可使用 a — 澱粉酶 > 形成麥芽五糖之澱粉酶 y 形成麥芽 7^ 糖之澱粉酶其係揭示於 Pe rgamon P r e S S ,Tokyo, Japan ( 1 9 8 8 ) 出版之 Hand book of Amylase s an d Re 11 ed Enzme s ~ -書< > 這些澱粉酶可隨喜好地與脫支酶 ( 例如支鏈澱粉酶及異澱粉酶 ) -- 併使用〇當使用形成非原醣之酵素作用在還原性澱粉部份水解物時該酵素可形成具有海藻糖結構且具有至少二個葡萄糖聚合程度之非還原醣可以用曰本專利串請案第 3 4 9 2 1 6 / 9 3 號中揭示之源白根瘤菌 Μ — 1 1 株 ( Rh i i: zob ά urn sp », Μ 卜1 1) 或節桿菌 Q 3 6 株 (A Lr thr obac tor SE ). Q36)的酵素 9 然而 1 若酵素反應在超 5 5 °C 之溫度下進行時較好使用對熱安定之形成非還原醣的酵素其屬於曰本專利串請案第 1 6 6 ， 0 1 1 / 9 4 號中揭示之 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -13 - 507008 修正; 捕充 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（ 1 l) 硫化葉菌屬中的一類〇根瘤菌 Μ — 1 1 株與節桿菌 Q 3 6 株於 1 9 9 4 年 6 月 2 1 曰寄存於食品工業發展研究所寄存編號分別爲 C C R C 9 1 0 0 0 2 及 C C R C 9 1 0 0 0 1 0 本發明中受質的濃度不厳格限制〇舉例而言當使用 0 . 1 % 或 5 0 % 之受質溶液時，本發明之酵素反應可進行而形成海藻糖〇再者本發明可使用含有過量受質且該受質未完全溶解的溶液〇本發明之酵素反應中所用的反應溫度可設定爲 — 溫度在該溫度時 > 本發明酵素不被鈍化，亦即高達約 8 5 °c 之溫度 5 較好是 5 5 — 7 0 °c 之間的溫度〇本發明酵素反應的反應 Ρ Η 控制在 4 — 1 0 之間較好在約 5 — 7 之間〇本發明酵素反應所用的時間係根據此酵素反應的條件而適宜地選擇〇根據本發明而使用還原性澱粉部份水解物來製備海藻糖的方法 > 與揭示於曰本專利串請案第 3 4 9 2 1 6 / 9 3 號說明書的方法比較本發明方法可製備顯著增加產量的海藻糖更特別地是藉形成非還原醣之酵素與葡糖澱粉酶 —. 起作用可製得作爲對照的反應溶液〇更特別地是藉由形成非還原醣之酵素與葡糖澱粉酶 —* 起作用所製得的海藻糖製劑濃度約 3 0 % ，然而由形成非還原醣的酵素與本發明之海藻糖釋出酵素一起反應所製得的海藻糖製劑濃度約爲 6 0 % 或更高〇本發明之酵素反應如下 ·· 首先，藉形成非還原醣之酵素將 —. 分子之還原性澱粉部份水解物其具有至少三個葡 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-14 - 507008 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（12 ) 萄糖之聚合程度，轉化爲一分子的非還原醣，其具有海藻糖結構作爲終端單位，然後藉海藻糖釋出酵素之水解作用將所生成的非還原醣化爲一分子的海藻糖與一分子的還原性澱粉部份水解物，該水解之葡萄糖聚合程度減少2。如果新產生的還原性澱粉部份水解物具有至少3個葡萄糖之聚合程度，利用形成非還原醣之酵素作用將其轉化爲非還原醣，其具有海藻糖結構作爲終端單位，然後藉由海藻糖釋出酵素之作用，形成一分子的海藻糖及還原性澱粉部份水解物。藉重複這些形成非還原醣之酵素與海藻糖釋出酵素的作，由一分子之還原性澱粉部份水解物製備數個分子的海藻糖。上述酵素反應中，可令形成非還原醣的酵素與本發明海藻糖釋出酵素同時作用在具有至3個葡萄糖聚合程度之還原性澱粉部份水解物，以及首先令形成非還原醣之酵素作用在該還原性澱粉部份水解物，然後進行本發明海藻糖釋出酵素的作用。若有需要，較好令葡糖澱粉酶作用其上以增加海藻糖的含量。以習知方法令所生成的反應混合物液進行過濾與離心 ’以除去不溶物質，並使用活性炭將所生成的溶液脫色，利用Η -及0H -型之離子交換器脫塩，濃縮爲糖漿產物 ’其可乾燥爲粉末狀產物。若有需要，藉純化此粉末狀產物’十分容易將此粉末狀產物製成具最高可能純度的非還原醣。管柱層析分餾法的範例有，例如離子交換管柱層析 ’使用活性炭或矽膠之管柱層析；使用有機酸（例如乙醇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家檩準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） 1^/ -15- 507008 Α7 Β7 五、發明説明（13 ) 及丙酮）的分離法；及碱處理醣，藉由這些純化法，十分容物。若有需要，如此製得之具醣可被澱粉酶水解，此澱粉酶經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

粉酶，葡糖澱粉酶原醣醣進行醣酶及/或葡萄及降低黏度。醇藉此除去其管柱層析，可藻糖含量的流糖漿產物，且和溶液，並晶本發明可，本專利先公 / 8 3號中揭技術，可輕易得高海藻糖含，移動床及半若欲製備重約6 0 %以晶器中，若有拌於9 5 °C或轉換反糖基轉再者，還原力由所生份。如若有必析而得用之離開案第示使用除去粗量的產移動方 α -澱粉應，其係換酶，藉此醣產物。藉使用成的產物此製得的要，此糖水合結晶子交換管 2 3，7 強酸陽離製海藻糖物。在此法中任一法以分易製得海藻糖例如有酶及海利用環此控制可被任上述純中除去流份可漿產物海藻糖柱層析 9 9/ 子交換產物中情況下者0 解及除去殘留的還原具高純度的海藻糖產結構的 α -澱藻糖酶麥芽糊其甜度氫化以化法，葡萄糖被任意可進一或無水技術包 8 3及樹脂者所含的，可任本發明粉酶，，或令精聚葡及還原將其轉例如離，藉此純化及步濃縮結晶海括，舉 7 2，。藉使附帶醣意使用非還原卜澱此非還糖轉換力，以化爲糖子交換製備海濃縮爲爲過飽藻糖。例而言 5 9 8 用這些類，獲固定床

水合結晶海藻糖上純度的約6 5 需要，當於0 . 更低的溫度時，較好溫度介於1 0 — 9 0 °C ，舉例而言，將具有佔乾固 -90%海藻糖溶液置於結 1 一 2 0%種結晶存在下攪本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 1 β _ 16 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7 五、發明説明（14 ) ，逐漸冷卻而得含有水合結晶海藻糖之糖膏°同理’較好1 在本發明中使用連續結晶法來製備水合結晶海藻糖’其係在減壓下濃縮海藻糖溶液。本發明可使用習知方法’例如分離法，團塊碾末法’液化床成粒法及噴霧乾燥法’由糖膏水合結晶海藻糖或含彼之結晶醣製備。當使用分離法時’通常令糖膏置入籃型離心機’藉此由厚液中分離出水合結晶海藻糖，且若有必要，在此水合結晶海藻糖上噴灑少量冷水予以洗滌’藉此有利於製備純度提升的水合結晶海藻糖。若使用噴霧乾燥法’可輕易製得無或實質上無收濕性的結晶醣’其係利用高壓幫浦由噴嘴噴灑濃度爲6 0 — 8 5% (乾固重）’且結晶比例約爲 20 — 60% (佔乾固重）的糖膏；以60 — 1 00 °C熱空氣乾燥所生成的產物，此熱空氣不會熔解所生成的結晶粉末；及令所生成的粉末老化約1 - 2 0小時，同時對其灌吹3 0 — 6 0 °C的熱空氣。若使用團塊碾末法，可輕易製得無或實質上無收濕性的結晶醣，其係令濕度含量爲 1 0 — 2 0%且結晶比例約爲1 0 — 6 0% (佔乾固重）之糖膏靜置約數小時至3天，藉此將整份內容物晶析及乾燥爲團塊；及碾碎或切碎所生成的團塊。雖然將水合結晶海藻糖乾燥而轉化爲無水型式，藉此可製備無水結晶海藻糖，但其之製備通常爲如下：將高海藻糖含量之溶液，其濕度含量低於1 0 %，置入結晶器；在攪拌條件下及種結晶存在下，保持此溶液在5 〇 - 1 6 0 °C之溫度間，較好介於8 0 — 1 4 0°C之溫度範圍內，製得含有無水結晶海本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-17 - 507008 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（l5) 藻糖之糖膏；及在相當高溫下，利用習知方法例如團塊碾末法，液化床成粒法及噴霧乾燥法晶析及碾碎無水結晶海藻糖。如此製得之本發明海藻糖是安定的且實質上無還原力，並可與其它物質混合物與處理，特言之，胺基酸及含有胺基酸的物質，例如不用擔心造成不欲之棕化與氣味，以及該物質惡化的寡肽及蛋白質。海藻糖本身有令人高度滿意的品質及甜度。由於海藻糖十分容易被海藻糖酶水解爲葡萄糖單位，當口服，海藻糖被生物體同化，吸收及利用以作爲能量來源。再者，海藻糖實質上不被引起蛀牙之微生物醱酵，因此造成海藻糖適用於作爲實質上不造成蛀牙的甜味劑。海藻糖可藉各種注射方式使式，例如液體哺育及浸液，且不需擔憂毒性及副作用，較好，其係用來作爲生物體的能量來源。海藻糖是安定的甜味劑，特別是當海藻糖與凝固劑混合時結晶海藻糖可任意用來作爲錠劑的糖衣劑，凝固劑例如有支鏈澱粉，羥乙基澱粉或聚乙烯吡咯烷酮。此外，海藻糖尙有如下特性，例如調控滲透壓的能力，提供填料之能力，提供光面之能力，保濕力，提供黏性之能力，實質上無醱酵力，及防止膠化澱粉逆降解之能力。緣是之故，本發明海藻糖及含彼之醣組成物可任意用來作爲甜味劑，增味劑，品質改善劑，安定劑及填充劑，旋多種組成物中，例如食品，香煙，菸草，飼料，化粧品及藥品。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 18 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

----rr 507008 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _____ B7五、發明説明（16 ) 本發明之海藻糖及含彼之醣組成物可不予處理即用來作爲增甜之調味料。若有需要，其可與適當量之一種以上的其它甜劑一併使用，例如，粉狀糖漿，葡萄糖，麥芽糖 ’蔗糖，異構化的糖，蜂蜜，槭糖，山梨糖醇，麥芽糖醇 (maltitol)，乳糖醇（lactitol)，二氫查耳酮，斯切維苷（stevioside) ，α —糖基斯切維苷，瑞寶代奧苷（ rebaudioside)，甘草苷，L -天冬胺酸一 L —苯基丙胺酸甲酯，糖精1甘胺酸及丙胺酸；及/或填料例如糊精，澱粉及乳糖。呈粉狀或結晶狀之本發明海藻糖及含彼之醣組成物可不加處理即予使用，或者，若有需要，可在使用前將其與劑，稀釋劑，填充劑及黏著劑混合而製成顆粒，球，短桿，盤，立方體或錠劑形式。本發明之海藻糖及含彼之醣組成物可與具酸味，酸性，鹹味，苦味，澀味及好吃口感之其它物質充分調和，且其具有相當高的耐酸性及耐熱性。因此，其一般可用於食品以作爲甜味劑，增味劑，及品質改良劑。本發明之海藻糖及含彼之醣組成物可用於調味料，例如醬油、醬油粉，味噌，味噌粉，’ moromi (未精製醬油 )"，Ahishio (混合上鹽漬蔬菜之味噌醬）〃，、 fur ikake (魚或紫菜粉）〃，美乃滋，調味汁，醋，’ sa nbai-zu (混合酒’醬油及醋之醬）〃，Afunmatsu-sus- hi-su (供壽司用之粉狀醋）〃 ’ 、chuka-no-moto (中國 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、11

口味之調味劑 tentsuya (供甜不辣用之湯） [yr 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 19 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7 五、發明説明（Π ) mentsuyu (供日式麵條用之湯〃，醬，蕃煎醬，’ yakiniku-no-tare(供烤肉用之湯）〃，咖哩，燉煮預混物，湯預混物，’dashi-no-moto(乾燥松魚口味之調味劑）"，混合調味劑，’ m i r i η (重度甜化之酒）"，’ shin-mirin (合成mirin) 〃，桌用糖及咖啡糖。本發明之海藻糖與含彼之醣組成物亦可自用使用以甜化曰式糕餅，諸如>senbei (米製脆餅）A ，arare-moc-hi (黏著之米製脆餅）"，a okoshi (粟及米製脆餅），米糕，’manju (含豆醬填料之麵包）〃，>uiro (甜米凍膠）〃，’an (豆醬）〃，Ayokan (豆類之甜凍膠） ” ’ ’mizu-yokan (軟adzuki —豆凍膠）〃，’kingyoku 〃（一種凍膝）’凍膠，pao de castella及〜amedama( 日式太妃糖）〃等；西式糕餅諸如麵包，硬麵包，脆餅，餅乾，派，布丁，奶油，乳蛋糕乳酯，奶油泡芙，軟餅，海綿蛋糕，甜甜圏，巧克力，口香糖，焦糖及糖果等；冷凍點心諸如冰淇淋及冰凍果子露等；糖漿諸如、kaj itsu-no-syrup-zuke〃（一種水果蜜餞）Akorimitsu〃（削冰用之糖漿）；糊諸如麵粉糊，花生糊，及水果糊及；加工水困及蔬果諸如困醬，橘子果醬，糖漿漬水果及結晶水果等；醃漬物及醃漬產品諸如Afukujin zuke紅色之酶漬紅蘿蔔〃，〜bettara-zuke (—種新鮮醃蘿蔔）〃，、 senmai-zuke 〃（一種切片之新鮮醃漬紅蘿蔔）及、 rakky-zuke (醃漬葱）'，供醃漬物醃漬產品用之預混物諸如’takuan-zuke-no-moto〃（醃漬紅蘿蔔之預混物本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

- 20 - 507008 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

¥ /IV 五、發明説明（18 ) )及、hakusai-zuke-no-moto〃（供新鮮白油菜醃漬品用之預混物）；肉製品諸如火腿及香膠等；魚肉製品諸如魚肉內腿，魚肉香膠’ ’kamaboko (煮熱之魚糊）〃 ’ chikuwa (—種魚漿）及、temPura(日式深炸魚槳）"； "chinmi 〃（佐料）諸如、ni-no-shiokara (鹽漬海膽腸）〃，、ika-n〇-shiokara(鹽漬烏或賊腸）〃 ’、 su-konbu〃（處理過的海帶結）’ saki-surume (脫水就魚絲）及 Afugu-n〇-mirin-boshi〃（脫水之經 mirin 調味的鼓腹魚）；’ tsukudani (於醬油中沸煮之食品）〃諸如紫草，可食的野生植物，乾燥烏賊，小魚及貝等；曰常小菜諸如、nimaffle (煮熟之豆〃，馬鈴薯沙拉及’ konbu-maki (昆布捲）〃；奶製品諸如乳酸製品及乳酷；瓶裝及罐漿產品諸如裝肉，魚肉，水果及蔬菜者；酒精飮料諸如合成日本酒，葡萄酒及酒類；軟性飮料諸如咖啡，茶，可可亞，果汁，碳酸飮料，乳酸飮料及乳酸菌飮料；即食食品諸如即食布丁預混物，即食熱蛋糕預混物，及> sokuseki-shiruco ( adzyki —豆湯與米糕之預混物）及即食湯預混物；嬰兒食品；健康食品；及營養飮料；以及改良上述食品口味及品質的食品。本發明之海藻糖及含彼之醣組成物亦可用於動物飼料及寵物食品，以改善其口味喜好，這些動物例有家畜，家禽’蜜蜂，蠶及魚類。本發明之海藻糖及含彼之醣組成物可隨意用來作爲糊狀及液狀之其它食品的甜味劑，增味劑，品質改良劑及安定劑，這些食品例如有煙草，香煙，牙本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' -21 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -丁二一Φ;

507008 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（19 ) 膏，口紅，胭脂，潤唇油，內服藥，口含錠，藥錠，魚肝油滴劑，口香丸，口部清新劑，含嗽劑，化粧品及藥品。本發明之海藻糖及含彼之醣組成物可用來作爲品質改善之安定劑，其係用於易損失其有效組成份及活性的生物活性物質，以及，含有生物活性物質之健康食品及藥學組成物。這類生物活性物質之範例有淋巴激素諸如α -，冷一，及r—干擾素，腫瘤壞死因子一a(TNF—α)，腫瘤壞死因子一点（TNF —点），巨噬細胞移動抑制因子，集落刺激因子，轉移因子及間白素一2(IL—2) ;激素諸如胰島素，生長激素，催乳素，紅血球生成素及濾泡刺激激素等；生物製劑諸如B C G疫苗，日本腦炎疫苗，麻疹疫苗，小兒麻痺活毒疫苗，牛痘病毒疫苗，破傷風類毒素，Trimeresurus抗毒素及人類免疫球蛋白等；抗生素諸如青黴素，紅黴素，氯黴素，四環素，鏈黴素及卡那黴素硫酸鹽等；維生素諸如硫胺素，核黃素，I -抗壞血酸，魚肝油，類胡蘿蔔素，麥角固醇及生育酚等；酵素諸如脂肪酶，彈性蛋白酶，尿激酶，蛋白酶及Θ -澱粉酶，，異澱粉酶，葡聚糖酶，及乳糖酶等；萃取物諸如入參萃取物，類鱉烏龜萃取物，綠藻萃取物，蘆薈萃取物及蜂膠萃取物等；及活存微生物諸如病毒，乳酸菌，及酵母菌等，及其它生物活性物質諸如蜂王膠。本發明之海藻糖及含彼之醣組成物可輕易推知，將上述生物活性物質製成健康食品及藥品，其具有令人滿意的高度安定性及無須擔憂喪失或鈍化其有效組成份及活性的品質。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂

-22 - 507008 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（20 ) 女口前所述’將本發明之海藻糖及含彼之醣組成物摻入上述物質及組成物的方法包括習知方法，舉例而言，諸如混合法，捏合法，溶解法，熔化法，浸泡法，滲透法，擴展法’塗敷法，塗覆法，噴霧法，注射法，結晶法及固化法等。本發明之海藻糖及含彼之醣組成物通常滲入上述物質及組成物，其量爲〇. 1%以上，較好，1%以上（按乾固重計）。下列實驗係更詳細描述本發明。實驗1 酵素之製浩製備營養培養液，其由下列組成：〇 . 1 w / v %膝 ’〇_ lw/ν%酵母萃取物，0. 2W/V%硫酸銨塩 ’〇. 05w/v%磷酸鉀，〇. 〇2w/v%硫酸鎂， 0_ 〇2w/v%氯化鉀及水。將1〇〇毫升之該營養培養液置入5 0 0毫升Erlenmeyer燒瓶中，於1 2 0°C高壓滅菌2 0分鐘以完成滅菌，冷卻並添加硫酸塩以正ρ η至 3· 〇’然後將酸熱硫化葉菌ATCC33909之原培養物接種其中，培養於75 °C，1 30 r pm之攪拌條件下歷2 4小時。將所生成的培養液匯合且用來作爲第一種培養物。將約5公升新鮮配製之與用於第一種培養物相同之營養培養液置入1 〇公升醱酵槽中，滅菌，冷卻至7 5 °C且校正pH至3. 0，然後接種lv/v%之第一種培養物且於7 5 °C培養約4 8小時，同時在有氧條條（本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

507008 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（21 ) 5 〇 0毫升/分鐘之供氧狀況）攪拌以獲得第二種培養物。將約2 5 0公升新鮮配製之與用於第一種培養物相同之營養培養液置入3 0 0公升醱酵槽中，滅菌，冷卻至7 5 °C且校正pH至3. 0，然後接種lv/v%第二種培養物且於7 5 °C培養約2 4小時，同時在有氧條件（1 0 0 毫升/分鐘之供氧狀況）下攪拌之。此培養物中累積之本發明海藻糖釋出酵素約爲0. 03單位/毫升。實驗？· 酵素之純化離心由實驗1之方法製得之約1 7 0公升的培養物，以回收約2 5 8克之濕細胞。將如此回收的細胞懸浮在 300毫升之10mM磷酸塩緩衝液（ρΗ7· ，0)，並以購自 Nippon Seiki, Co.，Ltd.Niigate , Japan 之超音波細胞震碎機S 3 0 0"予以處理，令所生成之混合液於1 0，0 0 0 r p m，離心3 0分鐘，以獲得約 3 0 0毫升之上清液。將硫酸銨加入此上清液，且將其溶解以生成0. 7之飽和度，令此生成之溶液於4 °C靜置 2 4小時，離心而得沈澱物。令所生成之沈澱物溶於1 0 m M Tris-HC1緩衝液（ρΗ8. 5)，令其對新鮮配製之相同緩衝液透析2 4小時，且離心以去除不溶物。將所生成之經透析溶液（約6 0 0毫升）分爲兩份，其隨後分別進行管柱層析，其使用管柱，其填充約3 5 0毫升購自 Tosoh Corporation, Tokyo, Japan之離子交換子 a DEAE- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T %, 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7__ 五、發明説明（22 ) T0Y0PEARL ® ' 0 令吸附在'DEAE-T0Y0PEARL®之標的對熱安定之海藻糖釋出酵素及對熱安定之形成非還原醣的酵素，由管柱溶離出來，其使用含有0. 1M氯化鈉之10mM Tris-HC 1緩衝液。回收所生成的流份。令如此製得的流份對含有1 Μ硫酸銨之新鮮配製的 1 0 m M Tr is-HCl緩衝液進行透析。離心如此製得之經透析溶液，以去除不溶物質，且令所生成之上清液進行厭水性管柱層析，其使用一管柱，其填充3 5 0毫升購自 Tosoh Corporation，Tokyo, Japan之厭水性凝膠 > BUTYL-TOY OPE ARL®650〃。使用含1M至0M硫酸銨之線形梯度緩衝液，將吸附於凝膠者由管柱溶離出來，對熱安定之海藻糖釋出酵素與對熱安定之形成非還原醣之酵素在不同的硫酸銨濃度下 '洁離出來。填充有>BUTYL-T0Y0PEARL®〃之管柱的溶離圖示於圖1。對熱安定之形成非還原醣的酵素在硫酸銨濃度約爲0. 2M時，自管柱溶離出來，而海藻糖釋出酵素在硫酸銨濃度約爲0. 2M時，自管柱溶離出來。分別回收及純化含有上述標的酵素任一者之流份。令對熱安定之形成非還原醣的酵素製劑，對新鮮配製之含有0 . 2M氯化鈉的1 〇mM Tris-HCl緩衝液透析，離心此經透析之溶液，以去除不溶物質。令所生成之上清液進行凝膠過濾層析，其使用購自SepraCOΓIIlC.Mar·-lborough,Massachusetts 01752»U.S. A. * 之用於凝膠過濾的樹脂〜ULTROGEL A c A 4 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-25 - 507008 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（23 ) ® "，回收具有酵素活性的流份。令所生成之流份對新鮮配製之1 0 mM Tris-HCl緩衝液透析，且令所生成的上清液進行管柱層析，其使用一管柱，其係填充1 〇毫升購自 P h a r m a c i s L K B，U p p s a 1 a , S w e d e η，之離子交換子' MONO Q ® 〃。利用線性梯度緩衝液（0 . 2 Μ至 0 Μ氯化鈉）將吸附在離子交換子上的物自管柱溶離出來，然後回收約0. 1Μ氯化鈉處溶離出來的流份。標的對熱安定之海藻糖釋出酵素之純化，係令充填> BUTYL-T0Y0PEARL®"之管柱所溶離的流份進行凝膠過濾層析，其使用>TOYOPEARL®HW-55〃，以回收具有酵素活性之流份。令所生成之流份再次進行厭水性管柱層析，其使用充填’BUTYL-T0Y0PEARL® 6 5 0 〃之管柱，然後進行凝膠過濾層析，其使用’SEPER ROSE 12HR1 0/3 0 ^，以回收具有對熱安定之海藻糖釋出酵素之酵素活性的流份。本說明書中，除非特別指出，本發明之對熱安定性之形成非還原醣的酵素之活性命名爲單位活性，其分析如下 :將1毫升之酵素溶液添加至4毫升之含有1. 2 5w/ v%麥芽五糖之50mM磷酸塩緩衝液（ρΗ5· 5)，其係作爲受質，並令此混合溶液於6 0 °C培養6 0分鐘。令此反應混合物於1 〇〇 °C加熱1 〇 0分鐘，以懸浮此酵素反應物，且此反應混合物以去離子水精確地稀釋1 〇倍 ’然後測定此稀釋後溶液於SomogyiONelson’s方法上的還原力。該酵素之一單位活性定義爲：在上述條件下，每分本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-26 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 & 507008 A7 B7 五、發明説明（24 ) 鐘減少1毫莫耳麥芽五糖之還原力所需的酵素量。每一純化步驟中，對熱安定之形成非還原醣的酵素活性，特異活性及產量，示於表1 ，而本發明之對熱安定之海藻糖釋出酵素的數據則示於表2。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-27 - 507008

7 B 五、發明説明（25 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製表 1 純化步驟總酵素活性特異活性（單位/ 產量單位）毫克蛋白質） (% ) 原培養物 N D N D N D 細胞破裂後的上清液 N D N D N D 塩析後的經透析溶液 N D N D N D 離子交換管柱之溶離物 N D N D N D 厭水性管柱之溶離物 440 19.8 100 凝膠過濾管柱之溶離物 152 54.7 35 離子交換管柱之溶離物 39.8 80.8 9.0 註：表中、N D 〃表示、未測定〃。廉II— -Ί- - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T .¾. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） Μ 507008 Α7 Β7 五、發明説明（26 ) 表 2 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Μ 純化步驟總酵素活性單位）特異活性（單位/ 毫克蛋白質）產量 (% ) 原培養物 4,550 - 100 細胞破裂後的上清液 4,450 0.22 98 塩析後的經透析溶液. 4 ,340 0.23 95 離子交換管柱之溶離物 3,290 1 .35 72 厭水性管柱之溶離物 2,470 36.5 54 凝膠過濾管柱之溶離物 2,020 54.7 44 厭水性管柱之溶離物 820 128 18 凝膠過濾管柱之溶離物 147 730 3 . 2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -29 ϋϋ· fllflii-1 ·ϋϋ I —ϋ i_n —ϋ ϋϋ ι_ϋ ·11 ϋϋ ϋ—-·r i-i i^—ϋ n^i (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7___ 五、發明説明（27 ) 於使用7 . 5 %聚丙烯醯胺凝膠之電泳上，測定此經純化之酵素製劑，其係由表1及2所示之凝膠過濾管柱所得之溶離物。結果，每一酵素製劑觀察而得單一蛋白質帶，表示一高度純化之製劑。實驗3 物化特性實驗3 — 1 對熱安定之海藻糖釋出酵素的特件令實驗2方法所得之一份經純化之對熱安定之海藻糖釋出酵素製劑，進行電泳，其使用含有1 0%十二酯硫酸鈉聚丙烯醯胺的凝膠，且藉與Japan Bio-Rad Laboratories ， Tokyo, Japan 購得之標記蛋白質比較，鑑知其分子量約爲54，000 — 64，000道耳吞。令另一份經純化之酵素製劑進行等電點電泳，其使用含有 2 v / v % 購自 Pharmac i a LKB B i ot echno 1 ogy AB, Uppsala,Sweden,之兩性電解質>AMPH0LINE 〃的聚丙烯醯胺凝膠。將所生成之凝膠切成一條條，然後測定其p Η，且得知此酵素之pi約爲5. 6—6. 6。根據測定此酵素活性所用的分析法，研究溫度與p Η 對本發明酵素的影響。其結果分別示於圖2 (溫度之影響 )及圖3 (pH之影響）。當於ρΗ6. 0培養30分鐘時’此酵素之最佳溫度約爲7 5 °C，當於g q t培養3 〇分鐘時，最佳pH約爲5. 5—6. 〇。此酵素之熱安定本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

~ 30 - 507008 f]年丨修.補充丨 A7 五、發明説明（28 ) 性的測定’係將酵素培養在5 〇 m Μ磷酸塩緩衝液（p Η 7· 0)中’於不同溫度下歷60分鐘，以冷水冷卻此緩衝液’且測定每份緩衝液中的殘留酵素活性。此酵素之 Ρ Η安定性的測定，係將酵素培養在具有不同ρ η值之 5 OmM磷酸墙緩衝液中，於2 5 歷1 6小時，校正緩衝液至ρ Η 7 ’並分析每份緩衝液中的殘留酵素活性。此酵素之熱安定性及pH安定性的結果分別示於圖4及5。此酵在溫度高達約85 °C且pH約5· 5 — 9. 5時仍是安定的。本發明酵素之胺基酸序列係於購自Perk in-Elmer Corp.，Instrument Div.，Norwalk，U.S.A，之蛋白質定序儀$ Μ 0 D E L 4 7 3 A 〃上分析，以得知N —終端之 1 0個胺基酸殘基。含有N -終端之部份胺基酸序列爲甲硫胺酸-苯丙胺酸-絲胺酸一苯甲胺酸一甘胺酸一甘胺酸 -天冬醯胺-異亮胺酸-榖胺醯胺-離胺酸。實驗3 — 2 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 對熱安定之形成非還原醣之酵素的特性於SD S -聚丙烯醯胺凝膠電泳（丨〇%凝膠濃度）上’測定由實驗2方法製得之經純化對熱安定之形成非還原醣之酵素的分子量，藉由比較同時電泳之標記物的分子量’得知此酵素在電泳上呈現對應約6 9，0 0 0 -79 ’ 0 0 0道耳吞的單一帶。本發明之純化酵素係於聚丙烯醯胺凝膠上進行等電點電泳，所生生之凝膠的ρ Η經本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐）分f 507008 in 争i re 修正 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製、發明説明（29) 校正且此酵素之pi值鑑知約爲5. 4—6. 4。根據用於此酵素活性之分析法，研究溫度與p Η對本發明酵素活性的影響。本發明酵素之最佳溫度約爲7 5 °C 且最佳pH爲5. 0—5. 5。本發明酵素之熱安定性及 P Η安定性係根據實驗3 - 1之方法研究。本發明酵素在溫度高達約85 °C且pH約4. 0 - 9 . 5時，仍爲安定的。本發明酵素之胺基酸序列係根據實驗3 - 1之方法分析。含N -終端之部份胺基酸序列爲甲硫胺酸-異亮胺酸 -絲胺酸-蘇胺酸-酪胺酸-精胺酸-亮胺酸-穀胺醯胺一亮胺酸。實驗4 利用對熱安定件之海藻糖釋出酵素製造海藻糖實驗4 — 1 形成非還原醣之酵素的製備製備由下列組成之營養培養液：2. Ow/v%麥芽糖，0· 5w/v%臃，0. lw/v%酵母萃取物， 0. lw/v%磷酸氫二鈉及〇. lw/v%磷酸氫二鉀。將約1 0 0毫升之該營養基培養液置入5 0 0毫升 Erlenmeyer燒瓶，於1 2 0 °C高壓滅菌2 0分鐘以完成滅菌，冷卻，接種根瘤菌厘_11(?£11%8?-4 1 3 0 )之原培養物，並於搖盪條件下，以2 7°C培養 2 4小時。匯合所生成的培養物且用來作爲種培養物。分 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) #

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -32 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7 五、發明説明（3〇 ) 批地，將用於上述培養物相同之新鮮配製的2 0公升營養培養液置入3 0公升醱酵槽，滅菌，種種1 v/v%種培養物，且於3 0 °C培養約7 2小時，同時保持培養基之 P Η爲6 — 8並在供氧之有氧條件下攪拌。藉購自 Dainippon Phermaceu t i ca 1 Co. , Osaka, Japan’ 之超高速細胞均質機I N I - LAB"處理所生成的培養物，以磨碎細胞。離心所生成者以除去不溶物質，然後以硫酸銨晶析之，並連續以如下技術純化之：離交換管柱層析，其使用離子交換樹脂’DEAE T0Y0PEARL®";厭水性管柱層析，其使用厭水性樹脂’BUTYL T0Y0PEARL®〃；凝膠過濾層析，其使用凝膠過濾樹脂’T0Y0PEARL®HW-55"，上述者皆爲 Tosoh Corporation，Tokyo, Japan 的產物，藉此回收形成非還原醣之酵素製劑，其具有1 9 5單位/ 毫克蛋白質之特異活性，產量約爲2 2 0單位（此係根據 1單位/公升培養物來計算）。根據實驗之方法，分析衍自根廇菌Μ—11株之形成非還原醣之酵素的活性，其中用來作爲受質之5 OmM磷酸塩緩衝液（ρΗ7· 0)及6 0°C之反應溫度分別替換爲5 0 m Μ醋酸塩緩衝液（p Η 5 . 5 )及4 0 °C。實驗4 一？. 靈非原醣’該非還原醣具有海藻糠結構作爲終端單位且 ms少三個葡萄糠夕聚合狀態對含有作爲受質之2 0%麥芽三糖，麥芽四糖，麥芽本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公釐） -33 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

507008 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（31 ) 五糖，麥芽六糖或麥芽七糖的水溶液，添加2單位/克受質（按乾固重計）之實驗4 - 1方法製得之經純化的酵素製劑，且令此生成之混合液於4 0 °C及p Η 7 . 0進行，酵素反應4 8小時。加熱此反應混合物，以鈍化殘留的酵素，過濾脫色，脫塩且濃縮而得經濃縮之醣水溶液，然後令其進行離子交換管柱層析，其使用購自Tokyo Organic Chemical Industries，Ltd·，Tokyo, Japan 之離子交換子' XT— 1 〇 1 6 (Na+ —型，4%聚合程度）〃。管柱層析儀中，離子交換子被填充在3個外套著不銹鋼的管柱中，此管柱內徑爲2. 0公分且長爲1公尺，其隨後一個接一個地套接在一起，加熱而產生5 5 °C之內管溫度，添加5 v/v%之濃縮醣溶液，同時保持5 5 °C與樹脂反應，注入5 5 °C熱水，其S V (空間速度）爲〇 . 1 3，獲得具有高純度非還原醣之流份，該非還原醣具有海藻糖結構作爲終端單位且具有至少三個葡萄糖之聚合狀態。所生成之流份中，非還原醣之高純度製劑中，非還原醣的純度至少9 5% (按乾固重計）。回收如此製得的流份並將此溶液溶於0 . 1 N氫氧化鈉中，於1 〇〇 °C加熱2小時以分解殘留的還原性醣。利用活性炭將所生成的溶液脫色，並以離子交換子（H+及OH-型）純化之，製得富含非還原醣製劑的製劑，α -葡糖基海藻糖，α -麥芽糖基海藻糖，α -麥芽三糖基海藻糖，α -麥芽四糖基海藻糖及α -麥芽五糖海藻糖在其高純度製劑中的純度分別爲 99. 0%以上（按乾固重計）。本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） Μ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7 五、發明説明（32 ) 實驗4 一 3 利用對熱安定性之海藻糖釋出酵素，由非還原_醣製備海藻將含有實驗4 - 2方法製得之上述五種非還原醣製劑中任一者的水溶液（5%，按乾固重計），與2單位/克受質（按乾固重計）之實驗2製得的經純化海藻糖釋出酵素混合，令其於60°C及pH5. 5，進行酵素反應48 小時。令所生成之每份反應混合物脫塩，且於高效液相層析儀（HP L C)上分析其組成份，其使用購自Wako Pu-r e Chem i ca 1 I ndustr i es Ltd ·，Tokyo, Japan之管柱 Α ΜΑΚΟ BEADS WB-T-330"。作爲對照組的是，令相同酵素之新配製劑作用在麥芽糖寡醣諸如麥芽三糖，麥芽四糖，麥芽五糖，麥芽六糖及麥芽七糖。於 Η P L C上分析所生成之反應混合物的組成。結果示於表 3。表3之結果証明下列事項： 1. 本發明之對熱安定的海藻糖釋出酵素，專一地水解非還原醣之海藻糖部份與糖基部份之間的鍵結，該非還原醣具有海藻糖結構作爲終端單位且具有至少三個葡萄糖之聚合狀態，以形成海藻糖與具有一個以上葡萄糖之聚合程度的非還原醣；及 2. 麥芽寡醣類不能被本發明之海藻糖釋出酵素水解。本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

507008 Φ A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（33 ) 表 3 受質產物 HPLC上的溶離百分比時間（分鐘） (%) 海藻糖 27.4 7.2 葡糖基海藻糖葡萄糖 33.8 3.9 葡糖基海藻糖 23.3 88.9 海藻糖 27.4 40 . 2 麥芽糖基麥芽糖 28.7 40.5 麥芽糖基 21.6 19.3 海藻糖 27 . 4 41 . 1 麥芽三糖基麥芽三糖 25.9 58.2 麥芽三糖基 19.7 0.7 JLP 丁 111 ^ϋΒϋ —Βιϋ —ϋ·— ·ϋϋ ϋι_— 1>1 meaatmmmmm —ϋϋ _11 m I·—— 1·1>ιϋ etamtmt (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

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五、發明説明（34 ) (待續）經濟部中央標準局員工消費合作社印製受質產物 HPLC上的溶離百分比時間（分鐘） (%) 海藻糖 27.4 34.0 麥芽四糖基麥芽四糖 24.1 65.8 .麥芽四糖基 18.7 0.2 海藻糖 27.4 29.1 麥芽五糖基麥芽五糖 22.6 70.6 麥芽五糖基 17.8 0.3 麥芽三糖麥芽三糖 25.9 100 麥芽四糖麥芽四糖 24.1 100 麥芽五糖麥芽五糖 22.6 100 麥芽六糖麥芽六糖 21.8 100 麥芽七糖麥芽七糖 21.0 100 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (0〇 - 37 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂

507008 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（35 ) 由這些結果可証實，本發明之對熱安定的海藻糖釋出酵素是新穎酵素，其具有能專一地水解非還原醣中海藻糖部份與其餘糖基部份之間鍵結的機轉，以自該非還原醣釋出酵海藻糖，該非還原醣具有海藻糖結構作爲終端單位且具有至少三個葡萄糖之聚合狀態。實驗5 自非還原性澱粉部份水解物製備海荡糖令含5%蠟狀玉米澱粉之懸浮液明膠化，藉加熱，校正pH至4· 5,加熱至50 °C，與購自Hay ash i bar a Biochemical Labor tor i es Inc.，Okayama, Japan之含有 4，0 0 0單位/克澱粉（按乾固重計）之異澱粉酶樣品混合，且進行酵素反應2 0小時。令此反應混合液於 12 0°C高壓滅菌1 0分鐘，冷卻至6 0°C，進行凝膠過濾管柱層析，其使用一管柱，其填充75°毫升購自 Tosoh Corporation , Tokyo, Japan之 ^ Toyo pearl ® HW〃，製得具有37-11之葡萄糖聚合程度的還原性澱粉部份水解物。將如此製得之還原性澱粉部份水解物或具有3個葡萄糖聚合程度之麥芽三糖（其係作爲受質），溶於10mM 磷酸塩緩衝液（PH7. 0)，製成1%之溶液，再將此溶液與4單位/克受質（按乾固重計）之經純化之形成非還原醣的酵素及經純化之海藻糖釋出酵素，其係由實驗2 之方法製得，且於4 0°C進行酵素反應2 4小時。完成酵 m In# _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 Α7 Β7 五、發明説明（36 ) 素反應之後，令每份反應混合液中的部份生成物脫塩，且於Η P L C上分析以鑑知其組成。將每份反應混合液之其它部份加熱至50 °C，校正pH至4_ 5，與50單位/ 克受質（按乾固重計）之購自Seikagaku-Kogyo Co.,Ltd. ,Tokyo, Japan,之葡糖澱粉酶樣品混合，進行酵素反應 1 0小時。如前所述，令每份反應混合液中之部份生成物脫塩，於Η P L C上分析以鑑知其組成。結果示於表4。如表4所示，當使用具有三個葡萄糖之聚合程度的麥芽三糖作爲受質時，使用對熱安定之形成非還原醣的酵素及本發明對熱安定之海藻糖釋出酵素進行酵素反應之後，所得的海藻糖產量相當低，即2. 2%;然而當使有具有 10. 8-36. 8葡萄糖聚合程度之澱粉部份水解物作爲受質時，海藻量產量欲相當高，即63. 3-81. 2 %。發現作爲受質之還原性澱粉部份水解物之葡萄糖聚合程度愈高，則所生成之海藻糖純度愈高。另亦發現，所生成之海藻糖純度可予進一步提高，其係令葡萄糖澱粉酶作用在上述兩種酵素製備之反應混合物上，以將相隨的非還原醣’分解爲海藻糖及葡萄糖分子，該非還原醣具有海藻糖結構作爲終端單位且具有至少三個葡萄糖之聚合狀態。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

- 39 - 507008 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（37 ) 表 4 還原性澱粉部份反應產物組成（％ ) 1 水解物之麥芽糖聚合程度 A · B · 麥芽糖 81 . 2 82.5 葡萄糖 1 . 2 17 . 5 36.8 還原性寡糖 13.6 0.0 葡糖基海藻糖 4.0 0.0 麥芽糖 79.5 81.8 葡萄糖 1.8 18.2 2 7.5 還原性寡糖 14.1 0.0 泛一葡糖基海藻糖 4.6 0 . 0 麥芽糖 77 . 3 80.2 葡萄糖 2 . 2 19.8 19.8 還原性寡糖 15 . 3 0.0 ^ -葡糖基海藻糖 5.2 0.0 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）請先閲讀背面 $ i 事項再填寫本頁

I %tI 40 - 507008 Α7 Β7 五、發明説明（38 ) (後續）還原性澱粉部份反應產物組成 (% ) 水解物之麥芽糖聚合程度 A · B · 麥芽糖 73.4 77.5 葡萄糖 2.5 22.5 16.5 還原性寡糖 18.1 0.0 ^一葡糖基海藻糖 6.0 0.0 麥芽糖 63.3 68.5 葡萄糖 5.7 31.5 10.8 還原性寡糖 22.8 0.0 α -葡糖基海藻糖 8.2 0.0 海藻糖 2.2 19.9 3 葡萄糖 10.4 80.1 (麥芽三糖）麥芽糖 18.5 0.0 麥芽三糖 42.0 0 . 0 ^-葡糖基海藻糖 25.9 0.0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 註：符號a*"表示形成非還原醣之酵素及本發明海藻糖釋出酵素進行酵素反應之後的組成物，且符號、* * 〃表示葡糖澱粉酶進行酵素反應之後的組成物。表中，、^ 一葡糖基海藻糖"乙詞表示非還原醣，該非還原醣具有海藻糖結構作爲終端單位且具有至少三個葡萄糖之聚合狀態。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -41 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 Α7 Β7 五、發明説明（39 ) 實驗ft 自硫化葦菌屬之其它微生物製備對熱安立之海荡糖鏗，屮f 素及箕特件利用實驗1之相同方法，製備營養培養基，接種微生物，於醱酵槽中培養2 4小時，例外處是，使用酸熱硫化葉菌CC 4 9 4 2 6 )，火山口硫化葉菌（

(A 3 509 1)及火山口硫化葉菌（ATCC

3 5 0 )之微生物替換酸熱硫化葉菌（ATC C 33909)。根據實驗2之方法，由約170公升之各種所生成之培養物回收細胞，藉超音波震碎細胞以獲得上清液。以硫酸銨塩析所生成之上清液，透析，進行離子交換管柱及厭水性管柱層析，以獲得部份純化之酵素製劑，然後分析其特性。結果示於表5，使用酸熱硫化葉菌（ ATCC 3 3909)所得之結果亦一併示於表5。根據實驗4 - 3之方法，利用這些部份純化之酵素製劑製備海藻糖，研究其結構而發現，類似自酸熱硫化葉菌 (ATCC 33909)所得之對熱安定的海藻糖釋出酵素’所有酵素製劑皆自非還原醣釋出海藻糖，該非還原醣具有海藻糖結構作爲終端單位且具有至少三個葡萄糖之聚合狀態。 Λ張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） /於 -42 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂 507008 A7 B7 五、發明説明（40 )Μ_5 微生物自離子交換管柱所得溶離物中的酵素活性 (單位）最佳溫度 (°C) 最佳pH 熱安定性 (°C ) p Η安定性酸熱硫化葉菌 (ATCC 33909) 2470 約 75°C 約5.5-6.0 高達85°C 約5_5-9·5 酸熱硫化葉菌 (ATCC 49426) 1850 約 75°C 約5.5-6.0 高達85°C 約5.5-9.5 火山口酸熱硫化葉菌 (ATCC 35091) 1220 約 75°C 約5.5-6.0 高達85°C 約4.5-8.5 火山口酸熱硫化葉菌 (ATCC 35092) 445 約 750C 約5.5-6.0 高達85°C 約4.5-8.5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -43 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 0/ Z/ 507008 A7 B7 五、發明説明（41 ) 下列實例A說明本發明對熱安定之海藻糖釋出酵素的製劑，藉使用酵素製得之海藻糖，及含彼之醣類；實例B 說明添加海藻糖之組成物及含彼之醣類。實例A - 1 根據實驗1方法，藉醱醏槽培養酸熱硫化葉菌（ ATCC 33909)之種培養物約42小時。培養完成後，藉S F —膜濃縮所生成的培養物，獲得約5公升的細胞懸浮液b利用購自D a i n i ρ ρ ο η Phrarmaceutical Co. ，之超高壓細胞均質器I N I - LAB 〃處理所生成之懸浮液，以打碎細胞。離心所生成的溶液，回收約 4 . 8公升之上清液。對所生成之上清液，添加硫酸銨以生成約0· 7之過飽和程度，並令此生成的溶液晶析，離心而得沈澱物。將沈澱物溶於1 0 m M Tr i s —塩酸塩緩衝液（ρ Η 8 . 5 )，對此相同之塩酸塩緩衝液的新鮮製劑透析。令所生成之經透析溶液分五次進行離子交換管柱層析’其使用一管柱，其填充約2公升之購自1〇(3111)丨3[1-i Chemical Industries Ltd.，Tokyo Japan之凝藤、 SEPABEADS FP — DA13"，該凝膠經相同之塩酸塩緩衝液平衡過。將吸附在離子交換子上之標的酵素由管柱溶離出來，其係藉由線形梯度緩衝液，其添加〇 Μ至〇 · 5 Μ的氯化鈉，然後由收具酵素活性的流份，其係在約0.15Μ氯化鈉時，自管柱溶離出來。藉SF— 膜濃縮所生成的流份，然後回收約30°毫升之濃縮酵素本紙張尺度適用中國i家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ' ' - " -44 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 Α7 Β7 五、發明説明（42 ) 溶液，其含有36單位/毫升之對熱安定之形成非還原醣的酵素及58. 5單位/毫升對熱安定之海藻糖釋出酵素。令如此回收之具酵素活性的流份，對含有1 Μ硫酸銨之新鮮配製的1 0 mM Tris-HCl緩衝液透析，並離心如此製得之經透析溶液以除去不溶物質。將所生成之上清液分五次進行厭水性管柱層析，使用一管柱，其填充 3 5 0 毫升購自 Tosoh Corporation, Tokyo, Japan之厭水性凝膠'BUTYL-TOYOPEARL® 650"，然後分離對熱安定之形成非還原醣的酵素與對熱安定之海藻糖釋出酵素。添加碳酸鈣至具有濃度爲1 5 w/ v %的馬鈴薯澱粉懸浮液中，生成終濃度爲0. lw/v%，校正pH至6. 0 ，摻和購自 N 〇 v ο I n d u s t r i A / S，C 〇 p e n h a g e η，D e n m a r k 之α —澱粉酶〃 TERMAMYL 6〇L〃，生成每克澱粉爲0. 之濃度，且於9 5°C進行酵素反應 1 5分鐘。令所生成之混合液高壓滅菌3 0分鐘（2 公升/ cm2)，冷卻至58 °C，校正pH至5. 5，摻和2，0 0 0單位/克澱粉之購自Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc. Okayama, Japan之異澱粉酶， 0. 5單位/克澱粉之上述對熱安定之形成非還原醣的酵素，及0. 5單位/克澱粉之上述對熱安定之海藻糖釋出酵素，及進行酵素反應9 6小時。令所生成的混合液保持在9 7 °C，歷3 0分鐘，冷卻及過濾。以習用方法，使用活性炭將所生成的濾液脫色，且藉使用Η -及0H -型之離子交換樹脂將其脫塩而純化。將所生成的溶液濃縮爲一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

45 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7 五、發明説明（43 ) 糖漿，其具有約6 〇w/v %之濃度及約9 3%之產量（按乾固重計）。此產物含有71. 2%海藻糖，3. 0% 葡糖基海藻糖，1. 3%麥芽糖基海藻糖，2· 9%葡萄糖，11.1%麥芽糖，8. 5%麥芽三糖，2. 0%麥芽寡糖類包括麥芽四糖或比其分子量更大者（按乾固重計 )。此產物具有溫和且高品質的甜度，以及適當的黏度及保濕力，且這些特性使得此產物可任意用於食品，化粧品及藥品中，作爲甜味劑，調味劑，品質改良劑，安定劑及填充劑。實例A — 2 分離實例A - 1方法製得之醣溶液，其作爲飼料溶液，藉使用一管柱，其填充購自Toyko Organic Chemical Industries Ltd.，Toyko，Japan之強酸陽離子交換樹脂〃 XT— 1 〇 1 6 (Na+-型，4%之聚合程度）。步驟如下所述之：將此樹脂填充在內徑爲5 . 4公分之4支外套不銹鋼的管柱中，此管柱一個接一個套接一起而得總凝膠床深度爲2 0公尺。加熱管柱而得管柱內溫爲5 5 °C，並饋入5 v/v%之該醣溶液以對抗該樹脂，同時保持在該溫度下，然後將5 5 °C熱水饋至管柱，以分餾分離該醣溶液’且藉此除去併隨的醣諸如麥芽糖及麥芽三糖，及回收富含海藻糖的流份。匯合如此製得的流份，純化，濃縮 ’真空乾燥且碾製而得海藻糖含量高的粉末，其產量約 _ 5 7% (按乾固雷計）。此產物中的海藻糠含量約爲9 7 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

131 -46 — 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7 五、發明説明（44 ) % (按乾固重計），且此產物具有溫和且高品質的甜度，緣是之故，此產物可任意用於食品，化粧品及藥品中，作爲甜味劑，調味劑，品質改良劑’安定劑，賦形劑，稀釋劑及填充劑。實例A - 3 藉一般方法，使用活性炭將實例A - 2方法製得之高海藻糖含量的流份脫色，藉離子交換半脫塩，且濃縮爲約 7 0 %之溶液，再將此溶液置入晶析器，摻和作爲種結晶的約2%含水結晶海藻糖，並逐漸冷卻而得具有約4 5% 晶析度糖膏。令此糖膏由裝配在乾燥塔頂端之噴嘴，以高壓（1 5 0公斤/平方公分）噴霧出來。此噴霧步驟中，糖膏同時被乾燥塔頂端送出的8 5 °C熱空氣通風。且回收此乾燥塔底層架設的金屬截絲網輸送帶上的結晶粉末，漸漸自此乾燥塔移出，同時4 5 °C之蒸氣通過此金屬鐵絲網上方。將所生成的結晶粉末注入熟化塔中且熟化1 0小時以完成晶析化及乾燥化，然後回收粉末狀之無水結晶海藻糖’其相對實質高海藻糖含量之流份而言，產量約9 0% (按乾固重計）。此產物實質上非經濕性的且容易處理，因此其可任意用於食品，化粧品及藥品中，作爲甜味劑，調味劑，品質改良劑，安定劑，賦形劑，稀釋劑及填充劑〇實例A — 4 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） [y〇 - 47 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7 五、發明説明（45 ) 類似實例A - 3，將實例A- 2方法製得之高海藻糖含量之流份予以純化，將所生成者置入蒸發器中，真空沸煮至獲得一糖漿，其具有約3. 0%之濕度含量。將所生成之糖漿置入晶析器中，摻和相對於糖漿乾重爲1 %之無水結晶海藻糖，於攪拌狀態下1 2 0 °C晶析5分鐘，並將所生成的混合物置入簡單鋁容器，於1 0 0 °C熟化6小時，製得一團塊。藉切刀碾製所生成之團塊，且藉液體床乾燥法乾燥之，製得粉末狀之無水結晶海藻糖，其具有約 0. 3 %之濕度含量，及相對實質高海藻糖含量流份約爲 8 5%之產量（按乾固重計）。此產物可任意用來作爲食品，化粧品及藥品中的除濕劑，及其原料及中間物。此產物亦可用於多種組成物中，諸如食品，化粧品及藥品的白色粉狀甜味劑。實例A - 5 根據實例A - 1之方法，令酸熱硫化葉菌（AT C C 3 3 9 0 9 )突變株之種培養物於醱酵槽中培養約4 2小時。培養完成後，藉S F -膜將所生成的細胞經膜過濾，回收約5公升濾液，以購自Dainippon Pharmaceutical Co.，之超高壓細胞均質機、MI N I - LAB 〃將細胞打碎。離心所生成的溶液，回收約4 . 8公升上清液。將硫酸銨加入所生成之上清液，製得約0 . 7之過飽和度，晶析及離心，此生成的溶液製得一沈澱物。將此沈澱物溶於 10mM磷酸協緩衝液（DHfl. 5)，對新鮮配製之相本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 48 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

507008 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（46 ) 同磷酸塩緩衝液透析，回收約6 0 0毫升之酵素溶液，其含有約15單位/毫升之對熱安定之形成非還原醣的酵素與約1 2單位/毫升之對熱安定的海藻糖釋出酵素，然後令此酵素溶液進行厭水性管柱層析，以回收5，8 5 0單位之對熱安定之形成非還原醣的酵素與3，9 6 0單位之對熱安定之海藻糖釋出酵素。令一份重之馬鈴薯澱粉與6 份重之水，及0 . 0 1份重之購自Nagase Biochemical%

Ltd·，Kyoto，Japan 之 α —澱粉酶、、ΝΕΟ — SP I ΤΑ SE 〃摻和。攪拌所生成之混合液且校正pH 至6 . 2，其在8 5至9 0 °C之溫度下明膠化及液化。於 1 2 0 °C加熱所生成之液化溶液1 0分鐘，以鈍化殘留之α —澱粉酶，冷卻至60 °C，校正pH至5. 5,摻和 5 0 0 單位 / 克澱粉之購自^1〇7〇1^丨31^6:1(：:111(11131：1*-y，Copenhagen，Denmark的支鏈激粉酶 ApROMOZINE"，1 單位/克澱粉之上述對熱安定之形成非還原醣的酵素，及 1單位/克澱粉之上述對熱安定的海藻糖釋出酵素，令其進行酵素反應7 2小時。於9 7 °C加熱所生成之混合液 3 0分鐘，以鈍化殘留的酵素，校正至5 0°C及pH 5 _ 0，混合1 0單位/克澱粉之購自Nahase Bicohemi- cals，Ltd.，的葡糖基澱粉酶>GLUC0ZYME"，進行酵素反應2 4小時，加熱以鈍化此酵素。以一般方法，令所生成之溶液脫色，以離子交換樹脂脫塩，及濃縮爲濃度約6 0 % 之糖漿。如此製得的醣溶液含有79. 5%海藻糖，按乾固重計。根據實例A — 2之方法，管柱層析此醣溶液，例本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）一 49 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7____ 五、發明説明（47 ) 外處爲，使用購自Japan Organo Co.，Tokyo，Japan之強酸性陽離子交換樹脂作爲分餾分離所用的樹脂，然後回收富含海藻糖之流份。此流份含有約9 5%海藻糖（按乾固重計），將其濃縮爲約7 5 %之溶液，再將其置入晶析器，與作爲種結晶之約2 %含水結晶海藻糖摻和，在攪拌條件下逐漸晶析。將生成物置入簡單塑膠瓶中，令其於室溫下靜置3天以形成一團塊。再藉切刀碾製所生成的團塊，製得粉末狀之含水結晶海藻糖，其產量爲約爲相對實質澱粉的7 0 %，按乾固重計。此產物實質上非收濕性且易於處理，因而使得此產物可任意用於多種組成物中諸如食品，化粧品及藥品，作爲甜味劑，調味劑，品質改良劑，安定劑，賦形劑，稀釋劑及填充劑。實例A - 6 根據實驗1之方法，藉醱酵槽培養酸熱硫化葉菌（ A T C C 3 5 0 9 1 )之種培養，約歷4 2小時。培養完成之後，根據實例A - 1之方法，令此生成之細胞進行 S F -膜過濾及細胞打碎。藉硫酸銨晶析所生成之上清液，製得一沈澱物。透析此沈澱物，然後進行離子交換管柱層析以回收具有酵素活性之流份。藉U F -膜濃縮此流份，然後回收約1 5 0毫升之經濃縮酵素溶液，其含有 26. 4單位/毫升之對熱安定之形成非還原醣的酵素與 5 7 . 5單位/毫升之對熱安定的海藻糖釋出酵素。令此酵素溶液進行厭水性管柱層析，回收2，ft Fi Π單位之對本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-50 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7 五、發明説明（48 ) 熱安定之形成非還原醣的酵素，與5，9 5 0單位之對熱安定之海藻糖釋出酵素。藉加熱將濃度爲6%之馬鈴薯澱粉懸浮液明膠化，校工至P Η 4 . 5及5 0 °C，摻和 5 0 0單位/克澱粉之異澱粉酶，且進行酵素反應2 0小時。校正所生成之混合液至pH爲6. 5，於120°(：高壓滅菌10分鐘，冷卻至9 5 °C，摻和每克澱粉爲〇. 1 w / v % 之購自 Novo lndusti A/S，Copenhagen，Denma-rk的α —澱粉酶、TERMAMYL 6〇L〃，並進行酵素反應1 5分鐘。令此反應根據於1 3 0°C高壓滅菌 3 0分鐘，冷卻6 5 °C，摻和1單位/克澱粉之上述形成非還原醣的酵素與1單位/克澱粉酶之上述海藻糖釋出酵素，進行酵素反應7 2小時。令所生成之混合液保持在 9 7 °C，歷30鐘，校正至pH 5. 0及50 °C，摻和 1 0單位/克澱粉之購自Nagase Biochemicals，Ltd.，的葡糖基澱粉酶、GLUCOZYME"，進行酵素反應 2 4小時，及加熱以鈍化此酵素。以一般方法令所生成之溶液脫色，藉離子交換樹脂脫塩且濃縮成濃度約6 0 %之糖漿。如此製得之醣溶液含有80. 9%海藻糖，按乾固重計。濃縮此醣溶液而得約8 4 %之濃度，再將其置入晶析器，摻和約2 %之作爲種結晶的含水結晶海藻糖，並於攪拌條件下逐漸晶析化。將生成物置入普通的塑膠瓶中，室溫下令其靜置3天以形成一團塊。再藉切刀將所生成之團塊碾製而得粉末狀之含水結晶海藻糖，產量爲相對於實質澱粉之約9 0%，按乾固重計。吐產物眚質h非吸濕件本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I-------------、訂----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) \7^ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7 五、發明説明（49 ) 的且易於處理，因此，其可任意用於多種組成物中諸如食品，化粧品及藥品，作爲甜品劑，調味劑，品質改質劑，安定劑，賦形劑，稀釋劑及填充劑。實例B - 1 甜味劑對一份重之實例A - 3方法製得的粉末狀含水結晶海藻糖，同質地添加下列物質：0 . 0 1份重之購自Toy〇

Sugar Refining Co·，Ltd. Tokyo, Japan的 α —葡糖基史德維苷產物SWEET"，及0. 01份重之購自 Ajimomoto Co.，Ltd.，Tokyo，Japan之 L —門冬氨醯基 _L —苯基丙胺酸甲酯產物、ASPRTAME〃，並令所生成的混合液饋至粒化器而得顆粒狀甜味劑。此產物具有令人滿意地甜度且具有約大於2. 5倍的蔗糖甜力，且卡路里值低至約爲庶糖卡路里值的1 / 2 . 5。具有令人滿意之安定性的該產物不會分解其它欲混和的甜味劑，故適用於低熱量食品中作爲低熱量甜味劑，此低熱量食品乃針對受到減少熱量攝取限制之肥胖者及糖尿病病人。此產物實質上不形成不溶的聚葡糖，此特性使其適用於甜化食品以防止牙結石。實例B — 2 硬糖果將一百份重之5 5%蔗糖溶液與3 0份JI之海藻糖糖本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

507008 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _ B7 五、發明説明（50 ) 槳混合，同時加熱，該海藻糖係實例A - 1方法製得者，並真空濃縮所生成之溶液，直到濕度含量低至2 %以下。令此濃縮溶液與一份重之檸檬酸及適量檸檬增味劑及呈色劑混合，並以一般方法將所生成之混合液製成所欲產物。此產物是高品質的硬糖果，具令人滿意的口感及嚼感，且不必擔心會造成葡萄糖晶析反應。實例B _ 3 口香糖藉加熱熔化3份重之樹膠碱，至其軟化爲止，令生成物與4份重蔗糖及3份重實例A - 3方法製得之含水結晶海藻糖粉末混合，再進一步與適量增味劑及呈色劑混合。以一般方法，藉滾筒揉捏所生成之混合物，定型及包裝而得所欲產物。此產物是具有令人滿意質感及口感的口香糖實例B — 4 甜味之濃縮牛乳令實例A — 1方法製得之三份重的海藻糖及一份重蔗糖溶於1 0 0份重之新鮮牛乳中，且藉平底加熱器加熱所，生成之溶液而予以滅菌，濃縮而得7 0%之濃度，然後無菌操作地將所生成之濃縮物罐裝成所欲產物。此產物具溫和甜度及令人滿意的口感，且這些特性使得該產物適用於作爲嬰兒食品，新生兒食品，水果，咖酿，可可及茶之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-53 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^ 507008 A7 B7 五、發明説明（51 ) 調味劑。實例B - 5 含有乳酸茼之飮料將1 7 5份重之脫脂奶粉，1 3 0份之實例A〜1方法製得之海藻糖糖漿，及5 0份重之日本專利先公開案第 2 8 1 ，7 9 5/9 2號中揭示之高乳糖基蔗糖含量的粉末，溶於1 ，150份重的水，並藉65 °C加熱3〇分鐘而滅菌所生成之溶液，冷卻至4 0%，以一般方法摻和 3 0份重之乳酸菌作爲起始物，培養於3 7 °C，8小時，以獲得含乳酸菌之飮料。此產物是含乳酸菌之飮料，其具有令人滿意之口感及風味。含有寡醣之該產物穩定保留乳酸菌且可促進二頭菌的生長。實例B — 6 粉末狀果汁令3 3份重由噴霧乾燥製得之粉末狀橘汁與下列物質混合至均質：5 0份重之實例A - 2方法製得之高海藻糖含量的粉末，10份重蔗糖，〇· 65份重之無水檸檬酸，0. 1份重蘋果酸，0. 1份重之L 一抗壞血酸， 0.1份重之檸檬酸鈉，0. 5份重之支鏈澱粉，及適量之粉末狀增味劑。碾製所生成的混合物，饋至液化床之成粒器並噴灑實例A - 1方法製得之海藻糖糖漿作爲黏固劑，同時將茸涣至有流涑爲1 5 0 m 3之4 0 °C空氣的容器本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2丨〇><297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-54 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ 507008 A7 B7 五、發明説明（52 ) 。稱重及封裝如此製得之顆粒，製得所欲產物。此產物含有3 0 %橘汁（按乾固重計），其保留相當長時間之高品質，但不產生令人不滿意的口感及味道。實例B - 7 乳蛋酯將1 0 0份重之玉米澱粉，1 0 0份重之實例A — 1 方法製得的海藻糖糖漿，8 0份重之麥芽糖，2 0份重之蔗糖，及1份重之塩混合均匀。令所生成之混合液與 2 8 0份重的蛋摻和，且慢慢添加1，0 0 0份重之煮沸牛乳。令如此製得之混合液持續攪拌及加熱，當混合液中的玉米澱粉完全明膠化而生成半透明之完整內容物時，停止加熱，然後冷卻此混合液且添加適量之香草增味劑至此混合液中。稱重所生成的混合液，灌注及封裝而得所欲產物。此產物具有光滑表面及光澤，以及溫和口感及甜度。實例B — 8 U i r 〇 — η 〇— mo t 〇 (製ui r 〇之良卩溶、混合物）將9 0份重之米粉與下列物質混合至均勻：2 0份重之玉米澱粉，40份重鹿糖，80份重含有實例Α - 3方法製得之含水結晶海藻糖的粉末，及4份重之支鏈澱粉，以製得 'u i ro — no— mo t 〇。令此i ro — n o—mo t 〇〃與適量、ma c cha ( —種綠茶粉末 _ ) 〃及水揉和，日將所半成夕煆合物分涣小瓶中，沸縢本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-55 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7 五、發明説明（53 ) 60分鐘而得、、ma c cha - u i r 〇〃。此產物具光滑光澤，極佳美味及好吃的口感，亦具有長的擱置有效期，因爲澱粉之逆降解反應被有效抑制了。實例B — 9 A η (豆醬）以一般方法，添加水而煮沸1 0份重之> a d z u k i 〃豆子作爲質物，然後去除豆子的收歛性及粗糙感，以及可溶水的雜質，製得約2 1公斤a adzuki — tsubu - an’ 。對此生成物，添加 1 4份重之蔗糖，5份重之實例A - 1方法製得之酵素糖漿，及4份重之水，且煮沸所生成之混合液，摻和少量沙拉油，並小心揉合而不使豆子成醬。因此，製得所欲產物，產重約3 5公斤。未脫色之產物具有令人滿意的口感及味道，脫色乃藉加熱誘生，且此特性使得該產物可用來作爲質> A η 〃，以製備夾豆之小圓麵包，有夾豆填料的小圓麵包，麵團，填充豆夾之薄餅干，冰糕，及冰淇淋。實例Β — 1 0 麵包以一般方法，將1 0 0份重之麥粉，2份重之酵母， 5份重之糖，一份重之含有實例Α - 2方法製得之海藻糖的粉末，0.1份重之無機酵母食品，與水揉合，以進行醱酵反應，於2 6 °C，歷2小時，然後熟化3 0分鐘，再本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------,AW-- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 % />( 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7 五、發明説明（54 ) 烘生成物。產物是高品質的麵包，其具有令人滿意的顏色及膨鬆度，以及令人滿意的彈性及溫和甜度。實例B — 1 L 火腿對1 0 0份重之火腿肉片，添加1 5份重之塩及3份重之硝酸鉀，並磨至均勻，堆起所生成的肉片，令其於冷藏室靜置一夜。然後，在冷藏室中先將所生成的肉片浸入一塩溶液中7天，該塩溶液由下列組成：5 0 0份重之水，1 0 0份重之塩，3份重之硝酸鉀，4 0份重實例A -6方法製得之粉末狀含水結晶海藻糖，及適量之薄荷，再以一般方法用冷水洗滌，綁起，煙燻，烘烤，冷卻及封裝而得所欲產物。此產物是高品質的火腿，其具有令人滿意的顏色、口感及味道。實例B — 1 2 粉末狀之狀將 1 份重之 4 0 %購自 Fuji Oil Co., Ltd.，Tokyo, Japan之可食大豆的肽溶液a Hi nut e S〃，與2份重之實例A - 6方法製得之粉末狀含水結晶海藻糖混合，且將所生成之混合液置入塑膠瓶中，於5 0°C真空乾燥，碾製而得粉末狀肽。此產物具有令人滿意的口感及味道，可任意用來作爲製備糖果糕餅之原料，此糖果糕餅類諸如預混物，冰糕及冰淇淋，以及口服及導管餵食形式之罌轵食品及本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

% -57 - 507008 A7 B7 五、發明説明（55 ) 治療用營養品。實例B - 1 3 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 粉末狀映措將3份重之實例A - 4方法製得之粉末狀無水結晶海澡糖’加入一份重之、akamis〇〃（一種味噌），且將此混合液倒入表面具有半圓孔之金屬板中，令其於室溫下靜置一夜以製得、味噌〃固體，每份約4克重，再將其送至碾製品而得所欲產物。此產物可任意用於速食麵及湯之調味料，以及、味噌〃糖果糕餅。實例B — 1 4 粉末狀蛋昔於6 0 — 6 4°C，藉平底加熱器將新鮮蛋製得的蛋黃滅菌，並令所生成的液體與4份重之實例A - 4方法製得之粉末狀無水結晶海藻糖（相對於一份重之該液體）混合。將所生成之混合液移至容器中，令其靜置一夜以形成圍經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ? Iff /^ 塊，同時令此無水結晶海藻糖轉化爲含水結晶海藻糖。藉切割機碾製如此製得的爵塊，製得粉末狀蛋黃。此產物可任意用來作爲下列物質之原料：糖果糕餅類之預混物，冰糕，冰淇淋及乳劑，以及口服與導管餵食形式之嬰兒食品及治療用營養基品。此產物亦可用來作爲嫩膚劑及保鬆劑〇本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐）一 ~ -58 - 507008 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（56 ) 實例B - 1 5 化粧乳液藉一般方法，藉加熱溶解2份重之聚氧化乙烯乙二醇單硬脂酸，5份重之甘油基單硬脂酸（其自動乳化）’ 2 份重之實例A — 2方法製得之高海藻糖含量的粉末’ 1份重之α-甘油基藝香甙，1分重之液體凡士林，1〇份重之甘油基三一 2 -乙基己酯，及適量之防腐劑。令所生成之溶液與2份重之L 一乳酸，5份重之1，3 -丁二醇及 6 6份重之精製水混合，且藉均質機將所得混合液乳化’ 及在攪拌條件下與適量增香劑混合而得化粧乳液。此產物具有相當高之安定性，且此特性令其可任意用來作爲高品質之防曬乳油，嫩膚劑及皮膚白化劑。實例Β — 1 β 粉末狀人參萃取物令0. 5份重之人參萃取物與1. 5份重之實例Α- 4方法製得之粉末狀無水結晶海藻糖混合，將所生成之混合物倒入普通容器，令其靜置2天，將無水結晶海藻糖轉化爲含水結晶海藻糖而得一團塊。藉切刀碾製所生成的團塊’且分級而得粉狀人參萃取物。令此產物與適量之粉末狀維生素B 1及B 2送入成粒機，製得含維生素之粉末狀人參萃取物。所得產物可任意用來作爲補藥，舒解疲勞劑及活力提供劑。此產物亦可用來作爲保髮劑。本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂

-59 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 507008 A7 B7 五、發明説明（57 ) 實例B - 1 7 固體藥品以一般方法’將購自 Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.，Okayama, Japan之天然人類干擾素一 α製劑饋至一管柱，該管柱上具固著之抗-人類干擾素一 ^的抗體，藉此吸附天然人類干擾素- α，並將含有小牛血清白蛋白作爲安定劑之緩衝液注入該管柱，然後去除過量的白蛋白。之後，將干擾素一 α自管柱溶離出來，其係使用含有5 %富含實例Α - 2方法製得之海藻糖粉末的生理食塩水，然而生理食塩水之p Η隨其變化。令所生成之溶離物經膜過濾，添加約2 0倍體積之購自Hayashibara Shoji， Inc· ， Okayama， Japan 之無水結晶麥芽糖粉末、 FINET0SE®"，將濾液脫水，然後碾製所生成之脫水產物，藉打錠機將所生成的粉末錠化，製得每錠約 2 0 0毫克之含有約1 5 0單位天然人類干擾素一 α的錠劑。此產物可作爲口含錠而經口施用於病患，劑量爲1 -10錠/成人/天，且可隨意用來治療病毒感染，過敏症，風濕症，糖尿病及惡性腫瘤。更特別地，此產物適用來作爲A I D S及肝炎的治療劑，患有這些疾病的病人數目已顯著增加中。併入此產物中的海藻糖及麥芽糖係作爲天然人類干擾素一 α之安定劑，故擾素一 α之活性可良好保留相當長的時間，即使在室溫下。實例 Β — 1 8 _^__ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

ff7 -60 - 507008 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 /0 /1 A7 B7五、發明説明（58 ) 糖衣錠將1 5 0毫克重之粗製錠作爲核心，塗覆具有如下組成的溶液：4 0份重之實例A - 3方法製得的粉末狀含水結晶海藻糖，2份重之支鏈澱粉，其具有平均分子量爲 200，0 00，30份重之水，25份重之滑石，及3 份重之二氧化鈦，直至總重達約2 3 0毫克’再令生成物進一步塗覆具如下組成之溶液：6 5份重之相同粉末狀含水結晶海藻糖的新鮮製劑，1份重之支鏈澱粉’及3 4份重之水，並以液態蠟打光而得具令人滿意光澤及外觀的糖衣錠。此產物具有相當高的耐撞性且保留其高品質，歷當當長時間。實例B - 1 9 牙膏組成：磷酸氫鈣支鏈澱粉月桂酸鈉甘油 45. 0¾ 2.95% 1.5% 20. 0% 聚氧化乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯 0. 5% 防腐劑 0.05% 粉末狀含水結晶海藻糖 12.0% (實例A — 3方法製得者）馬特醇（maltitol) 5.0% 水 13.0 % 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 61 _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

507008 A7 B7 五、發明説明（59 ) 以一般方法混合上述物質而得牙膏。此產物具適當甜度，適合作爲兒童牙膏。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例B ，Π 蔓璧餵食品製備具有如下組成之組合物：5 0 0份重之實例A — 3方法製得的粉末狀含水結晶海藻糖，2 7 0份重之脫水蛋黃，209份重之脫脂奶，4_ 4份重之氯化鈉， 1 · 8份重之氯化鉀，4份重之硫酸鎂，〇. 01份重之維生素B1，〇_ 1份重之維生素C鈉塩，〇. 6份重之維生素E醋酸塩及〇_ 04份重之菸鹼醯胺，並將此組合物分成2 5克之等份，置入小之具防濕內層之鋁袋，然後將其加熱密封。將一袋產物溶入約1 5 0 - 3 0 0毫升水中，且生成的溶液可用來作爲液體補給營養品，其係非經腸胃式施用至鼻腔，胃或腸。實例B — 2 3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製匕創傷用油膏將2 0 0份重之實例A - 3方法製得之粉末狀含水結晶海藻糖與3 0 0份重之麥芽糖，及含有3份重碘之5 0 份重甲醇混合，且令生成物與2 0 0份重之1 Ow/v% 支鏈澱粉混合而得一創傷用油膏，其具有適當的延展性及黏附性。此產物縮短治療期且治療創傷而不留下疤痕，因爲併入此產物的碘具有滅菌作用R併入此產物中的、游蓮本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2Η)Χ297公釐） -62 - 507008 A7 B7 五、發明説明（60 ) 對創處提供養份。如上所証實的，本發明之新穎對熱安定的海藻糖釋出酵素能自非還原醣釋出海藻糖，該非還原醣具有海藻糖結構作爲終端單位且具有至少三個葡萄糖之聚合狀態，其具優良之熱安定性，當其與對熱安定之形成非還原醣的酵素一同作用在還原性澱粉部份水解物時，形成相當高產量的海藻糖，如此製得的海藻糖可輕易分離及純化，且所生成之純化後海藻糖及含彼之醣組成物具有令人滿意的安定性，以及相當高品質及中甜度。由於口服時，海藻糖十分容易被生物體消化吸收，因此此產物可用來作爲能量來源，且此產物本身與含彼之醣組成物可隨意用來作爲多種組成物諸如食品，化粧品及藥品中的甜味劑，增味劑，品質改良劑，安定劑，賦形劑，稀釋劑及填充劑。經濟部中央標準局員工消費合作社印製緣是之故，本發明提供一新穎技術，可由澱粉（一種便宜且豐高的天然來源）製備之澱粉部份水解物，以工業規模及相當低的成本製備海藻糖及含彼之醣組成物。因此 ’本發明在諸如澱粉、酵素及生化學之技術領域上，尤其在食品，化粧品及藥品工業上，以及林業，漁業，農業，畜牧等及化學工業上，產生難以衡量的巨大影響。因此，本發明在這些領域上的影響是難以衡量地巨大。本文所載者乃本發明目前之之較佳具體實體，應可了解的是，其中可做多種變化，且所有這類變化涵括在所附之申請專利範圍中，當此變化屬於本發明之精神及範圍內本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 63 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims

507008

六、申請專利範圍--- 附件一（A )：第84 1 0 6 0 2 1號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國91年4月修正 Γ· 一種對熱安定之海藻糖釋出酵素，其專一地水解非還原醣中海藻糖部份與其餘糖基部份之間的鍵結，該非還原醣具有海藻糖結構作爲終端單位且具有至少三個葡萄糖之聚合狀態，該酵素具有下列物化特性·· (1 )作用 . . 專一地水解非還原醣中海藻糖部份與其餘糖基部份之間的鍵結，該非還原醣具有海藻糖結構作爲終端單位且具有至少三個葡萄糖之聚合狀態； (2 )分子量於十二酯硫酸鈉一聚丙烯醯胺凝膠電泳（S D S -PAGE)上約54，000至64，000道耳吞； (3 )等電點（p I ) 於使用兩性電解質之等電點電泳上約5 . 6至6 . 6 1 (4 )最佳溫度當培養於pH於6. 0，歷30分鐘，最佳溫度約 7 5 °C ； (5 )最佳P Η 當培養於60 °C，歷3 0分鐘，最佳pH約5. 5至 6.0; (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格ΓηΟΧ297公釐） 7ΤΤ 507008 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製々、申請專利範圍 (6 )溫度安定性當培養於PH7. 0，歷60分鐘，溫度高至約85 °C仍安定；及 (7 ) p Η安定性當培養於2 5 °C，.歷1 6小時，在ρ Η約4 . 〇至 9 . 5之間呈安定。 2.如申請專利範圍第1項之酵素，其中該非還原醣中，海藻糖部份以外的糖基部份由一個或一個以上的葡萄糖殘基組成。 . . 3 .如申請專利範圍第1項之酵素，其係由選自下列之微生物獲得，包括酸熱硫化葉菌（Sulfolnhnc, Rcidot aldar ius. ATCC 33909 及 ATCC 49426)，火山口硫化葉菌 (Sul f ο 1 q b 11 s sol fataricus, ATCC 35091 及 ATCC 35092) ，及其突變株。 4. 一種製備如申請專利範圍第1項之酵素的方法，其包括在營養培養基中培養能夠製造該酵素之微生物，且自所生成的培養物中回收該酵素，該微生物係選自下列之微生物’包括酸熱硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldari-ILS_, ATCC 33909 及 ATCC 49426)，火山口硫化葉菌（Si】1 f 〇-Lobus s.olf atar icus, ATCC 3 5 0 9 1 及 ATCC 3 5 0 9 2 )，及其突變株。 . 5 . —種製備海藻糖之方法，其包括一步驟以令如申請專利範圍第1項之酵素作用在含有非還原醣的溶液上，該非還原醣具有海藻糖結構作爲終端單位且具有至少三個 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝--- 訂 4 絲本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2i〇X297公釐）一 2 - 507008 A8 B8 C8 _____ D8 _ 六、申請專利範圍葡萄糖之聚合狀態◊ 6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中令形成非還原醣之酵素與如申請專利範圍第1項之酵素共同作用在含有一種或一種以上還原性澱粉部份水解物的溶液上乂 7. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該海藻糖係選自下列任一者：含水結晶海藻糖，無水結晶海藻糖，及其混合物。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）