KR100291757B1

KR100291757B1 - 비환원성 당질 생성 효소와 그 제조 방법 및 용도

Info

Publication number: KR100291757B1
Application number: KR1019930029868A
Authority: KR
Inventors: 가즈히꼬 마루따; 미찌오 구보따; 도시유끼 스기모도; 도시오 미야께
Original assignee: 도시오 미야께; 가부시키가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
Priority date: 1992-12-28
Filing date: 1993-12-27
Publication date: 2001-06-01
Also published as: JP4249055B2; EP0691344B1; KR100301386B1; EP0691344A1; EP0606753A3; EP0606753B1; IL119549A0; TW366363B; AU5272193A; DE69325700T2; DE69332781T2; IL123389A0; ATE182359T1; CA2112423C; IL119548A; EP0606753A2; US5455168A; CN1091470A; DE69325700D1; ES2194885T3

Abstract

신규의 비환원성 당질 생성 효소와 그 제조 방법 및 용도를 제공한다. 본 발명의 효소는 리조븀 sp. M-11(Rhizobium sp. M-11)(FERM BP-4130)과 아르드로박터 sp. Q36(Arthrobacter sp. Q36)(FERM BP-4316) 및 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성할 수 있는 미생물을 환원성 전분 부분 가수분해물에 작용시켜 얻은 배양액으로부터 제조한다. 글루코아밀라아제와 α-글루코시다아제는 비환원성 당질에 작용시킬 경우 쉽사리 트레할로오스를 생성한다. 이들 비환원성 당질과 트레할로오스는 음식물, 화장품, 의약품 등에 광범위하게 이용할 수 있다.

Description

비환원성 당질 생성 효소와 그 제조 방법 및 용도

제1도는 리조븀 sp. M-11 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 그래프.

제2도는 리조븀 sp. M-11 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 그래프.

제3도는 리조븀 sp. M-11 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 열적 안정성을 나타내는 그래프.

제4도는 리조븀 sp. M-11 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 pH의 안정성을 나타내는 그래프.

제5도는 아르드로박터 sp. Q36 유래의 비환원성 당질 효소의 활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 그래프.

제6도는 아르드로박터 sp. Q36 유래의 비환원성 당질 효소의 활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 그래프.

제7도는 아르드로박터 sp. Q36 유래의 비환원성 당질 효소의 열적 안정성을 나타내는 그래프.

제8도는 아르드로박터 sp. Q36 유래의 비환원성 당질 효소의 pH의 안정성을 나타내는 그래프.

본 발명은 비환원성 당질 생성 효소와 그 제조 방법 및 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 글루코오스 중합도 3이상으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 환원성 전분 부분 가수분해물로부터 트레할로오스 구조를 가지는 비환원성 당질을 생성하는 신규의 비환원성 당질 생성 효소와 그 제조 방법, 이 효소를 생산하는 미생물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 신규의 비환원성 당질 생성 효소를 사용하여 제조되는 말단에 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질, 이것을 함유하는 저환원성 당질 및/또는 이들로부터 제조되는 트레할로오스 및 이들 비환원성 당질을 함유시킨 조성물에 관한 것이다.

글루코오스를 구성 당으로 하는 비환원성 당질로서 옛날부터 트레할로오스(α,α-트레할로오스)가 알려져 있는데, 문헌 [Advances in Carbohydrate Chemistry, Vol.18, pp.201∼225(1963), published by Academic Press, USA 및 Applied and Environmental Microbiology, Vol.56, pp.3,213∼3,215(1990)]에 기재되어 있는 바와 같이 그 함량은 비교적 작지만 미생물, 버섯, 곤충 등 광범위하게 존재하고 있다. 트레할로오스와 같은 비환원성 당질은 아미노산이나 단백질 등의 아미노기를 가진 물질과 반응하지 않기 때문에 이들응 아미노카르보닐 반응을 일으키지 않고 아미노산 함유 물질을 상하게 하지 않는다.

따라서, 비환원성 당질은 갈변이나 열화(劣化)의 우려가 없이 이용, 가공할 수 있는 것으로 기대되어 그 공업적 제조 방법의 확립이 요망되고 있다. 종래의 트레할로오스 제조 방법으로서는, 예컨대 일본국 특허 공개 제154,485/75호 공보에 개시(開示)되어 있는 미생물 균체를 이용하는 방법과, 일본국 특허 공개 제216,695/83호 공보에 제안되어 있는 말토오스-포스포릴라아제와 트레할로오스-포스포릴라아제와의 조합에서 말토오스를 변환하여 트레할로오스를 얻는 방법 등이 알려져 있다.

그러나, 미생물 균체를 사용하는 방법은 이 균체를 출발 원료로 하여 여기에 함유되는 트레할로오스의 함량이 통상 고형물당 15w/w%(이하, 본 명세서에서는 별달리 명세하지 않는 한 “w/w%”을 간단히 “%”로 약칭한다) 이하로서 낮고, 그외에 이것을 추출, 정제하는 공정이 번잡하여 공업적 제조 방법으로서는 적당하지 않다. 또한, 말토오스-포스포릴라아제와 트레할로오스-포스포릴라아제를 사용하는 방법은 어느 것이나 (가) 글루코오스-1-포스페이트를 경유하여 트레할로오스를 생성시키고 있으므로 기질인 말토오스를 비교적 고농도로 사용할 수 없고, (나) 포스포릴라아제의 효소 반응계가 가역 반응이므로 목적물인 트레할로오스의 수율이 낮으며, (다) 이들 효소의 반응계를 안정하게 유지하여 반응을 원활하게 진행시키는 것이 곤란하여 아직 공업적 제조 방법으로서 실현되지 않고 있다.

트레할로소의 제조에 관해서는 문헌 [“Food Chemicals”, No.88. pp.67~72(August, 1992), “전분 이용 개발의 현상과 과제”의 “올리고당”의 항]에서 “트레할로오스에 대해서는 현저하게 넓은 응용 범위가 고려될 수 있으나 이 당의 전분 당질로부터의 직접 당전이 반응 또는 가수분해 반응을 이용한 효소적 생산은 현재로서는 학술적으로 불가능하다고 할 수 있다”라고 기재되어 있는 바와 같이 전분을 원료로 하여 효소 반응에 의하여 트레할로오스를 제조한다는 것은 종래에는 학술적으로도 불가능하다고 생각되었던 것이다.

한편, 전분을 원료로 하여 제조되는 전분 부분 가수분해물, 예컨대 전분 액화물, 각종 덱스트린, 각종 말토올리고당 등은 통상 그 분자의 말단에 환원기를 가져 환원성을 나타내는 것이라 알려져 있다. 이와 같은 환원성 전분 부분 가수분해물은 본 명세서에서는 “환원성 전분 부분 가수분해물”이라 한다. 일반적으로, 이러한 환원성 전분 부분 가수분해물의 환원력을 DE(Dextrose Equivalent) 값으로 나타내고 있다. 이 값이 큰 것은 통상 분자량이 적고 저점도이며 감미가 강한 것이기는 하나 반응성이 강하고 아미노산과 단백질 등의 아미노기를 가진 물질과 아미노카르보닐 반응을 일으키기 쉬우며 갈변하여 악취를 발생하고 쉽사리 품질이 열화하는 성질이 있다는 것이 알려져 있다.

이와 같은 환원성 전분 부분 가수분해물의 여러 가지 특성은 DE값의 대소에 의존하고 있고 환원성 전분 부분 가수분해물과 DE와의 관계는 극히 중요하다. 종래 당업계에서는 이 관계를 단절시킨다는 것은 불가능하다고 믿고 있기까지 하였다.

환원성 전분 부분 가수분해물과 DE와의 관계를 단절하는 유일한 방법은 환원성 전분 부분 가수분해물을 고압 수소 첨가법 등에 의하여 그 환원성 말단기를 당알코올로 변환시켜 비환원성 당질로 하는 방법이다. 그러나, 이 방법은 고압 오토클레이브를 필요로 하고 다량의 수소와 에너지를 소비할 뿐만 아니라 방재상으로부터도 고도의 안전 설비와 관리를 필요로 하고 있다. 그외에 수득되는 환원성 전분 부분 가수분해물의 당알코올은, 원료인 환원성 전분 부분 가수분해물이 글루코오스만으로 되어 있는데 대하여 글루코오스와 소르비톨로 구성되어 있는 점에서 상이하며, 이것을 섭취함으로써 일과성이기는 하지만 소화 불량, 설사 등의 증상을 일으킬 우려도 있다. 따라서, 환원성 전분 부분 가수분해물의 구성 당인 글루코오스를 변화시키지 않고 그 환원력을 감소시키거나 소멸시키는 방법의 확립이 요망된다.

본 발명의 목적은 종래 믿어 왔던 환원성 전분 부분 가수분해물과 이들의 DE 값과의 관계를 타파하고 환원성 전분 부분 가수분해물의 새로운 용도를 개척하기 위하여 환원성 전분 부분 가수분해물로부터의 비환원성 당질의 신규 제조 방법과 그 비환원성 당질 및 그 용도를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 환원성 전분 부분 가수분해물로부터 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성하는 새로운 비환원성 당질 생성 효소의 실현에 기대를 걸고 이 효소를 생산하는 미생물을 토양으로부터 널리 검색하여 왔다.

그 결과, 일본국 岡山縣, 岡山市의 토양으로부터 새롭게 분리한 신규 미생물인 리조븀속(Rhizobium 屬)에 속하는 미생물 M-11과 岡山縣純社市의 토양으로부터 새롭게 분리한 신규 미생물인 아르드로박터속(Arthrobacter 屬)에 속하는 신규 미생물 Q36이 환원성 전분 부분 가수분해물로부터 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성하는 신규의 비환원성 당질 생성 효소를 생산한다는 것을 발견하여, 이 비환원성 당질 생성 효소를 환원성 전분 부분 가수분해물에 작용시킴으로써 목표로 하고 있던 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 용이하게 제조할 수 있음을 발견하였다.

또한, 환원성 전분 부분 가수분해물에 이 비환원성 당질 생성 효소를 작용시킨 다음 글루코아밀라아제 또는 α-글루코시다아제를 작용시킴으로써 용이하게 트레할로오스를 제조할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 더욱이, 이 비환원성 당질 생성 효소를 생산하는 미생물을 공지의 균으로부터 널리 검색하였다.

그 결과, 브레비박테리움속(Brevibacterium 屬), 플라보박테리움속 (Flavobacterium 屬), 미크로코커스속(Micrococcus 屬), 쿠르토박테리움속 (Curtobacterium 屬), 테라박테리움속(Terrabacterium 屬)에 속하는 미생물도 본 발명의 비환원성 당질 생성 효소를 생산한다는 것을 판명하고, 위에 나온 리조븀속과 아르드로박터속에 속하는 미생물 유래의 비환원성 당질 생성 효소와 마찬가지로 환원성 전분 부분 가수분해물로부터 말단에 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성하는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 아울러 본 발명의 비환원성 당질, 이것을 함유하는 저환원성 당질 및/또는 트레할로오스를 함유시킨 음식물, 화장품, 의약품 등의 조성물을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 신규의 비환원성 당질 생성 효소와 그 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 효소를 생산하는 미생물, 상기 효소로 제조되는 비환원성 당질, 이들 당질로부터 제조되는 트레할로오스 및 이들 당질과 트레할로오스 모두 또는 어느 한 가지를 함유한 조성물에 관한 것이다.

본 발명자등은 전분 부분 가수분해물에 작용시켰을 경우 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성하는 신규의 비환원성 당질 생성 효소를 생성하는 미생물을 철저히 검색하여 결국에는 목적으로 하는 미생물을 발견하였다.

이어서, 본 발명의 리조븀속에 속하는 미생물 M-11, 즉 “리조븀 sp. M-11”의 확인 시험 결과에 대하여 설명한다. 그런데, 이 확인 시험은 “미생물의 분류와 동정”(일본국 長谷川武治編, 東大출판회, 1985년)에 준하여 하였다.

A. 세포 형태

육즙 한천 배양(27℃)했을 때의 세포 특징

통상 0.6∼0.8×1.0∼1.5㎛의 간균(桿菌); 단독으로 존재하나 드물게는 쌍을 이루고 연쇄 형태 세포도 관찰됨; 다형성 없음; 운동성 있음, 무포자, 편모는 주편모(周鞭毛); 비항산성; 그램 음성; 캡슐 음성; 이염(異染) 과립 양성; Poly-β-hydroxy butyrate를 축적함.

B. 배양적 성질

(1) 육즙 한천 평판 배양, 27℃

형상 : 원형, 크기는 24시간 배양에서 약 1.5mm; 주연(酒宴) : 전연(全緣); 융기 : 편평상 내지 반렌즈상; 광택 : 있음; 색조 : 반투명, 크리임색;

(2) 덱스트로오스와 트립톤 한천 평판 배양, 27℃

콜로니는 반투명, 크리임색, mucoid 생성;

(3) 효모 엑스와 만니톨 한천 평판 배양, 27℃

형상 : 원형, 크기는 5일 배양에서 약 3mm; 색조 : 반투명, 크리임색, mucoid 생성;

(4) 콩고 레드 함유 효모 엑스와 만니톨 한천 평판 배양, 27℃

콜로니는 회색의 핑크색이고 거의 콩고 레드를 흡수하지 않음;

(5) 2w/w% NaCl 함유 효모 엑스와 만니톨 한천 평판 배양, 27℃-생육함;

(6) 육즙 한천 사면 배양, 27℃

생육 : 양호; 형상 : 실(絲) 형상;

(7) 육즙 젤라틴 천자 배양, 27℃-액화하지 않음.

C. 생리학적 성질

(1) 질산염의 화원 : 양성; (2) 탈질 반응 : 음성; (3) 메틸 레드 시험 : 음성; (4) VP 시험 : 음성; (5) 인돌의 생성 : 음성; (6) 황화 수소의 생성 : 양성; (7) 전분의 가수분해 : 음성; (8) 시트르산의 이용 : 양성; (9) 무기 질소원의 이용 : 암모늄염과 질산염을 이용; (10) 색소의 생성 : 가용성 색소의 생성은 없음; (11) 우레아제 : 양성; (12) 옥시다아제 : 음성; (13) 카탈라아제 : 양성; (14) 생육의 범위 : pH 5.5∼9.0, 온도 4℃∼35℃; (15) 산소에 대한 태도 : 호기성; (16) 탄소원의 이용성과 산 생성의 유무 :

(17) 아미노산의 탈탄산 시험(decarboxylase test) : L-리신, L-아르기닌 및 L-오르니틴에 대하여 음성; (18) 아미노산의 이용 : L-글루탐산 나트륨, L-아스파르트산 나트륨, L-히스티딘 및 L-프롤린을 이용함; (19) DNase : 음성; (20) 3-케토락토오스의 생성 : 음성; (21) DNA의 구아닌(G) 및 시토신(C) 함량(mol%) : 61%.

이상의 균학적 성질에 의거하여 문헌 [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol.1(1984)]을 참고로 하여 공지 균주와 그 이동(異同)을 검토하였다. 그 결과, 리조븀속에 속하는 미생물인 것이 판명되었다. 이 미생물은 리조븀 멜릴로티(Rhizobium meliloti)에 가까운 성질을 나타내는 것이기는 하나, 이 균과는 달리 말토오스, 락토오스, 만니톨을 이용하지만 산을 생성하지 않는다는 점에서 다르다는 것이 밝혀졌고, 또한 환원성 전분 부분 가수분해물로부터 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성하는 비환원성 당질 생성 효소를 생산하는 문헌 미기재의 특징을 가지고 있다.

이들 결과로부터 본 발명자등은 이 균을 신규 미생물인 리조븀 sp. M-11(Rhizobium sp. M-11)로 명명하여 1992년 12월 24일자로 일본국 공업 기술원 미생물 공업 기술 연구소에 기탁하여 미생물 수탁번호 FERM BP-4130으로서 수탁되었다.

본 발명에서는 상기 균 뿐만 아니라 리조븀속에 속하는 환원성 전분 부분 가수분해물로부터 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성하는 비환원성 당질 생성 효소를 생산하는 기타 균주, 더욱이는 이들 균주의 돌연변이체 등도 적절히 이용할 수 있다.

이어서, 본 발명의 아르드로박터속에 속하는 미생물 Q36(Arthrobacter sp. Q36)의 확인 시험 결과는 다음과 같다. 이 확인 시험은 리조븀 sp. M-11의 경우와 마찬가지로 문헌 [“미생물의 분류와 동정”長谷川武治編, 東大출판회(1985년, 일본국)]에 준거하여 하였다.

A. 세포 형태

(1) 육즙 한천 배양, 27℃

통상 0.5∼0.7×0.8∼1.6㎛의 간균; 단독; 다형성 있음; 운동성 없음, 무포자, 편모 없음; 비(非)항산성; 그램 : 양성; 캡슐 : 음성;

(2) EYG 한천 배양, 27℃

간균-구균의 생육 사이클을 나타냄.

B. 배양적 성질

(1) 육즙 한천 평판 배양, 27℃

형상 : 원형, 크기는 3일간 배양에서 2∼2.5mm; 주연 : 전연(全緣); 융기 : 반렌즈상; 광택 : 습광(濕光); 표면 : 평활; 색조 : 반투명, 백색 내지 담황색;

(2) 육즙 한천 사면 배양, 27℃

생육도 : 양호; 형상 : 실(絲) 형상;

(3) 효모 엑스-펩톤 한천 사면 배양, 27℃

생육도 : 양호; 실(絲) 형상;

(4) 육즙 젤라틴 천자 배양, 27℃-액화함.

C. 생리학적 성질

(1) 질산염의 환원성 : 양성; (2) 탈질 반응 : 음성; (3) 메틸 레드 시험 : 음성; (4) VP 시험 : 양성; (5) 인돌의 생성 : 음성; (6) 황화 수소의 생성 : 양성; (7) 전분의 가수분해 : 음성; (8) 셀룰로오스의 가수분해 : 음성; (9) 시트르산의 이용 : 양성; (10) 무기 질소원의 이용 : 암모늄과 질산염을 이용; (11) 색소의 생성 : 음성; (12) 우레아제 : 양성; (13) 옥시다아제 : 음성; (14) 카탈라아제 : 양성; (15) 생육의 범위 : pH 5∼10, 온도 4℃∼37℃; (16) 산소에 대한 태도 : 호기성; (17) 탄소원의 이용성과 산 생성의 유무 :

(18) 아미노산의 이용 : L-글루탐산 나트륨, L-아스파르트산 나트륨, L-히스티딘 및 L-프롤린을 이용함; (19) DNase : 양성; (20) 3-케토락토오스의 생성 : 음성; (21) 세포벽의 주요 디아미노산 : 리신; (22) DNA의 구아닌(G) 및 시토신(C) 함량(mol%) : 63%.

이상의 균학적 성질을 기초로 하고 문헌 [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol.2(1984)]을 참고로 하여 공지 균과의 이동(異同)을 검토하였다. 그 결과, 이 균은 아르드로박터속(Arthrobacter 屬)에 속하는 미생물임이 판명되었다. 그리고, 이 균은 환원성 전분 부분 가수분해물로부터 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성하는 비환원성 당질 생성 효소를 생산하는 문헌 미기재의 특징을 가지고 있다.

이들 결과로부터 본 발명자등은 이 균을 신규 미생물인 아르드로박터 sp. Q36(Arthrobacter sp. Q36)로 명명하여 1993년 6월 3일자로 일본국 공업 기술원 생명공학 공업 기술 연구소에 기탁하여 수탁번호 FERM BP-4316으로 수탁되었다.

본 발명에서는 상기 균주 뿐만 아니라 아르드로박터속에 속하고 환원성 전분 부분 가수분해물로부터 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성하는 비환원성 당질 생성 효소를 생산할 수 있는 기타의 균주, 더욱이는 이들 균주의 돌연변이체 등도 적절히 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 미생물로서는 본 발명의 비환원성 당질 생성 효소 생성능을 가진 것이면 좋은데, 예컨데 앞에 나온 신규 미생물인 리조븀 sp. M-11(FERM BP-4130)과 아르드로박터 sp. Q36(FERM BP-4316) 뿐만 아니라 공지의 미생물인 브레비박테리움 헬로볼룸(ATCC 11822), 플라보박테리움 아쿠아틸레(IFO 3772), 미크로코거스 루테우스(IFO 3064), 미크로코커스 로제우스(ATCC 186), 쿠르토박테리움 시트레움(IFO 15231), 마이코박테리움 스메그마티스(ATCC 19420), 테라박터 투메스센스(IFO 12960) 및 이들의 돌연변이체도 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지는 미생물이 생육할 수 있고 본 발명의 비환원성 당질 생성 효소를 생산할 수 있는 영양배지이면 좋고, 합성 배지와 천연 배지 어느 것이라도 좋다. 탄소원으로서는 미생물이 자화(資化)할 수 있는 물질이면 좋은데, 예컨대 글루코오스, 프룩토오스, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 당밀, 환원성 전분 부분 가수분해물 등의 당질, 그리고 시트르산, 숙신산 등의 유기산도 사용할 수가 있다. 배지에서의 이들 탄소원의 농도는 탄소원의 종류에 따라 적절히 선택된다. 예를 들자면, 환원성 전분 부분 가수분해물인 경우에는 통상 20% 이하가 바람직하고, 균의 생육과 증식의 면에서는 5% 이하가 바람직하다. 질소원으로서는 예컨대 암모늄염, 질산염 등의 무기 질소 화합물과, 예컨대 우레아, 콘 스티프 리커, 카제인, 펩톤, 효모 엑스, 육(肉) 엑스 등의 유기 질소 화합물이 사용된다. 또한, 무기 성분으로서는 예컨대 칼슘염, 마그네슘염, 칼륨염, 나트륨염, 인산염, 망간염, 아연염, 철염, 구리염, 몰리브덴염, 코발트염 등이 적절히 사용된다. 더욱이, 필요에 따라서는 아미노산, 비타민 등도 적절히 사용된다.

배양은 통상 온도 4℃∼40℃, 바람직하게는 20℃∼37℃, pH4∼10, 바람직하게는 pH5∼9에서 선택되는 조건에서 호기적으로 실시한다. 배양 시간은 미생물이 증식하기 시작하는 시간 이상의 시간이면 좋고, 바람직하게는 10시간∼100시간이다. 그리고, 배양액의 용존 산소(DO : dissolved oxygean) 농도에는 특히 제한은 없으나 통상은 0.5∼20ppm이 바람직하다. 따라서, 통기량을 조절하거나 교반하거나 통기에 산소를 추가하거나, 또한 퍼어멘터(fermentor)내의 압력을 높이는 등의 수단을 채용하여 DO 농도 범위내로 유지할 수 있다. 또한, 배양 방식은 회분(batchwise) 배양 또는 연속 배양중 어느 것이라도 좋다.

이와 같이 하여 미생물을 배양한 후 본 발명의 효소를 회수한다. 이 효소의 활성은 배양물의 균체와 제균액 어느 쪽에도 나타나는데, 균체와 제균액을 조(組) 효소액으로 하여 채취하는 것도, 그리고 배양물 전체를 조효소액으로 하여 사용하는 것도 가능하다. 배양물로부터 균체를 제거하자면 공지의 고액 분리법이 채용된다. 예컨대, 배양물 그 자체를 그대로 원심 분리하는 방법 혹은 프리코우트 필터(precoat filter) 등을 사용하여 원심 분리하는 방법, 평막(平膜), 중공사막(中空絲膜) 등의 막 여과에 의하여 분리하는 방법 등이 적절히 채용된다. 제균액을 그대로 효소액으로 사용할 수가 있으나 일반적으로는 농축하여 사용한다. 농축 방법으로서는, 예컨대 황산암모늄 염석법, 아세톤과 알코올을 이용하는 침전법, 평막, 중공사막 등의 막을 이용하는 막 농축법 등을 사용할 수 있다.

더욱이, 제균액과 그 농축물을 공지의 방법으로 고정화할 수도 있다. 예를 들자면, 이온 교환체에의 결합법, 수지와 막 등과의 공유결합, 흡착법, 고분자 물질을 사용한 포괄법 등을 채용할 수 있다. 그리고, 배양물로부터 분리한 균체도 그대로 조효소로서 사용할 수가 있으나, 이것을 고정화하여 사용하여도 좋다. 한가지 예로서 이것을 알긴산 나트륨과 혼합하여 염화 칼슘 수용액중에 적하해서 입상(粒狀)으로 겔화시켜 고정화한다. 이 입상화물을 다시 폴리에틸렌 이민 또는 글루타르알데리드로 처리하여 고정화하여도 좋다. 균체로부터 효소를 추출하고 그 추출액을 조효소액으로 사용할 수도 있다. 예를 들자면, 초음파에 의한 파쇄법, 유리 비이드(bead)와 알루미나에 의한 기계적 파쇄법, 프렌치 프레스에 의한 파쇄법 등으로 균체로부터 효소를 추출하여 원심 분리 또는 막 여과 등으로 청징한 조효소액을 얻을 수 있다.

이 효소액을 그대로 사용할 수 있으나 공지의 방법으로 다시 정제하여 사용할 수도 있다. 한 가지 예로서 배양액의 처리물을 황산암모늄 염석하여 농축한 조효소 표품(標品)을 투석한 후 DEAE-Toyopearl 수지를 사용한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 이어서 부틸 Toyopearl 수지(소수성 수지)를 사용한 소수(疎水) 칼럼 크로마토그래피, Toyopearl HW-55 수지를 사용한 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제함으로써 전기 영동적으로 단일의 효소를 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 얻게 되는 본 발명의 비환원성 당질 생성 효소는 아래와 같은 물리화학적 성질을 가진다.

(1) 작용 : 글루코오스 중합도 3이상에서 선택되는 1종 이상의 환원성 전분 부분 가수분해물로부터 말단에 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성함; (2) 분자량 : SDS-PAGE(소디움 도데실술페이트-폴리아크릴아미트겔 전기 영동법)에 의하여 약 76,000±87,000 돌턴; (3) 등전점(pI) : 양쪽성 전해질 함유 전기 영동법에서 약 3.6±4.6; (4) 최적 온도 : pH 7.0 및 60분간 배양에서 약 35℃∼40℃; (5) 최적 pH : 40℃ 및 60분간 배양에서 약 6.4∼7.2; (6) 열적 안정성 pH 7.0에서 60분간 유지하여 약 35℃∼40℃ 부근까지 안정; (7) pH 안정성 : 25℃에서 16시간 유지하여 pH 약 5.5∼11.0에서 안정;

본 발명의 비환원성 당질 생성 효소의 활성 측정 방법은 기질로서 말토펜타오스 1.25 w/v%(50mM 인산 완충액, pH 7.0) 4㎖에 효소액을 1㎖ 가하고 40℃에서 60분간 반응시킨 후 100℃에서 10분간 가열하여 반응을 정지시키고, 그 반응액을 정확히 탈이온수로 10배로 희석하여 그 희석액의 환원력을 소모기넬슨법(Somogy-Nelson's method)으로 측정한다. 대조로서 미리 100℃에서 10분간 가열하여 실활(失活)시킨 효소액을 사용하여 마찬가지로 측정한다. 위의 측정 방법을 사용하여 1분간에 1μmole의 말토펜타오스에 상당하는 환원력을 감소시키는 효소량을 1단위로 정의하였다.

이 효소의 기질로서는 전분, 아밀로펙틴, 아밀로오스 등의 전분을 아밀라아제 또는 산으로 부분 가수분해시켜 제조된 환원성 전분 부분 가수분해물을 사용한다. 아밀라아제에 의한 가수분해로 수득되는 이러한 환원성 전분 부분 가수분해물로서는 예컨대 문헌 [Handbook of Amylases and Related Enzymes, published by Permagon Press, Tokyo, Japan(1988)]에 기재되어 있는 α-아밀라아제, 말토트리오스 생성 아밀라아제, 말토테트라오스 생성 아밀라아제, 말토펜타오스 생성 아밀라아제, 말토헥사오스 생성 아밀라아제 등의 아밀라아제로 전분 물질을 가수분해하여 얻은 직쇄상 및 측쇄 있는 구조를 가진 환원성 전분 부분 가수분해물이 있다. 더욱이, 환원성 전분 부분 가수분해물을 제조할 경우에 있어서 풀루라나아제와 이소아밀라아제 등의 지절 효소(debranching enzyme : 枝切酵素)를 아밀라아제와 조합하여 유리하게 작용시킬 수도 있다. 그리고, 환원성 전분 부분 가수분해물로서 말토올리고당, 예컨대 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스 등의 1종 또는 2종 이상을 사용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

기질로 사용되는 환원성 전분 부분 가수분해물의 농도는 특히 한정되지 않는다. 예컨대, 0.1%의 기질 용액으로서 사용했을 경우에도 이 효소의 반응은 진행하지만, 공업적으로는 2% 이상, 바람직하게는 5∼50%의 고농도의 용액에서는 효소 반응이 훨씬 양호하게 진행한다. 이들 농도 조건하에서는 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 유리하게 높은 수율로 생성시킬 수 있다. 또한, 기질 요액 중에 완전히 용해하지 않는 불용성 기질을 함유하는 현탁액도 본 발명에서 사용할 수 있다. 반응 온도는 이 효소가 실활하지 않는 온도, 즉 55℃ 부근까지로 설정하면 좋은데, 바람직하게는 40℃∼50℃ 부근의 온도를 사용한다. 본 발명의 효소의 반응에 사용되는 반응 pH는 통상 5∼10의 범위로 조정하면 좋은데, 바람직하게는 약 6∼8의 범위로 조정한다. 본 발명의 효소의 반응에 사용되는 반응 시간은 효소 반응의 조건에 따라 적절히 선택한다.

위의 반응에 의해 수득한 비환원성 당질을 함유하는 반응액은 기질로 사용한 환원성 전분 부분 가수분해물과 비교하여 현저히 환원력이 저하하여 있다. 예컨대, 기질로서 말토펜타오스를 사용했을 경우 이 효소 반응에 의하여 반응액이 나타내는 환원력은 기질인 말토펜타오스 용액이 나타내는 초기 환원력의 약 93%가 소실되어 약 7%까지 저하한다.

반응액은 통상적인 방법으로 여과, 원심 분리 등에 의해 불융물을 제거한 후 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온 교환 수지로 탈염해서 정제하여 농축한 다음 시럽상 제품으로 한다. 더욱이, 건조하여 분말상 제품으로 할 수도 있다. 필요에 따라서는 분말상 제품을 다시 정제, 예를 들자면 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 활성탄 칼럼 크로마토그래피, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 등의 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획, 알코올과 아세톤 등의 유기 용매에 의한 분별, 적당한 분리 성능을 가진 막에 의한 분리, 더욱이는 효모에서의 발효 처리, 알칼리 처리 등에 의한 잔존 환원성 당질의 분해 제거 등의 방법을 1종 또는 2종 이상 조합하여 정제함으로써 최고순도의 비환원성 당질 제품을 얻는 것도 용이하다.

특히, 공업적 대량 생산 방법으로서는 이온 교환 칼럼 크로마토그래피의 채용이 적합한데, 예를 들자면 일본국의 특허 공개 제23,799/83호 공보, 특허 공개 제72,598/83호 공보 등에 개시되어 있는 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의하여 협잡 당류를 제거하고 목적물의 함량을 향상시킨 비환원 당질을 유리하게 제조할 수 있다. 이 경우에 있어서, 고정상 방식, 이동상 방식, 의사(擬似) 이동상 방식중 어느 것을 사용하여도 좋다.

이와 같이 해서 제조된 트레할로오스 구조를 가진 본 발명의 비환원성 당질 또는 이것을 함유하는 저환원성 당질을 필요에 따라 아밀라아제, 예컨대 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 글루코아밀라아제 등과 또는 α-글루코시다아제로 분해하여 감미성, 환원력 등을 조정하거나 점성을 저하시키며, 또한 수소 첨가하여 잔존하는 환원성 당질을 당알코올로 하여 환원력을 소멸시키는 등의 가공 처리를 할 수도 있다.

특히, 본 발명의 비환원성 당질 또는 이것을 함유하는 저환원성 당질에 대하여 글루코아밀라아제 또는 α-글루코시다아제를 작용시킴으로써 보다 용이하게 트레할로오스를 제조할 수 있다. 즉, 이들 비환원성 또는 저환원성 당질에 글루코아밀라아제 또는 α-글루코시다아제를 작용시켜 트레할로오스와 글루코오스의 혼합 용액으로 하고, 이것을 앞서 나온 정제 방법, 예컨대 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 등으로 글루코오스를 제거하여 트레할로오스 고함유 획분을 채취한 다음 이것을 정제, 농축하여 시럽상 제품을 얻는 것도, 더욱이 시럽상 제품을 농축하여 과포화 용액으로 하여 결정화시켜 트레할로오스 함수 결정 또는 무수트레할로오스 결정을 얻는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

트레할로오스 함수 결정을 제조하자면, 예컨대 순도 약 60% 이상, 농도 약 65∼90%의 트레할로오스 고함유액을 결정화기에 넣고 0.1∼20%의 종정(種晶 : Seed Crystal) 존재하에 온도 95℃ 이하, 바람직하게는 10℃∼90℃의 범위에서 교반하면서 서서히 냉각하여 트레할로오스 함수 결정을 함유하는 매스키트(massecuite)를 제조한다. 매스키트로부터 트레할로오스 함수 결정 또는 이것을 함유하는 당질 결정을 제조하는 방법은, 예컨대 분리법, 블록 분쇄 방법, 유동 조립 방법, 분무 건조 방법 등 공지의 방법을 사용하면 좋다.

분리법의 경우에는 통상 매스키트를 바스켓형 원심 분리기에서 처리하여 트레할로오스 함수 결정과 모액을 분리하고, 필요에 따라 이 결정에 소량의 냉수를 분무하여 트레할로오스 함수 결정을 세척하여 보다 고순도의 트레할로오스 함수 결정을 용이하게 제조할 수 있다. 분무 건조 방법의 경우에는 통상 농도 70∼85%, 결정화율 약 20∼60% 정도의 매스키트를 고압 펌프로 노즐로부터 분무하여 결정 분말이 용해하지 않는 온도, 예컨대 60℃∼100℃의 열풍으로 건조한 다음 30℃∼60℃의 온풍으로 약 1∼2시간 숙성하면 비흡습성 또는 난(難)흡습성의 당질 결정을 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 블록 분쇄 방법의 경우에는 통상 수분 10∼20%, 결정화율 10∼60% 정도의 매스키트 약 0.1∼3일간 정치하여 블록상으로 결정화하고, 고화시킨 다음 이것을 분쇄 또는 절삭 등의 방법으로 분말화하여 건조하면 비흡습성 또는 난흡습성의 당질 결정을 용이하게 제조할 수 있다.

또한, 무수 결정 트레할로오스를 제조하자면 트레할로오스 함수 결정을 건조하여 무수 상태의 것으로 변환시킬 수도 있으나, 일반적으로는 수분 10% 미만의 고농도 트레할로오스 고함유 용액을 결정화기에 넣고 종정 존재하에 50℃∼160℃, 바람직하게는 80℃∼140℃의 범위에서 교반하면서 무수 결정 트레할로오스를 함유하는 매스키트를 제조하고, 이것을 비교적 고온 건조 조건하에서 예컨대 블록 분쇄, 유동 조립(造粒), 분무 건조 등의 방법으로 결정화하고 분말화하여 무수 결정 트레할로오스를 제조한다.

이와 같이 하여 제조되는 본 발명의 비환원성 당질 및 이것을 함유하는 저환원성 당질은 원료인 환원성 전분 부분 가수분해물과 비교하여 환원성이 적고 안정하여 기타 소재, 특히 아미노산 및 올리고펩티드, 단백질 등의 아미노산 함유물질과 혼합 가공하여도 갈변하는 일도 없고 악취를 발생하는 일도 없으며, 혼합한 다른 소재를 상하게 하는 일도 없다. 또한, 환원성 전분 부분 가수분해물의 경우와는 달리 이들 당질은 환원력이 작음에도 불구하고 저점도이고, 평균 글루코오스 중합도가 낮은 것의 경우에는 양질로서 상품의 감미를 가지고 있다.

더욱이, 본 발명의 비환원성 당질은 아밀라아제, 예컨대 췌장 유래의 α-아밀라아제에 의하여 분해하여 비교적 저분자량의 비환원성 올리고당이나 저분자량의 말토오리고당을 생성하며, 또한 이들 올리고당도 α-글루코시다아제와 소장 효소에 의해서도 용이하게 분해하여 글루코오스와 트레할로오스를 생성한다.

더욱이, 생성된 트레할로오스는 트레할라아제에 의하여 용이하게 글루코오스로 분해되므로, 본 발명의 비환원성 당질과 이를 함유된 저환원성 당질은 물론이고 트레할로오스는 경구 섭취에 의하여 소화 흡수되어 칼로리원으로서 이용된다. 본 발명의 당질과 트레할로오스는 충치 유발균 등에 의하여 발효되기 어려우므로 충치를 일으키기 어려운 감미료로서도 이용할 수 있다.

그리고, 본 발명의 비환원성 당질과 이를 함유한 저환원성 당질 및 트레할로오스는 안정한 감미료이므로 결정 제품의 경우에는 풀룰란, 히드록시에틸 전분 및 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제와 병용하여 정제(錠劑)의 당의제로서 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 또한, 이들 당질과 트레할로오스는 삼투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 기타 당의 결정화 방지성, 난 발효성, 호화 전분의 노화 방지성 등의 성질을 구비하고 있다.

그리고, 무수 결정 트레할로오스의 경우에는 식품, 의약품, 화장품, 기타 원재료 또는 가공 중간물 등의 함수물의 탈수제로서도 유리하게 이용할 수 있고, 안전하고도 고품질의 분말, 과립, 정제 등 고상물을 용이하게 제조할 수가 있다.

따라서, 본 발명의 비환원성 당질 또는 이것을 함유하는 저환원성 당질 및 이들 당질로부터 제조되는 트레할로오스는 감미료, 정미(呈味) 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제, 탈수제 등으로서 음식물, 기호물, 사료, 이료, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명의 비환원성 당질, 이것을 함유하는 저환원성 당질 및 이들로부터 제조되는 트레할로오스는 그대로 감미 부여를 위한 조미료로서 사용할 수 있다. 필요하다면, 예컨대 분말 시럽, 글루코오스, 말토오스, 수크로오스, 이성화당, 꿀, 메이플 슈거, 이소말토올리고당, 갈락토올리고당, 프룩토올리고당, 락토수크로오스, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α-글리코실 스테비오시드, 레바우디오시드, 글리시리진, L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르, 사카린, 글리신 및 알라닌 등과 같은 기타 감미료의 1종 또는 2종 이상의 적당량과 혼합해서 사용하여도 좋고, 또한 필요하다면 덱스트린, 전분, 락토오스 등과 같은 중량제와 혼합하여 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 비환원성 당질, 이것을 함유하는 저환원성 당질 및 이들로부터 제조되는 트레할로오스의 분말 내지 결정상 제품은 그대로 또는 필요에 따라 중량제, 부형제, 결합제 등과 혼합하여 과립, 구상, 단봉상, 편상, 입방체, 정제 등 각종 형상으로 성형하여 사용할 수도 있다.

그리고, 본 발명의 비환원성 당질, 이것을 함유하는 저환원성 당질 및 이들로부터 제조되는 트레할로오스는 다음과 같은 특징을 가지고 있다; (1) 이들의 감미는 신맛, 짠맛, 떫은 맛, 감칠 맛, 쓴 맛 등의 기타 정미를 가진 각종 물질과 잘 조화하고, (2) 내산성과 내열성도 크다. 따라서, 일반적인 음식물의 감미료, 맛 개선제 및 품질 개량제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명의 비환원성 당질, 이것을 함유하는 저환원성 당질 및 이들 당질로부터 제조되는 트레할로오스는, 예를 들자면 아미노산, 펩티드류, 간장, 분말 간장, 된장, 분말 된장, 정제술, 정제 간장, 어육 조미품, 마요네즈, 드레싱, 식초, 산바이주(설탕, 간장, 식초로 된 소오스), 초밥용 분말 식초, 츄가노 모토(중화 요리용 인스탄트 믹스), 텐츠유(일본식 튀김 식품용 소오스), 멘츠유(일본식 버어미셀리용 소오스), 소오스, 켓찹, 야구니쿠 노 타레(일본식 불고기용 소오스), 커리 루우, 인스탄트 스튜우 믹스, 인스탄트 수우프 믹스, 다시 노 모토(인스탄트스톡 믹스), 핵산계 조미료, 복합 조미료, 미린(감미나는 술), 신미린(합성 미린), 테이블 슈거, 커피 슈거 등 각종 조미료로서 유리하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 비환원성 당질, 이것을 함유하는 저환원성 당질 및 이들 당질로부터 제조되는 트레할로오스는, 예컨대 각종 일본식 과자류[예 : 센베이(쌀 크래커), 아라레모치(입방체의 쌀떡), 오코시(기장과 쌀로 된 케이크), 모치(쌀풀), 만주(팥 잼 넣은 만두), 우이로(단맛의 젤리), 안(팥 잼), 요캉(단맛의 팔 젤리), 미즈요캉(연질의 아즈키 팥 젤리), 킹요쿠(요캉의 일종), 젤리, 파오드 카스텔라, 아메다마(일본식 토피)]; 양과자류[예 : 빵, 비스켓, 크래커, 쿠우키, 파이, 푸딩, 버터 크리임, 커스터드 크리임, 크리임 퍼프, 와플, 스폰지 케이크, 도우넛, 초콜렛, 츄잉 검, 카라멜, 캔디]; 빙과류[예 : 아이스크리임, 셔어벳]; 시럽류[예 : 과실의 시럽 절임, 방수용 설탕 시럽]; 페이스트류[예 : 플라워 페이스트, 피이넛 페이스트, 푸루트 페이스트, 스프레드]; 과실과 야채의 가공 식품류[예 : 잼, 마아멀레이드, 시럽 즈케(과실 피클류), 토카(당과)]; 절임 및 절임 제품[예 : 푸쿠진 즈께(적색의 무 피클), 베타라 츠케(통무우 피클), 센마이 즈케(썰은 무우 절임), 라쿄 즈케(파 절임)]; 절임 및 절임 제품의 프리믹스[예 : 단무지 프리믹스, 백채(白菜) 절임 프리믹스]; 축육제품류[예 : 햄, 소오세지]; 어육제품[예 : 어육햄, 어육 소오세지, 어묵, 치쿠와(어묵의 일종), 튀김]; 각종 진미류[예 : 성게 내장젓, 오징어젓, 가공된 다시마, 말린 오징어채, 미린으로 조미된 말린 복어]; 츠쿠다니(간장에 끓인 음식)[예 : 김, 산채, 말린 오징어, 소어(小魚), 조개]; 평상시 식품[예 : 볶은 팥, 감자 샐러드, 다시 말이]; 우유 제품[예 : 축육, 어육, 과실, 야채 등의 통조림, 병조림]; 주류[예 : 합성주, 와인, 양주 등]; 청량 음료수[예 : 커피, 차, 코코아, 주우스, 탄산 음료, 유산 음료, 유산균 음료 등]; 즉석 식품[예 : 인스탄트 푸딩 믹스, 인스탄트 핫 케이크 밀스, 즉석 시루코, 즉석 수우프 믹스]; 각종 음식물[예 : 이유식, 치료식, 드링크제, 펩티드 식품, 냉동 식품 등]에 대한 감미 부여, 맛 개량, 품질 개량 등에 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 가축, 가금, 꿀벌, 누에, 물고기 등의 사육 동물을 위한 사료, 이료 등의 기호성을 향상시킬 목적으로 사용할 수 있다. 그 외에 담배, 치약, 입술 연지, 립크림, 내복액, 정제, 트로치, 간유 드롭, 구중 청량제, 구중 향제 가아글제 등 각종 고형물, 페이스트상, 액상 등으로 하여 기호물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 대한 감미제로서 또는 정미 개량제, 교미제로서, 더욱이는 품질 개량제, 안정제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명의 비환원성 당질, 이를 함유하는 저환원성 당질 및 이들로부터 제조되는 트레할로오스는 유효 성분, 활성 등을 상실하기 쉬운 각종 생리 활성 물질 또는 이것을 함유한 건강 식품, 의약품 등에 품질 개량제와 안정제로서 유리하게 적용할 수 있다. 예를 들자면, 림포카인류[예 : α-β- 및 γ-인터페론, 종양괴사인자-α(TNF-α), 종양 괴산인자-β(TNF-β), 대식세포 유주(遊走) 저지인자, 콜로니 자극인자, 트랜스퍼 팩터, 인터로이킨 II 등]; 호르몬류[예 : 인슐린, 성장 호르몬, 프로락틴, 에리트로포이에틴, 단세포 자극 호르몬 등]; 생물제제[예 : BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 폴리오 생백신, 천연두 백신, 파상풍 톡소이드, 반시뱀 항독소, 인간 면역 글로불린 등]; 항생물질[예 : 페니실린, 에리드로마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 황산 카나마이신 등]; 비타민류[예 : 티아민, 리보플라빈, L-아스코르브산, 간유, 카로티노이드, 에르고스테롤, 토코페롤 등]; 효소류[예 : 라파아제, 엘라스타아제, 우로키나아제, 프로테아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제 등]; 엑스류[예 : 약용 인삼 엑스, 자라 엑스, 글로렐라 엑스, 알로에 엑스, 프로폴리스 엑스 등]; 생균류[예 : 바이러스, 유산균, 효모 등]; 기타 생리활성 물질[예 : 로얄젤리 등]도 그 유효 성분, 활성을 상실함이 없이 안정하고도 고품질의 액상, 페이스트상 또는 고상의 건강 식품이나 의약품 등에 용이하게 제조할 수 있게 된다.

이상 설명한 각종 조성물에 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질, 이것을 함유한 저환원성 당질 및 이들로부터 제조되는 트레할로오스를 함유시키는 방법은 그 제품이 완성되기 까지의 공정에서 함유시키면 좋은데, 예를 들자면 혼화, 용해, 융해, 침지, 침투, 살포, 도포, 피복, 분무, 주입, 결정화, 고화 등 공지의 방법이 적절히 선택된다. 이들 당질과 트레할로오스의 첨가량은 통상적으로 0.1% 이상, 바람직하게는 1% 이상 함유시키는 것이 바람직하다.

이하 실험에 의하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

먼저, 신규 미생물인 리조븀 sp. M-11로부터 유래되는 비환원성 당질 생성 효소의 생산, 정제 및 그 성질 등에 대하여 설명한 다음에, 두 번째로 아르드로박터 sp. Q36로부터 유래되는 비환원성 당질 생성 효소에 대하여 위와 마찬가지로 설명한다. 더욱이, 세 번째로는 공지의 미생물로부터의 비환원성 당질 생성 효소에 대하여 설명한다.

[실험 1]

[리조븀 sp. M-11로부터의 비환원성 당질 생성 효소의 제조]

말토오스 2.0w/v%, 펩톤 0.5w/v%, 효모 엑스 0.1w/v%, 인산 수소 2나트륨 0.1w/v%, 인산 수소 칼륨 0.1w/v%, 및 물로 된 액체 배지를 pH 7.0으로 조정하였다. 500㎖ 용량의 삼각 플라스크에 이 배지를 약 100㎖씩 넣고 오토클레이브에서 120℃에서 20분간 멸균하고 냉각한 다음, 리조븀 sp. M-11(FERM BP-4130)을 접종하고, 27℃, 130rpm에서 24시간 배양한 것을 종배양액(seed culture)으로 하였다.

용량 30ℓ의 퍼어멘터(fermentor)에 종배양의 경우와 동일한 조성의 배지 약 20ℓ을 넣고 멸균 후 냉각하여 온도 30℃로 한 후 종배양액 1w/v%, 을 접종하고 온도 30℃, pH 6.0∼8.0에서 유지하면서 약 24시간 통기 교반 배양하였다. 배양액의 효소 활성은 약 1.5단위/㎖이었다. 배양액의 일부를 취하여 원심 분리하여 균체와 배양 상청액으로 분리하고, 다시 균체를 50mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 원래의 배양액과 동일한 액량의 현탁액으로 한 후 균체 현탁액과 배양 상청액의 효소 활성을 측정한 결과 균체 현탁액에는 약 0.6단위/㎖의 효소 활성이, 그리고 배양 상청액에는 약 0.9단위/㎖의 효소 활성이 있었다.

[실험 2]

[효소 정제]

실험 1에서 얻은 배양액 약 18ℓ을 초고압 균체 파쇄 장치 “Mini-Rabo”(일본국 大日本제약 주식회사제)로 처리하여 함유된 균체를 파쇄하였다. 처리액을 원심 분리(10,000rpm, 30분간) 함으로써 약 16ℓ의 상청액을 얻었다. 이 액에 포화도 0.2가 되도록 황산 암모늄을 용해시키고 4℃에서 1시간 방치한 후 원심 분리(10,000rpm, 30분간) 함으로써 상청액을 회수하였다.

다시 이 액에 포화도 0.6이 되도록 황산 암모늄을 용해시키고 4℃에서 24시간 방치한 후 원심 분리(10,000rpm, 30분간)하여 황산 암모늄 염석물을 회수하였다. 수득한 황산 암모늄 염석물을 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해시킨 후 동일한 완충액에 대하여 24시간 투석하고 원심 분리(10,000rpm, 30분간)하여 불용물을 제거하였다. 이 투석액(360㎖)을 2회에 나누어 DEAE-Toyopearl겔(일본국 Tosoh 주식회사제)을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔의 양 : 300㎖)를 하였다.

목적으로 하는 이 효소를 DEAE-Toyopearl겔에 흡착시켜 식염을 함유한 동일한 완충액으로 칼럼으로부터 용출하였다. 수득한 효소 활성 획분을 2M 황산 암모늄을 함유한 동일한 완충액에 대하여 투석하고, 이 투석액을 원심 분리(10,000rpm, 30분간)하여 불용물을 제거하고 수득되는 상청액을 “부틸-Toyopearl 650”(일본국의 Tosoh 주식회사제의 소수성(疏水性) 겔)을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피(겔의 양 : 300㎖)를 하였다. 흡착된 이 효소를 황산 암모늄 2M으로부터 0M까지의 직선 기울기에 의하여 칼럼으로부터 용출시켜 효소 활성 획분을 회수한 다음, Toyopearl HW-55 겔(일본국 Tosoh 주식회사제)을 사용한 겔 여과 크로마토그래피(겔의 양 : 300㎖)를 하여 효소 활성 획분을 회수하였다. 정제의 각 공정에서의 효소 활성량, 비활성(比活性) 및 수율은 표 1에 나와 있다.

[표 1]

표 1의 공정에서 겔 여과 용출액으로서 수득한 정제 효소 제품을 폴리아크릴아미드 겔(겔 농도 7.5%)을 사용하는 전기 영동법으로 순도를 검정한 결과 단백질 밴드는 단 하나가 나타났고, 수득한 효소 제품은 전기 영동적으로 단일의 고순도의 것이었다.

[실험 3]

[효소의 성질]

실험 2에서 수득한 정제 효소 제품을 SDS(소디움 도데실술페이트)-폴리아크릴아미드 겔(겔 농도 10%)을 사용하는 전기 영동법으로 처리하고, 동시에 영동 처리된 분자량 마이커(marker)(일본국의 Bio-Rad Laboratory 주식회사제)와 비교하여 이 효소의 분자량을 측정한 결과 분자량 약 77,000∼87,000 돌턴이었다.

정제 효소 제품을 폴리아크릴아미드 겔(2v/v% “Ampholine” 함유, 스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB사제의 양쪽성 전해질)을 사용하는 등전점 전기 영동법으로 처리한 후, 겔의 pH를 측정하여 이 효소의 등전접(pI)을 구한 결과, 등전점은 약 3.6∼4.6이었다.

이 효소 활성에 대한 온도의 영향과 pH의 영향은 활성 측정 방법에 준하여 조사하였다. 그 결과는 제1도(온도의 영향)와 제2도(pH의 영향)에 각각 나와 있다. 효소의 최적 온도는 pH 7.0에서 60분간 반응에서는 40℃ 부근이었고, 최적 pH는 40℃에서 60분간 반응에서 약 7.0이었다. 이 효소의 열적 안정성은 효소 용액(50mM 인산 완충액을 함유, pH 7.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고 냉각한 후 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 그리고, pH 안정성은 이 효소를 각 pH의 50mM 인산 완충액 중에서 25℃에서 16시간 유지한 후 pH를 7로 조정하고 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과는 제3도(열적 안정성)와 제4도(pH 안정성)에 나와 있다. 이 효소의 열적 안정성은 40℃ 부근까지 안정하였고, pH 안정성은 약 6∼9이었다.

[실험 4]

[비환원성 당질의 제조]

기질로서 글루코오스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스 또는 말토헵타오스의 20% 수용액을 제조하고, 각각의 실험 2에서 제조한 정제 효소를 가질 고형물 1g당 2단위의 비율로 가하여 40℃, pH 7.0에서 48시간 작용시킨 후 탈염하고 “Wakobeads WB-T-330 칼럼”(일본국의 和光純藥品 공업 주식회사제)을 사용한 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)로 반응 생성물을 분석하였다. 고속 액체 크로마토그래피는 실온하에서 하였고 용리액으로서 물을 유속 0.5㎖/min으로 공급하여 시차(示差) 굴절계 RI-8012(일본국의 Tosoh 주식회사제)로 반응 생성물을 분석하였다. 그 결과는 표 2에 나와 있다.

[표 2]

(주) : 표에서 “P I”, “P II”, “P III”, “P IV” 및 “PV”는 각각의 기질인 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스 및 말토헵타오스로부터 생성된 신규 당질을 의미함.

표 2 결과로부터 명백한 바와 같이 각각의 반응 생성물은 각각의 잔존 기질과 새로이 생성한 각각의 당질 P I, P II, P III, P IV, PV로 되어 있고, 그 이외의 당질은 거의 검출되지 않았다. 각각의 생성율은 글루코오스 중합도 4 이상인 P II, P III, P IV 및 PV는 85% 이상의 높은 생성율을 나타낸 반면, 글루코오스 중합도 3인 P I은 비교적 낮은 생성율을 나타내는 것임이 판명되었다. 그리고, 글루코오스와 말토오스로부터는 새로운 당질을 생성하지 않았음이 판명되었다.

각각의 반응 혼합물로부터 새로 생성된 당질을 정제하기 위해 탈색, 탈염, 농축 후, 알칼리 금속형 강산성 양이온 교환 수지(XT-1016, Na⁺형, 가교도 4%, 일본국 東京有機化學 공업 주식회사제)를 사용한 칼럼 분획을 하였다. 수지를 내경 2.0cm, 길이 1m의 자켓부 스테인레스제 칼럼 3개에 충전하고 직렬로 연결하여 칼럼내의 온도를 55℃로 유지하면서 반응당액을 수지에 대하여 5v/v% 가하였다. 여기에 55℃의 온수를 SV(공간 속도) 0.13으로 흘려서 분획하여 새로이 생성된 당질 함량 97% 이상의 고순도 획분을 채취하였다. 수득한 고순도 획분을 진공 건조하여 각각 고순도 당질 제품을 제조하였다. 기질 원료에 대한 수율은 고형물 환산으로 각각 P I에서 약 9%, P II에서 약 65%, P III에서 약 82%, P IV에서 약 80%, P V에서 약 77%이었다. 그 순도는 각각 P I에서 약 97.5%, P II에서 약 98.6%, P III에서 약 99.5%, P IV에서 약 98.4%, P V에서 약 98.4%이었다.

또한, 이들 신규의 고순도 당질 제품의 환원력을 소모니-넬슨법으로 측정하여 DE로 나타내었다. 그 결과는 표 3에 나와 있다.

[표 3]

표 3의 결과로부터 명백한 바와 같이 각 당질 제품에서 약간 정도의 환원력 밖에 타나나지 않았다. 이러한 약간 정도의 환원력은 잔존하고 있는 기질 유래의 환원성 말토올리고당에서 기인하는 것으로 추정되고, 새로이 생성된 당질은 어느 것이나 실질적으로 비환원성이라고 판단된다.

[실험 5]

[메일라아드 반응(Maillard reaction)]

실험 4에서 제조한 당질 제품 P I, P II, P III, P IV 및 PV 10%와 글리신 1% 및 50mM 인산 완충액(pH 7.0)을 함유하는 용액을 100℃에서 90분간 유지하고 냉각한 후 이 용액의 파장 480nm 및 1cm 셀에서의 흡광도를 측정하였다. 대조로서 각각의 원료인 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스를 사용하여 마찬가지로 처리하여 파장 480nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 표 4에 나와 있다.

[표 4]

표 4의 결과로부터 명백한 바와 같이 새로이 생성된 비환원성 당질 제품, P I, P II, P III, P IV, PV 중 어느 것이나 메일라아드 반응(Maillard reaction)에 의한 착색도는 극히 낮고, 각각 원료의 기질인 말토올리고당의 착색도의 3∼6%에 불과하여 본 발명의 신규 효소에 의하여 생성하는 비환원성 당질은 메일라아드 반응을 거의 나타내지 않는 당질임이 판명되었다.

[실험 6]

[글루코아밀라아제에 의한 효소 분해]

실험 4에서 제조한 비환원성 당질 제품 P I, P II, P III, P IV 및 PV 각각 50mg을 50mM 아세트산 완충액(pH 4.5) 1㎖에 융해하고 1단위의 글루코아밀라아제(일본국의 生化學 공업 주식회사제)를 가하여 40℃에서 6시간 유지하여 효소 분해하였다. 수득한 분해물을 고속 액체 크로마토그래피(HPLG)로 분석한 결과 어느 것이나 분해물로서 글루코오스와 트레할로오스만이 검출되었다. 검출된 글루코오스 함량, 트레할로오스 함량 및 그 조성 몰비의 결과는 표 5에 나와 있다.

[표 5]

표 5의 결과로부터 명백한 바와 같이 글루코아밀라아제에 의하여 비환원성 당질 P I은 글루코오스 1몰과 트레할로오스 1몰로 분해되고, P II는 글루코오스 2몰과 트레할로오스 1몰로, P III는 글루코오스 3몰과 트레할로오스 1몰로, P IV는 글루코오스 4몰과 트레할로오스 1몰로, 그리고 PV는 글루코오스 5몰과 트레할로오스 1몰로 각각 분해되었음이 판명되었다.

또한, 글루코아밀라아제의 효소 반응 특성을 고려하면 이들 비환원성 당질의 구조는 트레할로오스 1몰에 글루코오스 1몰 이상이 α-1,4 결합 또는 α-1,6 결합으로 결합한 당질로서, 각각 P I는 트레할로오스 1몰에 글루코오스 1몰이 결합한 글루코오스 중합도 3의 비환원성 당질이고, P II는 트레할로오스 1몰에 글루코오스 2몰이 결합한 글루코오스 중합도 4의 비환원성 당질이고, P III은 트레할로오스 1몰에 글루코오스 3몰이 결합한 글루코오스 중합도 5의 비환원성 당질이며, P IV는 트레할로오스 1몰에 글루코오스 4몰이 결합한 글루코오스 중합도 6의 비환원성 당질이고, PV는 트레할로오스 1몰에 글루코오스 5몰이 결합한 글루코오스 중합도 7의 비환원성 당질이다. 그리고, 글루코아밀라아제와 마찬가지로 비환원성 당질 제품 P I, P II, P III, P IV 또는 PV에 β-아밀라아제를 작용시켰을 때 비환원성 당질 P I과 P II는 분해되지 않고, P III은 말토오스 1몰과 P I 1몰로 분해되고, P IV는 말토오스 1몰과 P II 1몰로 분해되며, PV는 말토오스 2몰과 P I 1몰로 분해됨이 판명되었다.

이상의 결과로부터 본 발명의 비환원성 당질 생성 효소에 의한 반응은 기질의 저분자화와 고분자화를 수반하지 않는, 환언하자면 글루코오스 중합도의 변화를 수반하지 않는 분자내 변환 반응이라 판단되고, 또한 이 비환원성 당질 생성 효소에 의해 생성된 비환원성 당질 P I, P II, P III, P IV 및 PV는 각각 α-글루코실 트레할로오스, α-말토실 트레할로오스, α-말토트리오실 트레할로오스, α-말토테트라오실 트레할로오스 및 α-말토펜타오실 트레할로오스의 α-글리코실 트레할로오스 [Gn-T, 여기서 “G”는 글루코오스 잔기, n은 1이상의 정수, T는 α,α-트레할오스 잔기임]라고 판단된다.

[실험 7]

[각종 효소에 의한 가수분해]

실험 4에서 제조한 비환원성 당질 제품 P I, P II, P III, P IV 또는 PV 각각을 기질로 하여 돼지 췌장 유래의 α-아밀라아제(Sigma사 판매), 쌀 유래의 α-글루코시다아제(Sigma사 판매) 또는 래트 소장 아세톤 분말 효소(Sigma사 판매) 각각에 작용시킨 후 수득한 가수분해물의 당 조성물 고속 액체 크로마토그래피로 분석하였다. α-아밀라아제의 효소 반응은 각각의 기질 10mg을 50mM 인산 완충액(pH 6.9) 1㎖에 용해하고 여기에 α-아밀라아제 1단위를 가하고 37℃에서 18시간 유지하여 실시하였다. α-글루코시다아제의 효소 반응은 50mM 아세트산 완충액(pH 4.0)을 사용한 이외는 α-아밀라아제의 경우와 마찬가지의 조건에서 실시하였다. 래트 소장 아세트 분말 효소의 반응 경우도 50mM 말레산 완충액(pH 6.0)을 사용한 이외는 α-아밀라아제의 경우와 마찬가지 조건에서 실시하였다. α-아밀라아제에 의한 분해물의 당 조성을 표 6에, α-글루코시다아제와 래트 소장 아세톤 분말 효소에 의한 분해물의 당 조성을 표 7과 표 8에 각각 나타내었다.

[표 6]

(주) 표에서 G3, G2 및 G1은 각각 말토트리오스, 말토오스 및 글루코오스를 의미한다.

[표 7]

[표 8]

표 6의 결과로부터 명백한 바와 같이 당질 제품인 P I 및 P II은 α-아밀라아제에 의하여 거의 가수분해되지 않으나, 당질 제품인 P III과 P IV 및 PV는 α-아밀라아제에 의하여 저분자량의 올리고당 P I, P II, 말토트리오스, 말토오스 및 글루코오스로까지 가수분해되었다는 것을 알 수 있다.

그리고, 표 7과 표 8의 결과로부터 명백한 바와 같이 당질 제품 P I, P II, P III, P IV, PV 어느 것이라도 α-글루코시다아제와 래트 소장 아세톤 분말 효소에 의하여 실험 6의 글루코아밀라아제의 경우와 마찬가지로 글루코오스와 트레할로오스로까지 가수분해되었다는 것을 알 수 있다.

또한, 마찬가지로 α-글루코시다아제와 래트 소장 아세톤 분말 효소에 의하여 가수분해된 각각의 반응물에 다시 1단위의 돼지 신장 유래의 트레할라아제(Sigma사 판매)를 가하고 pH 5.7 및 37℃에서 18시간 작용시킨 다음 고속 액체 크로마토그래피법으로 당 조성을 분석한 결과, 당질 제품 P I, P II, P III, P IV, PV 어느 경우도 α-글루코시다아제와 래트 소장 아세톤 분말 효소에 의하여 생성된 트레할로오스는 트레할라아제에 의하여 글루코오스로까지 가수분해되었음이 판명되었다.

이상의 결과를 요약하면 다음과 같다.

(1) 본 발명의 비환원성 당질 생성 효소는 글루코오스 중합도 3이상으로부터 선택되는 1종 이상의 환원성 전분 부분 가수분해물로부터 그 글루코오스 중합도를 변화시키지 않고 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성하고 있다.

(2) 비환원성 당질 P V는 α-아밀라아제에 의하여 주로 비환원성 당질 P II과 말토트리오스를 생성하고, 비환원성 당질 P II는 글루코아밀라아제에 의하여 트레할로오스 1몰과 글루코오스 2몰을 생성하고 있다.

이들 결과로부터 본 발명의 비환원성 당질 생성 효소는 환원성 전분 부분 가수분해물의 환원성 말단을 비환원성의 트레할로오스 구조로 분자내 변환하는 아주 새로운 작용 메카니즘의 효소인 것으로 판명된다.

[실험 8]

[급성 독성 시험]

7주령의 dd계 마우스를 사용하여 실험 4에서 제조한 비환원성 당질 제품 P I, P II, P III, P IV 또는 PV을 경구 투여하여 급성 독성 시험을 한 결과, 이들 비환원성 당질은 어느 것이나 저독성의 물질이고, 투여 가능한 최대 투여량에 있어서도 사망예는 확인되지 않았다. 따라서, 정확한 값이라고는 할 수 없으나 이들의 LD₅₀값은 어느 것이나 50g/kg 이상이었다.

[실험 9]

[아르드로박터 sp. Q36로부터의 비환원성 당질 생성 효소 제조]

리조븀 sp. M-11(FERM BP-4130) 대신에 아르드로박터 sp. Q36(FERM BP-4316)을 사용한 외에는 실험 1과 마찬가지로 퍼어먼터에서 약 72시간 배양하였다. 배양액의 비환원성 당질 생성 효소의 효소 활성은 약 1.2단위/㎖ 이었다. 실험 1과 마찬가지로 하여 균체 현탁액과 배양액 상청액의 효소 활성을 측정한 결과 각각 약 0.5단위/㎖ 및 약 0.7단위/㎖ 이었다.

[실험 10]

[효소의 정제]

실험 9의 방법으로 제조한 배양액 18ℓ을 사용하여 수득한 비환원성 당질 생성 효소를 실험 2와 마찬가지로 정제하였다. 정제의 각 공정 결과는 표 9에 나와 있다.

[표 9]

(주) * : 비환원성 당질 생성 효소를 뜻함.

표 9의 공정에서 겔 여과 칼럼 용출액으로서 얻은 정제된 효소 제품은 실험 2의 경우와 마찬가지로 전기 영동법으로 순도를 검정한 결과 단일 단백질 밴드를 나타내었고 수득한 효소 제품은 전기 영동적으로 단일 밴드를 가진 고순도의 효소이었다.

[실험 11]

[효소의 성질]

실험 10에서 얻은 정제 효소 제품을 실험 3의 경우와 마찬가지로 SDS-PAGE로 분자량을 측정한 결과 약 76,000∼86,000 돌턴이었다. 그리고, 이 정제 효소 제품의 등전점(pI)을 실험 3의 경우와 마찬가지로 등전점 전기 영동법으로 구한 결과 pI 약 3.6∼4.6이었다. 또한, 이 효소 활성에 대한 온도의 영향과 pH의 영향 및 열적 안정성과 pH 안정성에 대하여 실험 3의 경우와 마찬가지로 하여 구하였다. 그 결과는 온도의 영향을 제5도에, pH의 영향을 제6도에, 열적 안정성을 제7도에, 그리고 pH 안정성을 제8도에 각각 나타내었다.

제5도∼제8도로부터 명백한 바와 같이 효소의 최적 온도는 40℃ 부근이고, 최적 pH는 약 6.5∼7.0이다. 그리고, 열적 안정성은 40℃ 부근까지이고, pH 안정성은 6.0∼9.5이다.

[실험 12]

[비환원성 당질 제조]

실험 10에서 제조한 정재 효소 제품을 사용하여 실험 4와 실험 6의 방법에 따라 비환원성 당질의 제조 및 그 구조 확인의 실험을 하였다. 그 결과, 리조븀 sp. M-11 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 경우와 마찬가지로 글루코오스 중합도 3이상에서 선택되는 1종 이상의 환원성 전분 부분 가수분해물로부터 말단에 트레할로오스 구조를 가진 글루코오스 중합도 3이상에서 선택되는 1종 이상의 비환원성 당질을 생성하는 것이 판명되었다.

[실험 13]

[공지 미생물로부터의 비환원성 당질 생성 효소의 제조와 그 성질]

공지 미생물중에서 본 발명의 비환원성 당질 생성 효소 생산능이 확인된 표 10에 나온 특정의 미생물을 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) ATCC 19420의 경우에 대하여 37℃에서 배양한 이외는 실험 1의 경우와 마찬가지로 퍼어멘터에서 27℃에서 72시간 배양하였다. 각각의 배양액 약 18ℓ을 사용하여 실험 2와 마찬가지로 해서 배양액을 세포 파쇄 장치에서 처리하고, 그 상청액을 황산 암모늄 염석하여 투석한 다음, 다시 이온 교환 칼럼 처리하여 부분 정제 효소 제품을 얻은 후 그 성질을 조사하였다. 그 결과는 표 10에 나와 있다.

[표 10]

그리고, 이들 공지 균 유래의 부분 정제 효소 제품을 사용하여 실험 12의 방법에 따라 비환원성 당질의 제조와 그 구조 확인을 한 결과, 어느 효소도 리조븀 sp. M-11 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 경우와 마찬가지로 글루코오스 중합도 3이상에서 선택되는 1종 이상의 환원성 전분 부분 가수분해물로부터 말단에 트레할로오스 구조를 가진 글루코오스 중합도 3이상에서 선택되는 1종 이상의 비환원성 당질을 생성하는 것이 판명되었다.

[실험 14]

[비환원성 당질 생성 효소의 부분 아미노산 배열]

(1) N 말단 아미노산 배열

실험 2의 방법으로 제조된 리조븀 sp. M-11 유래의 부분 정제 효소 제품과 실험 10의 방법으로 제조한 아르드로박터 sp. Q36 유래의 정제 효소 제품의 일부를 각각 증류수에 대하여 투석한 후 단백질양으로서 약 80㎍을 N 말단 아미노산 배열 분석용의 시료로 하였다. N 말단 아미노산 배열은 “Protein Sequencer Model 473A”(미합중국의 Applied Biosystems사 제조)를 사용하여 N 말단으로부터 10 아미노산 잔기까지 분석하였다. 효소 제품의 N 말단 부분 아미노산 배열은 표 11에 나와 있다.

[표 11]

표 11로부터 명백한 바와 같이 N 말단 아미노산 배열은 그 말단 아미노산이 리조븀 sp. M-11 유래의 효소인 경우 발린이고, 아르드로박터 sp. Q36인 경우의 메티오닌과 다른데 반하여, 분석된 아미노산 배열 10잔기중의 8잔기까지가 일치하고 있다. 그 중에서도 제2번째의 L-아르기닌 잔기로부터 제4번째의 L-프롤린 잔기까지 3잔기의 아미노산 배열 및 제6번째의 L-세린 잔기로부터 제10번째의 L-로이신 잔기까지 5잔기의 아미노산 배열은 양 효소 사이에 완전히 일치하고 있다. 즉, 이들 효소 제품의 N 말단 부분 아미노산 배열은 X₁-아르기닌-트레오닌-프롤린-X₂-세린-트레오닌-티로신-아르기닌-로이신-(단, X₁은 발린 또는 메티오닌을 의미하고, X₂는 알라닌 또는 발린을 의미함)의 공통 배열을 가지고 있음이 확인되었다.

(2) 내부 부분 아미노산 배열

실험 2의 방법으로 제조한 리조븀 sp. M-11 유래의 정제 효소 제품 또는 실험 10의 방법으로 제조한 아르드로박터 sp. Q36 유래의 정제 효소 제품의 일부를 각각 10mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한 후, 이 완충액으로 약 1㎎/㎖의 농도가 되도록 희석하였다. 이들 시료액(1㎖) 각각에 10㎍의 “리실 엔도펩티다아제”(일본국의 和光純藥 주식회사 판매)를 가하고, 30℃에서 22시간 반응시켜 펩티드화 하였다. 생성한 펩티드를 분리하기 위하여 역상 HPLC를 하였다. 즉, 리조븀 sp. M-11 유래 효소의 경우 “CAPCELL PAK C18 칼럼”(직경 4.5㎜×길이 250㎜; 일본국의 (주) 資生堂 제조)을 사용하여 유속 0.6㎖/min으로 하여 실온에서 0.1v/v% 트리플루오로 아세트산-16v/v% 아세토니트릴 용액으로부터 0.1v/v% 트리플루오로 아세트산-48v/v% 아세토니트릴 용액까지의 직선 기울기 조건에서 60분간 용리하였다. 그리고, 아르드로박터 sp. Q36 유래 효소의 경우 “μ-Bondapack C18 칼럼”(직경 2.1㎜×길이 150㎜; 미합중국의 Waters사 제조)을 사용하여 유속 0.9㎖/min, 실온에서 0.1v/v% 트리플루오로 아세트산-30v/v% 아세토니트릴 용액으로부터 0.1v/v% 트리플루오로 아세트산-55v/v% 아세토니트릴 용액까지의 직선 기울기 조건에서 60분간 용리하였다. 칼럼에서 용출된 펩티드는 파장 210mm에서의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 리조븀 sp. M-11의 효소 제품으로부터 세가지 펩티드[R37(유지 시간 약 37분), R40(유지 시간 약 40분), R42(유지 시간 약 42분)]와 아르드로박터 sp. Q36의 효소 제품으로부터 세가지 펩티드[A17(유지 시간 약 17분), A22(유지 시간 약 22분), A40(유지 시간 약 40분)]를 기타 펩티드와 분리하여 회수한 다음 감압하에 건조한 후 200㎍의 0.1%∼50% 아세토니트릴 용액에 각각 용해하였다. 이들 펩티드 시료를 Protein Sequencer에서 처리하여 각각 10잔기까지 아미노산 배열을 분석하였다. 수득한 내부 부분 아미노산 배열은 표 12에 나와 있다.

[표 12]

표 12로부터 명백한 바와 같이 리조븀 sp. M-11 효소의 펩티드 R37의 부분 아미노산 배열과 아르드로박터 sp. Q36 효소의 펩티드 A17의 부분 아미노산 배열은 완전히 일치하였다. 또한 펩티드 R40과 펩티드 A22의 배열도 완전히 일치하였다. 펩티드 R42와 펩티드 A40에서는 분석된 10잔기중의 7잔기가 일치하고 있다. 즉, 펩티드 R42와 펩티드 A40의 부분 아미노산 배열은 글루와인-글리산-아르기닌-X₃-세린-X₄-티로신-알라닌-X₅-알라닌-(단, X₃은 글리신 또는 글루탐산을 의미하고, X₄는 프롤린 또는 아르기닌을 의미하며, X₅는 발린 또는 글루탐산을 의미함)의 공통 배열을 가지고 있다.

이하, 본 발명의 비환원성 당질, 이것을 함유한 저환원성 당질 및 트레할로오스의 제조 방법을 실시예 A에서, 그리고 비환원성 당질, 이것을 함유한 저환원성 당질 및/또는 트레할로오스를 함유시킨 조성물을 실시예 8에서 설명한다.

[실시예 A-1]

리조븀 sp. M-11(FERM BP-4130)을 실험 1의 방법에 준하여 퍼어멘터에서 약 36시간 영양 배지중에서 배양하였다. 배양후 SF막을 사용하여 제균 여과하여 약 18ℓ의 배양 여액을 회수한 다음 이 여액을 UF막으로 농축하여 본 발명의 비환원성 당질 생성 효소의 농축액 약 1ℓ(17.7단위/㎖)를 회수하였다.

6% 감자 전분 현탁액을 가열 호화시킨 후 pH 4.5, 온도 50℃로 조정하여 여기에 이소아밀라아제(일본국의 (주) 林源생물화학연구소 제조)를 전분 1g당 2500단위의 비율이 되도록 가하고 20시간 반응시켰다. 이 반응액을 pH 6.0으로 조절하고 오토클레이브 처리(120℃)를 10분 한 다음 45℃로 서서히 냉각하여 여기에 α-아밀라아제(덴마크국의 Novo사 제조, 상품명 “Termamyl 60L”)를 전분 1g당 150단위의 비율이 되도록 가하고 24시간 반응시켰다.

이 반응액을 20분 동안 오토클레이브 처리(120℃)한 후 45℃로 냉각하고 여기에 위의 방법으로 제조한 비환원성 당질 생성 효소를 전분 1g당 1단위의 비율이 되도록 가하여 96시간 효소 반응시켰다. 이 반응액을 95℃로 가열하고 10분간 유지한 후 냉각하여 여과해서 얻은 여액을 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온 교환 수지로 탈염하여 정제한 후, 농축하여 농도 70%의 시럽을 고형물당 약 91%의 수율로 얻었다.

이 제품은 DE 18.8이고, 비환원성 당질을 고형물당 P I 8.3%, P II 5.5%, P III 37.7%, P IV 1.4% 및 P V 1.3%를 함유하고 있으며, 온화하고 고품질의 감미, 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있으며 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

[실시예 A-2]

실시예 A-1의 방법으로 제조한 당액을 원당액으로 하고, 비환원성 당질의 함량을 높이기 위해 알칼리 금속형 강산성 양이온 교환 수지(XT-1016, Na⁺형, 가교도 4%, 일본국의 東京有機化學공업(주) 제조)를 사용한 칼럼 분획을 하였다. 수지를 내경 5.4cm의 자켓부 스테인레스제 칼럼 4개에 충전하고 직렬로 연결하여 수지층 전체 길이를 20m로 하였다. 칼럼내 온도를 55℃로 유지하면서 당액을 수지에 대하여 5v/v% 가하고, 여기에 55℃의 온수를 SV 0.13으로 공급하여 분획함으로써 글루코오스와 말토오스 고함유 획분을 제거하여 비환원성 당질 고함유물을 회수하였다. 이것을 정제 농축하고 진공 건조한 다음 분쇄하여 비환원성 당질 고함유 분말을 고형물당 약 61%의 수율로 얻었다.

이 제품은 DE 5.7이고 비환원성 당질을 고형물당 P I 9.3%, P II 7.4%, P III 55.5%, P IV 2.1%, P V 1.9%를 함유하고 있으며, 실시예 A-1과 마찬가지로 온화하고 고품질의 감미, 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있으며 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

[실시예 A-3]

33% 옥수수 전분 현탁액에 최종 농도 0.1중량%가 되도록 탄산 칼슘을 가한 후 pH 6.5로 조정하고, 여기에 α-아밀라아제(덴마크국의 Novo사 제조, 상품명 “Termamyl 60L”)를 전분 1g당 0.2중량%가 되도록 가하여 95℃에서 15분간 효소 반응시켰다. 이 반응액을 오토클레이브 처리(120℃)를 10분간 한 후 55℃로 냉각하고, 여기에 말토테트라오스 생성 아밀라아제(일본국의 (주) 林源생물화학연구소 제조)를 전분 1g당 5단위의 비율이 되도록 가하고 6시간 효소 반응시켰다. 여기에 α-아밀라아제(일본국의 上田화학(주) 제조, 상품명 “α-아밀라아제 2A”)를 전분 1g당 30단위 가하고 다시 65℃에서 4시간 반응시켰다. 이 반응액을 오토클레이브 처리(120℃)를 10분 동안 한 다음 45℃로 냉각하고 실시예 A-1의 방법으로 제조한 비환원성 당질 생성 효소를 전분 1g당 2단위의 비율이 되도록 가하고 64시간 반응시켰다. 이 반응액을 95℃에서 10분간 유지한 후 냉각하여 여과해서 얻은 여액을 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온 교환 수지로 탈염하여 정제한 다음 농축하여 농도 70%의 시럽을 고형물당 약 90%의 수율로 얻었다.

이 제품은 DE 10.5이고, 비환원성 당질을 고형물당 P I 3.7%, P II 43.7%, P III 1.2%, P IV 1.1% 및 P V 0.6%를 함유하고 있으며, 온화하고 고품질의 감미, 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있으며 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

[실시예 A-4]

실시예 A-3의 방법으로 제조한 당액을 원당액으로 하고, 이 액의 비환원성 당질 P II(글루코오스 중합도 4)의 함량을 높이기 위하여 분획용 수지로서 강산성 양이온 교환 수지(미합중국의 Dow Chemical사 판매, 상품명 “Dowex 50W-X4, Mg⁺⁺형)”를 사용한 이외는 실시예 A-2의 방법으로 칼럼 크로마토그래피를 하여 비환원성 당질 P II 고함량 획분을 채취하였다. 이 획분을 정제, 농축하고 분무 건조하여 비환원성 당질 고함유 분말을 고형물당 약 40%의 수율로 얻었다.

이 제품은 비환원성 당질을 고형물당 P I 8.5%, P II 68.0%, P III 1.4% 함유하고 있고 그 DE는 3.5를 나타내고 있어 환원성이 극히 작으며, 실시예 A-3과 마찬가지로 온화하고 고품질의 감미, 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있으며 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

[실시예 A-5]

말토펜타오스(일본국의 (주) 林源생물화학연구소 제조)의 20% 수용액에 실시예 A-1의 방법으로 제조한 비환원성 당질 생성 효소를 말토펜타오스 1g당 1.0단위의 비율이 되도록 가하고 45℃에서 48시간 효소 반응시켰다. 이 효소 반응에 의하여 말토펜타오스의 약 93%가 비환원성 당질 P III로 변환하였다. 이 반응액을 95℃에서 10분간 유지한 후 냉각하고 여과하여 얻은 여액을 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온 교환 수지로 탈염하여 농축하였다. 비환원성 당질 P III(글루코오스 중합도 5)의 함량을 높이기 위해 실시예 A-2와 마찬가지로 알칼리 금속형 강산성 양이온 교환 수지를 사용한 칼럼 분획을 하여 P III 고함량 획분을 회수하였다. 이 획분 용액을 정제, 농축하고 분무 건조하여 고순도 비환원성 당질 분말을 고형물당 약 55%의 수율로 얻었다.

이 제품은 비환원성 당질을 고형물당 P III 99.0% 함유하고 있고, 그 DE는 약 0.2 이하밖에 되지 않아 환원성이 극히 작다. 이 제품은 약간 정도의 감미를 가지고 있어서 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

[실시예 A-6]

전분 부분 가수분해물(일본국의 松谷화학공업(주) 판매, 상품명 “PINE-DEX#4” 40중량부를 물 60중량부에 가열 용해하고, 이 용액을 45℃, pH 6.5로 조정한 후, 실시예 A-1의 방법으로 제조한 비환원성 당질 생성 효소를 전분 부분 가수분해물 1g당 1단위의 비율이 되도록 가하고 96시간 반응시켰다. 이어서, 100℃에서 10분간 가열하여 실활시켰다. 이 반응액을 농도 약 20%까지 희석하고 글루코아밀라아제(일본국의 Nagase 생화학공업(주) 제조, 상품명 “GLUCOZYME”)를 전분 부분 가수분해물 1g당 10단위 가하고 40시간 효소 반응시킨 다음 가열하여 효소를 실활시켰다. 이 용액을 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고 이온 교환 수지로 탈염하여 농도 약 60%로 농축하였다.

이 당액중에는 고형물당 29.5%의 트레할로오스를 함유하고 있었다. 분획용 수지로서 강산성 양이온 교환 수지(일본국의 Organo(주) 판매, 상품몇 “CG 6000”, Na⁺형)를 사용한 이외는 실시예 A-2의 방법에 따라 칼럼 크로마토그래피를 하여 트레할로오스 고함유 획분을 회수하였다. 이 고함유액은 고형물당 약 90%의 트레할로오스를 함유하고 있었다. 이 용액을 농도 약 75%로 농축한 후 결정화기에 넣고 종정으로서 트레할로오스 함수 결정 약 2%를 가하고 서냉하여 결정화율 약 45%의 매스키트를 얻었다. 이 매스키트를 건조탑위의 노즐로부터 150kg/㎠의 고압으로 분무하였다. 이와 동시에 85℃의 열풍을 건조탑 상부로부터 송풍하고 저부에 설치된 이송 금망 컨베이어 위에 결정 분말을 포집하며, 컨베이어의 밑으로부터 45℃의 온풍을 보내면서 이 분말을 건조탑 밖으로 서서히 이동시켜 배출하였다. 이 결정 분말을 숙성탑에 충전하여 온풍을 보내면서 10시간 숙성시켜 결정화와 건조를 완료하여 트레할로오스 함수 결정 분말을 얻었다.

이 제품은 실질적으로 흡습성을 나타내지 않아 취급이 용이하므로 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정화제, 부형제 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

[실시예 A-7]

고구마 전분 1중량부를 전분 1g당 0.01w/w%의 비율로 α-아밀라아제(일본국의 Nagase 생화학공업(주) 제조, 상품명 “NEO-NAGASE”)를 함유한 물 6중량부에 교반 혼합하고, pH 6.0으로 조정후 이 현탁액을 85∼90℃로 유지하여 호화와 액화를 동시에 일으키고, 곧바로 120℃에서 5분간 가열하여 DE 1.0이하로 유지하여 이것을 55℃로 급냉한 후 pH 7.0으로 조정하였다. 여기에 일본국의 (주) 林源생물화학연구소 제조, 상품명 “PULLULANASE (EC 3.2.1.41)”와 실시예 A-3에서 설명한 말토테트라오스 생성 아밀라아제를 각각 전분 1g당 150단위와 8단위의 비율로 가하고 pH 7.0, 50℃에서 36시간 반응시켰다.

이 반응액을 오토클레이브 처리(120℃)를 10분간 한 다음 45℃로 냉각하고, 여기에 실험 13의 방법으로 제조한 브레비박테리움 헬로볼룸 ATCC 11822 유래의 비환원성 당질 생성 효소를 전분 1g당 2단위의 비율이 되도록 가하고 64시간 반응시켰다. 이 반응액을 95℃에서 10분간 유지한 후 냉각하여 여과해서 얻은 여액을 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형, OH형 이온 교환 수지로 탈염하여 정제하였다. 이것을 농축하고 분무 건조하여 비환원성 당질 함유 분말을 고형물당 약 90%의 수율로 얻었다.

이 제품은 DE 11.2로서 비환원성 당질을 고형물당 P I 2.9%, P II 61.5%, P III 0.8%를 함유하고 있으며, 온화하고 고품질의 감미, 적당한 점도 및 보습성을 가지므로 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

[실시예 A-8]

아르드로박터 sp. Q36(FERM BP-4316)을 실험 9의 상법에 준하여 퍼어멘터에서 영양 배지중에서 약 72시간 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 제균하고 상청액을 UF막으로 약 10배로 농축하여 본 발명의 비환원성 당질 생성 효소 농축액(약 15.2단위㎖)을 얻었다.

30% 옥수수 전분 현탁액을 사용하여 실시예 A-3의 방법에 따라 α-아밀라아제(덴마크국의 Novo사 제조), 말토테트라오스 생성 아밀라아제(일본국의 (주) 林源생물화학연구소 제조) 및 α-아밀라아제(일본국의 上田화학(주) 제조)를 작용시켜 오토클레이브 처리(120℃)를 한 다음 45℃로 냉각하고, 여기에 위의 방법으로 제조한 비환원성 당질 생성 효소를 전분 1g당 2단위 되도록 가하여 64시간 효소 반응시켰다. 이어서,100℃에서 10분간 가열하여 효소를 실활시킨 후, 이 반응액을 실시예 A-6의 방법에 준하여 글루코아밀라아제(일본국의 Nagase 생화학공업(주) 제조)를 작용시키고, 탈색 탈염하여 약 농도 60%로 농축하였다. 이 당액중 고형물당 25%의 트레할로오스를 함유하고 있었다. 이 당액을 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 하여 트레할로오스 고함유 획분을 회수하였다. 이 고함유액은 고형물당 약 95%의 트레할로오스를 함유하고 있었다. 이 용액을 증발 가마에 넣고 감압하에 끓여 수준 약 4.0%의 시럽으로 하여 결정화기에 옮겨 여기에 종정으로서 무수 결정 트레할로오스를 시럽 고형물당 1% 가하고 95℃에서 5분간 교반하여 무수 결정 트레할로오스를 결정화한 다음 알루미늄제 용기에 넣어 100℃에서 6시간 숙성시켜 블록을 얻었다. 이 블록을 절삭기로 분쇄하고 유동 건조하여 수분 약 0.3%의 무수 결정 트레할로오스 분말을 얻었다.

이 제품은 식품, 의약품, 화장품, 이들의 원재료 또는 가공 중간물 등의 함수물의 탈수제로서 뿐만 아니라 온화하고도 고품질의 감미를 가진 백색 분말 감미료로서도 유리하게 이용할 수 있다.

[실시예 B-1]

[감미료]

실시예A-4의 방법으로 제조한 비환원성 당질 고함유 분말 1중량부에 α-글루코실 스테비오시드(일본국의 東洋精糖(주) 판매, 상품명 “αG Sweet”) 0.01중량부와 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르(일본국의 Ajinomoto(주) 판매, 상품명 “아스파르템”) 0.01중량부를 균일히 혼합하여 과립 성형기에서 과립상 감미료를 제조하였다. 이 제품은 감미의 질이 우수하여 수크로오스의 약 2배의 감미도를 가지며 감미도당 칼로리는 수크로오스의 약 1/2로 저하되어 있다.

이 감미료는 여기에 배합된 고감미도 감미물의 분해도 없고 안정성이 우수하여 저칼로리 감미료로서 칼로리 섭취를 제한하고 있는 비만자, 당뇨병자 등을 위한 저칼로리 음식물 등에 대한 감미 부여에 적당하다.

또한, 이 감미료는 충치 유발균에 의한 산의 생성이 작고 불용성 글루칸의 생성도 적으므로 충치를 억제하는 음식물 등에 대한 감미 부여에도 적당하다.

[실시예 B-2]

[하아드 캔디]

농도 55% 수크로오스 용액 100중량부에 실시예 A-3의 방법으로 제조한 비환원성 당질 함유 시럽 30중량부를 가열 혼합한 다음 감압하에 수분 2% 이하가 될 때까지 가열 농축하고, 여기에 시트르산 1중량부와 레몬향료 적당량과 착색료를 혼화하여 통상의 방법에 따라 성형하여 표제의 제품을 얻었다.

이 제품은 깨물기와 맛이 양호하고 수크로오스의 결정화와 변형을 일으키지 않는 고품질의 하아드 캔디이다.

[실시예 B-3]

[츄잉 검]

검 베이스 3중량부를 유연하게 될 정도로 가열 용융하고, 여기에 수크로오스 4중량부와 실시예 A-6의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 3중량부를 가하고, 적당량의 향료와 착색료를 혼합한 후 통상의 방법에 따라 로울에서 반죽하여 성형, 포장함으로써 제품을 얻었다.

이 제품은 텍스쳐와 풍미가 모두 양호한 츄잉 검이다.

[실시예 B-4]

[가당 연유]

원유 100중량부에 실시예 A-1의 방법으로 제조한 비환원성 당질 함유 시럽 3중량부와 수크로오스 1중량부를 용해하고 플레이트 히이터에서 가열 살균한 다음 70%로 농축하고 무균 상태에서 통조림하여 제품을 얻었다.

이 제품은 온화한 감미로서 풍미도 좋아서 유아 식품, 과실, 커피, 코코아, 차 등의 조미용으로 유리하게 이용할 수 있다.

[실시예 B-5]

[유산균 음료]

탈지 분유 175중량부, 실시예 A-2 방법으로 제조한 비환원성 당질 고함유 분말 80중량부 및 일본국 특허 공개 제281,795/92호 공보에 개시되어 있는 락토수크로오스 고함유 분말 50중량부를 물 1200중량부에 용해하고, 65℃에서 30분간 살균하여 40℃로 냉각한 후 여기에 통상의 방법에 따라 유산균의 스타아터(starter)를 30중량부 식균(植菌)하고 37℃에서 8시간 배양하여 유산균 음료를 제조하였다.

이 제품은 풍미가 양호한 유산균 음료이고, 또한 이 제품은 올리고당을 함유하여 유산균을 안정하게 유지할 뿐만 아니라 비피도스균 증식 촉진 작용을 가지고 있다.

[실시예 B-6]

[분말 쥬우스]

분무 건조에 의해 제조한 오렌지 과즙 분말 33중량부에 대하여 실시예 A-2의 방법으로 제조한 비환원성 당질 고함유 분말 50중량부, 수크로오스 10중량부, 무수 시트르산 0.65중량부, 말산 0.1중량부, L-아르코브르산 0.1중량부, 시트르산 나트륨 0.1중량부, 풀룰란 0.5중량부 및 분말 향료 적당량을 잘 혼합, 교반하고 분쇄하여 미분말로 한 후, 이것을 유동층 조립기(造粒機)에서 배풍 온도 40℃, 풍량 150㎥로 하여 여기에 실시예 A-1의 방법으로 제조한 비환원성 당질 함유 시럽을 바인더로 하여 분무해서 30분간 조립(造粒)하고 계량, 포장해서 제품을 얻었다.

이 제품은 과즙 함유율이 약 30%인 분말 쥬우스이고 만족하지 못한 맛과 냄새가 없으며 장기간 안정하였다.

[실시예 B-7]

[커스타드 크리임]

옥수수 전분 100중량부, 실시예 A-3의 방법으로 제조한 비환원성 당질 함유 시럽 100중량부, 말토오스 80중량부, 수크로오스 20중량부 및 식염 1중량부를 충분히 혼합하고 계란 280중량부를 가하여 교반하였다. 여기에 끓인 우유 1000중량부를 서서히 가한 후 교반하면서 계속 가열하여 옥수수 전분이 완전히 호화하여 전체가 반투명하게 되었을 때 가열을 중지하고 냉각하여 적당량의 바닐라 향료를 가하고 계량, 충전, 포장하여 제품을 얻었다.

이 제품은 평활한 표면과 광택을 가지며 온화한 감미를 가지고 있다.

[실시예 B-8]

[안(An : 팥 페이스트)]

원료인 아즈키(adzuki) 팥 10중량부에 통상의 방법에 따라 물을 가하여 끓인 다음 팥의 고유한 불만족스런 냄새와 맛을 제거하고 수용성 협잡물을 제거하여 “아즈키-쯔부-안(adzuki-tsubu-an)” 약 21kg을 얻었다. 여기에 수크로오스 14중량부와 실시예 A-3의 방법으로 제조한 비환원성 당질 함유 시럽 5중량부 및 물 4중량부를 가하고 끓인 다음, 여기에 소량의 샐러드 오일을 가하고 조심스럽게 반죽하여 제품인 안(an : 팥 페이스트) 약 35kg을 얻었다.

이 제품은 끓일 때 생기는 탈색도 없고 맛과 풍미가 양호하여 팥잼 만두, 팥빵, 빙과, 셔어벳 등의 재료로서 적당하다.

[실시예 B-9]

[빵]

밀가루 100중량부, 효모 2중량부, 설탕 5중량부, 실시예 A-7의 방법으로 제조한 비환원성 당질 함유 분말 1중량부와 무기 이스트 푸우드 0.1중량부를 통상의 방법에 따라 물과 반죽하여 26℃에서 2시간 동안 발효시킨 다음 다시 30분 숙성한 후 불에 구웠다.

이 제품은 색상도 좋고 양호하게 부풀어 올라 있어 적당한 탄력, 온화한 감미를 가진 고품질의 빵이다.

[실시예 B-10]

[햄]

돼지 넓적다리 고기 1000중량부에 식염 15중량부와 질산 칼륨 3중량부를 균일히 갈아 냉실에서 하룻밤 퇴적한 후 물 500중량부, 식염 100중량부, 질산 칼륨 3중량부, 실시예 A-7의 방법으로 제조한 비환원성 당질 함유 분말 40중량부 및 페퍼민트 적당량으로 된 염지액에 냉실에서 7일간 침지한 다음 통상의 방법에 따라 냉수로 세척하고 끈으로 말아 훈연하여 쿠킹해서 냉각 포장하여 제품을 얻었다.

이 제품은 색상, 맛, 풍미가 양호한 고품질의 햄이다.

[실시예 B-11]

[분말 펩티드]

40% 식품용 대두 펩티드 용액(일본국의 不二製油(주) 제조, 상품명 “Hinute S”) 1중량부에 실시예 A-6의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 2중량부를 혼합하고 플라스틱제 용기에 넣어 50℃에서 감압 건조하고 분쇄하여 분말 펩티드를 제조하였다.

이 제품은 풍미가 양호하여 프리믹스, 냉과 등의 제과용 재료로서 뿐만 아니라 경구 유동식, 경관 유동식 등의 이유식, 치료용 영양제 등으로서 유리하게 이용할 수 있으며, 피부 정화제, 육모제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있다.

[실시예 B-13]

[화장용 크리임]

폴리옥시에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 2중량부, 자기 유화형 글리세릴 모노스테아레이트 5중량부, 실시예 A-2의 방법으로 제조한 비환원성 당질 고함유 분말 2중량부, α-글리코실 루틴 1중량부, 유동 파라핀 1중량부, 글리세릴 트리-2-에틸헥사노에이트 10중량부 및 적당량의 방부제를 통상의 방법에 따라 가열 용해하였다. 여기에 L-락트산 2중량부, 1,3-부틸렌글리콜 5중량부 및 정제수 66중량부를 가하여 오모게나이저로 유화하여 향료를 적당량 가하고 교반하여 크리임을 제조하였다.

이 제품은 항산화성을 가지며 안정성이 높아 고품질의 햇빛 그을음 방지제, 피부 정화제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.

[실시예 B-14]

[고체 제제]

인간의 천연형 인터페론-α 제품(일본국의 (주)林源생물화학연구소 제조, Cosmo Bio(주) 판매)을 통상의 방법에 따라 고정화 항인터페론-α 항체 칼럼에다 가하여 이 제품에 함유된 인간의 천연형 인터페론-α를 흡착시키고, 안정제인 소혈청 알부민을 함유한 완충액을 가한 다음 과잉량의 알부민을 제거한 후, 인간의 천연형 인터페론-α을 실시예 A-5의 방법으로 제조한 고순도 비환원성 당질 분말을 5% 함유하는 생리 식염수를 사용하여 생리 식염수의 pH를 변화시키면서 용출하였다.

이 용출액을 정밀 여과하고 여액을 약 20배량의 무수 결정 말토오스 분말(일본국의 (주)林源상사 판매, 상품명 “FINETOSE”)에 가하여 탈수, 분말화 한 다음, 이것을 타정기에서 타정하여 1정(약 200mg)당 인간의 천연형 인터페론-α를 약 150단위 함유하는 정제를 제조하였다.

이 제품은 설하정 등으로 하여 하루에 성인 1∼10정 정도를 경구 투여하여 바이러스성 질환, 알레르기성 질환, 류머티즘, 당뇨병, 악성 종양 등의 치료에 유리하게 이용할 수 있다. 특히, 근년에 와서 환자수가 급증하고 있는 에이즈, 간염 등의 치료제로서 유리하게 이용할 수 있다. 이 제품은 본 발명의 비환원성 당질과 무수 결정 트레할로오스가 함께 인간의 천연형 인터페론-α의 안정제로서 작용하여 실온에서 방치하더라도 그 활성을 장기간 잘 유지한다.

[실시예 B-15]

[당의정]

중량 150mg의 소정(素錠)을 심제(core)로 하고, 여기에 실시예 A-6의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 40중량부, 풀룰란(평균 분자량 200,000) 중량부, 물 30중량부, 탈크 25중량부 및 산화 티탄 3중량부로 된 용액을 코우팅하여 정제 중량이 약 230mg 되게 한 다음 동일한 트레할로오스 함수 결정 분말 65중량부, 풀룰란 1중량부 및 물 34중량부로 된 용액을 사용하여 코우팅한 후 왁스액으로 광택을 나게 해서 외관이 우수한 당의정을 제조하였다.

이 제품은 내충격성도 우수하며 고품질을 장기간 유지한다.

이상에서 명백한 바와 같이 본 발명의 신규 비환원성 당질 생성 효소는 온화한 효소 반응 조건하에서 환원성의 전분 부분 가수분해물을 그 글루코오스 중합도를 변화시킴이 없이 비환원성 당질로 고수율로 변환한다. 이 비환원성 당질의 분리, 정제도 용이하고, 이와 같이 하여 제조되는 비환원성 당질, 이것을 함유한 저환원성 당질 및 이들로부터 제조되는 트레할로오스는 안전성이 우수하고 양질의 고품위 감미를 가지고 있다. 그리고, 경구 섭취에 의하여 소화 흡수되어 칼로리원으로 된다. 비환원성 당질, 이것을 함유한 저환원성 당질 및 이들로부터 제조되는 트레할로오스는 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물의 제조에 유리하게 이용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 확립은 값싸고 무한한 자원이 전분에서 유래하는 전분 부분 가수분해물로부터, 종래 필요는 하였으나 쉽사리 제조할 수 없었던 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질, 이것을 함유한 저환원성 당질 및 이들로부터 용이하게 제조되는 트레할로오스를 공업적으로 대량으로 값싸게 공급할 수 있는 아주 새로운 길을 개척하게 되어, 이것이 미치는 영향의 크기는 전분 과학, 효소 과학, 생화학 등의 학문 분야에는 말할 것도 없고, 특히 식품, 화장품, 의약품 분야는 물론이고 농수축산업, 화학 공업에도 미쳐 이들 산업계에 미치는 공업적 의의는 헤아릴 수 없다 하겠다.

Claims

환원성 전분 부분 가수분해물에 작용시킬 경우 이로부터 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성하고, 상기 미생물의 리조븀속, 아르드로박터속, 브레비박테리움속, 플라보박테리움속, 미크로코커스속, 쿠르토박테리움속, 마이코박테리움속, 테라박터속 및 이들의 돌연변이체로 된 군으로부터 선택되는 미생물로부터 수득되며, 아래의 물리화학적 성질을 가진 효소, (1) 작용 : 글루코오스 중합도 3이상에서 선택되는 1종 이상의 환원성 전분 부분 가수분해물로부터 말단에 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성함; (2) 분자량 : SDS-PAGE(소디움 도데실술페이트-폴리아크릴아미트겔 전기 영동법)에 의하여 약 76,000±87,000 돌턴; (3) 등전점(pI) : 양쪽성 전해질 함유 전기 영동법에서 약 3.6±4.6; (4) 최적 온도 : pH 7.0 및 60분간 배양에서 약 35℃∼40℃; (5) 최적 pH : 40℃ 및 60분간 배양에서 약 6.4∼7.2; (6) 열적 안정성 pH 7.0에서 60분간 유지하여 약 35℃∼40℃ 부근까지 안정; (7) pH 안정성 : 25℃에서 16시간 유지하여 pH 약 5.5∼11.0에서 안정.
제1항에 있어서, 상기 비환원성 당질에서의 트레할로오스 구조가 말단에 위치하고, 상기 환원성 전분 부분 가수분해물은 글루코오스 중합도 3이상인 1종 이상의 환원성 전분 부분 가수분해물인 것을 특징으로 하는 효소.
제1항에 있어서, 비환원성 당질 생성 효소가 미생물 유래의 효소인 것을 특징으로 하는 효소.
제1항에 있어서, 부분 아미노산 배열로서 (1) X₁-아르기닌-트레오닌-프롤린-X₂-세린-트레오닌-티로신-아르기닌-로이신-(단, X₁은 발린 또는 메티오닌을 의미하고, X₂는 알라닌 또는 발린을 의미함); (2) 글리신-발린-글루탐산-아스파르트산-트레오닌-알라닌-페닐알라닌-페닐 알라닌-아르기닌-티로신-; (3) 로이신-발린-글루타민-로이신-트레오닌-메티오닌-프롤린-글리신-발린-프롤린-; 및 (4) 글루탐산-글리신-아르기닌-X₃-세린-X₄-티로신-알라닌-X₅-알라닌-(단, X₃은 글리신 또는 글루탐산을 의미하고, X₄는 프롤린 또는 아르기닌을 의미하며, X₅는 발린 또는 글루탐산을 의미함); 으로 된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 부분 아미노산 배열을 가지는 효소.
제2항에 있어서, 상기 비환원성 당질은 아래 일반식으로 나타내어지는 α-글리코실 트레할로오스인 효소. Gn-T(위의 식에서 G는 글루코오스 잔기를 의미하고, n은 1이상의 정수이며, T는 α,α-트레할로오스 잔기를 의미함).
환원성 전분 부분 가수분해물로부터 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성하는 비환원성 당질 생성 효소 생산능을 가진 미생물을 영양 배지에서 배양하고, 수득한 배양물로부터 상기 비환원성 당질 생성 효소를 회수하는 것을 특징으로 하는 제1항의 효소의 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 미생물이 리조븀속, 아르드로박터속, 브레비박테리움속, 플라보박테리움속, 미크로코커스속, 쿠르토박테리움속, 마이코박테리움속, 테라박터속 및 이들의 돌연변이체로 된 군으로부터 선택되는 미생물인 제조 방법.
미생물이 리조븀속 및 아르드로박터속으로 된 군으로부터 선택되는 미생물인 것을 특징으로 하는 제1항의 효소의 생산능을 가진 미생물.
제8항에 있어서, 리조븀속의 상기 미생물이 리조븀 sp. M-11(FERM BP-4130)인 미생물.
제8항에 있어서, 아르드로박터속의 상기 미생물이 아르드로박터속 sp. Q36(FERM BP-4316)인 미생물.
제1항의 효소를 환원성 전분 부분 가수분해물을 함유하는 용액에 작용시키는 단계를 포함하는 환원성 전분 부분 가수분해물의 환원력 감소 방법.
제11항에 있어서, 상기 전분 부분 가수분해물이 글루코오스 중합도 3이상인 1종 이상의 환원성 전분 부분 가수분해물인 것을 환원력 감소 방법.
(가) 청구범위 제1항의 효소를 환원성 전분 부분 가수분해물을 함유한 용액에 작용시켜 비환원성 당질을 생성시키고, (나) 환원성 전분 부분 가수분해물 공존하에 또는 부재하에 상기 비환원성 당질을 회수하여 수득됨을 특징으로 하는, 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 비환원성 당질의 트레할로오스 구조가 말단에 위차한 제조방법.
제14항에 있어서, 비환원성 당질이 아래 일반식으로 나타내어지는 α-글리코실 트레할로오스인 제조방법. Gn-T(위의 식에서 G는 글루코오스 잔기를 의미하고, n은 1이상의 정수이며, T는 α,α-트레할로오스 잔기를 의미함).
제13항에 있어서, 상기 환원성 전분 부분 가수분해물이 글루코오스 중합도 3이상인 1종 이상의 환원성 전분 부분 가수분해물인 제조방법.
(가) 청구범위 제1항의 효소를 환원성 전분 부분 가수분해물을 함유한 용액에 작용시켜 비환원성 당질을 생성시키고, (나) 상기 비환원성 당질을 회수하여, (다) 식품, 화장품, 의약품 사료 또는 이를 애완동물 먹이의 재료에 함유시키는 것을 특징으로 하는, 청구범위 제13항의 비환원성 당질을 함유하는 조성물의 제조방법.
(가) 청구범위 제1항의 효소를 환원성 전분 부분 가수분해물을 함유한 용액에 작용시켜 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성시키고, (나) 수득한 비환원성 당질에 글루코아밀라아제 또는 α-글루코시다아제를 작용시켜 트레할로오스를 생성시킨 다음, (다) 수득한 트레할로오스를 회수함을 특징으로 하는 트레할로오스의 제조방법.
제18항에 있어서, (나) 단계에는 상기 트레할로오스를 결정화하는 단계를 추가로 포함하는 제조방법.
제19항에 있어서, 상기 트레할로오스가 트레할로오스 함수 결정 또는 무수 트레할로오스 결정인 제조방법.
제18항에 있어서, (나) 단계에서 수득한 혼합물을 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피 처리하여 트레할로오스의 함량을 증가시킴을 특징으로 하는 제조방법.
제18항에 있어서, 상기 비환원성 당질의 트레할로오스 구조가 말단에 위치한 제조방법.
제22항에 있어서, 상기 비환원성 당질이 아래 일반식으로 나타내어지는 α-글루코실 트레할로오스인 트레할로오스. Gn-T(위의 식에서 G는 글루코오스 잔기를 의미하고, n은 1이상의 정수이며, T는 α,α-트레할로오스 잔기를 의미함).
제18항에 있어서, 상기 환원성 전분 부분 가수분해물이 글루코오스 중합도 3이상인 1종 이상의 환원성 전분 부분 가수분해물인 제조방법.
(가) 청구범위 제1항의 효소를 환원성 전분 부분 가수분해물을 함유한 용액에 작용시켜 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성시키고, (나) 수득한 비환원성 당질에 글루코아밀라아제 또는 α-글루코시다아제를 작용시켜 트레할로오스를 생성시킨 다음, (다) 수득한 트레할로오스를 식품, 화장품, 의약품, 사료 혹은 애완동물 먹이의 재료에 첨가하여 수득되는, 트레할로오스 함유 조성물의 제조방법.
제25항에 있어서, (나) 단계에 트레할로오스를 결정화하는 단계를 추가로 포함하는 제조방법.
제26항에 있어서, 상기 트레할로오스가 트레할로오스 함수 결정 또는 무수 트레할로오스 결정인 제조방법.
제25항에 있어서, (나) 단계에서 수득한 혼합물을 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 칼로마토그래피 처리하여 트레할로오스의 함량을 증가시키는 제조방법.
제25항에 있어서, 상기 비환원성 당질의 트레할로오스 구조가 말단에 위치한 제조방법.
제29항에 있어서, 트레할로오스 구조를 가진 상기 비환원성 당질이 아래 일반식으로 나타내어지는 α-글루코실 트레할로오스인 제조방법. Gn-T(위의 식에서 G는 글루코오스 잔기를 의미하고, n은 1이상의 정수이며, T는 α,α-트레할로오스 잔기를 의미함).
제25항에 있어서, 상기 환원성 전분 부분 가수분해물이 글루코오스 중합도 3이상인 1종 이상의 환원성 전분 부분 가수분해물인 제조방법.