KR100379784B1 - 비환원성당질과그제조방법및용도 - Google Patents

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Abstract

글루코오스 중합도 3 이상인 환원성 전분 부분 분해물을 함유하는 영양 배지에서 비환원성 당질 생성 효소 산생능이 있는 미생물을 배양하여 α-글리코실트레할로오스, α-글리코실 α-글리코시드 및 트레할로오스 등의 비환원성 당질을 쉽사리 제조한다. 배지중에서 또는 배지없이 환원성 전분 부분 분해물에 전분 지절 효소 및/또는 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제를 작용시켜 이들 당질의 수율을 현저하게 높일 수 있다. 수득한 비환원성 당질 또는 저환원성 당질은 공통적으로 온화한 상품의 감미도 외에 소요의 성질을 가지고 있으므로 음식물, 화장품, 의약품 등의 조성물에 광범위하게 사용할 수 있다.

Description

비환원성 당질과 그 제조 방법 및 용도{NON-REDUCING SACCHARIDE AND ITS PRODUCTION AND USE}
본 발명은 비환원성 당질과 그 제조 방법 및 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 글루코오스 중합도 3 이상인 1 종 이상의 환원성 전분 부분 가수분해물을 함유하는 영양 배지에서 비환원성 당질 생성 효소를 생성할 수 있는 미생물을 배양하여 수득되는 비환원성 당질 및 이것을 함유하는 저환원성 당질과 그 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
글루코오스로 구성된 비환원성 당질로서 옛날 부터 트레할로오스 (α,α-트레할로오스) 가 알려져 있는데, 문헌 [Advances in Carbohydrate Chemistry, Vol. 18, pp.201∼225 (1963), published by Academic Press, USA 및 Applied and Environmental Microbiology, Vol. 56, pp. 3,213∼3,215 (1990)] 에 기재되어 있는 바와 같이 그 함량은 소량이지만 미생물, 버섯, 곤충 등에 광범위하게 발견되고 있다. 트레할로오스와 같은 비환원성 당질은 아미노산이나 단백질 등의 아미노기를 가진 물질과 아미노카르보닐 반응을 하지 않기 때문에 이들은 아미노산 함유 물질을 열화 (劣化) 하지도 않고 변질시키지도 않는다. 따라서, 이들 당질은 갈변이나 열화 (劣化) 의 우려가 없이 이러한 물질들을 이용, 가공할 수 있는 것으로 기대되어 그 공업적 제조 방법의 확립이 요망되고 있다.
종래의 트레할로오스 제조 방법으로서는, 예컨대 일본국 특허 공개 제 154,485/75 호 공보에 개시 (關示) 되어 있는 미생물 균체를 이용하는 방법과, 말토오스 포스포릴라아제와 트레할로오스 포스포릴라아제와의 조합에 의하여 말토오스를 변환하는 방법 등이 알려져 있다. 그러나, 미생물 균체를 사용하는 전자의 방법은 이 균체를 출발 원료로 하여 여기에 함유되는 트레할로오스의 함량이 통상적으로 고형물당 15 w/w % (이하, 본 명세서에서는 별달리 명세하지 않는 한 " w/w % " 을 간단히 " % " 로 약칭한다) 이하로서 낮고, 그 외에 이것을 추출, 정제하는 공정이 번잡하여 공업적 제조 방법으로서는 적당하지 않다. 한편, 말토오스 포스포킬라아제와 트레할로오스 포스포릴라아제를 사용하는 후자의 방법은 어느것이나 글루코오스-1-포스페이트를 경유하여 트레할로오스를 생성 시키고 있으므로 기질인 말토오스를 비교적 고농도로 사용할 수 없고, 동일한 반응계에서 이들 두가지 효소가 가역적으로 작용하므로 목적물인 트레할로오스의 수율이 낮으며, 이들 효소의 반응계를 안정하게 유지하여 반응을 원활하게 진행시키는 것이 곤란하여 아직 공업적 제조 방법으로서 실현되지 않고 있다.
트레할로오스의 제조에 관해서는 문헌 [Monthly Food Chemicals, " 전분 이용 개발의 현상과 과제 ", August, pp. 67∼72 (1992)의 " 올리고당 " 의 항] 에서 " 트레할로오스에 대해서는 현저하게 넓은 응용 범위가 고려될 수 있으나 이 당의 전분 당질로 부터의 직접 당전이 반응 또는 가수분해 반응을 이용한 효소적 생산은 현재로서는 학술적으로 불가능하다고 할 수 있다 " 라고 기재되어 있는 바와 같이, 전분을 원료로하여 효소 반응에 의해 트레할로오스를 제조한다는 것을 학술적으로도 불가능한 것으로 생각하고 있었다.
한편, 전분을 원료로 하여 제조되는 전분 부분 가수분해물, 예컨대 액화 전분, 덱스트린, 말토올리고당 등은 통상 그 분자의 말단에 환원기를 가져 환원성을나타내는 것이라 알려져 있다. 이와 같은 전분 부분 가수분해물을 본 명세서에서는 이후부터는 " 환원성 전분 부분 분해물 " 이라 한다. 일반적으로, 이러한 환원성 전분 부분 분해물의 환원력을 DE (Dextrose Equivalent) 값으로 나타내고 있다. 이 값이 큰 것은 통상 분자량이 적고 저점도이며 감미가 강한 것이기는 하나 반응성이 강하고 아미노산과 단백질 등의 아미노기를 가진 물질과 쉽사리 아미노카르보닐 반응을 일으켜 갈변하여 악취를 발생하고 쉽사리 품질을 열화하는 성질이 있다는 것이 알려져 있다.
이와 같은 환원성 전분 부분 분해물의 여러가지 특성은 DE 값의 대소에 의존하고 있고 환원성 전분 부분 분해물과 DE 와의 관계는 극히 중요하다. 종래 당업계에서는 이 관계를 단절시킨다는 것은 불가능하다고 믿고 있었다.
환원성 전분 부분 분해물과 DE 와의 관계를 단절하는 유일한 방법은 환원성 전분 부분 분해물을 고압 수소 첨가법에 의하여 그 환원성 말단기를 당알코올로 변환시켜 비환원성 당질로 하는 방법이다. 그러나, 이 방법은 고압 오토 클레이브를 필요로 하고 다량의 수소와 에너지를 소비할 뿐만아니라 방재상으로 안전 시설과 세심한 관리를 필요로 하고 있다. 그 외에 수득되는 당알코올은 원료인 환원성 전분 부분 분해물이 글루코오스만으로 되어 있는데 대하여 클루코오스와 소르비톨로 구성되어 있는 점에서 상이하며, 이것을 섭취함으로써 일과성이기는 하지만 소화 불량, 설사 등의 증상을 일으킬 우려도 있다. 따라서, 환원성 전분 부분 분해물의 구성 당인 글루코오스를 변화시키지 않고 그 환원력을 감소시키거나 소멸시키는 방법의 확립이 크게 요구되고 있다.
이들 문제를 해결하기 위하여 본 발명자들은 일본국 특허 출원 제 349,216/93 호에서 클루코오스 중합도 3 이상인 환원성 전분 부분 분해물로 부터 말단에 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질을 생성할 수 있는 신규의 비환원성 당질 생성효소 (이하, " 비환원성 당질 생성 효소 " 라 함) 를 개시함으로써 분자의 말단에 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질과 이를 함유한 저환원성 당질 및 이들 비환원성 당질 생성 효소를 사용하여 이들 당질로 부터 트레할로오스를 제조하는 방법을 확립하였다.
또한, 본 발명자들은 일본국 특허 출원 제 79,291/94 호에서 클루코오스 중합도 3 이상인 비환원성 당질의 트레할로오스 부분과 기타 부분과의 사이의 결합을 특이적으로 가수분해하는 신규의 트레할로오스 방출 효소 (이하, " 트레할로오스 방출 효소 " 라 함) 를 개시하였고, 아울러 비환원성 당질 생성 효소와 트레할로오스 방출 효소를 병용함으로써 트레할로오스를 고수율로 제조할 수 있는 방법을 확립하였다. 그러나, 나중에 발견된 사실로서는 불행하게도 이 방법은 미생물의 배양에 의한 효소의 생산, 이 효소의 회수 및 환원성 전분 부분 분해물을 비환원성 당질로 전환하기 위한 효소 반응 등에 장시간을 필요로 한다는 점이었다.
따라서, 환원성 전분 부분 분해물로 부터 비환원성 당질을 간편한 방법으로 제조할 수 있는 방법과 이들 효소의 제조 방법의 확립이 크게 요망되고 있다.
본 발명은 환원성 전분 부분 분해물로 부터 비환원성 당질을 짧은 처리시간에 고수율로 제조할 수 있는 신규의 제조 방법과 그 용도를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명자 등은 상기 과제를 해결하기 위하여 비환원성 당질 생성 효소를 생산 할 수 있는 미생물의 배양과 이 미생물로 부터의 효소의 제조 방법을 예의 연구 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 이들 미생물이 배양 초기단계에서 효소를 생산하였고, 더욱이 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해를 1 종 이상을 배양 도중에 배지에 가하여 주면 비환원성 당질이 용이하게 생성되어 축적된다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
더욱 구체적으로는, 본 발명은 클루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해물 1 종 이상을 함유하는 영양 배지에서 비환원성 당질 생성 효소 산생능(産生能) 이 있는 미생물을 배양함으로써 수득되는 비환원성 당질 또는 이를 함유한 저환원성 당질을 확립함과 아울러 이들의 제조 방법과 그 용도를 확립함에 있다. 본 발명에서 바람직한 환원성 전분 부분 분해물은 영양 배지 존재하 또는 부재하에 액화 전분에 전분 지절 (技切) 효소 및/또는 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제를 작용시켜 수득되는 것들인 반면, 비환원성 당질 생성 효소와 트레할로오스 방출 효소의 산생능이 있는 미생물은 트레할로오스 제조에 있어서 바람직한 미생물이라는 것을 발견하였다. 비환원성 당질 및 이를 함유한 저환원성 당질은 안정성이 크고 취급이 용이하기 때문에 음식물, 화장품 및 의약품 등을 비롯한 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.
먼저, 본 발명에서 사용되는 비환원성 당질 생성 효소는 클루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해물 1종 이상으로 부터 α-글리코실 트레할로오스를 생성할 수 있는 것들인데, 이러한 효소의 예로서는 리조븀속 (Rhizobium屬), 아르드로박터속 (Arthrobacter屬), 브레비박테륨속 (Brevibacterium屬), 플라보박테륨속 (Flavobacterium屬), 미크로코커스속 (Micrococcus屬), 쿠르토박테륨속 (Curtobacterium屬), 테라박테륨속 (Terrabacterium屬) 등에 속하는 미생물들이 있으며, 이들은 일본국 특허 출원 제 349,216/93 호에 개시되어 있다. 트레할로오스 방출 효소는 클루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해물 1 종 이상에 비환원성 당질 생성 효소를 작용시켜 생성시킨 α-클리코실 트레할로오스에서의 트레할로오스 부분과 기타 부분과의 사이의 결합을 특이적으로 가수분해하는 것들이데, 이러한 효소의 예로서는 리조븀속, 아르드로박터속, 브레비박테륨속 및 미크로코커스속 유래의 것들이 있으며, 이들은 일본국 특허 출원 제 79,291/94 호에 개시되어 있다.
본 발명의 미생물의 배양에 사용하는 영양 배지는 미생물이 생육할 수 있고 비환원성 당질 생성 효소를 생산할 수 있는 영양 배지로서, 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해물 1 종 이상을 비환원성 당질 생성 효소를 산생하기 위한 기질로서 함유하고 있는 배지이면 어느것이라도 좋다. 필요에 따라서는 예컨대 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 당밀 등의 당류, 그리고 시트르산, 숙신산, 이들의 염 등의 유기산를 포함한 기타 탄소원과 병용하는 것도 마음데로 실시할 수 있다. 배지에서의 환원성 전분 부분 분해물의 바람직한 농도는 비교적 높은데, 특히 3 w/v % 이상, 바람직하게는 5∼40 w/v %, 보다 바람직하게는 약 10∼30 w/v % 이다. 질소원으로서는 예컨대 암모늄 염, 질산 염 등의 무기 염과, 우레아, 콘 스티프리커, 카제인, 펩톤, 효모 엑스,육 (肉) 엑스 등의 유기 질소 화합물이 사용된다. 또한, 미네랄 성분으로서는 예컨대 칼슘 염, 마그네슘 염, 칼륨 염, 나트륨 염, 인산 염, 망간 염, 아연 염, 철 염, 구리 염, 몰리브덴 염, 코발트 염 등이 적절히 사용된다. 필요에 따라서는 아미노산, 비타민 등도 적절히 사용된다.
배양은 통상적으로 4∼40℃, 바람직하게는 20∼37℃ 및 pH 4∼10, 바람직하게는 pH 5∼9 에서 호기적 조건하에 실시한다. 배양 시간은 미생물이 증식할 수 있는 시간 이상의 시간이면 좋고, 예컨대 10∼100 시간이다. 그리고, 배양액의 산소 농도에는 특히 제한은 없으나 통상은 0.5∼20 ppm 이 바람직하다. 따라서, 통기량을 조절하거나 교반하거나 통기에 산소를 추가하거나, 또한 퍼어멘터 (fermenter) 내의 압력을 높이는 등의 수단을 채용할 수 있다. 또한, 배양 방식은 뱃치식 (batchwise) 배양 또는 연속식 배양중 어느것이라도 좋다.
글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해물 1 종 이상을 함유한 영양 배지에서의 비환원성 당질 생성 효소 산생능이 있는 미생물을 배양하여 비환원성 당질을 생성, 축적시킨다. 배양 도중 필요에 따라서는 영양 배지에 비환원성 당질 생성 효소 또는 트레할로오스 방출 효소를 보충하여 비환원성 당질의 생성을 촉진시키거나 트레할로오스를 생성, 축적시키는 것도 유리하다. 또한, 배양 도중 영양 배지에 음이온 및/또는 비이온 계면 활성제 등의 계면 활성제 및/또는 난백 (egg white) 리소자임 등의 세포 용해 효소를 첨가하여 트레할로오스의 생성 속도를 증가시킬 수도 있다. 이렇게 하여 생성, 축적시킨 비환원성 당질은 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균체를 제거한 액 속에 함유되어 있다.
비환원성 당질을 함유하는 배양액을 종래의 고액 분리법, 예컨대 여과 및 원심분리법으로 처리하여 균체가 제거된 액을 먼저 얻은 다음 농축하고, 활성탄으로 탈색하여 H 형 및 OH 형의 이온 교환 수지로 탈염한 후 종래의 방법으로 다시 농축하여 시럽상 제품을 얻는다. 이들 제품을 더 건조하여 분말을 얻을 수도 있다. 필요에 따라서는 배양물 전부를 사용하여 평막법 (平膜法), 중공 사막법 (中空絲膜法) 등의 막 여과법에 의하여 균체와 단백질, 핵산 등의 가용성 고분자물을 제거하거나 원심분리법으로 불용물을 먼저 제거한 다음 막 여과법에 의해 가용성 고분자물을 제거하고 농축하기 전에 탈색, 탈염하여 정제함으로써 비환원성 당질 및 이를 함유하는 제환원성 당질을 제조하는 것을 유리하게 실시할 수 있다.
효소 활성은 균체와 배양물의 상청액에서 나타나므로 이들을 조효소 (粗酵素) 제품으로 회수하거나 배양물 전체를 조효소 제품으로 사용할 수 있다. 배양물로 부터 균체를 제거하기 위하여 종래의 고액 분리법을 채용한다. 예컨대, 배양물을 원심분리하는 방법, 배양물을 프리코우트 (precoat) 필터를 사용하는 여과법으로 분리하는 방법 및 평막과 중공사막을 사용하는 막 여과법으로 분리하는 방법중에서 임의로 선택할 수 있다. 균체가 제거된 액을 그대로 조효소로 사용할 수 있으나 통상적으로는 농축한 다음 사용한다. 농축 방법으로서는, 예컨대 황산 암모늄 염석법, 아세톤과 알코올을 이용하는 침전법, 평막, 중공사막 등의 막을 이용하는 막 농축법 등을 사용할 수 있다.
제균액과 그 농축물을 공지의 방법으로 고정화 할 수도 있다. 예들 들자면, 이온 교환체에의 결합법, 수지와 막 등과의 공유 결합 또는 흡착법, 고분자 물질을사용한 포괄법 등을 채용할 수 있다. 그리고, 배양물로 부터 분리한 균체도 그대로 조효소로서 사용할 수가 있으나, 이것을 고정화하여 사용하여도 좋다. 예로서 균체를 먼저 알긴산 나트륨과 혼합하여 염화 칼슘 수용액중에 적하해서 입상 (粒狀) 으로 겔화시켜 고정화 한다. 이 입상화물을 다시 폴리에틸린이민 또는 글루타르알데히드로 처리하여 고정화하여도 좋다. 균체로 부터 효소를 추출하고 그 추출액을 조효소액으로 사용할 수도 있다. 예를 들자면, 초음파에 의한 파쇄법, 유리 비이드 (bead) 와 알루미나에 의한 기계적 파쇄법, 프렌치 프레스에 의한 파쇄법 등으로 균체로 부터 효소를 추출하여 원심분리 또는 막 여과등으로 투명한 조효소액을 얻을 수 있다.
이 효소액을 그대로 사용할 수 있으나 공지의 방법으로 다시 정제하여 사용할 수도 있다. 예를 들자면, 배양액의 처리물을 황산 암모늄 염석하여 농축한 조효소 표품 (標品) 을 투석한 후 " DEAE-TOYOPEARL " 을 사용하는 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 이어서 " BUTYL TOYOPEARL" 을 사용하는 소수 (疎水) 칼럼 크로마토그래피, 그 다음에는 " TOYOPEARL HW-55 " 를 사용하는 겔 여과 크로마토그래피 (이들은 모두가 일본국의 Tosoh 사제임) 를 사용하여 정제함으로써 전기 영동적으로 균질한 효소를 얻을 수 있다.
이와 같이 하여 얻은 본 발명의 비환원성 당질 생성 효소는 아래와 같은 물리 화학적 성질을 가진다.
(1) 작용
글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해물 1 종 이상으로 부터α-글리코실 트레할로오스를 생성함.
(2) 분자량
SDS-겔 전기 영동법에서 약 76,000∼87,000 달톤
(3) 등전점
양쪽성 전해질 함유 전기 영동법에서 pI 약 3.6∼4.6
(4) 최적 온도
pH 7.0 에서 60 분간 반응에서 약 35∼40℃
(5) 최적 pH
40℃ 에서 60 분간 반응에서 약 6.4∼7.2
(6) 열적 안정성
pH 7.0 에서 60 분간 인큐베이트하여 35∼40℃ 부근까지 안정
(7) pH 안정성
25℃ 에서 16 시간 인큐베이트하여 pH 약 5.5∼1.0 에서 안정
비환원성 당질 생성 효소의 활성 측정 방법은 다음과 같다. 즉, 기질로서 말토펜타오스 1.25 w/v % (50 mM 인산 완충액, pH 7.0) 4 mℓ에 효소액을 1 mℓ 가하고 40℃ 에서 60 분간 반응시킨 후 100℃ 에서 10 분간 가열하여 반응을 정지시키고, 그 반응액을 탈이온수로 정확히 10 배로 희석하여 그 환원력을 소모기-넬슨법 (Somogyi-Nelson's method) 으로 측정한다. 대조로서, 미리 100℃ 에서 10 분간 가열하여 실활 (失活) 시킨 효소액을 사용하여 위와 마찬가지로 측정한다. 위와 같은 시험조건하에서 효소 1 단위는 1 분간에 1 μmole 의 말토펜타오스에 상당하는 환원력을 감소시키는 효소량으로 정의하였다.
위와 같이 하여 수득한 트레할로오스 방출 효소는 아래의 물리화학적 성질을 가진다.
(1) 작용
α-글리코실 트레할로오스의 트레할로오스 부분과 기타의 부분과의 사이의 결합을 특이적으로 가수분해함.
(2) 분자량
SDS-겔 전기 영동법에서 약 57,000∼68,000 달톤
(3) 등전점
양쪽성 전해질 함유 전기 영동법에서 pI 약 3.3∼4.6
(4) 최적 온도
pH 7.0 에서 30 분간 반응에서 약 35∼45℃
(5) 최적 pH
40℃ 에서 30 분간 반응에서 약 6.0∼7.5
(6) 열적 안정성
pH 7.0 에서 60 분간 인큐베이트하여 30∼45℃ 부근까지 안정
(7) pH 안정성
25℃ 에서 16 시간 인큐베이트하여 pH 약 5.0∼10.0 에서 안정
트레할로오스 방출 효소를 아래와 같은 시험 방법으로 측정한다. 즉, 기질로서 말토트리오실 트레할로오스 또는 α-말토테트라오실 α-D-글루코시드 1.25 w/v% (50 mM 인산 완충액, pH 7.0) 4 mℓ 에 효소액을 1 mℓ 가하고 40℃ 에서 30 분간 반응시킨 후 소모기 구리액 (Somogyi's copper liquid) 을 가하여 반응을 정지시키고, 그 환원력을 소모기-넬슨법으로 측정한다. 대조로서, 미리 100℃ 에서 10 분간 가열하여 실활 (失活) 시킨 효소액을 사용하여 위와 마찬가지로 측정한다. 위와 같은 시험조건하에서 효소 1 단위는 1 분간에 1 μmole 의 글루코오스에 상당하는 환원력을 증가시키는 효소량으로 정의하였다.
본 발명에서 사용하는 전분 지절 효소는 비교적 낮은 DE, 바람직하게는 15 이하의 액화 전분액에 작용하여 전분의 구조내의 측쇄를 가수분해하는 것들인데, 종래의 풀룰라나아제와 이소아밀라아제 및 시판품인 효소 제품을 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명에서의 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제는 비교적 낮은 DE, 바람직하게는 15 이하의 DE 를 가진 액화 전분액에 작용하여 전분당에서의 당전이 반응과 불균등화 (disproportionation) 반응을 일으키는 효소인데, 종래의 바실루스속 및 클렙시엘라속 미생물 유래의 것들과 시판품인 효소 제품을 유리하게 사용할 수 있다.
기타의 효소, 특히 비교적 낮은 DE 를 가진 액화 전분액에 작용하여 클루코오스 중합도 3 이상인 올리고당을 주성분으로 생성하는 효소를 위에 나온 전분 지절 효소 및/또는 시클로말토덱스트린 클루카노트란스퍼라아제와 더불어 유리하게 사용할 수 있다. 이러한 효소의 예로서는 α-아밀라아제, 말토트리오스 생성 아밀라아제, 말토테트라오스 생성 아밀라아제, 말토펜타오스 생성 아밀라아제, 말토헥사오스 생성 아밀라아제 및 말토헵타오스 생성 아밀라아제 등을 들 수 있다.
옥수수 전분, 쌀 전분 및 및 전분 등의 지표상 전분 (terrestrial starch) 과 감자 전분, 고구마 전분 및 타피오카 전분 등의 지하 전분 (subterranean starch) 는 모두 본 발명에서 사용할 수 있다. 이러한 전분을 액화하자면 통상적으로 물속에 바람직하게는 10 % 이상 까지, 보다 바람직하게는 약 20∼50 % 까지 현탁한 다음 가열하고 기계적, 효소적 또는 산에 의해 액화한다. DE 로 나타낸 액화도는 비교적 낮은데, 특히 DE 15 이하, 바람직하게는 10 이하이다. 예컨대, 산으로 액화할 경우에 있어서, 먼저 염산, 인산 또는 옥살산을 사용하고, 이어서 탄산 칼슘, 산화 칼슘 또는 탄산 나트륨을 사용하여 소요의 pH 까지 중화한다. 효소로 액화할 경우에 있어서 α-아밀라아제, 특히 내열성의 액화형 α-아밀라아제가 바람직하다. 필요에 따라서는 글루코오스 중합도 3 이상인 올리고당을 생성하는 위에 나온 아밀라아제를 사용해도 좋다.
이와 같이 하여 제조한 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해물 1 종 이상은 본 발명에 의한 배양시에 비환원성 당질 및 이를 함유한 저환원성 당질의 당질 공급원으로 유리하게 사용할 수 있다. 시판품인 환원성 전분 부분 분해물도 유리하게 사용할 수 있다. 이러한 환원성 전분 부분 분해물을 배지에 첨가하는 시기는 임의로 할 수 있는데, 비환원성 당질이 생성되는 한 배양 전후에 첨가할 수 있다. 연속 배양 또는 반연속 배양의 경우에 있어서 배양도중, 예컨대 비환원성 당질이 생성된 배양액의 일부를 회수하고 환원성 전분 부분 분해물을 함유한 동일 체적의 신선한 영양 배지를 배양액에 보충해준다.
액화 전분에 전분 지절 효소 및/또는 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제를 작용시켜 얻게 되는 환원성 전분 부분 분해물이 가장 적합하다. 따라서, 예컨대 별도로 제조한 환원성 전분 부분 분해물을 함유한 영양 배지 뿐만아니라 전분 지절 효소 및/또는 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제와 더불어 액화 전분을 함유한 영양 배지에서 배양을 유리하게 실시할 수 있다.
효소 사용량은 반응시간을 비롯한 반응조건에 따라 임의로 선택할 수 있다. 통상적으로 기질인 환원성 전분 부분 분해물에 대해 전분 지절 효소를 고형분 g 당 약 1∼2,000 단위를 사용하고 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제는 고형분 g 당 약 0.05∼100 단위를 사용한다. 수득한 비환원성 당질을 함유한 배양액은 전분 지절 효소 및/또는 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제가 액화 전분액에 작용할 때 배양물중의 균체 또는 액체 부분에 존재하는 비환원성 당질 생성 효소 또는 비환원성 당질 생성 효소 및 트레할로오스 방출 효소와 더불어 작용하기 때문에 비교적 분자가 작은 α-글리코실 트레할로오스 및/또는 α-글리코실 α-글리코시드 또는 트레할로오스를 다량으로 함유하는 특징을 가지고 있다. " α-글리코실 α-클리코시드 " 란 용어는 α-D-올리고글루코실 α-D-올리고글리코시드를 포함하는 것인데, 이들은 본 출원인의 일본국 특허 출원 제 54,377/94 호에 개시되어 있다.
수득한 배양액을 통상적인 방법으로 여과, 원심분리 등에 의해 불용물을 제거한 후 활성탄으로 탈색하고, H 형 및 OH 형 이온 교환 수지로 탈염해서 정제하여 농축한 다음 시럽상 제품으로 한다. 더욱이, 건조하여 분말상 제품으로 할 수도 있다. 필요에 따라서는 시럽상 제품을 다시 정제, 예를 들자면 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 활성탄 칼럼 크로마토그래피, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 등의 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획, 알코올과 아세톤 등의 유기 용매에 의한 분별 침전, 적당한 분리 성능을 가진 막에 의한 분리, 더욱이는 효모에 의한 발효 처리, 알칼리 처리 등에 의한 잔존 환원성 당질의 분해 제거 등의 방법을 1 종 또는 2 종 이상 조합하여 정제함으로써 최고순도의 비환원성 당질 제품을 얻는 것도 용이하다.
특히, 공업적 대량 생산 방법으로서는 이온 교환 칼럼 크로마토그래피의 채용이 적합한데, 예들 들자면, 일본국의 특허 공개 제 23,799/83 호 공보, 특허 공개 제 72,598/83 호 공보 등에 개시되어 있는 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의하여 협잡 당류를 제거하고 목적의 비환원성 당질 함량을 향상시킨 저환원성 당질을 유리하게 제조할 수 있다. 이 경우에 있어서, 고정상 방식, 이동상 방식, 의사 (擬似) 이동상 방식중 어느것을 사용하여도 좋다.
분자내에 트레할로오스 구조를 가진 비한원성 당질 또는 이것을 함유하는 저환원성 당질을 필요에 따라, 예컨대 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 글루코 아밀라아제 등의 아밀라아제 또는 α-글루코시다아제로 분해하여 감미성, 환원력 등을 조정하거나 점성을 저하시키며, 또한 수소 첨가하여 잔존하는 환원성 당질을 당알코올로 하여 환원력을 소멸시키는 등의 가공 처리를 할 수도 있다.
특히, 본 발명의 분자내에 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질 또는 이것을 함유하는 저환원성 당질에 대하여 글루코아밀라아제 또는 α-글루코시다아제를 작용시킴으로써 보다 용이하게 트레할로오스를 제조할 수 있다. 즉, 이들 비환원성 또는 저환원성 당질에 글루코아밀라아제 또는 α-글루코시다아제를 작용시켜 트레할로오스와 글루코오스의 혼합 용액으로 하고, 이것을 앞서 나온 정제 방법, 예컨대 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 등으로 글루코오스를 제거하여 트레할로오스 고함유 획분을 채취한 다음, 이것을 정제, 농축하여 시럽상 제품을 얻는 것도, 더욱이 시럽상 제품을 농축하여 과포화 용액으로 하여 결정화시켜 트레할로오스 함수 결정 또는 무수 결정 트레할로오스를 얻는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
트레할로오스 함수 결정을 제조하자면, 예컨대 순도 약 60 % 이상, 농도 약 65∼90% 의 트레할로오스 고함유액을 결정화기에 넣고, 필요에 따라 0.1∼20% 의 종정 (seed crystal) 존재하에 온도 95℃ 이하, 바람직하게는 10∼90℃ 의 범위에서 교반하면서 서서히 냉각하여 트레할로오스 함수 결정을 함유하는 매스키트(massecuite) 를 제조한다. 이 경우에 있어서, 트레할로오스를 감압하에 농축 하면서 결정화하는 연속 결정화법을 유리하게 채용할 수도 있다. 매스키트로 부터 트레할로오스 함수 결정 또는 이것을 함유하는 당질 결정을 제조하는 방법은, 예컨대 결정 분리 방법, 블록 분쇄 방법, 유동 조립 (造粒) 방법, 분무 건조 방법 등 공지의 방법을 사용하면 좋다.
분리법의 경우에는 통상, 매스키트를 바스켓형 원심분리기에서 처리하여 트레할로오스 함수 결정과 모액을 분리하고, 필요에 따라 이 결정에 소량의 냉수를 분무하여 트레할로오스 함수 결정을 세척하여 보다 고순도의 트레할로오스 함수 결정을 용이하게 제조할 수 있다. 분무 건조 방법의 경우에는 통상, 농도 70∼85 %, 결정화율 약 20∼6O % 정도의 매스키트를 고압 펌프로 노즐로 부터 분무하여 결정분말이 용해하지 않는 온도, 예컨대 60∼100℃ 의 열풍으로 건조한 다음 30∼60℃ 의 온풍으로 약 1∼20 시간 숙성하면 비흡습성 또는 난 (難) 흡습성의 당질 결정 혼합물을 용이하게 제조할 수 있다. 블록 분쇄 방법의 경우에는 통상, 수분 10∼20%, 결정화율 10∼60 % 정도의 매스키트를 약 0.1∼3 일간 정치하여 블록상으로 결정화하고, 고화시킨 다음 이것을 분쇄 또는 절삭 등의 방법으로 분말화하여 건조하면 비흡습성 또는 난흡습성의 당질 결정 혼합물을 용이하게 제조할 수 있다.
또한, 무수 결정 트레할로오스를 제조하자면 트레할로오스 함수 결정을 건조하여 무수 상태의 것으로 변환시킬 수도 있으나, 일반적으로는 수분 10 % 미만의 고농도 트레할로오스 고함유 용액을 결정화기에 넣고 종정 존재하에 50∼160℃, 바람직하게는 80∼140℃ 의 범위에서 교반하면서 무수 결정 트레할로오스를 함유하는 매스키트를 제조하고, 이것을 비교적 고온의 건조조건하에서 예컨대 블록 분쇄, 유동 조립 (造粒), 분무 건조 등의 방법으로 결정화하고 분말화하여 무수 결정 트레할로오스를 제조한다.
이와 같이 하여 제조되는 본 발명의 비환원성 당질, 이것을 함유하는 저환원성 당질은 환원력이 낮고 안정하여 기타 소재, 특히 아미노산 및 올리고펩티드, 단백질 등의 아미노산 함유 물질과 혼합 가공하여도 갈변하는 일도 없고 악취를 발생하는 일도 없으며, 혼합한 다른 소재를 상하게 하는 일도 없다. 또한, 이들 당질은 환원력이 낮음에도 불구하고 저점도이고, 평균 글루코오스 중합도가 낮은 것의 경우에는 양질로서 상품의 감미를 가지고 있다.
더욱이, 본 발명의 당질은 아밀라아제, 예컨대 췌장 유래의 α-아밀라아제에의하여 분해되어 비교적 저분자의 비환원성 올리고당이나 저분자의 말토올리고당을 생성하며, 또한 이들 올리고당도 α-글루코시다아제와 소장 효소에 의해서도 용이하게 분해하여 글루코오스와 트레할로오스를 생성한다. 더욱이, 생성된 트레할로오스는 트레할라아제에 의하여 용이하게 글루코오스로까지 분해되므로, 이들 당질은 경구 섭취에 의하여 소화, 흡수되어 칼로리원으로서 이용된다. 본 발명의 당질은 충치 유발균 등에 의하여 발효되기 어려우므로 충치를 일으키기 어려운 감미료로서도 이용할 수 있다. 그리고, 이들 당질은 삼투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 기타 당의 결정화 방지성, 난발효성, 호화 전분의 노화 방지성 등의 소요의 성질을 구비하고 있다.
또한, 본 발명의 트레할로오스는 경관 (經管) 영양제, 수액제 (輪液劑) 등으로 하여 비경구적으로 사용될 경우 독성과 부작용의 우려도 없이 쉽사리 대사되어 이용되므로 생체에 대한 에너지 보급에 유리하게 이용할 수 있다. 그리고, 트레할로오스는 안정한 감미료로 작용하므로 트레할로오스 결정 고함유 제품의 경우에는 풀룰란, 히드록시에틸 전분, 폴리비닐 피롤리돈 등의 결합제와 병용하여 정제 (tablet) 의 당의제로서 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
그리고, 무수 결정 트레할로오스의 경우에는 식품, 의약품, 화장품, 기타 원재료 또는 가공 중간물 등의 함수물의 탈수제로서도 유리하게 이용할 수 있어, 안전하고도 고품질의 분말, 과립, 정제 등 고상물을 용이하게 제조할 수가 있다.
따라서, 본 발명의 비환원성 당질 또는 이것을 함유하는 저환원성 당질은 감미료, 정미 (呈味) 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제, 탈수제 등으로서 음식물, 기호물, 사료, 이료, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명의 비환원성 당질과 이것을 함유하는 저환원성 당질은 그대로 감미 부여를 위한 조미료로서 사용할 수 있다. 필요하다면, 예컨대 분말 시럽, 글루코오스, 말토오스, 수크로오스, 이성화당, 꿀, 메이폴 슈거, 이소말토올리고당, 갈락토올리고당, 프룩토올리고당, 락토수크로오스, 소르비톨, 말리톨, 락티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α-글리코실 스테비오시드, 레바우디오시드, 글리시리진, L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르, 사카린, 글리신 및 알라닌 등과 같은 기타 감미료의 1 종 또는 2 종 이상의 적당량과 혼합해서 사용하여도 좋고, 또한 필요하다면 덱스트린, 전분, 락토오스 등과 같은 증량제와 혼합하여 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 비환원성 당질과 이것을 함유하는 저환원성 당질은 그대로 또는 필요에 따라 증량제, 부형제, 결합제 등과 혼합하여 과립, 구상, 단봉상, 판상, 입방체, 정제 등 각종 형상으로 성형하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 비환원성 당질과 이것을 함유하는 저환원성 당질은 신 맛, 짠 맛, 떫은 맛, 단 맛, 쓴 맛 등의 기타 정미를 가진 각종 물질과 잘 조화하고, 내산성과 내열성도 크므로 일반적인 음식물의 감미 부여 및/또는 정미 개량, 품질 개량 등에 유리하게 사용할 수 있다.
예를 들자면, 이들은 아미노산, 펩티드류, 간장, 분말 간장, 된장, 분말 된장, 모로미, 히시오, 후리카케, 마요네즈, 드레싱, 식초, 산바이주, 초밥용 분말식초, 츄카노 모토, 텐츠유, 멘츠유, 소오스, 켓찹, 야구니쿠 노 타레, 커리 루우, 스튜우스톡, 수우프 스톡, 다시 노 모토, 핵산계 조미료, 복합 조미료, 미린, 신미린, 테이블 슈거, 커피 슈거 등 각종 조미료로서 유리하게 사용할 수 있다.
또한, 이들은 예컨대 센베이, 아라레, 오코시, 아메, 만주, 우이로, 안, 요캉, 미즈요캉, 킹요쿠, 젤리, 카스텔라, 아메다마 등의 일본식 과자 ; 빵, 비스켓, 크래커, 쿠우키, 파이, 푸딩, 버터 크리임, 커스터드 크리임, 크리임 퍼프, 와플, 스폰지 케이크, 도우넛, 초콜렛, 츄잉 검, 카라멜, 캔디 등의 양과자 ; 아이스 크리임, 셔어벳 등의 빙과 ; 과실의 시립 절임, 빙수용 설탕 시럽 등의 시럽류 ; 플라워 페이스트, 피이넛 페이스트, 푸루트 페이스트, 스프레드 등의 페이스트류 ; 잼, 마아멀레이드, 시럽 즈케, 토카 등의 과실과 야채의 가공식품류 ; 푸쿠진즈께, 베타라 츠케, 센마이 즈케, 라쿄 즈케 등의 절임제품류 ; 단무지 프리믹스, 배추 절임 프리믹스 등의 절임 및 절일제품의 프리믹스 ; 햄, 소오세지 등의 축육제품류 ; 어육햄, 어육 소오세지, 어묵, 치쿠와, 튀김 등의 어육제품 ; 성게 내장전, 오징어전, 가공된 다시마, 말린 오징어채, 미린으로 조미된 말린 복어 등의 각종 진미류 ; 김, 산채, 말린 오징어, 소어 (小魚), 조개 등의 츠쿠다니류 ; 볶은 팥, 감자 샐러드, 다시 말이 등의 평상시 식품 : 요구르트, 치이즈 등의 우유 제품 ; 축육, 어육, 과실, 야채 등의 통조림, 병조림 ; 합성주, 와인, 양주 등의 주류 ; 커피, 차, 코코아, 주우스, 탄산 음료, 유산 음료, 유산균 음료 등의 청량 음료수 : 인스탄트 푸딩 믹스, 인스탄트 핫 케이크 밀스, 즉석 시루코, 즉석 수우프 믹스 등의 즉석식품 ; 더욱이 이유식, 치료식, 드링크제, 펩티드 식품, 냉동식품, 건조식품등의 각종 음식물에 대한 감미 부여, 정미 개량, 품질 개량 등에 유리하게 이용할 수 있다.
또한, 가축, 가금, 꿀벌, 누에, 물고기 등의 사육 동물을 위한 사료, 이료 등의 기호성을 향상시킬 목적으로 사용할 수 있다. 그외에 담배, 치약, 입술 연지, 립 크림, 내복액, 정제, 트로치, 간유 드롭, 구중 (口中) 청량제, 구중 향제, 가아글제 등 각종 고형물, 페이스트상, 액상 등으로 하여 기호물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 대한 감미제로서 또는 정미 개량제, 교미제로서, 더욱이는 품질 개량제, 안정제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
품질 개량제, 안정제로서는 유효 성분, 활성 등을 상실하기 쉬운 각종 생리 활성 물질 또는 이것을 함유한 건강 식품, 의약품 등에 품질 개량제와 안정제로서 유리하게 적용할 수 있다. 예를 들자면, 림포카인류 [예 : α-, β- 및 r-인터페론, 종양 괴사인자-α, 종양 괴사인자-β, 대식 세포 유주 (遊走) 저지인자, 콜로니 자극인자, 트랜스퍼 팩터, 인터로이킨 II 등] ; 호르몬류 [예 : 인슐린, 성장 호르몬, 프로락틴, 에리트로포이에틴, 난세포 자극 호르몬 등] ; 생물제제 [예 : BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 폴리오 생백신, 천연두 백신, 파상풍 톡소이드, 반시뱀 (Trimeresurus) 항독소, 인간 면역 글로불린 등] ; 항생물질 [예 : 페니실린, 에리드로마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 황산 카나마이신 등] ; 비타민류 [예 : 티아민, 리보플라빈, L-아스코르브산, 간유, 카로티노이드, 에르고스테롤, 토코페롤 등] ; 효소류 [예 : 리파아제, 엘라스타아제, 우로키나아제, 프로테아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제 등] ; 엑스류 [예 : 약용 인삼 엑스, 자라 엑스, 글로렐라 엑스, 알로에 엑스, 프로폴리스 엑스 등] ; 생균류 [예 : 바이러스, 유산균, 효모 등] ; 기타 생리활성 물질 [예 : 로얄젤리 등] 도 그 유효 성분, 활성을 상실함이 없이 안정하고도 고품질의 액상, 페이스트상 또는 고상의 건강 식품이나 의약품 등에 용이하게 제조할 수 있게 된다.
이상 설명한 각종 조정물에 비환원성 당질 및 이것을 함유한 저환원성 당질을 함유시키는 방법은 그 제품이 완성되기 까지의 공정에서 함유시키면 좋은데, 예를 들자면 혼화, 용해, 융해, 침지, 침투, 살포, 도포, 피복, 분무, 주입, 결정화, 고화 등 공지의 방법이 적절히 선택된다. 그 첨가량은 통상적으로 0.1 % 이상, 바람직하게는 1 % 이상 함유시키는 것이 바람직하다.
이하, 실험에 의하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 먼저, 신규 미생물인 리조븀 sp. M-11 및 아르드로박터 sp. Q36 로 부터 유래되는 비환원성 당질 생성 효소에 대하여 설명한 다음에, 공지의 미생물로 부터의 비환원성 당질 생성 효소에 대하여 설명한다.
실험 1 : 리조븀 sp. M-11 로 부터의 비환원성 당질 생성 효소의 제조
말토오스 2.0 w/v %, 펩톤 0.5 w/v %, 효모 엑스 0.1 w/v %, 인산 수소 2 나트륨 0.1 w/v %, 인산 수소 2 칼륨 0.1 w/v % 및 물로 된 액체 배지를 pH 7.0 으로 조정하였다. 500 mℓ용량의 삼각 플라스크에 이 배지를 약 100 mℓ씩 넣고 오토클레이브에서 120℃ 에서 20 분간 멸균하고 냉각한 다음, 리조븀 sp. M-11 (FERM BP-4130) 의 종배양액 (seed culture) 을 접종하고, 27℃, 130 r.p.m. 에서 24 시간배양한 것을 종배양액으로 하였다.
용량 30 ℓ의 퍼어멘터 (fermenter) 에 위에 나온 종배양의 경우와 동일한 조성의 배지 약 20 ℓ을 넣고 멸균 후 냉각하여 온도 30℃ 로 한 후 종배양액 1 w/v % 을 접종하고 온도 30℃, pH 6.0∼8.0 에서 유지하면서 약 24 시간 통기 교반 배양하였다. 배양액의 효소 활성은 약 1.5 단위/mℓ이었다. 배양액의 일부를 취하여 원심분리하여 균체와 배양 상청액으로 분리하고, 다시 균체를 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 원래의 배양액과 동일한 액량의 현탁액으로 한 후, 균체 현탁액과 배양 상청액의 효소 활성을 측정한 결과, 균체 현탁액에는 약 0.6 단위/mℓ의 효소 활성이, 그리고 배양 상청액에는 약 0.9 단위/mℓ의 효소 활성이 확인되었다.
실험 2 : 효소 정제
실험 1 에서 얻은 배양액 약 18 ℓ을 초고압 균체 파쇄 장치 " MINI-LABO " (일본국 大日本제약 주식회사제) 로 처리하여 함유된 균체를 파쇄하였다. 처리액을 원심분리 (10,000 r.p.m., 30 분간) 함으로써 약 16 ℓ의 상청액을 얻었다. 이 액에 포화도 0.2 가 되도록 황산 암모늄을 용해시키고 4℃ 에서 1 시간 방치한 후 원심분리함으로써 상청액을 회수하였다.
다시 이 액에 포화도 0.6 이 되도록 황산 암모늄을 용해시키고 4℃ 에서 24 시간 방치한 후 원심분리하여 황산 암모늄 염석물을 회수하였다. 수득한 황산 암모늄 염석물을 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 에 용해시킨 후 동일한 완충액에 대하여 24 시간 투석하고 원심분리하여 불용물을 제거하였다. 이 투석액 (360 mℓ) 을 2 회에 나누어 " DEAE-TOYOPEARL" 겔을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 (겔의양 : 300 mℓ) 를 하였다.
" DEAE-TOYOPEARL " 겔에 흡착된 목적의 효소를 식염을 함유한 동일한 완충액으로 칼럼으로 부터 용출하였다. 수득한 효소 활성 획분을 2 M 황산 암모늄을 함유한 동일한 완충액에 대하여 투석하고, 이 투석액을 원심분리하여 불용물을 제거하고 수득되는 상청액을 " BUTYL-TOYOPEARL 650 " 을 사용한 소수 (疏水) 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양 : 300 mℓ) 를 하였다. 흡착된 이 효소를 황산 암모늄 2 M 으로 부터 0 M 까지 감소하는 직선 기울기에 의하여 칼럼으로 부터 용출시켜 효소 활성 획분을 회수한 다음 " TOYOPEARL 칼럼 HW-55 " 겔을 사용한 겔 여과 크로마토그래피 (겔의 양 : 300 mℓ) 를 하여 효소 활성 획분을 회수하였다. 정제의 각 공정에서의 효소 활성, 비활성 (比活性) 및 수율은 표 1 에 나와 있다.
표 1
표 1 의 정제 공정에서 겔 여과 용출액으로서 수득한 정제 효소 제품을 폴리아크릴아미드 겔 (겔 농도 : 7.5 %) 을 사용하는 전기 영동법으로 순도를 검정한결과, 단백질 밴드는 단 하나가 나타났고, 수득한 효소 제품은 전기 영동적으로 단일의 고순도의 것이었다.
실험 3 : 효소의 성질
실험 2 에서 수득한 정제 효소 제품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 (겔 농도 : 10 %) 을 사용하는 전기 영동법으로 처리하고, 동시에 영동 처리된 분자량 마아커(marker) (일본국의 Bio-Rad Laboratories 주식회사제) 와 비교하여 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 77,000∼87,000 달톤이었다.
정제 효소 제품을 2 v/v % " Ampholine " 함유의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 등전점 전기 영동법으로 처리한 후, 겔의 pH 를 측정하여 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 약 3.6∼4.6 이었다.
이 효소 활성에 대한 온도의 영향과 pH 의 영향은 활성 측정 방법에 준하여 조사하였다. 그 결과는 제 1 도 (온도의 영향) 와 제 2 도 (pH 의 영향) 에 각각 나와 있다. 효소의 최적 온도는 pH 7.0 에서 60 분간 반응에서는 40℃ 부근이었고, 최적 pH 는 40℃ 에서 60 분간 반응에서 약 7.0 이었다. 이 효소의 열적 안정성은 효소 용액 (50 mM 인산 완충액을 함유, pH 7.0) 을 각 온도에서 60 분간 유지하고 물로 냉각한 후 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 그리고, pH 안정성은 이 효소를 각 pH의 50 mM 완충액 중에서 25℃ 에서 16 시간 유지한 후 pH 를 7 로 조정하고 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과는 제 3 도 (열적 안정성) 와 제 4 도 (pH 안정성) 에 나와 있다. 이 효소의 열적 안정성은 40℃ 부근까지 안정하였고, pH 안정성은 약 6∼9 이었다.
실험 4 : 비환원성 당질의 제조
기질로서 글루코오스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스 또는 말토헵타오스의 20 % 수용액을 제조하고, 각각에 실험 2 에서 제조한 정제 효소를 기질 고형물 1 g 당 2 단위의 비율로 가하여 40℃, pH 7.0에서 48 시간 작용시킨 후 탈염하고 " WAKO BEADS WB-T-330 " (일본국의 和光純藥공업 주식회사제) 을 사용한 고속 액체 크로마토그래피로 반응 생성물을 분석하였다. 고속 액체 크로마토그래피는 실온하에서 하였고 용리액으로서 물을 유속 0.5 mℓ/min 으로 공급하여 시차 (示差) 굴절계 " Model RI-8012 " (일본국의 Tosoh 주식회사제) 로 반응 생성물을 분석하였다. 그 결과는 표 2 에 나와 있다.
표 2
표 2 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 각각의 반응 생성물은 각각의 잔존 기질과 새로이 생성한 각각의 당질 PI, PII, PIV, PV 로 되어 있고, 그 이외의 당질은 거의 검출되지 않았다. 각각의 생성율은 글루코오스 중합도 4 이상인 당질 PII, PIII, PIV 및 RV 는 85 % 이상의 극히 높은 생성율을 나타낸 반면, 글루코오스 중합도 3 인 당질 PI 은 비교적 낮은 생성율을 나타내는 것임이 판명되었다. 그리고, 글루코오스와 말토오스로 부터는 새로운 당질을 생성하지 않았음이 판명되었다.
각각의 반응 생성물로 부터 새로 생성된 당질을 정제하기 위해 반응 생성물을 탈색, 탈염, 농축 후, 나트륨형 강산성 양이온 교환 수지 (" XT-1016 ", 가교도 4 %, 일본국 東京유기화학공업 주식회사제) 를 사용한 칼럼 분획을 하였다. 수지를 내경 2.0 cm, 길이 1 m 의 자켓부 스테인레스제 칼럼 3 개에 충전하고 직렬로 연결하여 칼럼내의 온도를 55℃ 로 유지하면서 반응 생성물을 수지에 대하여 5 v/v % 가하였다. 여기에 55℃ 의 온수를 SV (공간 속도) 0.13 으로 흘려서 분획하여 새로이 생성한 당질 함량 97 % 이상의 고순도 획분을 회수하였다. 수득한 고순도 획분을 동결 건조하여 각각 고순도 당질 제품을 제조하였다. 기질 원료에 대한 수율은 고형물 환산으로 각각 PI 에서 약 9 %, PII 에서 약 65 %, PIII 에서 약 82 %, PIV 에서 약 80 %, PV 에서 약 77 %이었다. 순도는 각각 PI 에서 97.5 %, PII 에서 98.6 %, PIII 에서 99.5 %, PIV 에서 98.4 %, PV 에서 98.4 % 이었다.
또한, 이들 새로 생성된 고순도 당질 제품의 환원력을 소모기-넬슨법으로 측정하여 DE 로 나타내었다. 그 결과는 표 3 에 나와 있다.
표 3
표 3 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 각 당질 제품에서 약간 정도의 환원력 밖에 나타나지 않았다. 이러한 약간 정도의 환원력은 제품중에 잔존하고 있는기질 유래의 환원성 말토올리고당에서 기인하는 것으로 추정되고, 새로이 생성한 당질은 어느 것이나 실질적으로 비환원성이라고 판단된다.
실험 5 : 메일라아드 반응 (Maillard reaction)
실험 4 에서 제조한 당질 제품 PI, PII, PIII, PIV 또는 PV 10 % 와 글리신 1 % 및 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 을 함유하는 용액을 100℃ 에서 90 분간 유지하고 냉각한 후 이 용액의 480 nm 및 1 cm 셀에서의 흡광도를 측정하였다. 대조로서 각각의 원료인 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스 및 말토헵타오스를 사용하여 위와 마찬가지로 처리하여 480 nm 에서의 흐광도를 측정하였다. 그 결과는 표 4 에 나와 있다.
표 4
표 4 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 새로이 생성한 비환원성 당질 제품PI, PII, PIII, PIV, PV 중 어느 것이나 메일라아드 반응 (Mailard reaction) 에 의한 착색도는 극히 낮고, 각각 원료의 기질인 말토올리고당의 착색도의 3∼6 % 에 불과하여 본 발명의 신규 효소에 의하여 생성하는 비환원성 당질은 메일라아드 반응을 거의 나타내지 않는 당질임이 판명되었다.
실험 6 : 클루코아밀라아제에 의한 효소 분해
실험 4 에서 제조한 비환원성 당질 제품 PI, PII, PIII, PIV 또는 PV 각각 50 mg 을 50 mM 아세트산 완충액 (pH 4.5) 1 mℓ 에 용해하고 1 단위의 글루코아밀라아제 (일본국의 生化學 공업 주식회사제)를 가하여 40℃ 에서 6 시간 유지하여 효소 분해하였다. 수득한 분해물을 고속 액체 크로마토그래피로 분석한 결과 어느것이나 분해물로서 글루코오스와 트레할로오스만이 검출되었다. 검출된 클루코오스 함량, 트레할로오스 함량 및 그 조성 몰비의 결과는 표 5 에 나와 있다.
표 5
표 5 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 클루코아밀라아제에 의하여 비환원성 당질 PI 은 글루코오스 1 분자와 트레할로오스 1 분자로 분해되고, 비환원성 당질PII 는 글루코오스 2 분자와 트레할로오스 1 분자로 분해되며, 비환원성 당질 PIII 는 글루코오스 3 분자와 트레할로오스 1 분자로 분해되고, 비환원성 당질 PIV 는 글루코오스 4 분자와 트레할로오스 1 분자로 분해되며, 그리고 비환원성 당질 PV 는 글루코오스 5 분자와 트레할로오스 1 분자로 각각 분해 되었음이 판명되었다.
또한, 글루코아밀라아제의 효소 반응 특성을 고려하면 이들 비환원성 당질의 구조는 트레할로오스 분자에 글루코오스 분자가 α-1,4 결합 또는 α-1,6 결합으로 결합한 당질로서, 각각 PI 는 트레할로오스 1 분자에 글루코오스 1 분자가 결합한 글루코오스 중합도 3 의 비환원성 당질이고, PII 는 트레할로오스 1 분자에 글루코오스 2 분자가 결합한 글루코오스 중합도 4 의 비환원성 당질이며, PIII 은 트레할로오스 1 분자에 글루코오스 3 분자가 결합한 글루코오스 중합도 5 의 비환원성 당질이고, PIV 는 트레할로오스 1 분자에 글루코오스 4 분자가 결합한 글루코오스 중합도 6 의 비환원성 당질이며, PV 는 트레할로오스 1 분자에 글루코오스 5 분자가 결합한 글루코오스 중합도 7 의 비환원성 당질이다. 그리고, 위와 마찬가지로 β-아밀라아제를 작용시켰을 때 비환원성 당질 PI 과 PII 는 분해되지 않고 비환원성 당질 PIII 은 말토오스 1 분자와 PI 1 분자로 분해되고, 비환원성 당질 PIV 는 말토오스 1 분자와 PII 1 분자로 분해되며, 비환원성 당질 PV 는 말토오스 2 분자와 PI 1 분자로 분해됨이 판명되었다.
이상의 결과로 부터 본 발명의 비환원성 당질 생성 효소에 의한 반응은 기질의 저분자화와 고분자화를 수반하지 않는, 환언하자면 글루코오스 중합도의 변화를 수반하지 않는 일종의 분자내 변환 반응이라 판단되고, 또한 이 비환원성 당질 생성 효소에 의해 생성된 비환원성 당질 PI, PII, PIII, PIV 및 PV 는 각각 α-글루코실 트레할로오스, α-말토실 트레할로오스, α-말토트리오실 트레할로오스, α-말토테트라오실 트레할로오스 및 α-말토펜타오실 트레할로오스 등의 일반식 " α-글리코실 트레할로오스 [Gn-T, 여기서 " G " 는 글루코오스 잔기, n 은 1 이상의 정수, T 는 α, α-트레할오스 잔기임] " 으로 공통적으로 나타낼 수 있는 것으로 판단된다.
실험 7 : 기타 효소에 의한 가수분해
실험 4 에서 제조한 비환원성 당질 제품 PI, PII, PIII, PIV 및 PV 각각을 기질로 하여 돼지 췌장 유래의 α-아밀라아제 (Sigma 사 판매), 쌀 유래의 α-글루코시다아제 (Sigma사 판매) 또는 래트 소장 아세톤 분말 효소(Sigma 사 판매) 각각에 작용시킨 후 수득한 분해물의 당 조성을 고속 액체 크로마토그래피로 분석하였다. α-아밀라아제의 반응은 각각의 기질 10 mg 을 50 mM 인산 완충액 (pH 6.9) 1 mℓ에 용해하고 여기에 α-아밀라아제 1 단위를 가하여 37℃ 에서 18 시간 유지하여 실시하였다. α-글루코시다아제의 반응은 50 mM 아세트산 완충액 (pH 4.0) 을 사용한 이외는 α-아밀라아제의 경우와 마찬가지의 조건에서 실시하였다. 래트 소장 아세톤 분말 효소의 경우도 50 mM 말레산 완충액 (pH 6.0) 을 사용한 이외는 α-아밀라아제의 경우와 마찬가지 조건에서 실시하였다. α-아밀라아제에 의한 분해물의 당 조성을 표 6 에, α-글루코시다아제와 래트 소장 아세톤 분말 효소에 의한 분해물의 당 조성을 표 7 과 표 8 에 각각 나타내었다.
표 6
표 7
표 8
표 6 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 당질 제품인 PI 및 PII 은 α-아밀라아제에 의하여 거의 분해되지 않으나, 당질 제품인 PIII 과 PIV 및 PV 는 α-아밀라아제에 의하여 저분자의 올리고당, 즉 PI, PII, 말토트리오스, 말토오스 및 글루코오스로 까지 가수분해되었다는 것을 알 수 있다.
그리고, 표 7 과 표 8 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 당질 제품 PI, PII, PIII, PIV 및 PV 중의 어느것이라도 α-글루코시다아제와 래트 소장 아세톤 분말 효소에 의하여 실험 6 의 글루코아밀라아제의 경우와 마찬가지로 글루코오스와 트레할로오스로 까지 분해되었다는 것을 알 수 있다.
또한, 마찬가지로 α-글루코시다아제와 래트 소장 아세톤 분말 효소에 의하여 분해된 각각의 반응 생성물에 다시 1 단위의 돼지 신장 유래의 트레할라아제 (Sigma 사 판매) 를 가하고 pH 5.7 및 37℃ 에서 18 시간 작용시킨 다음, 고속 액체 크로마토그래피법으로 당 조성을 분석한 결과, 당질 제품 PI, PII, PIII, PIV, PV 의 어느 경우도 α-글루코시다아제와 래트 소장 아세톤 분말 효소에 의하여 생성된 트레할로오스는 트레할라아제에 의하여 글루코오스까지 가수분해되었음이 판명되었다.
이상의 결과를 요약하면 다음과 같다.
(1) 본 발명의 비환원성 당질 생성 효소는 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해물 1 종 이상으로 부터 그 글루코오스 중합도를 변화시키지 않고 α-글리코실 트레할로오스를 생성하고 있다.
(2) 비환원성 당질 PV 는 α-아밀라아제에 의하여 주로 비환원성 당질 PII 와 말토트리오스를 생성하고, 비환원성 당질 PII 는 글루코아밀라아제에 의하여 트레할로오스 1 분자와 글루코오스 2 분자를 생성하고 있다.
이들 결과로 부터 본 발명의 비환원성 당질 생성 효소는 환원성 전분 부분 분해물의 환원성 말단을 비환원성의 트레할로오스 구조로 분자내 변환하는 아주 세로운 작용 매카니즘의 효소인 것으로 판명된다.
실험 8 : 급성 독성 시험
7 주령의 dd 계 마우스를 사용하여 실험 4 에서 제조한 비환원성 당질 제품 PI, PII, PIII, PIV 또는 PV 을 경구 투여하여 급성 독성 시험을 한 결과, 이들 비환원성 당질은 어느것이나 저독성의 물질이고, 투여 가능한 최대 투여량에 있어서도 사망예는 확인되지 않았다. 따라서, 정확한 값이라고는 할 수 없으나 이들의 LD50값은 어느것이나 약 50 g/kg 이상이었다.
실험 9 : 아르드로박터 sp. Q36 로 부터의 비환원성 당질 생성 효소 제조
리조븀 sp. M-11 (FERM BP-4130) 대신에 아르드로박터 sp. Q36 (FERM BP-4316) 을 사용한 외에는 실험 1 과 마찬가지로 퍼어멘터에서 약 72 시간 배양하였다. 배양액의 비환원성 당질 생성 효소의 효소 활성은 약 1.2 단위/mℓ이었다. 실험 1 과 마찬가지로 하여 균체 현탁액과 배양 상청액의 효소 활성을 측정한 결과, 각각 약 0.5 단위/mℓ 및 약 0.7 단위/mℓ이었다.
실험 10 : 효소의 정제
실험 9 의 방법으로 제조한 배양액 18 ℓ을 사용하여 실험 2 와 마찬가지로 정제하였다. 정제의 각 공정 단계의 결과는 표 9 에 나와 있다.
표 9
표 9 의 공정 단계에서 겔 여과 칼럼 용출액으로서 얻은 정제된 효소 제품을 실험 2 의 경우와 마찬가지로 전기 영동법으로 순도를 검정한 결과, 단일 단백질 밴드를 나타내었고 수득한 효소 제품은 전기 영동적으로 단일 밴드를 가진 고순도의 효소이었다.
실험 11 : 효소의 성질
실험 10 에서 얻은 정제 효소 제품을 실험 3 의 경우와 마찬가지로 분자량을 측정한 결과, 분자량은 약 76,000∼86,000 달톤이었다. 그리고, 이 정제 효소 제품의 등전점 (pI) 을 실험 3 의 경우와 마찬가지로 측정한 결과, pI 약 3.6∼4.6 이었다. 또한, 이 효소 활성에 미치는 온도의 영향과 pH 의 영향 및 열적 안정성과 pH 안정성에 대하여 실험 3 의 경우와 마찬가지로 시험하였다. 그 결과는 온도의 영향을 제 5 도에, pH 의 영향을 제 6 도에, 열적 안정성을 제 7 도에, 그리고 pH 안정성을 제 8 도에 각각 나타내었다.
제 5 도∼제 8 도로 부터 명백한 바와 같이 효소의 최적 온도는 40℃ 부근이고, 최적 pH 는 약 6.5∼7.0 이다. 그리고, 열적 안정성은 40℃ 부근까지이고, pH 안정성은 약 6.0∼9.5 이다.
실험 12 : 비환원성 당질 제조
실험 10 에서 제조한 정제 효소 제품을 사용하여 실험 4 와 실험 6 의 방법에 따라 비환원성 당질의 제조 및 그 구조 확인의 실험을 하였다. 그 결과, 리조븀 sp. M-11 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 경우와 마찬가지로 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해물 1 종 이상으로 부터 α-글리코실 트레할로오스를 생성하는 것이 판명되었다.
실험 13 : 공지 미생물로 부터의 비환원성 당질 생성 효소의 제조와 그 성질
공지 미생물중에서 본 발명의 비환원성 당질 생성 효소 생산능이 확인된 표 10 에 나온 특정의 미생물을 마이코박테리움 스메그마티스 (Mycobacteriumsmegmatis) ATCC19420 의 경우에 대하여 37℃ 에서 배양한 이외는 실험 1 의 경우와 마찬가지로 퍼어멘터에서 27℃ 에서 72 시간 배양하였다. 각각의 배양액 약 18 ℓ을 사용하여 실험 2 와 마찬가지로 해서 배양액을 세포 파쇄하고, 그 상청액을 황산 암모늄 염석하여 투석한 다음, 다시 이온 교환 칼럼 처리하여 조 (組) 효소 제품을 얻은 후 그 성질을 조사하였다. 그 결과는 표 10 에 나와 있다.
표 10
그리고, 이들 공지의 균 유래의 부분 정제 효소 제품을 사용하여 실험 12 의 방법에 따라 비환원성 당질의 제조와 그 구조 확인을 한 결과, 어느 효소라도 리조븀 sp. M-11 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 경우와 마찬가지로 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해물 1 종 이상으로 부터 α-글리코실 트레할로오스를 생성하였음이 확인되었다.
이어서, 신규 미생물 리조븀 sp. M-11 및 아르드로박터 sp. Q36 으로 부터의 트레할로오스 방출 효소에 대해 먼저 설명한 다음 공지 미생물로 부터의 트레할로오스 유리 효소에 대해 설명한다.
실험 14 : 리조븀 sp. M-11 로 부터의 트레할로오스 방출 효소의 제조
" PINEDEX #4 " (일본국 松谷화학공업 주식회사제의 전분 부분 분해물) 2.0 w/v %, 펩톤 0.5 w/v %, 효모 엑스 0.1 w/v %, 인산 수소 2 나트륨 0.1 w/v %, 인산 2 수소 칼륨 0.1 w/v % 및 물로 된 액체 배지를 pH 7.0 으로 조정하였다. 500 mℓ용량의 플라스크에 이 배지를 약 100 mℓ씩 넣고 오토클레이브에서 120℃ 에서 20 분간 멸균하고 냉각한 다음, 리조븀 sp. M-11(FERM BP-4130) 을 접종하고, 27℃, 130 r.p.m. 에서 24 시간 배양한 것을 종배양액으로 하였다.
용량 30 ℓ의 퍼어멘터에 종배양의 경우와 동일한 조성의 배지 약 20 ℓ를 넣고 멸균 후 냉각하여 온도 27℃ 로 한 후 종배양액 1 w/v % 을 접종하고 온도 27℃, pH 6.0∼8.0 에서 유지하면서 약 72 시간 통기 교반 배양하였다.
배양액의 비환원성 당질 생성 효소의 효소 활성은 약 1.5 단위/mℓ이었고, 본 발명의 트레할로오스 방출 효소의 효소 활성은 약 2 단위/mℓ이었다.
배양액의 일부를 취하여 원심분리하여 균체와 배양 상청액으로 분리하고, 다시 균체를 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 샘플링된 배양액과 동일한 액량의 현탁액으로 한 후 균체 현탁액과 배양 상청액의 효소 활성을 측정한 결과, 균체 현탁액에는 비환원성 당질 생성 효소의 효소 활성이 약 0.6 단위/mℓ이었고, 본 발명의트레할로오스 방출 효소의 효소 활성이 약 0.8 단위/mℓ이었으며, 그리고 배양 상청액에는 비환원성 당질 생성 효소의 효소 활성이 약 0.9 단위/mℓ이었고, 본 발명의 트레할로오스 발출 효소의 효소 활성이 약 1.2 단위/mℓ이었다.
실험 15 : 효소 정제
실험 14 에서 얻은 배양액 약 18 ℓ를 초고압 균체 파쇄장치 " MINI LABO " (일본국 大日本제약 주식회사제) 로 처리하여 함유된 균체를 파쇄하였다.
이 액을 원심분리 (10,000 r.p.m., 30 분간) 함으로써 약 16 ℓ의 상청액을 얻었다. 이 액에 포화도 0.2 가 되도록 황산 암모늄을 용해시키고 4℃ 에서 1 시간 방치한 후 원심분리 (10,000 r.p.m., 30 분간) 함으로써 상청액을 회수하였다. 다시, 이 상청액에 포화도 0.6 이 되도록 황산 암모늄을 용해시키고 4℃ 에서 24 시간 방치한 후 원심분리하여 황산 암모늄 염석물을 회수하였다. 수득한 황산 암모늄 염석물을 10mM 인산 완충액 (pH 7.0) 에 용해시킨 후 동일한 완충액에 대하여 24 시간 투석하고 원심분리하여 불용물을 제거하였다. 이 투석액 (360 mℓ) 을 2 회에 나누어 " DEAE-TOYOPEARL " 겔을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양 : 300 mℓ) 를 하였다.
본 발명의 트레할로오스 방출 효소와 비환원성 당질 생성 효소를 " DEAE-TOYOPEARL " 에 흡착시켜 염화 나트륨을 함유한 동일한 완충액으로 칼럼으로 부터 상이한 염화 나트륨 농도에서 각각 용출하였다. " DEAE-TOYOPEARL " 의 용출 패턴은 제 9 도에 나와 있다. 비환원성 당질 생성 효소는 염화 나트륨 농도 약 0.2 M 에서 용출하고 트레할로오스 방출 효소는 염화 나트륨 농도 약 0.3 M 에서 용출하였다. 각각의 효소 활성 획분을 각각 회수하여 이들 효소를 따로 따로 정제하였다.
비환원성 당질 생성 효소 활성 획분을 2 M 황산 암모늄을 함유한 동일한 완충액에 대하여 투석하고, 이 투석액을 원심 분리하여 불용물을 제거하고 수득되는 상청액을 " BUTYO-TOYOPEARL 650 " 을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피(겔의 양 : 300 mℓ) 를 하였다. 흡착된 이 효소를 황산 암모늄 2 M 으로 부터 0 M 까지 감소하는 직선 기울기에 의하여 칼럼으로 부터 용출시켜 효소 활성 획분을 회수한 다음 " TOYOPEARL HW-55 " 을 사용한 겔 여과 크로마토그래피 (겔의 양 : 300 mℓ) 를 하여 비환원성 당질 생성 효소 활성 획분을 회수하였다.
트레할로오스 방출 효소의 정제는 " DEAE-TOYOPEARL " 칼럼으로 부터 용출한 트레할로오스 방출 효소 활성 획분을 사용하여 상기의 비환원성 당질 생성 효소의 정제 방법과 마찬가지로 2 M 황산 암모늄을 함유한 완충액에 대하여 투석하고, 이어서, 소수 (疏水) 칼럼 크로마토그래피와 겔 여과 크로마토그래피를 하였다.
정제의 각 공정에서의 효소 활성량, 비활성 (比活性) 및 수율을 비환원성 당질 생성 효소의 경우는 표 11 에, 그리고 본 발명의 트레할로오스 방출 효소의 경우는 표 12 에 나타내었다.
표 11
표 12
정제 비환원성 당질 생성 효소 제품과 정제 트레할로오스 방출 효소 제품을 플리아크릴아미드 겔 (겔 농도 : 7.5 %) 을 사용하는 전기 영동법으로 순도를 검정한 결과, 단백질 밴드는 단 하나가 나타났고, 수득한 효소 제품은 전기 영동적으로 단일의 고순도의 것이었다.
실험 16 : 트레할로오스 방출 효소의 성질
실험 15 에서 수득한 정제 트레할로오스 방출 효소 제품을 SDS-폴리아크릴 아미드 겔 (겔 농도 : 10 %) 를 사용하는 전기 영동법으로 처리하고, 동시에 영동 처리된 분자량 마아커 (marker) 와 비교하여 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 58,000∼68,000 달톤이었다.
정제 효소 제품을 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 등전점 전기 영동법으로 처리한 후, 겔의 pH 를 측정하여 이 효소의 등전점 (pI) 을 구한 결과, 등전점은 약 3.3∼4.3 이었다.
이 효소 활성에 대한 온도의 영향과 pH 의 영향을 활성 측정 방법에 준하여 조사하였다. 그 결과는 제 10 도 (온도의 영향) 와 제 11 도 (pH 의 영향) 에 각각 나와 있다. 효소의 최적 온도는 pH 7.0 에서 30 분간 반응에서는 45℃ 부근이었고, 최적 pH 는 40℃ 에서 30 분간 반응에서 약 6.0∼7.5 이었다. 열적 안정성은 효소 용액 (50 mM 인산 완충액을 함유, pH 7.0) 을 각 상이한 온도에서 60 분간 유지하고 물로 냉각한 후 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 그리고, pH 안정성은 이 효소를 각 pH 의 50 mM 완충액중에서 25℃ 에서 16 시간 유지한 후 pH 를 7 로 조정하고 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과는 제 12 도 (열적 안정성) 와 제 13 도(pH 안정성) 에 나와 있다. 이 효소의 열적 안정성은 약 40℃ 까지 이었고, pH 안정성은 약 5∼10 이었다.
실험 17 : α-글리코실 트레할로오스로 부터 트레할로오스의 제조
기질로서 사용되는 α-글리코실 트레할로오스는 일본국 특허 출원 제 349,216/93 호 명세서에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 즉, 환원성 전분 부분 분해물로서 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스 또는 말토헵타오스의 20 % 수용액에 실험 15 의 방법으로 제조한 정제 비환원성 담질 생성 효소 제품을 기질 고형분 1 g 당 2 단위의 비율로 가하여 40℃, pH 7.0 에서 48 시간 작용시킨 후 통상의 방법에 따라 가열 실활, 여과, 탈염, 농축하고 나트륨형 강산성 양이온 교환 수지 " XT-1016 " 을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 하였다. 수지를 내경 2.0 cm, 길이 1 m 의 쟈켓부 스테인레스제 칼럼 3 개에 충전하고 직렬로 연결하여 칼럼내 온도를 55℃ 로 유지 하면서 반응 당액을 수지에 대하여 5 v/v % 가하고, 여기에 55℃ 의 온수를 SV 0.13 에서 흘려 분획함으로써 글루코오스 중합도가 3 이상인 비환원성 당질의 고순도 제품을 제조하였다. 수득한 고순도 제품중에서 글루코실 트레할로오스 제품의 순도는 97.6 % 이고, 말토실 트레할로오스 제품의 순도는 98.6 % 이며, 말토트리오실 트레할로오스 제품의 순도는 99.6 % 이고, 말토테트라오실 트레할로오스제품의 순도는 98.3 % 이며, 말토펜타오실 트레할로오스 제품의 순도는 98.1 % 이었다.
상기 5 종의 비환원성 당질 또는 α-글리코실 트레할로오스의 20 % 수용액을 제조하고, 각각에 실험 15 에서 제조한 정제 트레할로오스 방출 효소를 기질 고형분 1 g 당 2 단위의 비율로 가하여 40℃, pH 7.0 에서 48 시간 작용시킨 후 탈염하고, " WAKO BEADS WB-T-330 " 을 사용한 고속 액체 크로마토그래피로 반응 생성물을 분석하였다. 대조로서 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스에 정제 트레할로오스 방출 효소를 위와 마찬가지로 작용시켜 고속 액체 크로마토그래피로 분석하였다. 이들의 결과를 표 13 에 나타내었다.
표 13
표 13 의 결과로 부터 명백한 바와 같이,
(1) 트레할로오스 방출 효소는 α-글리코실 트레할로오스에서 글리코실 부분과 트레할로오스 부분 사이의 결합을 특이적으로 가수분해하여 트레할로오스와 글루코오스 중합도가 1 이상인 환원성 당질을 생성한다.
(2) 말토올리고당은 트레할로오스 방출 효소에 의하여 전혀 작용을 받지 않는다.
이들의 결과로 부터 본 발명의 트레할로오스 방출 효소는 α-글리코실 트레할로오스에서 글리코실 부분과 트레할로오스 부분 사이의 결합을 결합을 극히 특이적으로 가수분해하여 트레할로오스를 방출하는 전혀 세로운 작용 메카니즘을 가진 효소인 것으로 판단된다.
이어서, 각각의 반응 생성물로 부터 트레할로오스를 정제하기 위하여 탈색, 탈염, 농축하고 나트륨형 강산성 양이온 교환 수지 " XT-1016 " 를 사용한 칼럼 분획을 하여 트레할로오스 함량 97 % 이상의 고순도 획분을 채취하였다. 수득한 고순도 획분을 농축하여 농도 약 65 % 로 하고 25℃ 에서 2 일간 방치하여 함수 트레할로오스 결정을 정출시키고, 분밀 (分蜜) 하여 진공 건조함으로써 트레할로오스 함량 99 % 이상의 고순도 제품을 제조하였다. 원료 기질에 대한 각각의 수율은 고형물 환산으로 글루코실 트레할로오스로 부터 9.5 %, 말토실 트레할로오스로 부터 14.9 %, 말토트리오실 트레할로오스로 부터 16.0 %, 말토테트라오실 트레할로오스로 부터 18.5 %, 말토펜타오실 트레할로오스로 부터 17.7 % 이었다. 수득한 각각의 고순도 트레할로오스 제품을 사용하고 시판의 시약 트레할로오스 (일본국의 和光純藥공업 주식회사 판매) 를 표준품으로 하여 융점, 융해열, 비선광도, 적외선 흡수 스펙트럼, 분말 X 선 회절 패턴 및 돼지 신장 유래의 트레할라아제 (Sigma 사 판매) 에 의한 가수분해성에 대하여 비교한 결과, 제조된 모든 고순도 트레할로오스 제품은 융점 97.0±0.5℃, 융해열 57.8±1.2 KJ/mole, 비선광도 +182±1° 이었고, 시약 트레할로오스의 실측치와 잘 일치하며, 또한 적외선 흡수 스펙트럼 또는 분말 X 선 회절 패턴과 잘 일치 하였다. 더욱이, 돼지 신장 유래의 트레할라아제 (Sigma 사 판매) 에 의하여 고순도 트레할로오스 제품은 시약 트레할로오스와 마찬가지로글루코오스로 분해되었다. 이상의 결과로 부터 명백한 바와 같이 α-글리코실 트레할로오스에 트레할로오스 방출 효소를 작용시켜 생성시킨 당질은 트레할로오스인 것으로 확인되었다.
실험 18 : 환원성 전분 부분 분해물로 부터의 트레할로오스의 제조
5 % 왁시 콘 스타아치 (waxy corn starch) 현탁액을 가열 호화시킨 후 pH 4.5, 온도 50℃ 로 조정하고, 여기에 이소아밀라아제 (주식회사 林原생물 화학연구소제) 를 전분 1 g 당 4,000 단위의 비율이 되도록 가하고 20 시간 반응시켰다. 이 반응액을 오토크레이브 (120℃, 10 분간) 한 다음 60℃ 로 냉각하고 이것을 " TOYOPEARL HW-50S " 수지 (일본국 Tosoh 사제) 를 사용한 겔 여과 크로마토그래피 (겔의 양 : 750 mℓ) 로 글루코오스 중합도 10∼35 의 환원성 전분 부분 분해물을 제조하였다.
수득한 환원성 전분 부분 분해물 및 글루코오스 중합도 3 의 환원성 전분 부분 분해물인 말토트리오스를 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 1 % 농도로 희석하고, 여기에 실험 15 의 방법으로 제조한 정제 비환원성 당질 생성 효소 제품 및 정제 트레할로오스 방출 효소 제품을 각각 기질 고형물당 4 단위의 비율로 가하고 40℃ 에서 24 시간 작용시킨 후 일부를 채취하여 탈염하고 고속 액체 크로마토그래피로 반응 생성물을 분석하였다.
나머지의 반응 혼합물은 다시 50℃, pH 4.5 로 조정한 후 글루코아밀라아제 (일본국의 生化學공업 주식회사제) 를 기질 고형물당 50 단위의 비율로 가하고 24 시간 작용시켜 마찬가지로 탈염하고 고속 액체 크로마토그래피로 반응 생성물을 분석하였다. 이들의 결과는 표 14 에 나와 있다.
표 14
표 14 에 있는 바와 같이 비환원성 당질 생성 효소와 트레할로오스 방출 효소를 작용시킨 후의 트레할로오스 생성율은 글루코오스 중합도 3 의 말토트리오스에서는 4.2% 로 비교적 낮은 값이었으나 글루코오스 중합도 10∼34.1 의 전분 부분 분해물에서는 66.1∼80.8 % 의 높은 값이 얻어졌다. 원료인 환원성 전분 부분 분해물의 글루코오스 중합도가 높을수록 수득되는 트레할로오스 순도가 높은 것도 판명되었다. 더욱이, 이들 두가지 효소를 작용시킨 반응액에 글루코아밀라아제를 작용시켜 글루코오스 중합도 3 이상인 잔존하는 글리코실 트레할로오스를 트레할로오스와 글루코오스로 분해함으로써 생성하는 트레할로오스 순도가 보다 높아지는 것도 판명하였다.
실험 19 : 메일라아드 반응
실험 17 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 제품 (순도 99.5 %) 10 % 와 글리신 1 % 및 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 을 함유하는 용액을 100℃ 에서 90 분간 유지하고 냉각한 후, 480 nm 및 1 cm 셀에서의 이 용액의 흡광도를 측정하였다. 대조로서 글루코오스와 말토오스를 사용하여 마찬가지로 처리하여 480 nm 에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 표 15 에 나와 있다.
표 15
표 15 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 본 발명에 의한 트레할로오스 제품은 메일라아드 반응에 의한 착색도는 극히 낮아 글루코오스와 말토오스의 착색도의 0.4∼0.6 % 에 불과하여 본 발명의 트레할로오스 제품은 메일라아드 반응을 거의나타내지 않는 당질임이 판명되었다. 따라서, 본 발명의 트레할로오스는 아미노산과 혼합하여도 아미노산을 열화 (劣化) 시킬 우려가 거의 없는 당질이다.
실험 20 : 생체내에서의 이용 시험
厚治 등이 " 臨床營業 ", Vol.41, No.2, pp.200∼208 (1972) 에서 보고하고 있는 방법에 준하여 실험 17 의 방법으로 수득한 고순도 트레할로오스 제품 (순도 99.5 %) 30 g 을 20 w/v % 수용액으로 하고, 이것을 건강한 남자 (26 세, 27 세 28세, 29세, 30세, 31세) 에게 각각 경구 투여하여 경시적으로 채혈하고, 혈당치와 인슐린치를 측정하였다. 대조로서는 글루코오스를 사용하였다. 그 결과, 트레할로오스는 글루코오스의 경우와 마찬가지의 거동을 나타내어 혈당치와 인슐린치 모두에 있어서 투여후 약 0.5∼1 시간에서 최대치를 나타내었다. 트레할로오스는 용이하게 소화 흡수되고 대사 이용되어 에너지원으로 되는 것이 판명되었다.
실험 21 : 급성 독성 시험
마우스를 사용하고, 실험 17 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 제품
표 15 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 본 발명에 의한 트레할로오스 제품은 메일라아드 반응에 의한 착색도는 극히 낮아 글루코오스와 말토오스의 착색도의 0.4∼0.6% 에 불과하여 본 발명의 트레할로오스 제품은 메일라아드 반응을 거의 나타내지 않는 당질임이 판명되었다. 따라서, 본 발명의 트레할로오스는 아미노산과 혼합하여도 아미노산을 열화 (劣化) 시킬 우려가 거의 없는 당질이다.
실험 20 : 생체내에서의 이용 시험
厚治 등이 " 臨床營藥 ", Vol.41, No.2, pp.200∼208 (1972) 에서 보고하고있는 방법에 준하여 실험 17 의 방법으로 수득한 고순도 트레할로오스 제품 (순도 99.5 %) 30 g 을 20 w/v % 수용액으로 하고, 이것을 건강한 남자 (26 세, 27세, 28세, 30세, 31세) 에게 각각 경구 투여하여 경시적으로 채혈하고, 혈당치와 인슐린치를 측정하였다. 대조로서는 글루코오스를 사용하였다. 그 결과, 트레할로오스는 글루코오스의 경우와 마찬가지의 거동을 나타내어 혈당치와 인슐린치 모두에 있어서 투여후 약 0.5∼1 시간에서 최대치를 나타내었다. 트레할로오스는 용이하게 소화 흡수되고 대사 이용되어 에너지원으로 되는 것이 판명되었다.
실험 21 : 급성 독성 시험
마우스를 사용하고, 실험 17 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 제품 (순도 99.5 %) 을 경구 투여하여 급성 독성 시험을 한 결과, 트레할로오스는 투여 가능한 최대 투여량에 있어서도 사망예는 확인되지 않았다. 따라서, 정확한 값이라고는 할 수 없으나 트레할로오스 제품의 LD50값은 약 50 g/kg 이상이었다.
실험 22 : 아르드로박터 sp. Q36 로 부터의 트레할로오스 방출 효소의 제조
리조븀 sp. M-11 (FERM BP-4130) 대신에 아르드로박터 sp. Q36 (FERM BP-4316) 을 사용하여 실험 14 와 마찬가지로 퍼어멘터에서 약 72 시간 배양하였다. 배양액의 비환원성 당질 생성 효소의 효소 활성은 약 1.3 단위/mℓ이었고, 본 발명의 트레할로오스 방출 효소의 효소 활성은 약 1.8 단위/mℓ이었다. 실험 14 와 마찬가지로 하여 균체 현탁액과 배양액 상청액의 효소 활성을 측정한 결과, 균체 현탁액에는 비환원성 당질 생성 효소의 효소 활성이 약 0.5 단위/mℓ이었고, 트레할로오스 방출 효소의 효소 활성이 약 0.5 단위/mℓ이었으며, 배양 상청액에서는 비환원성 당질 생성 효소의 효소 활성이 약 0.8 단위/mℓ이었고, 트레할로오스 방출 효소의 효소 활성이 약 1.3 단위/mℓ이었다.
실험 23 : 효소의 정제
실험 22 의 방법으로 제조한 배양액 약 18 ℓ를 사용하여 실험 15 와 마찬가지 방법으로 정제하였다. 정제의 각 공정 단계의 결과는 비환원성 당질 생성 효소의 경우는 표 16 에, 그리고 트레할로오스 방출 효소의 경우는 표 17 에 나와 있다.
표 16
표 17
표 16 과 표 17 의 공정 단계에서 각각 겔 여과 칼럼 용출액으로서 얻은 정제 비환원성 당질 생성 효소 및 정제 트레할로오스 방출 효소 제품을 실험 15 의 경우와 마찬가지로 전기 영동법으로 순도를 검정한 결과 단일 단백질 밴드를 나타내었고 수득한 이들 두가지 정제 효소 제품은 전기 영동적으로 단일 밴드를 가진 고순도의 효소이었다.
실험 24 : 효소의 성질
실험 23 의 방법으로 얻은 정제 트레할로오스 방출 효소 제품을 실험 16 의 경우와 마찬가지로 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법으로 분자량을 측정한 결과 약 57,000∼67,000 달톤이었다. 그리고, 이 정제 효소 제품의 등전점 (pI) 을 실험 3 의 경우와 마찬가지로 시험한 결과, 그 등전점은 약 3.6∼4.6 이었다. 또한, 이 효소 활성에 대한 온도의 영향과 pH 의 영향 및 이 효소의 열적 안정성과 pH 안정성에 대하여 실험 16 의 경우와 마찬가지로 하여 구하였다. 그 결과는 온도의 영향을 제 14 도에, pH 의 영향을 제 15 도에, 열적 안정성을 제 16 도에, 그리고 pH 안정성을 제 17 도에 각각 나타내었다.
제 14 도∼제 17 도로 부터 명백한 바와 같이 효소의 최적 온도는 45℃ 부근이고, 최적 pH 는 약 6.0∼7.5 이다. 그리고, 열적 안정성은 45℃ 부근까지이고, pH 안정성은 약 5.0∼10.0 이다.
실험 25 : α-글리코실 트레할로오스로 부터 트레할로오스의 제조
실험 23 의 방법으로 제조한 정제 효소 제품을 사용하여 실험 17 의 방법에 따라 글루코오스 중합도 3 이상인 α-글리코실 트레할로오스로 부터의 트레할로오스의 제조의 실험을 한 결과, 리조븀 sp. M-11 유래의 트레할로오스 방출 효소의 경우와 마찬가지로 이 효소는 α-글리코실 트레할로오스로 부터 트레할로오스를 방출하는 것이 판명되었다.
실험 26 : 공지 미생물로 부터의 트레할로오스 방출 효소의 제조와 그 성질
공지 미생물중에서 본 발명의 트레할로오스 방출 효소 생산능이 확인된 브레비박테륨 헬로볼룸 (ATCC 11822) 및 미크로코커스 로제우스 (ATCC 186) 를 실험 14 의 경우와 마찬가지로 퍼어멘터에서 27℃ 에서 72 시간 배양하였다. 각각의 배양액 약 18 ℓ를 사용하여 세포 파쇄장치에서 처리하고, 그 상청액을 회수한 다음 황산 암모늄 염석하여 투석하고, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 처리하여 부분 정제 효소 제품을 얻은 후 그 성질을 조사하였다. 이들의 결과를 전술한 리조븀 sp. M-11 과 아르드로박터 sp. Q36 의 경우와 함께 표 18 에 나와 있다.
표 18
그리고, 이들 공지 미생물 유래의 부분 정제 효소 제품을 사용하여 실험 25 의 방법에 따라 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-글리코실 트레할로오스로 부터의 트레할로오스 제조의 실험을 한 결과 리조븀 sp. M-11 유래의 트레할로오스 방출 효소의 경우와 마찬가지로 이들은 α-글리코실 트레할로오스로 부터 트레할로오스를 방출하는 것이 판명되었다.
실험 27 : 배양에 의한 트레할로오스 제조에 미치는 당질 공급원의 영향
다섯가지 당질 공급원을 사용하여 비환원성 당질 생성 효소와 트레할로오스 방출 효소의 산생능이 있는 몇가지 미생물을 당질 공급원 함유의 영양 배지에서 배양하여 배양물중의 트레할로오스 수율에 미치는 영향을 시험하였다. 당질 공급원 및 기타 배양 성분을 별도로 멸균하였다. 당질 공급원 10 w/v %, 펩톤 0.5 w/v %, 효모 엑스 0.1 w/v %, 인산 수소 2 나트륨 0.1 w/v %, 인산 2 수소 칼륨 0.1 w/v %및 물로 된 액체 배지를 멸균하고 pH 7.0 으로 조정하여 50 mℓ을 위해 500 mℓ용량의 플라스크에 넣은 다음 아르드로박터 sp. Q36 (FERM BP-4316) 의 종배양액을 접종하고 27℃ 및 130 r.p.m. 에서 72 시간 배양하였다. 당질 공급원으로서는 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, " TETRUP " (일본국의 주식회사 林原상사 판매의 DE 약 30 되는 말토테트라오스 고함유 전분시럽) 및 " PINEDEX #3 " (일본국의 松谷화학공업 주식회사제의 DE 약 20 되는 분말 전분 시럽) 을 사용하였다.
각각의 배양물을 원심분리하고 상청액중의 트레할로오스 함량 (mg/mℓ) 을 고속 액체 크로마토그래피로 측정하였다. 그 결과는 표 19 에 나와 있다.
표 19
표 19 로 부터 명백한 바와 같이 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해물은 트레할로오스 수율이 증가 되었으므로 트레할로오스 제조에 적합함을 알 수 있다.
실험 28 : 배양에 의한 트레할로오스 제조에 미치는 환원성 전분 부분 분해물과 효소의 영향
비환원성 당질 생성 효소와 트레할로오스 방출 효소를 영양 배지에서 생산할 수 있는 미생물의 배양시에 전분 지절 효소 및/또는 시클로말토덱스트린 글루카노트란 스퍼라아제를 공존시켜 배양물중의 트레할로오스 수율에 대해 시험하였다.
실험 27 의 방법에 따라 당질 공급원으로서 글루코오스를 3 % 함유한 배지에서 아르드로박터 sp. Q36 을 24 시간 배양하고, 별도로 제조한 또 다른 공급원으로서의 환원성 전분 부분 분해물 1 종을 첨가하여 전분 지절 효소 및/또는 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제가 함유된 각각의 최종 농도 10 w/v% 로 하고, 다시 48 시간 배양하였다. 농도 20 % 의 옥수수 전분 현탁액을 0.1 % 탄산 칼슘으로 pH 6.5 로 조정하고 " TERMAMYL " (덴마크국의 Novo Industri 사제의 α-아밀라아제) 을 0.1∼2.0 % 가하여 95℃ 에서 15 분간 반응시키고 오토클레이브에서 120℃ 에서 10 분간 유지하여 액화함으로써 DE 2.5∼20.5 로 한 직후 냉각함으로써 제조한 당질 공급원으로서의 환원성 전분 부분 분해물을 기타 배양물 성분과 혼합한 다음, 위에 나온 24 시간 배양물에 등량으로 첨가 하였다. 배양물에 첨가된 효소는 전분 고형물 1 g 당 전분 지절 효소인 이소아밀라아제 1000 단위와 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제 10 단위인데, 이들은 모두가 일본국의 주식회사 林原생물화학연구소제의 것이었다. 대조로서 당질 공급원과 효소가 첨가되지 아니한 배지를 위와 마찬가지로 시험 하였다. 수득한 배양물을 원심분리하고, 상청액중의 트레할로오스 함량 (mg/mℓ) 을 고속 액체 크로마토그래피로 측정하였다. 그 결과는 표 20 에 나와 있다.
표 20
표 20 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 배지중에 환원성 전분 부분 분해물과 전분 지절 효소 및/또는 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제를 병용하는 것이 트레할로오스 수율을 증가시키므로 트레할로오스 제조에 유리하다는 것을 알 수 있다. 또한, 전분을 DE 15 이하로 액화하여 수득한 환원성 전분 부분 분해물 존재하에 먼저 배양한 다음 전분 지절 효소 및/또는 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제를 작용시킨 배지가 특히 적합하다는 것을 알 수 있다.
다음에 실시예 A 에서는 본 발명에 의한 비환원성 당질 또는 이것을 함유한저환원성 당질을 설명하고, 실시예 B 에서는 이들 당질을 함유하는 조성물을 설명한다.
실시예 A-1
감자 전분을 농도 약 20 % 의 현탁액으로 하고, 여기에 옥살산을 0.3 % 가하여 오토클레이브 처리하고 냉각하여 탄산 칼슘으로 pH 6.5 로 중화해서 DE 약 12 의 액화 전분액을 제조하였다. 액화 전분을 10 w/v % 로 하여 사용한 외에는 실험 27 과 마찬가지로 제조한 영양 배지를 퍼어멘터에 넣고 쿠르토박테륨 시트레움(IF015231)의 종배양액에 1 v/v % 으로 접종하여 27℃ 에서 72 시간 통기 교반하에 배양하였다. 수득한 배양액을 여과하여 불용물을 제거하고 95℃ 로 가열하여 효소를 실활시키고 농축한 다음 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색하고 H 형 및 OH 형 이온 교환 수지로 탈염하여 정제하고 농축하여 농도 약 70 % 의 시럽상 제품을 고형물당 약 90 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 α-글리코실 트레할로오스를 함유한 DE 약 8 의 저환원성 당질로서 온화한 상품의 감미, 비교적 저점도 및 적당한 보습성을 가지고 있어서 감미료, 정미 (呈味) 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 A-2
타피오카 전분을 농도 약 25 % 의 현탁액으로 하고, 여기에 " NEO-SPITASE " (일본국의 Nagase 생화학공업 주식회사제의 α-아밀라아제) 를 전분 고형분 1 g 당 0.1 % 가하여 85∼90℃ 에서 약 20 분 반응시키고 120℃ 에서 오토클레이브 처리한즉시 냉각하여 DE 약 4 의 액화 전분액을 얻은 다음, 여기에 전분 고형분 1 g 당 풀룰라나아제 100 단위와 말토테트라오스 생성 효소 5 단위(이들 두가지는 주식회사 林原생물화학연구소제임) 를 가하고 pH 6.5 및 50℃ 에서 20 시간 반응시켜 말토테트라오스 고함유 당화 제품을 얻었다. 이것을 가열하여 효소를 실활시키고 통상의 방법으로 정제하고 농축하여 농도 약 60 % 로 하였다. 15 w/v % 말토테트라오스 고함유 당화 제품을 당질 공급원으로 사용한 외에는 실험 27 에서와 마찬가지로 제조한 영양 배지를 퍼어멘터에 넣고 실험 A-1 에서와 마찬가지로 쿠르토박테륨 시트레움 (IF015231) 을 27℃ 에서 72 시간 배양하였다. 배양물을 여과하여 불용물을 제거하고, 여액을 통상적인 방법으로 탈색, 탈염하여 농도 약 60 % 로 하였다. 원당액으로서의 농축물의 비환원성 당질 함량을 증가시키기 위해 칼슘형의 강산성 양이온 교환 수지 " XT-1016 " 을 사용한 칼럼 크로마토그래피를 하였다. 이온 교환 수지를 내경 5.4 cm 인 자켓부 스테인레스강 칼럼 4 개에 충전하고 각각 직렬로 연결하여 수지층 총 길이를 20 m 되게 하였다. 칼럼 내부 온도를 55℃로 유지하면서 여기에 대해 5 v/v % 당액을 가하고 55℃ 의 온수를 SV 0.2 로 주입하여 글루코오스 중합도 4∼6 의 비환원성 당질을 함유한 획분을 회수하였다. 이들 획분을 정제하고 농축하여 감압 건조함으로써 비환원성 당질 고함유 분말을 건조 고형분 기준으로 약 63 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 α-글리코실 트레할로오스를 함유한 DE 5.4 의 비환원성 당질로서 온화하고 상품의 감미, 비교적 저점도, 적당한 보습성을 가지므로 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-3
옥수수 전분을 농도 약 30 % 의 현탁액으로 하고 여기에 탄산 칼슘 0.1 % 을 가하여 pH 6.5 로 조정하고 전분 고형분에 대해 " TERMAMYL 60L " (덴마크국의 Novo Industri 사제의 α-아밀라아제)을 0.2 % 가하여 90℃ 에서 15 분간 반응시킨 다음 120℃ 에서 오토클레이브한 즉시 냉각하여 DE 약 4 의 액화 전분액을 얻었다. 펩톤 0.5 w/v % 와 당질 공급원 10 w/v % 대신에 말토오스 2 w/v %, 염화 암모늄 0.2 w/v % 및 인산 마그네슘 7 수화물 0.05 w/v % 을 사용한 외에는 실험 27 과 마찬가지로 제조한 영양 배지를 퍼어멘터에 넣고 쿠르토박테륨 시트레움 (IFO15231) 을 27℃ 에서 72 시간 배양하였다. 이어서, 배양물에 당질 공급원으로서 액화 전분을 건조 고형분당 10 w/v % 가하고, 또한 당질 공급원 고형분 g 당 이소아밀라아제를 300 단위, 그리고 시클로알토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제를 2 단위 (이들 두가지는 모두가 일본국의 주식회사 林原생물화학연구소제임) 와 계면 활성제 " TRITON X-100 " (일본국의 和光純藥공업주식회사제의 알킬페놀 폴리옥시에틸렌 에테르) 0.1 v/v % 및 배양물 1 ℓ당 난백 리소자임 10 mg 을 가하고 다시 48 시간 배양하였다. 수득한 배양물을 여과하여 불용물을 제거하고 여액을 가열하여 효소를 실활시켜 냉각한 다음, 여기에 α-아밀라아제를 전분 고형분 1 g 당 2 단위 가하고 다시 pH 5.5 및 55℃ 에서 16 시간 반응시켰다. 반응 혼합물을 가열하여 효소를 실활시키고 통상의 방법으로 탈색, 탈염하여 정제한 다음 농축하여 농도 약 70 % 의 시럽상 제품을 건조 고형분 기준으로 약 90 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 α-글리코실 트레할로오스와 α-글리코실 α-글리코시드 등의 비환원성 당질을 함유한저환원성 당질로서 온화하고 상품의 감미, 비교적 저점도, 적당한 보습성을 가지므로 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 A-4
실시예 A-3 의 방법으로 제조한 시럽 제품을 농도 약 55 % 로 희석하여 원당액으로 하고 실시예 A-2 의 방법으로 염형 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 하여 비환원성 당질의 함량을 증가시킨 다음, 비환원성 당질 함유의 글루코오스 중합도 3∼6 의 획분을 회수하여 정제, 농축 및 분무 건조함으로써 비환원성 당질 고함유 분말을 고형분당 약 38 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 α-글리코실 트레할로오스 및 α-글리코실 α-글리코시드 등의 비환원성 당질을 다량 함유한 DE 8 의 저환원성 당질로서, 온화하고 상품의 감미, 비교적 저점도, 적당한 보습성을 가지므로 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 A-5
실시예 A-3 의 방법으로 제조한 배양액을 여과하여 불용물을 제거하고 여액을 가열하여 효소를 실활시키고 냉각하여, 여기에 당질 공급원 고형분 1 g 당 글루코 아밀라아제 10 단위를 가하고 pH 5.0 및 55℃ 에서 10 시간 반응시켰다.
반응 혼합물에는 당 조성으로서 약 66 % 의 트레할로오스를 함유하고 있었다. 이어서, 반응 혼합물을 가열하여 효소를 실활시키고 통상의 방법으로 탈색, 탈염하여 정제하고 농축하여 농도 약 80 % 로 한 다음 결정화기에서 교반하면서 서서히 냉각하여 결정화하고, 이것을 플라스틱제 바트에 나누어 넣어 실온에서 2 일간 방치하여 숙성함으로써 결정화를 완료시켜 블록상의 고형제품을 제조하였다.
이어서, 이 블록을 절삭기에서 분쇄하여 트레할로오스 함수 결정 분말을 고형물당 92 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 실질적으로 흡습성이 없고 취급이 용이하므로 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 A-6
타피오카 전분을 농도 약 30 % 의 현탁액으로 하고 여기에 실시예 A-2 의 방법에 따라 α-아밀라아제를 작용시켜 DE 5 의 액화 전분액을 얻었다. 당질 공급원 10 w/v % 와 펩톤 0.5 w/v % 대신에 말토오스 2 w/v % 와 염화 암모늄 0.2 w/v % 및 황산 마그네슘 7 수화물 0.05 w/v % 을 사용한 외에는 실험 27 과 마찬가지로 제조한 액체 배지를 퍼어멘터에 넣고 테라박터 투메스센스 (IF012960) 종배양액 1 v/v % 로 접종하고 27℃ 에서 30 시간 통기 교반하에 배양하였다. 이 배양물에 위에서 얻은 액화 전분을 가해 농도 20 w/v % 로 하고, 다시 여기에 실험 2 의 방법으로 제조한 정제 트레할로오스 방출 효소를 당질 공급원 1 g 당 5 단위를 가하고, 또한 당질 공급원 1 g 당 이소아밀라아제 500 단위와 시클로 말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제 10 단위 및 배양물 1 ℓ당 난백 리소자임 50 mg 을 가하고 다시 48 시간 배양하였다. 수득한 배양물을 여과하여 불용물을 제거하고 여액을 가열하여 효소를 실활시켰다. 여액중에는 당조성으로 트레할로오스를 약 78 % 함유하고 있었다. 여액을 통상의 방법으로 탈색, 탈염하여 정제한 다음, 농축하면서 연속적으로 결정화하였다. 수득한 매스키트 중의 결정을 바스켓형 원심분리기에서 분리하고 최소량의 물을 분무하여 세정함으로써 고순도 트레할로오스 함수 결정을 고형물당 약 55 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 순도가 극히 높은 트레할로오스 함수 결정으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물, 더욱이는 공업을 시약, 화공 원료 등으로 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 A-7
실시예 A-6 의 방법으로 가열 실활시킨 반응 혼합물에 기질 고형분 1 g 당 글루코아밀라아제 10 단위를 가하고 pH 5.0 및 50℃ 에서 10 시간 반응 시켰다. 이 반응 혼합물을 가열하여 효소를 실활시키고 통상의 방법으로 탈색, 탈염하여 정제한 다음 농축하여 농도 약 70 % 로 하고, 이것을 결정화기에서 교반하면서 서서히 냉각하여 결정화함으로써 결정화도 약 40 % 의 매스키트를 얻었다. 이어서, 이 매스키트를 건조탑 상부에 설치된 고압 노즐로 부터 150 kg/cm2의 압력으로 분무함과 동시에 건조탑 상부로 부터 85℃ 의 열풍을 아래쪽을 향해 송풍하고, 건조탑 저부에 설치된 이송 금망 컨베이어 위에 결정 분말을 포집하였다. 컨베이어의 밑으로 부터 위쪽을 향해 45℃ 의 온풍을 보내면서 이 분말을 건조탑 밖으로 서서히 이동시켜 배출하였다. 이 결정 분말을 숙성탑에 충전하고 온풍을 보내면서 10 시간 숙성하여 결정화와 건조를 완료함으로써 트레할로오스 함수 결정 분말을 원료인 전분 고형분에 대해 약 75 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 실질적으로 흡습성이 없고 취급이 용이하므로 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 A-8
옥수수 전분을 농도 약 33 % 의 현탁액으로 하고 여기에 실시예 A-3 의 방법에 따라 α-아밀라아제를 작용시켜 DE 약 4 의 액화 전분액을 제조하였다. 당질 공급원 10 w/v % 및 펩톤 0.5 w/v % 대신에 글루코오스 2 w/v %, 질산 암모늄 0.2 w/v % 및 황산 마그네슘 7 수화물 0.05 w/v % 을 사용한 외에는 실험 27 과 마찬가지로 제조한 영양 배지를 퍼어멘터에 넣고 리조븀 sp. M-11 (FERM BP-4130) 의 종배양액 1 v/v % 으로 접종하고 27℃ 에서 24 시간 통기 교반하에 배양하였다. 이어서, 배양물에 위에서 얻은 액화 전분을 가해 농도 25 w/v % 로 하고 여기에 당질 공급원 고형분 1 g 당 이소아밀라아제 500 단위, 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제 10 단위 및 계면 활성제 " TWEEN 40 " 0.2 v/v % 을 가하고 다시 48 시간 배양하였다. 수득한 배양물을 여과하여 불용물을 제거 하고 여액을 가열하여 효소를 실활시켰다. 여액중에는 당 조성으로 트레할로오스를 약 83 % 함유하고 있었다. 여액을 통상의 방법으로 탈색, 탈염하여 정제한 다음, 농축하면서 연속적으로 결정화하였다. 수득한 매스키트중의 결정을 바스켓형 원심분리기에서 분리하고 최소량의 물을 분무하여 세정함으로써 고순도 트레할로오스 함수 결정을 고형물당 약 64 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 순도가 극히 높은 트레할로오스 함수 결정으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물, 더욱이 공업용 시약, 화공 원료 등으로 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 A-9
실시예 A-8 의 방법으로 제조한 배양물의 여액을 가열하여 효소를 실활시키고 통상의 방법으로 탈색, 탈염하여 정제한 다음 농축하여 농도 약 55 % 의 시럽을 얻었다. 이 시럽을 원당액으로 하여 칼슘형의 강산성 양이온 교환 수지인 " DOWEX 99 " (가교도 6 %, 미합중국 Dow Chemical 사제) 를 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 처리함으로써 트레할로오스 함량을 증가시킨 트레할로오스 고함유 획분을 회수하였다. 이 획분에는 건조 고형을 기준으로 트레할로오스를 97 % 함유하고 있었다. 이 획분을 통상의 방법으로 탈색, 탈염하여 정제한 후 증발기에 넣고 감압하에 끊여 수분 함량 약 3.0 % 의 시럽을 제조하였다. 이 시럽을 결정화기에 넣고 여기에 종정 (種晶) 으로서 무수 결정 트레할로오스를 시럽 고형물당 1 % 가하여 120℃ 에서 교반하면서 결정화한 다음 알루미늄제 바트로 옮겨 100℃ 에서 6 시간 숙성하여 블록을 제조하였다. 이어서, 이 블록을 절삭기에서 분쇄하여 유동 건조함으로써 수분 함량 약 0.3 % 의 무수 결정 트레할로오스 분말을 원료인 트레할로오스 고함유 당액에 대해 고형물당 약 75 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 식품, 화장품, 의약품, 이들의 원재료 또는 가공 중간물 등의 함수물의 탈수제로서 뿐만아니라 상품의 감미를 가진 감미료로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 A-10
실험 27 과 마찬가지로 제조한 액체 배지를 퍼어멘터에 넣고 아르드로박터 sp. Q36 (FERM BP-4316) 종배양액 1 v/v %로 접종하고 27℃ 에서 24 시간 통기 교반하에 배양하였다. 이 배양물에 실시예 A-8 의 방법으로 얻은 액화 전분을 가해농도 20 w/v % 로 하고, 다시 여기에 실시예 A-8 에서와 마찬가지로 이소아밀라아제와 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제를 가하고 다시 24 시간 배양하였다. 수득한 배양물을 여과하여 불용물을 제거하고 여액을 가열하여 효소를 실활시킨 다음, 실시예 A-5 와 마찬가지로 글루코아밀라아제를 작용시켰다. 반응 혼합물중에는 당 조성으로 트레할로오스를 약 81 % 함유하고 있었다. 반응 혼합물을 가열하여 효소를 실활시키고 통상의 방법으로 탈색, 탈염하여 정제한 다음, 농축하여 농도 약 75 % 로 한 것을 결정화기에 넣고 완만히 교반하면서 서서히 약 25℃ 로 냉각하여 결정화하였다. 수득한 매스키트중의 결정을 바스켓형 원심분리기에서 분리하고 최소량의 물을 분무하여 세정함으로써 고순도 트레할로오스 함수 결정을 고형물당 약 45 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 순도가 극히 높은 트레할로오스 함수 결정으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물, 더욱이 공업용 시약, 화공 원료 등으로 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 B-1 : 감미료
실시예 A-7 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 1 중량부를 " ALPHA G SWEET " (일본국의 東洋精糖 주식회사 판매의 α-글리코실 스테비오시드) 0.01 중량부와 " ASPARTAME " (일본국의 Ajinomoto 주식회사 판매의 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르) 0.01 중량부를 균일히 혼합하여 과립 성형기에서 과립상 감미료를 제조하였다. 이 제품은 감미의 질이 우수하여 수크로오스의 약 2 배의 감미도를 가지며 감미도당 칼로리는 수크로오스의 약 1/2 로 저하되어 있다. 이 감미료는 여기에 배합된 고감미도 감미물의 분해도 없고 안정성이 우수하여 저칼로리감미료로서 칼로리 섭취를 제한하고 있는 비만자, 당뇨병자 등을 위한 저칼로리 음식물 등에 대한 감미 부여에 적당하다. 또한, 이 감미료는 충치 유발균에 의한 산의 생성이 작고 불용성 글루칸의 생성도 적으므로 충치를 억제하는 음식물 등에 대한 감미 부여에도 적당하다.
실시예 B-2 : 하아드 캔디
농도 55 % 의 수크로오스 용액 100 중량부에 실시예 A-1 의 방법으로 제조한 비환원성 당질 함유 시럽 30 중량부를 가열 혼합한 다음 감압하에 수분 2 % 이하가 될 때까지 가열 농축하고, 여기에 시트르산 1 중량부와 레몬향료 적당량과 착색료를 혼화하여 통상의 방법에 따라 성형하여 표제의 제품을 얻었다. 이 제품은 깨물기와 맛이 양호하고 수크로오스의 결정화와 변형을 일으키지 않는 고품질의 하아드 캔디이다.
실시예 B-3 : 초콜렛
카카오 페이스트 40 중량부, 카카오 버터 10 중량부, 수크로오스 30 중량부, 실시예 A-10 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정 20 중량부를 혼합하여 리파이너에서 입자 크기를 작게한 다음 콘체에서 50℃ 에서 2 일간 반죽하였다. 반죽 도중 레시틴 0.5 중량부를 가하고 충분히 분산시켜 균질화한 다음 온도 조절기로 31℃ 로 조절하여 버터가 굳기 직전에 모울드속에 주입하고 진동기로 탈기한 후 10℃ 의 냉각 터널을 20 여분간 통과시켜 고화하였다. 모울드에서 내용물을 탈형하고 포장하여 제품을 얻었다. 이 제품은 흡습성이 없고 색상, 광택 및 내부 조직이 우수하며 입속에서 원만히 녹아 상품의 감미와 온화한 풍미와 맛을 가진것이다.
실시예 B-4 : 츄잉 검
검 베이스 3 중량부를 유연하게 될 정도로 가열 용융하고, 여기에 수크로오스 4 중량부와 실시예 A-5 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 3 중량부를 가하고, 적당량의 향료와 착색료를 혼합한 후 통상의 방법에 따라 로울에서 반죽하여 성형, 포장함으로써 제품을 얻었다. 이 제품은 텍스처와 풍미가 모두 양호한 츄잉 검이다.
실시예 B-5 : 가당 연유
원유 100 중량부에 실시예 A-3 의 방법으로 제조한 비환원성 당질 함유 시럽 3 중량부와 수크로오스 1 중량부를 용해하고 플레이트 히이터에서 가열 살균한 다음 70 % 로 농축하고 무균 상태에서 통조림하여 제품을 얻었다. 이 제품은 온화한 감미로서 풍미도 좋아서 유아 식품, 과실, 커피, 코코아, 차 등의 조미용으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-6 : 유산균 음료
탈지 분유 175 중량부, 실시예 A-2 의 방법으로 제조한 비환원성 당질 고함유 분말 80 종량부 및 일본국 특허 공개 제 281,795/92 호 공보에 개시되어 있는 락토수크로오스 고함유 분말 50 중량부를 물 1200 중량부에 용해하고, 65℃ 에서 30 분간 살균하여 40℃ 로 냉각한 후 여기에 통상의 방법에 따라 유산균의 스타아터 (starter)를 30 중량부 가하고 37℃ 에서 8 시간 배양하여 유산균 음료를 제조하였다. 이 제품은 풍미가 양호한 유산균 음료이고, 또한 이 제품은 올리고당을 함유하여 유산균을 안정하게 유지할 뿐만아니라 비피도스균 증식 촉진 작용을 가지고 있다.
실시예 B-7 : 분말 쥬우스
분무 건조에 의해 제조한 오렌지 과즙 분말 33 중량부에 대하여 실시예 A-6 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정 50 중량부, 수크로오스 10 중량부, 무수 시트르산 0.65 중량부, 말산 0.1 중량부, L-아스코르브산 0.1 중량부, 시트르산 나트륨 0.1 중량부, 풀룰란 0.5 중량부 및 분말 향료 적당량을 잘 혼합, 교반하고 분쇄하여 미분말로 한 후, 이것을 유동층 조립기 (造粒機) 에서 배풍 온도 40℃ 로 하고, 여기에 실시예 A-6 의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 시럽을 바인더로 하여 분무해서 30 분간 조립 (造粒) 하고 계량, 포장해서 제품을 얻었다. 이 제품은 과즙 함유율이 약 30 % 인 분말 쥬우스이고 만족하지 못한 맛과 냄새가 없으며 장기간 안정하였다.
실시예 B-8 : 커스타드 크리임
옥수수 전분 100 중량부, 실시예 A-1 의 방법으로 제조한 비환원성 당질 함유 시럽 100 중량부, 말토오스 80 중량부, 수크로오스 20 중량부 및 염화 나트륨 1 중량부를 충분히 혼합하고 계란 280 중량부를 가하여 교반하였다. 여기에 끓인 우유 1000 중량부를 서서히 가한 후 교반하면서 계속 가열하여 옥수수 전분이 완전히 호화하여 전체가 반투명하게 되었을 때 가열을 중지하고 냉각하여 적당량의 바닐라 향료를 가하고 계량, 충전, 포장하여 제품을 얻었다. 이 제품은 평활한 표면과 광택을 가지며 온화한 감미를 가지고 있다.
실시예 B-9 : 우이로-노-모토
쌀가루 90 중량부에 옥수수 전분 20 중량부, 수크로오스 40 중량부, 실시예 A-5 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 80 중량부 및 풀룰란 4 중량부를 균일히 혼합하여 우이로-노-모토를 제조하였다. 이것을 적당량의 녹차 분말 및 물과 혼련하고 용기에 넣어 60 분간 증기찜하여 분말 녹차 우이로를 제조하였다. 이 제품은 광택과 깨물기가 양호하고 풍미도 양호하다. 또한, 전분의 노화도 억제되어 비교적 장기간 보존할 수 있다.
실시예 B-10 : 안 (An : 팥 페이스트)
원료인 아즈키 (adzuki) 팥 10 중량부에 통상의 방법에 따라 물을 가하여 끓인 다음 팥의 고유한 불만족스런 냄새와 떫은 맛을 제거하고 수용성 협잡물을 제거하여 아즈키-팥 페이스트 약 21 중량부를 얻었다. 여기에 수크로오스 14 중량부와 실시예 A-3 의 방법으로 제조한 비환원성 당질 함유 시럽 5 중량부 및 물 4 중량부를 가하고 끓인 다음, 여기에 소량의 샐러드 오일을 가하고 조심스럽게 반죽하여 제품인 안 (an : 팥 페이스트) 약 35 중량부를 얻었다. 이 제품은 끓일 때 생기는 탈색도 없고 맛과 풍미가 양호하여 팥잼 만두, 팥빵, 빙과, 셔어벳 등의 재료로서 적당하다.
실시예 B-11 : 빵
밀가루 100 중량부, 효모 2 중량부, 수크로오스 5 중량부, 실시예 A-4 의 방법으로 제조한 비환원성 당질 함유 분말 1 중량부와 무기 이스트 푸우드 0.1 중량부를 통상의 방법에 따라 물과 반죽하여 26℃ 에서 2 시간 동안 발효시킨 다음 다시 30 분 숙성한 후 불에 구웠다. 이 제품은 색상도 좋고 양호하게 부풀어 올라 있어 적당한 탄력, 온화한 감미를 가진 고품질의 빵이다.
실시예 B-12 : 햄
돼지 넓적다리 고기 1000 중량부에 식염 15 중량부와 질산 칼륨 3 중량부를 가하고 균일히 갈아 냉실에서 하루 동안 퇴적한 후 물 500 중량부, 식염 100 중량부, 질산 칼륨 3 중량부, 실시예 A-4 의 방법으로 제조한 비환원성 당질 함유 분말 40 중량부 및 향신료 적당량으로 된 염지액에 냉실에서 7 일간 침지한 다음 통상의 방법에 따라 냉수로 세척하고 끈으로 말아 훈연하여 쿠킹해서 냉각 포장하여 제품을 얻었다. 이 제품은 색상, 맛, 풍미가 양호한 고품질의 햄이다.
실시예 B-13 : 분말 펩티드
40 % 식품용 대두 펩티드 용액 " HIMUTE S " (일본국의 不二製油 주식회사제) 1 중량부에 실시예 A-6 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정 분말 2 중량부를 혼합하고 플라스틱제 용기에 넣어 50℃ 에서 감압 건조하고 분쇄하여 분말 펩티드를 제조하였다. 이 제품은 풍미가 양호하여 프리믹스, 냉과 등의 제과용 재료로서 뿐만아니라 경구 유동식, 경관 유동식 등의 이유식, 치료용 영양제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-14 : 분말 된장
적색 된장 1 중량부에 실시예 A-9 의 방법으로 제조한 무수 결정 트레할로오스 분말 3 중량부를 혼합하고 다수의 반구상 凹부를 가진 금속판에 부어 넣어 이것을 실온하에서 하룻밤 정치하여 고화한 후 이형하여 1 개당 약 4 g 되는 고형 된장을 얻어 이것을 분쇄기에서 분쇄하여 분말 된장을 얻었다. 이 제품은 즉석 라면, 즉석 수우프 등의 조미료로서 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 고형 된장은 고형 조미료로서 뿐만아니라 된장 과자 등으로서도 이용할 수 있다.
실시예 B-15 : 분말 난황
생란 (生卵) 으로 부터 제조한 난황을 플레이트 히이터식 가열 살균기에서 60∼64℃ 에서 살균하여 얻은 액상 난황 1 중량부에 대하여 실시예 A-9 의 방법으로 제조한 무수 결정 트레할로오스 분말 4 중량부의 비율로 혼합한 후 용기에 옮겨 하룻밤 방치하여 트레할로오스 함수 결정으로 변환시켜 블록을 제조하였다. 이 블록을 절삭기에서 분말화하여 분말 난황을 얻었다. 이 제품은 프리믹스, 냉과, 유화제 등의 제과용 재료로서 뿐만아니라 경구 유동식, 경관 유동식 등의 이유식, 치료용 영양제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있으며, 또한 피부 정화제, 육모제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-16 : 화장용 크리임
폴리옥시에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 2 중량부, 자기 유화형 글리세릴 모노스테아레이트 5 중량부, 실시예 A-2 의 방법으로 제조한 비환원성 당질 고함유 분말 2 중량부, α-글리코실 루틴 1 중량부, 유동 파라핀 1 중량부, 트리옥탄산 글리세릴 10 중량부 및 적당량의 방부제를 통상의 방법에 따라 가열 용해하였다. 여기에 L-락트산 2 중량부, 1,3-부틸렌 글리콜 5 중량부 및 정제수 66 중량부를 가하여 오모게나이저로 유화하고, 향료를 적당량 가하여 교반 혼합하여 크리임을 제조하였다. 이 제품은 항산화성을 가지며 안정성이 높아 고품질의 햇빛 그을음 방지제, 피부 정화제, 색백제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-17 : 분말 약용 인삼 엑스
약용 인삼 엑스 0.5 중량부에 실시예 A-9 의 방법으로 제조한 무수 결정 트레할로오스 분말 1.5 중량부를 혼합한 후 용기에 옮겨 2 일간 방치하여 트레할로오스 함수 결정으로 변환시켜 블록을 제조하였다. 이 블록을 절삭기에서 분말화하고 분급하여 분말 약용 인삼 엑스를 제조하였다. 이 제품을 적당량의 비타민 B1 및 비타민 B2 와 함께 과립 성형기에서 비타민 함유 과립상 약용 인삼 엑스로 하였다. 이 제품은 피로회복제, 강장제 등으로 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 육모제 등으로서도 이용할 수 있다.
실시예 B-18 : 고체 제제
인간의 천연형 인터페론-α제품 (일본국의 주식회사 林原생물화학연구소제) 을 통상의 방법에 따라 고정화 항인터페론-α항체 칼럼에다 가하여 이 제품에 함유된 인간의 천연형 인터페론-α를 흡착시키고, 안정제인 소혈청 알부민을 함유한 완충액을 가한 다음 과잉량의 알부민을 제거한 후, 인간의 천연형 인터페론-α을 실시예 A-6 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정을 5 % 함유하는 생리 식염수를 사용하여 생리 식염수의 pH 를 변화시키면서 용출하였다. 이 용출액을 정밀 여과하고 여액을 약 20 배량의 " FINETOSE " (일본국의 주식회사 林原상사 판매의 무수 결정 말토오스 분말) 에 가하여 탈수, 분말화한 다음 이것을 타정기에서 타정하여 1 정 (약 200 mg) 당 인간의 천연형 인터페론-α를 약 150 단위 함유하는 정제를 제조하였다. 이 제품은 설하정 등으로 하여 하루에 성인 1∼10 정 정도를경구 투여하여 바이러스성 질환, 알레르기성 질환, 류머티즘, 당뇨병, 악성 종양 등의 치료에 유리하게 이용할 수 있다. 특히, 근년에 와서 환자수가 급증하고 있는 에이즈, 간염 등의 치료제로서 유리하게 이용할 수 있다. 이 제품은 본 발명의 비환원성 당질과 무수 결정 말토오스가 함께 안정제로서 작용하여 실온에서 방치하더라도 그 활성을 장기간 잘 유지한다.
실시예 B-19 : 당의정
중량 150 mg 의 소정 (素錠) 을 심제 (core material) 로 하고, 여기에 실시예 A-8 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정 분말 40 중량부, 풀룰란(평균 분자량 200,000 달톤) 2 중량부, 물 30 중량부, 탈크 25 중량부 및 산화 티탄 3 중량부로 된 용액을 코우팅하여 정제 중량이 약 230 mg 될 때까지 당의 (糖衣) 한 다음 동일한 트레할로오스 함수 결정 분말 65 중량부, 풀룰란 1 중량부 및 물 34 중량부로 된 용액을 사용하여 당의한 후 왁스액으로 광택을 나게 해서 외관이 우수한 당의정을 제조하였다. 이 제품은 내충격성도 우수하며 고품질을
실시예 B-20 : 치약
배합 (중량부)
위에 나온 재료를 통상의 방법에 따라 혼합하여 치약을 제조하였다. 이 제품은 적당한 감미를 가지고 있어 특히 어린이용 치약으로 적당하다.
실시예 B-21 : 유동식용 고체 제제
실시예 A-7 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 500 중량부, 분말 난황 270 중량부, 탈지 분유 209 중량부, 염화 나트륨 4.4 중량부, 염화 칼륨 1.8 중량부, 황산 마그네슘 4 중량부, 티아민 0.01 중량부, 아스코르브산 나트륨 0.1 중량부, 비타민 E 아세테이트 0.6 중량부 및 니코틴산 아미드 0.04 중량부로 된 조성물을 제조하고, 이 조성물 25 g 씩을 방습성 라미네이트 소형 봉지에 충전하고 히이트 시일하여 제품을 얻었다. 이 제품은 봉지 하나를 약 150∼300 mℓ의물에 용해하여 유동식으로 해서 경구적 또는 비강 (鼻腔), 위, 장 등에 경관적 사용 방법에 따라 이용되며 생체에의 에너지 보급용으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-22 : 수액제 (輸液劑)
실시예 A-10 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정을 물에 농도 약 10 w/v % 되게 용해한 다음 통상의 방법에 따라 점밀 여과하여 파이로젠 (pyrogen) 을 제거한 후 플라스틱제 병에 무균적으로 충전하여 마개로 밀봉함으로써 제품을 얻었다. 이 제품은 방치하여도 변화가 없는 안정한 수액제로서 정맥내, 복강내 등에 투여하는데 적합하다. 이 제품은 농도 10 w/v %에서 혈액과 등장 (等張) 이어서 글루코오스의 경우의 2 배 농도에서 에너지를 보급할 수 있다.
실시예 B-23 : 수액제
실시예 A-8 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정과 아래의 조성의 아미노산 배합물이 각각 5 w/v % 및 30 w/v % 되도록 물에 혼합, 용해한 다음 실시예 B-22 와 마찬가지로 정제하여 파이로젠이 제거된 용액을 얻고, 이것을 플라스틱제 병에 충전하고 마개로 밀봉하여 제품을 얻었다.
아미노산 배합물의조성
이 제품은 당질과 아미노산의 복합 수액제임에도 불구하고 트레할로오스가 환원성을 나타내지 않으므로 방치하여도 변화하지 않는 안정한 수액제이어서 정맥내, 복강내 등에 투여하는데 적당하다. 이 제품은 생체에의 에너지 보급 뿐만아니라 아미노산 보급을 하기 위해서도 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-24 : 외상 치료용 연고
실시예 A-5 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 200 중량부와 말토오스 300 중량부에, 요오드 3 중량부를 용해한 메탄올 50 중량부를 가하여 혼합하고, 여기에 10 w/v % 의 풀룰란 수용액 200 중량부를 가하여 혼합해서 적당한 확포성과 부착성을 가진 외상 치료용 연고를 제조하였다. 이 제품은 요오드에 의한 살균 작용 뿐만아니라 트레할로오스에 의한 세포에의 에너지 보급제로서도 작용하기 때문에 치유 기간이 단축되고 상처난 곳도 깨끗이 아문다.
이상으로 부터 명백한 바와 같이 비환원성 당질 생성 효소 산생능이 있는 미생물을 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해물 1 종 이상을 함유하는 영양 배지에서 배양함으로써 배양물중에서 비환원성 당질을 용이하게 제조할 수 있기 때문에 비환원성 당질 및 이를 함유하는 저환원성 당질의 공업적 생산이 용이해진다. 전분으로 부터의 비환원성 당질, 특히 α-글리코실 트레할로오스, α-글리코실 α-글리코시드 및/또는 트레할로오스와 이를 함유하는 저환원성 당질의 생산 수율은 환원성 전분 부분 분해물로서의 액화 전분 용액에 전분지절 효소 및/또는 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제를 작용시키는 방법을 채용하고, 또한 비환원성 당질 생성 효소와 트레할로오스 방출 효소를 모두 산생할 수 있는 미생물을 사용함으로써 극히 많이 증대시킬 수 있기 때문에 비환원성 당질 또는 저환원성 당질의 공업적 생산이 용이해진다. 이러한 방식으로 제조한 α-글리코실 트레할로오스, α-글리코실 α-글리코시드 및 트레할로오스 등의 비환원성 당질과 이를 함유하는 저환원성 당질은 안정성이 우수하고 온화한 상품의 감미를 가지고 있다. 더욱이 이들 당질은 경구 섭취할 경우 소화 흡수되어 칼로리원으로 된다. 특히, 트레할로오스는 비경구적으로도 사용되어 쉽사리 대사, 이용된다. 따라서, 본 발명의 비환원성 당질 및 이를 함유한 저환원성 당질은 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명은 저렴하고 무한한 자원인 전분으로 부터 종래부터 크게 요망되고는있었으나 쉽사리 제조할 수가 없었던 비환원성 당질 및 이를 함유한 저환원성 당질을 저렴하게 대량으로 제공할 수 있는 아주 새로운 길을 개척한 것이다.
따라서, 본 발명의 효과는 식품, 화장품, 의약품 업계는 물론이거니와 농수축산업, 화학공업에도 미치므로 이들 산업계에 기여하는 공업적 의의는 헤아릴 수 없는 것이다.
제 1 도는 리조븀 sp. M-11 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 그래프.
제 2 도는 리조븀 sp. M-11 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 활성에 미치는 pH 의 영향을 나타내는 그래프.
제 3 도는 리조븀 sp. M-11 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 열적 안정성을 나타내는 그래프.
제 4 도는 리조븀 sp. M-11 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 pH 안정성을 나타내는 그래프.
제 5 도는 아르드로박터 sp. Q36 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 그래프.
제 6 도는 아르드로박터 sp. Q36 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 활성에 미치는 pH 의 영향을 나타내는 그래프.
제 7 도는 아르드로박터 sp. Q36 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 열적 안정성을 나타내는 그래프.
제 8 도는 아르드로박터 sp. Q36 유래의 비환원성 당질 생성 효소의 pH 안정성을 나타내는 그래프.
제 9 도는 본 발명에 의한 트레할로오스 방출 효소와 비환원성 당질 생성 효소의 DEAE-TOYOPEARL 에서의 용출 패턴.
제 10 도는 리조븀 sp. M-11 유래의 트레할로오스 방출 효소의 활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 그래프.
제 11 도는 리조븀 sp. M-11 유래의 트레할로오스 방출 효소의 활성에 미치는 pH 의 영향을 나타내는 그래프.
제 12 도는 리조븀 sp. M-11 유래의 트레할로오스 방출 효소의 열적 안정성을 나타내는 그래프.
제 13 도는 리조븀 sp. M-11 유래의 트레할로오스 방출 효소의 pH 안정성을 나타내는 그래프.
제 14 도는 아르드로박터 sp. Q36 유래의 트레할로오스 방출 효소의 활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 그래프.
제 15 도는 아르드로박터 sp. Q36 유래의 트레할로오스 방출 효소의 활성에 미치는 pH 의 영향을 나타내는 그래프.
제 16 도는 아르드로박터 sp. Q36 유래의 트레할로오스 방출 효소의 열적 안정성을 나타내는 그래프.
제 17 도는 아르드로박터 sp. Q36 유래의 트레할로오스 방출 효소의 pH 안정성을 나타내는 그래프.

Claims (10)

  1. (가) 비환원성 당질 생성 효소 산생능이 있는 미생물을 글루코오스 중합도 3 이상의 환원성 전분 부분 분해물 1 종 이상을 함유하는 영양 배지에서 4∼40℃ 및 pH 4 ∼ 10 에서 호기적 조건하에서 10 ∼ 100 시간 배양하고,
    (나) 수득한 비환원성 당질을 배양물로부터 채취하는 것을 포함하고,
    (다) 상기 비환원성 당질이 분자 말단에 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질,
    분자 내에 트레할로오스 구조를 가진 비환원성 당질 또는 트레할로오스인 것을 특징으로 하는 비환원성 당질의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 환원성 전분 부분 분해물은 DE 15 이하의 액화 전분에 전분 지절 효소 및/또는 시클로말토멕스트린 글루카노트란스퍼라아제를 배지 중에서 또는 배지없이 작용시켜 수득되는 것인 제조 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 환원성 전분 부분 분해물을 3 w/v % 이상 영양 배지에 첨가하는 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 미생물이 리조븀, 아르드로박터, 브레비박테륨, 플라보박테륨, 마이크로코커스, 쿠르토박테륨, 마이코박테륨 또는 테라박터 등의 속 (屬)에 속하는 미생물인 제조 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 미생물이 비환원성 당질 생성 효소와 더불어 트레할로오스 방출 효소를 생성능이 있는 것인 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 배양물을 뱃치식, 연속식 또는 반연속식으로 실시하는 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 배양물에 α-아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 α-글루코시다아제를 작용시키는 제조 방법.
  8. (가) 제 8 항의 방법을 실시하여 비환원성 당질을 생성하고,
    (나) 상기 공정단계 (가)에서 얻은 비환원성 당질을 식품재료에 첨가하는 것을 포함하는 식품의 제조방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 비환원성 당질을 1 종 이상의 환원성 당질과 더불어 함유시키는 제조 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 비환원성 당질은 1 종 이상의 환원성 당질을 추가로 함유하는 제조 방법.
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