DE69505437T2

DE69505437T2 - Kristalline Maltotetraosylglucosid, ihre Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE69505437T2
Application number: DE69505437T
Authority: DE
Inventors: Takahiko Okayama-Shi Okayama Mandai; Toshio Okayama-Shi Okayama Miyake; Takashi Souja-Shi Okayama Shibuya; Toshiyuki Okayama-Shi Okayama Sugimoto
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1994-03-01
Filing date: 1995-02-28
Publication date: 1999-06-02
Anticipated expiration: 2015-03-01
Also published as: KR100469524B1; KR100356840B1; DE69505437D1; KR100381897B1; EP0670327B1; KR950032256A; US5922691A; EP0670327A1; KR100350846B1; TW397840B

Description

Diese Erfindung betrifft ein neues kristallines Saccharid und seine Herstellung und Verwendung, insbesondere ein kristallines Maltotetraosylglucosid und seine Herstellung und Verwendung.
Maltopentaose ist ein Pentasaccharid der allgemeinen Formel O- α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-O-α-D-glucopyranosyl-1(l→4)-O-α-Dglucopyranosyl-(1→4)-0-a-D-glucopyranosyl-(1→4)-D-glucopyranose und ist als Süßungsmittel bekannt gewesen, das in Stärkesirup oder seinem Pulver enthalten ist. Dieses Saccharid hat eine charakteristische geringe Süße und eine geeignete Viskosität und wird in Zusammensetzungen, einschließlich Getränken, Nahrungsmitteln und Genußmittelprodukten, wie Tabak und Zigaretten, verwendet. Da Maltopentaose ein reduzierendes Saccharid ist, hat es allerdings Nachteile dergestalt, daß es schnell eine Bräunungsreaktion zusammen mit Proteinen und Aminosäuren, die in Getränken und Nahrungsmitteln enthalten sind, verursacht, womit eine Verschlechterung und ein Abbau dieser Produkte induziert wird.
Die Erfinder haben mit Energie Lösungen zur Überwindung dieser Nachteile untersucht und haben festgestellt, daß die Herstellung eines nicht-reduzierenden Maltotetraosylglucosids aus Maltopentaose erhältlich ist, indem ein reduzierendes Stärketeilhydrolysat mit einem Glucosepolymerisationsgrad von drei oder höher der Wirkung eines Enzyms ausgesetzt wird, das ein nicht-reduzierendes Saccharid mit Trehalosestruktur als Endeinheit (nachfolgend in der Beschreibung als "ein nichtreduzierendes saccharidbildendes Enzym" genannt), welches in der japanischen Patentanmeldung Nr. 349,216/93 beschrieben ist, bilden kann. Allerdings ist dieses nicht-reduzierende Saccharid von Maltotetraoseglucosid in Pulverform amorph und physikalisch instabil, und wegen der Stabilität bestand ein Bedarf hinsichtlich der Bereitstellung eines kristallinen Maltotetraosylglucosids.
Diese Erfindung hat zur Aufgabe, ein kristallines Maltotetraosylglucosid zur Verfügung zu stellen, das nicht hygroskopisch, nicht reduzierend, ausgezeichnet fluide, schwach fermentierbar und ausgezeichnet lösbar ist, und ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung anzugeben.
Die vorliegende Erfindung stellt ein wasserhaltiges oder wasserfreies kristallines Maltotetraosylglucosid zur Verfügung, das Beugungswinkel (26) von 12,6º, 21,3º, 22,1º und 22,8º bei der Pulverröntgenstrahlbeugungsanalyse für diese wasserhaltige kristalline Maltotetraosylglucosid aufweist, oder das Beugungswinkel (2θ) von 12,7º, 13,7º, 18,8º und 23,2º bei det Pulverröntgenstrahlbeugungsanalyse für dieses wasserfreie kristalline Maltotetraosylglucosid aufweist. Des weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendungen zur Verfügung.
Zur Überwindung der Nachteile des Standes der Technik haben die Erfinder mit Energie Untersuchungen durchgeführt. Während die Reaktion zur Umwandlung von Maltopentaose in ein Maltotetraosylglucosid durch Einstellung hochreiner Maltopentaose auf eine relativ hoch-konzentrierte Lösung von Maltopentaose und Aussetzen der erhaltenen Lösung der Wirkung eines nichtreduzierenden Saccharid bildenden Enzyms fortschreitet, haben im Ergebnis die Erfinder festgestellt, daß die Lösung unter Bildung eines Niederschlags trübe wird, und es ist weiterhin festgestellt worden, daß dieser Niederschlag ein kristallines Maltotetraosylglucosid ist, was zu dieser Erfindung durch Feststellung eines neuen kristallinen Maltotetraosylglucosids und seiner Herstellung und Verwendung führte. Des weiteren haben die Erfinder festgestellt, daß wasserhaltige und wasserfreie kristalline Maltotetraosylglucoside vorhanden waren, so daß diese Erfindung die Herstellung von kristallinem Maltotetraosylglucosid und seinen Verwendungen zur Verfügung stellt. Die vorliegende Erfindung wird nun weiterhin im einzelnen, allerdings nur beispielhaft, mit Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben.
Fig. 1 erläutert die Wirkung der Temperatur auf die Aktivität eines nicht-reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms von Rhizobium M-11.
Fig. 2 erläutert die Wirkung auf den pH auf die Aktivität eines nicht-reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms von Rhizobium M-11.
Fig. 3 erläutert die thermische Stabilität eines nichtreduzierenden Saccharid bildenden Enzyms von Rhizobium M-11.
Fig. 4 erläutert pH-Stabilität eines nicht-reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms von Rhizobium M-11.
Fig. 5 erläutert das Infrarotabsorptionsspektrum von wasserhaltigem kristallinen Maltotetraosylglucosid.
Fig. 6 erläutert das Infrarotabsorptionsspektrum von wasserfreiem kristallinen Maltotetraosylglucosid.
Fig. 7 erläutert die Ergebnisse der Kohlenstoff-Kernresonanzanalyse von Maltotetraosylglucosid.
Fig. 8 erläutert die Pulverröntgenstrahlbeugungsfigur von wasserhaltigem kristallinen Maltotetraosylglucosid.
Fig. 9 erläutert die Pulverröntgenstrahlbeugungsfigur von wasserfreiem kristallinen Maltotetraosylglucosid.
Verfahren zur Herstellung eines kristallinen Maltotetraosylglucosids gemäß dieser Erfindung sind solche, bei denen der erfindungsgemäße Kristall gebildet werden kann, wobei in der Regel eine wäßrige Lösung von Maltotetraosylglucosid kristallisiert wird, um den entstehenden Kristall zu gewinnen. Insbesondere handelt es sich erfindungsgemäß um ein Verfahren, worin die Lösung von Maltotetraosylglucosid übergesättigt und kristallisiert wird, um den entstehenden Kristall zu sammeln. Zur Herstellung von Maltotetraosylglucosid wird erfindungsgemäß beispielsweise ein Verfahren angewandt, worin man eine Lösung von Maltopentaose auf ein nicht-reduzierendes Saccharid bildendes Enzym wirken läßt. Als Lösung von Maltopentaose kann eine hoch-reine Maltopentaose verwendet werden, in der Regel verwendet man eine Maltopentaoselösung, die erhalten wird, indem eine stärkehaltige Substanz, wie ein Stärkeprodukt, gelatinierte Stärke, verflüssigte Stärke, gelöste Stärke, Amylose, Amylopektin und Dextrin der Wirkung von α-Amylase oder einer Mischung aus α-Amylase und einem Stärkeentzweigungsenzym ausgesetzt wird.
Erfindungsgemäß verwendbare Alpha-Amylasen sind solche mit einem relativ großen Produktionsvermögen für Maltopentaose, wobei beispielsweise "TERMAMYL 60L", eine α-Amylase von Novo Nordisk Bioindustry, Kopenhagen, Dänemark, bevorzugt eingesetzt wird.
Erfindungsgemäß verwendbare Stärkeentzweigungsenzyme sind solche, die die Verzweigungstruktur von stärkehaltigen Substanzen trennen und die Produktivität von Maltopentaose aus stärkehaltigen Substanzen durch Einwirken zusammen mit α-Amylase erhöhen können, wobei beispielsweise Pullulanase von Aerobacter aerogenes und Isoamylase von Pseudomonas amyloderamosa, im Handel erhältlich von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc. Okayama, Japan, verwendbar sind, und insbesondere die gemeinsame Verwendung mit Isoamylase wegen ihrer spezifischen Eigenschaften wünschenswert ist.
Die Maltopentaoselösung, die durch Aussetzen stärkehaltiger Substanzen der Wirkung von α-Amylase oder einer Mischung von α-Amylase und eines Stärkeentzweigungsenzyms erhalten wird, enthält in der Regel Maltopentaose im Bereich von 20 bis 40 G/G-% (die hier verwendeten Prozentangaben sollen "G/G-% auf Feststofftrockenbasis" bedeuten, falls nichts anderes angegeben ist); und nach Bedarf kann nach herkömmlichen Trennungs- und Reinigungsmethoden, der Gehalt an Maltopentaose in dieser Lösung erhöht werden, so daß die in dieser Weise konzentrierte Lösung insbesondere verwendbar ist.
Die erfindungsgemäß verwendbaren nicht-reduzierenden Saccharid bildenden Enzyme sind beispielsweise solche, die von den Erfindern in der japanischen Patentanmeldung Nr. 349,216/93, wie Rhizobium sp M-11 und Arthobacter sp Q36, beschrieben sind und im Patent Microorganism Depository, National Institute of Bioscience and Human-technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan unter den Hinterlegungsnummern FERM BP-4130 und FERM BP- 4316 hinterlegt worden sind, und Enzympräparationen, die durch Züchten in Nährkulturmedien herkömmlicher Mikroorganismen erhältlich sind, welche nicht-reduzierende Sacchride bilden können, beispielsweise Brevibacterium helovolum (ATCC 11822), Flavobacterium aquatile (IFO 3772), Micrococcus luteus (IFO 3064), Micrococcus reseus (ATCC 186), Curtobacterium citreum (IFO 15231), Mycobacterium smegmatis (ATCC 19420) und Terrabacter tumescens (IFO 12960). Falls notwendig, können diese Enzympräparationen entsprechend herkömmlicher Verfahren vor ihrer Verwendung gereinigt werden.
Die in dieser Weise erhaltenen nicht-reduzierenden Saccharidenzyme sind charakteristisch dahingehend, daß sie ein nichtreduzierendes Saccharid mit Trehalosestruktur als Endeinheit aus einem oder mehr Mitgliedern der Gruppe nicht-reduzierende Stärketeilhydrolysate mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 3 oder höher bilden können. Erfindungsgemäß kann jede Enzymreaktionsdauer für die Einwirkung des nicht-reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms innerhalb eines Bereichs ausgewählt werden, worin Maltopentaose der Wirkung dieses Enzyms zur Umwandlung in Maltotetraosylglucosid ausgesetzt werden kann und das Enzym kann willkürlich nach Verwendung von α-Amylase oder einer Mischung aus α-Amylase und einem Stärkeentzweigungsenzym oder zusammen mit diesen Enzymen verwendet werden.
Jede Bedingung für die enzymatische Reaktion kann erfindungsgemäß angewendet werden, so lange sie die Enzymreaktion fortschreitet, im allgemeinen können erfindungsgemäß eine Substratkonzentration im Bereich von 1 bis 70%, eine Reaktionstemperatur im Bereich von etwa 10 bis 80%, ein ReaktionspH im Bereich von etwa 4 bis 10 und eine Reaktionsdauer im Bereich von etwa 1 bis 100 Stunden erfindungsgemäß angewendet werden. Bei dieser Reaktion können nach Bedarf die Enzyme willkürlich in kontinuierlicher Weise oder im Batchverfahren verwendet werden, wenn sie durch herkömmliche Verfahren, einschließlich Trägerbindungsverfahren, Vernetzungsverfahren und Einfangverfahren, immobilisiert sind.
Zusätzlich zu der vorgenannten Herstellung von Maltotetraosylglucosid ist ein Verfahren unter Verwendung eines Saccharid übertragenden Enzyms erfindungsgemäß favorisiert, beispielsweise ist eine Lösung von Maltotetraosylglucosid erhältlich, indem eine wäßrige Lösung, die eine Mischung und Trehalose und stärkehaltiger Substanz enthält oder die ein nichtreduzierendes Saccharid mit Trehalosestruktur als Endeinheit enthält, der Wirkung von Cyclomaltodextringlucanotransferase ausgesetzt wird oder falls notwendig, weiterhin eine α-Amylase oder eine Mischung aus α-Amylase und Stärkeentzweigungsenzym nach der Umsetzung mit Cyclomaltodextringlucanotransferase einwirkt, es ist insbesondere erfindungsgemäß bevorzugt, den Gehalt an Maltotetraosylglucosid in dieser Lösung zu erhöhen.
Lösungen, die durch die vorgenannte Enzymreaktion erhalten werden, enthalten in der Regel etwa 1 bis 90% Maltotetraosylglucosid. Zur Herstellung von kristallinem Maltotetraosylglucosid aus diesen Lösungen können sie im allgemeinen eingeengt werden, um Maltotetraosylglucosid zu kristallisieren, wonach dann der Kristall gewonnen wird. Im allgemeinen werden konkurrierende Saccharide aus einer Rohlösung nach herkömmlichen Verfahren entfernt, die erhaltene Lösung enthält hochreines Maltotetraosylglucosid und diese Lösung wird eingeengt, wonach dann Maltotetraosylglucosid kristallisiert wird und das Kristall gewonnen wird.
Als Trennungs- und Reinigungsverfahren sind die Hefefermentierung, die Membranfiltration, die Fraktionssedimentation, eine Alkalibehandlung und/oder Säulenchromatographie willkürlich verwendbar. Insbesondere ist die Säulenchromatographie unter Verwendung eines stark-sauren Kationenaustauschers gemäß japanischem Patent Kokai Nr. 23,799/83 und Nr. 148,794/84 zur Entfernung konkurrierender Saccharide und Sammeln von Fraktionen, die reich an Maltotetraosylglucosid sind favorisiert. Bei dieser Chromatographie können willkürlich herkömmliche Festbett methoden, Bewegungsbettmethoden und simulierte Bewegungsbettmethoden angewendet werden.
Zur Kristallisation von Maltotetraosylglucosid aus den obigen Fraktionen, die reich an Maltotetraosylglucosid sind, werden geeignete Bedingungen für diese Kristallisation in Abhängigkeit der Art der kristallinen Form gewählt. Die Bedingungen für eine erfindungsgemäß ereignete Kristallisation sind solche, worin aus übergesättigten Lösungen von Maltotetraosylglucosid kristallines Maltotetraosylglucosid kristallisieren können.
Bei den vorgenannten Bedingungen für die Kristallisierung wird insbesondere eine nicht weniger als etwa 10%ige Maltotetraosylglucosidlösung eingeengt, um eine Konzentration von etwa 5 bis etwa 95% zu ergeben, und die Temperatur der erhaltenen Lösung liegt innerhalb eines Bereichs, worin die Lösung nicht gefroren ist, und sie hat eine Temperatur über dem Schmelzputzt des kristallinen Maltotetraosylglucosids und sie verursacht keine lästige Bräunungsreaktion und Abbau von Maltotetraosylglucosid. Im Fall des wasserhaltigen kristallinen Maltotetraosylglucosids ist beispielsweise die Kristallisation von Maltotettaosylglucosidlösungen mit nicht weniger als etwa 5% Wassergehalt bei etwa 5 bis 100ºC machbar, und beim wasserfreien kristallinen Maltotetraosylglucosid ist erfindungsgemäß die Kristallisation von Maltotetraosylglucosidlösungen mit nicht mehr als etwa 10% Wassergehalt bei etwa 90 bis 150ºC machbar. Außerdem kann wasserfreies kristallines Maltotetraosylglucosid ohne weiteres hergestellt werden, indem ein wasserhaltiges kristallines Maltotetraosylglucosid bei vermindertem Druck trocknet oder durch Einwirkung von Hitze trocknet. Zur Einstellung eines Übersättigungsgrades und der Viskosität von Maltotetraosylglucosidlösungen bei der Kristallisation können willkürlich Ethanol, Methanol und/oder Aceton verwendet werden. In dieser Erfindung sind Methoden für die Kristallisa tion von Maltotetraosylglucosid in der Regel solche, worin eine übergesättigte Lösung von Maltotetraosylglucosid auf eine relativ hohe Temperatur eingestellt wird und in einem Kristallisationsapparat eingegeben wird und nach Bedarf ein Impfkristall in einer Menge von 0,1 bis 5% zugemischt wird, die erhaltene Mischung unter Rühren allmählich abgekühlt wird, um die Kristallisation unter Bildung einer Masse zu erleichtern. Da des weiteren kristallines Maltotetraosyl ohne weiteres die Kristallisation einleiten kann, ist die kontinuierliche Kristallisation von Maltotetraosylglucosid, worin die Lösung von Maltotetraosylglucosid kontinuierlich eingeengt wird, erfindungsgemäß favorisiert. Als Methoden zur Herstellung von kristallinem Maltotetraosylglucosid aus diesen kristallisierten Massen sind beispielsweise herkömmliche Methoden zur Trennung, die Blockpulverisierung, wie Granulierung im Wirbelbett und das Sprühtrocknen anwendbar.
Beispielsweise sind Trennungsmethoden in der Regel solche, bei denen die Masse in eine Trommelzentrifuge eingegeben werden kann und die Maltotetraosylglucosidkristalle aus der Molasse getrennt werden, nach Bedarf können diese Kristalle ohne weiteres gewaschen werden, indem darauf eine kleine Menge eisgekühltes Wasser oder Alkohol gesprüht wird, und diese Trennungsmethode ist für die Herstellung von hoch-reinem kristallinen Maltotetraosylglucosid geeignet. Weitere drei Methoden sind für die Herstellung eines Pulvers, das kristallines Maltotetraosylglucosid enthält, ohne Trennung der Molasse geeignet, weil bei ihnen die Ausbeute der Herstellung von kristallinem Maltotetraosylglucosid erhöht werden kann, allerdings ist die Reinheit der mit diesen drei Methoden erhaltenen Kristalle nicht besonders gut. Demzufolge sind zusätzlich zu den Kristallen von Maltotetraosylglucosid Oligosaccharide, einschließlich Maltotetraose und Maltopentaose in dem Material vorhanden oder werden im Produktionsverfahren gebildet.
Beim Sprühtrocknen wird in der Regel die Maltotetraosylglucosidmasse mit einer Kristallinität von etwa 30 bis 60% aus einer Hochdruckpumpe durch ihre Düse gesprüht, bei einer hohen Temperatur, wobei die Maltotetraosylkristalle nicht schmelzen, beispielsweise bei etwa 60 bis 100ºC, hitzegetrocknet und gealtert, indem heiße Luft zur Bildung von kristallinem Maltotetraosylglucosidpulver durchgeblasen wird.
Bei der Blockpulverisierung läßt man in der Regel die Maltotetraosylglucosidmasse mit einer Kristallinität von etwa 20 bis 80% für etwa 0,5 bis 3 Tage zur Kristallisierung und Bildung eines Blocks stehen, und der erhaltene Block wird pulverisiert oder abgekratzt, wonach dann unter Bildung von kristallinem Maltotetraosylglucosidpulver getrocknet wird.
Das in dieser Weise erhaltene kristalline Maltotetraosylglucosid ist im wesentlichen nicht hygroskopisch und frei fließend, obwohl die Nicht-Hygroskopizität je nach Reinheit variiert, und es kann leicht gehandhabt werden, ohne daß Viskositätserscheinungen und Verfestigungen auftreten, und diese Eigenschaften reduziert die Material- und Personalkosten, die notwendig sind, um die Verpackung, den Transport und die Lagerung des kristallinen Maltotetraosylglucosids zu regeln. Das erfindungsgemäße kristalline Maltotetraosylglucosid ist ein im wesentlichen wenig oder nicht-hygroskopisches Pulver mit relativ hoher Wärmebeständigkeit und Stabilität, und es kann als Träger, Zusatzstoff und Pulverbasis in gepulverten Süßungsmittelmischungen, Schokolade, Kaugummi, Instantsaft, Instantsuppe, Granulae und Tabletten verwendet werden, die nach herkömmlichen Methoden erhältlich sind, beispielsweise in Getränken, Kosmetika, Pharmazeutika, Formkörpern und anderen Zusammensetzungen, sowie auf verschiedenen Anwendungsgebieten, wie als Reagenz und Rohmaterial für die chemische Industrie. Des weiteren variieren je nach Reinheit die physikochemischen Eigenschaften des kristallinen Maltotetraosylglucosids, wie der Schmelzpunkt und das spezifische Drehvermögen. Der Schmelzpunkt erniedrigt sich in Abhängigkeit in der Abnahme der Reinheit des Maltotetraosylglucosids und sein Bereich ist breit und deshalb ist ein kristallines Maltotetraosylglucosid nach Bedarf anwendbar, indem seine Reinheit je nach Anwendung ausgewählt wird.
Das erfindungsgemäße Maltotetraosylglucosid hat eine güte Süßungskraft. Bei der oralen Einnahme ist es verdaubar und als Energiequelle verwendbar. Es ist des weiteren als Süßungsmittel gegen Karies verwendbar, da es im wesentlichen nicht durch Zahnkaries induzierende Mikroorganismen fermentierbar ist, und das kristalline Maltotetraosylglucosid ist wegen seiner guten Süßkraft und Verwendbarkeit als Träger, insbesondere als Zuckerbeschichtungsmittel von Tabletten unter gleichzeitiger Verwendung mit Bindemitteln, wie Pullulan und/oder Hydroxyethylstärke, bevorzugt verwendbar. Des weiteren hat das kristalline Maltotetraosylgluccsid andere Eigenschaften, wie Körperverträglichkeit, Feuchtigkeitserhaltung, das Vermögen zur Verhinderung der Kristallisation anderer Saccharide, eine geringe Fermentierung und eine geringe Löslichkeit.
Diese Eigenschaften des kristallinen Maltotetraosylglucosids sind insbesondere nützlich bei der Herstellung von verschiedenen Zusammensetzungen, einschließlich Nahrungsmitteln, Getränken, Nahrungsmitteln, Kosmetika, Pharmazeutika und Formkörpern.
Das erfindungsgemäße Maltotetraosylglucosid ist intakt als Gewürz zum Süßen verwendbar. Dieses kristalline Maltotetraosylglucosid kann nach Bedarf zusammen mit einer geeigneten Menge eines oder mehrerer anderer Süßungsmittel, z. B. pulverförmigem Stärkesirup, Glucose, Maltose, Saccharose, isomerisiertem Zucker, Honig, Ahornzucker, Sorbit, Dihydrochalcon, Steviosid, α-Glycosylsteviosid, Rebaudiosid, Glycyrrhizin, L-Aspartyl-L- phenylalaninmethylester, Saccharin, Glycin und Alanin, und nach Bedarf zusammen mit einem Füllstoff, wie Dextrin, Stärke und Laktose, verwendet werden. Des weiteren ist es erfindungsgemäß insbesondere bevorzugt, das kristalline Maltotetraosylglucosid mit verbesserter Löslichkeit zusammen mit Oligosacchariden, wie Maltotetraose und Maltopentaose, zu verwenden.
Des weiteren kann das kristalline Maltotetraosylglucosid intakt als Füllstoff, Träger oder Pulverbasis oder nach Bedarf nach Zumischen anderer Füllstoffe, Träger und/oder Bindemittel verwendet werden. Es kann ebenfalls in ein Granulat, ein Kügelchen, eine kurze Stange, eine Platte, einen Kubus oder eine Tablette geformt werden.
Des weiteren ist das erfindungsgemäße kristalline Maltotetraosylglucosid bevorzugt anwendbar, um Nahrungsmittel und Getränke im allgemeinen zu süßen und auch deren Geschmack und Qualitäten zu verbessern, weil sein Geschmack gut mit Substanzen anderer Geschmackstypen, wie saurer, salziger, astringenter, delikater und bitterer Geschmack, gut harmonisiert, beispielsweise ist das erfindungsgemäße kristalline Maltotetraosylglucosid vorzugsweise in verschiedenen Gewürzen, wie Sojasoße, Miso, Essig, Soße, Mayonnaise und "Mirin (stark gesüßter Sake)" bevorzugt anwendbar. Des weiteren ist das erfindungsgemäße kristalline Maltotetraosylglucosid bevorzugt anwendbar, um verschiedene Nahrungsmittel, einschließlich japanische Süßwaren, westliche Süßwaren, gefrorene Desserts, Sirups, Pasten, verarbeitete Gemüse, eingelegte Produkte, Fleischprodukte, Frischfleischprodukte, alkoholische Getränke und Getränke zu süßen und damit ihren Geschmack und ihre Qualität zu verbessern. Da das erfindungsgemäße kristalline Maltotetraosylglucosid weniger hygroskopisch und frei fließend ist, kann das kristalline Maltotetraosylglucosid bei Kaugummi, "su-konbu", Bonbons und "gyuhi (Stärkepaste)" als Beschichtungsmaterial durch Beschichten der Oberflächen dieser Produkte bevorzugt verwen det werden, da es eine Anhaftung des Einwickelpapiers mit der Oberfläche der Produkte verhindert oder das Abgleiten des Einwickelpapiers von der Oberfläche der Produkte verbessert. Da darüber hinaus das erfindungsgemäße kristalline Maltotetraosylglucosid eßbar, relativ gering löslich und wärmebeständig ist, ist das kristalline Maltotetraosylglucosid insbesondere als Vormischungen für die Reiskuchenbeschichtung, Brötchen- und Bratenbeschichtung und als Ersatz für Beschichtungs- und Vereisungsmaterialien für Brötchen und Kuchen verwendbar, und es ist weiterhin verwendbar, um andere pulverförmige Materialien, wie Weizenmehl, Maissand und Stärke, jeweils teilweise oder im ganzen, einsetzbar, um Vormischungen für Puddings, warmen Kuchen, Konfekt und Brötchen zu erhalten. Des weiteren kann das erfindungsgemäße kristalline Maltotetraosylglucosid in Nahrungen und Haustiernahrungen für Haustiere und Federvieh verwendet werden, und es ist weiterhin bevorzugt verwendbar als Süßungsmittel für Zusammensetzungen, einschließlich Kosmetika und Pharmazeutika, wie Zigaretten, Zahnpasta, Pastillen und innere Medizin und auch als Geschmacksverbesserer, Geschmacksmaskierer und Qualitätsverbesserer.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist ein intaktes kristallines Maltotetraosylglucosid oder sie wird in der Regel hergestellt, indem kristallines Maltotetraosylglucosid zusammen mit einem oder mehr Mitgliedern der Gruppe bestehend aus Nährsubstanzen, wie Proteine, Aminosäuren, Fettsäuren, Vitamine und Mineralien oder pharmazeutischen Substanzen, wie antibakterielle Substanzen, Enzyme, Hormone und Cytokine, je nach Verwendung dieser Zusammensetzungen, vermischt wird. Nach Bedarf ist es bevorzugt machbar, andere geeignete Substanzen in diese erfindungsgemäße Zusammensetzung einzuarbeiten, zum Beispiel ein oder mehr Mitglieder der Gruppe von Geschmacksmaskierern, Farbmitteln, Geschmacksmitteln, Stabilisatoren, Füllstoffe und Träger, und es ist insbesondere machbar, die in dieser Weise erhaltenen Zusammensetzungen in eine geeignete Form, je nach Anwendungsgebiet der Zusammensetzungen, zu bringen. Verfahren zum Einbringen von kristallinem Maltotetraosylglucosid in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, sind solche, bei denen kristallines Maltotetraosylglucosid vor Vervollständigung ihrer Verarbeitung enthalten sind, Herkömmliche Methoden, wie beispielsweise Vermischen, Schmelzen, Aufsaugen, Eindringen, Verstreuen, Auftragen, Beschichten, Sprühen, Injizieren, Kristallisation und Verfestigung können verwendet werden.
Die Menge des kristallinen Maltotetraosylglycosids für die Einarbeitung in diesen Zusammensetzungen beträgt in der Regel 0,1% oder mehr, insbesondere 0,2% oder mehr, was von der Art dieser Zusammensetzungen abhängt. Die in dieser Weise erhaltenen Zusammensetzungen finden verbreitete Anwendungen in Nahrungsmitteln, Getränken, Kosmetika und Pharmazeutika, die peroral oder parenteral verwendet werden und auch in Produkten für den Hausgebrauch, in der Landwirtschaft, Waldwirtschaft, Fischwirtschaft und in der chemischen Industrie.
Die folgenden Experimente werden nun die Erfindung im einzelnen erklären.
Experiment A erklärt zunächst die Herstellung, Reinigung und Charakterisierung eines nicht-reduzierenden Saccharid bildenden Enzym aus Rhizobium sp M-11 und erläutert dann die Herstellung von Trehalose und nicht-reduzierenden Sacchariden mit Trehalosestruktur als Endeinheit aus reduzierenden Stärketeilhydrolysaten unter Verwendung dieses Enzyms. Experiment B erklärt die Herstellung und physikochemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Maltotetraosylglucosids.

Experiment A-1

Herstellung des nicht-reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms aus Rhizobium sp M-11

Ein flüssiges Kulturmedium aus 2,0 G/V-% Maltose, 0,5 G/V-% Pepton, 0,1 G/V-% Hefeextrakt, 0,1 G/V-% Dinatriumhydrogenphosphat, 0,1 G/V-% Kaliumdihydrogenphosphat und Wasser wurde auf einen pH von 7,0 eingestellt. Das flüssige Medium wurde in 100 ml-Aliquotes aufgeteilt, die dann separat in 500 ml-Kolben gegeben wurden, bei 120ºC für 20 Minuten in einem Autoklaven sterilisiert, abgekühlt, mit Rhizobium sp M-11 (FERM BP-4130) geimpft und bei 27ºC für 24 Stunden unter Rühren bei 130 rpm unter Erhalt einer Impfkultur inkubiert.
Etwa 20 l eines Kulturmediums, das die gleiche Zusammensetzung wie die Impfkultur hatte, wurde in einen 30 l-Becherfermenter gegeben, sterilisiert, auf 30ºC abgekühlt, mit 1 V/V-% der Impfkultur geimpft und bei 30ºC und einem pH von 6,0-8,0 für 24 Stunden unter Belüftung und Rühren inkubiert. Die Enzymaktivität der erhaltenen Kultur betrug etwa 1,5 Einheiten/ml. Ein Teil der Kultur wurde in Zellen und Überstand zentrifugiert und die Zellen wurden dann in 50 mMol Phosphatpuffer (pH 7,0) unter Erhalt des Anfangsvolumens suspendiert, wonach dann die erhaltene Zellsuspension und der Überstand auf Enzymaktivität untersucht wurden. Im Ergebnis hatte die Zellsuspension eine Enzymaktivität von etwa 0,6 Einheiten/ml, während der Überstand eine Enzymaktivität von etwa 0,9 Einheiten/ml aufwies.
Das nicht-reduzierende Saccharid bildende Enzym wird wie folgt untersucht: Zu 4 ml 1,25 G/V-% Maltopentaose als Substrat (50 mMol Phosphatpuffer, pH 7,0) wird 1 ml einer Enzymlösung gegeben und die Mischung wird bei 40ºC für 60 Minuten inkubiert auf 100ºC für 10 Minuten zur Inaktivierung des Enzyms erhitzt, genau durch das 10-fache in deionisiertem Wasser verdünnt und auf das Reduktionsvermögen durch die Somogyi-Nelson-Methode bestimmt. Als Kontrolle wird eine frische Präparation der gleichen Enzymlösung durch Erhitzen derselben bei 100ºC für 10 Minuten inaktiviert und dann ähnlich wie oben getestet. Eine Einheit des Enzyms wird als Menge Enzym definiert, die 1 Mikromol Reduktionskraft von Maltopentaose pro 1 Minute unter den gleichen Bedingungen vermindert.

Experiment A-2

Reinigung des Enzyms

Etwa 18 l der Kultur in Experiment A-1 wurde mit "MINI-LAB", ein Superhochdruckzellhomogenisator (ein Produkt von Dainippon Pharmazeutical Co., Ltd., Osaka, Japan) zur Zerstörung der Zellen behandelt. Das Ergebnis wurde bei 10.000 rpm für 30 Minuten zentrifugiert, um etwa 16 l Überstand zu erhalten. In den Überstand wurde Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad von 0,2 gelöst, und man ließ die erhaltene Lösung bei 4ºC für 1 Stunde stehen und zentrifugierte dann bei 10.000 rpm für 30 Minuten, um einen Überstand zu erhalten.
Zusätzlich wurde in diesem Überstand Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad von 0,6 gelöst und man ließ die erhaltene Lösung bei 4ºC für 24 Stunden stehen und zentrifugierte dann bei 10.000 rpm für 30 Minuten, um das erhaltene Sediment zu sammeln. Das Sediment wurde in 10 mMol Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst, gegen eine frische Präparation des gleichen Puffers für 24 Stunden dialysiert und bei 10.000 rpm bei 30 Minuten zentrifugiert, um unlösliche Substanzen zu entfernen. Die dialysierte Lösung (360 ml) wurde in zwei Teile geteilt, die dann getrennt einer Ionenaustauschersäulenchromatographie unter Verwendung von 300 ml "DEAE TOYOPEARL®", ein Gel von Tosoh Corporation, Tokyo, Japan, unterworfen wurden.
Das jeweilige Enzym, das auf DEAE TOYOPEARL adsorbierte, wurde von der Säule mit einer frischen Präparation des gleichen Phosphatpuffers, der Natriumchlorid enthielt, eluiert. Die erhaltenen enzymaktiven Fraktionen wurden gegen eine frische Präparation des gleichen Phosphatpuffers, der 2 Mol Ammoniumsulfat enthielt, dialysiert und weiterhin bei 10.000 rpm für 30 Minuten zentrifugiert, um unlösliche Substanzen zu entfernen, und der erhaltene Überstand wurde einer hydrophoben Säulenchromatographie unter Verwendung von 300 ml "BUTYL TOYOPEARL® 650", ein Gel von Tosoh Corporation, Tokyo, Japan, unterworfen. Das auf der Säule adsorbierte Enzym wurde mit einem linearen Gradientenpuffer, der von 2 Mol auf 0 Mol abstieg, eluiert und die enzymaktiven Fraktionen wurden gesammelt. Zusätzlich wurden die Fraktionen einer Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von 300 ml TOYOPEARL® HW- 55", ein Gel von Tosoh Corporation, Tokyo, Japan, unterworfen und die enzymaktiven Fraktionen wurden gesammelt. Die Enzymaktivitäten, spezifischen Aktivitäten und Ausbeuten in den jeweiligen Reinigungsschritten sind in Tabelle 1 aufgelistet. TABELLE 1
Die in dieser Weise erhaltene gereinigte Enzympräparation als Eluat in der Gelfiltration in Tabelle 1 wurde auf seine Reinheit in der Elektrophorese mit Polyacarylamidgel (7,5 G/V-%) bestimmt und die Elektrophorese ergab eine einzelne Proteinbande, was bedeutet, daß die Enzympräparation elektrophoretisch homogen und hochrein war.

Experiment A-3

Charakterisierung des Enzyms

In ein Teil der in Experiment A-2 erhaltenen gereinigten Enzympräparation wurde einer Elektrophorese, die 10 G/V-% SDS- Polyacrylamidgel enthielt, unterworfen und dann auf das Molekulargewicht durch Vergleich mit Standardmolekularmarker, (ein Produkt von Nippon Bio-Rad Laboratories KK, Tokyo, Japan), die auf dem gleichen Gel gelaufen waren, bestimmt. Es kam heraus, daß das Molekulargewicht des Enzyms etwa 77.000-87.000 Dalton betrug.
Ein weiterer Teil der gereinigten Enzympräparation wurde einer Elektrophorese für den isoelektrischen Punkt unter Verwendung von 2 G/V-% "AMPHOLINE®", ein Polyacrylamidgel von Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden, unterworfen und dann auf den isoelektrischen Punkt durch Messen des pHs des elektrophoretisierten Gels bestimmt, wobei herauskam, daß der isoelektrische Punkt des Enzyms etwa 3,6-4,6 betrug.
Die Wirkung der Temperatur des pHs auf die Enzymaktivität wurden gemäß der vorgenannten Untersuchungsmethode getestet. Die Ergebnisse sind in den Fig. 1 (Wirkung der Temperatur) und 2 (Wirkung des pHs) gezeigt. Die optimale Temperatur war etwa 40ºC bei Inkubation bei einem pH von 7,0 für 60 Minuten, während der optimale pH etwa 7,0 bei Inkubation bei 40ºC für 60 Minuten betrug. Die thermische Stabilität des Enzyms wurde durch Inkubation desselben in 50 mMol Phosphatpuffer, pH 7,0 bei verschiedenen Temperaturen für 60 Minuten bestimmt, wonach dann die Lösung im Wasserbad abgekühlt wurde und die Restenzymaktivität bestimmt wurde. Während die pH-Stabilität durch Inkubieren des Enzyms in 50 mMol Phosphatpuffer bei verschiedenen pHs und 25ºC für 16 Stunden und Einstellen der Puffer auf pH 7,0 und Untersuchung auf Restaktivitäten bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in den Fig. 3 (thermische Stabilität) und 4 (pH-Stabilität) gezeigt. Das Enzym war bei einer Temperatur bis zu 40ºC und einem pH im Bereich von 6-9 stabil.

Experiment A-4

Herstellung von nicht-reduzierendem Saccharid

Wäßrige Lösungen, die 20 G/V-% jeweils Glucose, Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose oder Maltoheptaose als Substrat enthielten, wurden mit 2 Einheiten/g Substratfeststoff der in Experiment A-2 erhaltenen gereinigten Enzympräparationen vermischt und bei 40ºC und einem pH von 7,0 für 48 Stunden umgesetzt, und die erhaltenen Lösungen wurden deionisiert und auf Reaktionsprodukte mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung von "WAKO BEADS® WB-T-330" (eine Säule von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) analysiert. Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wurde bei Umgebungstemperatur durchgeführt, und Wasser als Elutionsmittel wurde auf die Säule bei einer Fließrate von 0,5 ml/Minute gegeben, während das Eluat mit "RI-8012", ein Differenzialrefraktometer (ein Produkt von Tosoh Corporation, Tokyo, Japan) beobachtet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zu sehen.
Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 2 ersichtlich ist, bestanden die Reaktionsprodukte aus Restsubstraten und den neugebildeten Sacchariden PI, PII, PIII, PIV und PV und keine anderen Saccharide wurden im wesentlichen nachgewiesen. TABELLE 2
Bemerkung: PI, PII, PIII, PIV und PV in der Tabelle bedeuten die neu-gebildeten Produkte aus den jeweiligen Substraten, das heißt, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose und Maltoheptaose.
Die Ausbeuten für PI mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 3 waren relativ gering, allerdings waren diejenigen für PII, PIII, PIV und PV, die ein Glucosepolymerisationsgrad von 4 oder höher aufwiesen, hoch, das heißt 85% oder höher. Es ist festgestellt worden, daß sich kein Saccharid aus Glucose und Maltose bildete.
Zur Reinigung dieser neu-gebildeten Saccharide wurden die Reaktionsprodukte entfärbt, dionisiert, eingeengt und einer Säulenfraktionierung unter Verwendung eines stark-sauren Kationenaustauschers in Alkalimetallform ("XT-1016", Na&spplus;-Form, 4% Vernetzungsgrad, ein Produkt von Tokyp Organic Chemicals Industries, Ltd., Tokyo, Japan) unterworfen. Insbesondere wurde der Kationenaustauscher in drei ummandelte rostfreie Stahlsäulen, Innendurchmesser 2,0 cm, gepackt, in Serie geschaltet, die dann entweder mit Reaktionsprodukten in einer Menge von 5 V/V-% gegen das Volumen des Kationenaustauschers geladen wurden und dann mit 50ºC Wasser bei einer 5 V (Raumgeschwindigkeit) von 0,13 für die Fraktionierung gespült wurden, wonach dann die Fraktionen, die 97% oder mehr neu gebildete Saccharide enthielten, gesammelt wurden. Die erhaltenen Fraktionen wurden getrennt in hoch-reine Saccharidpräparationen lyophilisiert. Die Ausbeuten gegen die jeweiligen Materialsubstrate betrugen etwa 9% für PI, etwa 65% für PII, etwa 82% für PIII, etwa 80% für PIV und etwa 77% für PV, und die Endreinheiten betrugen 97, 5% für PI, 98, 6% für PII, 99, % für PIII, 98,4% für PIV und 98,4% für PV.
Diese hoch-reinen Saccharidpräparationen wurden auf Reduktionsvermögen mit der Somogyi-Nelson-Methode getestet und ihr Reduktionsvermögen wird durch DE (Dextroseäquivalent) wiedergegeben. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3
Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 3 zu ersehen ist, zeigten alle Präparationen nur eine geringe Reduktionskraft. Es wird angenommen, daß die Reduktionskraft wohl auf Spurenmengen von reduzierenden Maltooligosacchariden aus Substraten, die in den Präparationen verblieben, herrühren würden, so daß alle neugebildeten Saccharide in wesentlichen kein Reduktionsvermögen aufwiesen.

Experiment A-5

Enzymatischer Abbau mit Glucoamylase

50 mg von jeweils der nicht-reduzierenden Saccharidpräparation PI, PII, PIII, PIV oder PV von Experiment A-4 wurden in 1 ml 50 mMol Acetatpuffer (pH 7,5) gelöst, und die erhaltenen Lösungen wurden mit 1 Einheit Glucoamylase (ein Produkt von Seikagaku Corporation, Tokyo, Japan), vermischt, bei 40ºC für 6 Stunden auf Enzymabbau inkubiert und auf Abbauprodukte mittels Hochleistungsflüssigkeitchromatographie analysiert. Im Ergebnis wurden in allen hydrolysierten Produkten nur Glucose und Trehalose nachgewiesen. Die Gehalte und Molverhäitnisse von Glucose und Trehalose sind in Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 4
Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 4 zu ersehen ist, ist herausgekommen, daß PI durch Glucoamylase in 1 Glucosemolekül und 1 Trehalosemolekül; PII in 2 Glucosemoleküle und 1 Trehalosemolekül; PIl in 3 Glucosemoleküle und 1 Trehalosemolekül; PIV in 4 Glucosemoleküle und 1 Trehalosemolekül und PV in 5 Glucosemoleküle und 1 Trehalosemolekül abgebaut wurden.
Angesichts der Reaktionseigenschaften von Glucoamylase würden diese nicht-reduzierenden Saccharidpräparationen eine Struktur aufweisen, worin ein oder mehr Glucosemoleküle an das Trehalosemolekül über die α-1,4- oder α-1,6-Bindung gebunden sind: insbesondere ist PI ein nicht-reduzierendes Saccharid mit einem Glucosepolymerisationsgrad, wo 1 Glucosemolekül mit 1 Trehalosemolekül gebunden ist; PII ist ein nicht-reduzierendes Saccharid mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 4, wo 2 Glucosemoleküle mit 1 Trehalosemolekülen verbunden sind; PIII ist ein nicht-reduzierendes Saccharid mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 5, wo 3 Glucosemoleküle mit 1 Trehalosemolekülen gebunden sind; PIV ist ein nicht-reduzierendes Saccharid mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 6, wo 4 Glucosemoleküle mit 1 Trehalosemolekül verbunden sind und PV ist ein nicht-reduzierendes Saccharid mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 7, wo 5 Glucosemoleküle mit 1 Trehalosemolekül gebunden sind. Es ist herausgekommen, daß nach der Behandlung von PI, PII, PIII, PIV und PV mit β-Amylase, PI und PII nicht hydrolysiert waren, während PIII in 1 Maltosemolekül und 1 PI- Molekül; PIV in 1 Maltosemolekül und 1 PII Molekül; und PV in 2 Maltosemoleküle und 1 PII-Molekül hydrolysiert waren.
Die obigen Ergebnisse zeigen an, daß die Umsetzung mit dem erfindungsgemäßen nicht-reduzierenden Saccharid bildenden Enzym wohl eine intramolekulare Umwandlungsreaktion ist, die nicht von Abbau oder Polymerisation der Substrate begleitet ist, in anderen Worten, sie ändert nicht ihre Glucosepolymerisationsgrade. Daher wären die durch das Enzym produzierten PI, PII, PIII, PIV und PV α-Glucosyltrehalose (dargestellt durch Gn-T, wo G und T einen Glucoserest und T α, α-Trehalose bedeuten, während n eine ganze Zahl von 1 oder mehr ist), i. e. α- Glucosyltrehalose (oder α-Maltosylglucosid), α-Maltosyltrehalose (oder α-Maltotriosylglucosid), α-Maltotriosyltrehalose (oder α-Maltotetraosylglucosid), α-Maltotetraosyltrehalose (oder α-Maltopentaosylglucosid) und α-Maltopentaosyltrehalose (oder α-Maltohexaosylglucosid).

Experiment A-6

Herstellung von Trehalose und nicht-reduzierendem Saccharid mit Trehalosestruktur als Endeinheit

40 Gew.-Teile eines Stärketeilhydrolysats (PINE-DEX #4", ein Produkt von Matsutani Chemical Ind., Co., Ltd., Kyoto, Japan) wurden in 60 Gew.-Teilen Wasser unter Erhitzen gelöst und die erhaltene Lösung wurde auf 45ºC erhitzt und auf einen pH von 6,5 eingestellt, mit 1 Einheit/g reduzierendes Stärketeilhydrolysat eines nach der Methode in Experiment A-2 hergestellten nicht-reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms vermischt und für 96 Stunden umgesetzt, um nicht-reduzierende Saccharide mit Trehalosestruktur als Endeinheit zu bilden, wonach dann auf 100ºC für 10 Minuten zur Inaktivierung des Enzyms erhitzt wurde. Diese Reaktionsmischung wurde dann auf etwa 20% verdünnt, mit 10 Einheiten/g Stärketeilhydrolysat "GLUCOZYME", eine Glucoamylase oder -probe von Nagase Biochemicals Ltd., Kyoto, Japan, vermischt, für 40 Stunden umgesetzt und zur Inaktivierung des Enzyms erhitzt. Die erhaltene Lösung wurde mit Aktivkohle entfärbt, mit Ionenaustauscher deionisiert und in üblicher Weise auf eine etwa 60%ige Lösung eingeengt. Die erhaltene Saccharidlösung enthielt 29,5% Trehalose. Dieses Konzentrat wurde dann auf eine rostfreie Stahlsäule, die mit einem stark-sauren Kationenaustauscher ("CG6000", Na&spplus;-Form, ein Produkt von Japan Organo, Co., Ltd. Tokyo, Japan) vorgepackt war, bei 60ºC und einer SV von 0,4 gegeben, um Fraktionen zu erhalten, die reich an Trehalose waren. Die Fraktionen enthielten etwa 90% Trehalose. Die Fraktionen wurden gesammelt und die Lösung wurde auf etwa 75% eingeengt, in einen Kristallisator eingegeben, mit etwa 2%igem kristallinen Trehalosehydrat als Impfkristall vermischt und allmählich abgekühlt, um eine Masse zu erhalten, die eine Kristallinität von etwa 45 % hatte. Die in dieser Weise erhaltene Masse wurde dann aus einer Düse, die auf den oberen Teil eines Trockentunnels ange bracht war, bei einem Druck von 150 kg/cm² gesprüht. Zur gleichen Zeit wurde 85ºC-heiße Luft vom oberen Teil des Trockentunnels in Richtung seines Bodens gesandt, und das erhaltene Pulver, das sich auf einem Drahtnetz eines Bandes, das am Boden des Trockentunnels angebracht war, angesammelt hatte, wurde allmählich aus dem Trockentunnel herausbefördert, während darauf 45ºC-heiße Luft unter dem Drahtnetz gesandt wurde. Danach wurde das kristalline Pulver zu einem Alterungstunnel geführt und in einem Strom heißer Luft für 10 Minuten gealtert, um seine Kristallisation und Entwässerung zu vervollständigen, wobei ein kristallines Trehalosehydratpulver erhalten wurde.

Experiment B-1

Herstellung von kristallinen Maltotetraosylglucosid

Fünf Gew.-Teile 98%iger Maltopentaose (ein Produkt von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc. Okayama, Japan) wurden in 100 Gew.-Teilen Wasser unter Erhitzen gelöst, und die erhaltene Lösung wurde auf 40ºC erhitzt und auf einen pH von 7,0 eingestellt, mit einem nach der Methode in Experiment A-2 hergestellten nicht-reduzierenden Saccharid bildenden Enzym in einer Menge von 2 Einheiten/g Maltopentaose vermischt und dann für 48 Stunden umgesetzt, wonach dann bei 100ºC für 20 Minuten zur Inaktivierung des Enzyms erhitzt wurde. Man ließ die Lösung in einem 4ºC-kalten Kühlraum über Nacht zur Bildung eines Niederschlags stehen. Die in dieser Weise ausgefallene Suspension wurde auf 1,0 N durch Zugabe von Natriumhydroxid eingestellt und bei 100ºC für 2 Stunden zum Abbau reduzierender Saccharide erhitzt. Die erhaltene Lösung wurde mit Aktivkohle entfärbt und mit einem Ionenaustauscher (H&spplus;- und OH&supmin;Form) zur Bildung einer 97,5%igen Maltotetraosylglucosidfraktion gereinigt. Die Fraktionen wurden vereint, und die Lösung wurde eingeengt, um eine Konzentration von 50ºC zu ergeben, in einen Glasbecher überführt, und man ließ sie bei 25ºC für eine Stunde stehen, um einen Kristall auf der Innenwand des Bechers auszubilden. Der erhaltene Kristall wurde zentrifugiert und gewaschen, indem darauf eine kleine Menge Wasser gesprüht wurde, unter Bildung eines 99,5%igen wasserhaltigen kristallinen Maltotetraosylglucosidprodukts. Das Produkt wurde bei vermindertem Druck bei 100ºC über Nacht getrocknet und man erhielt ein wasserfreies kristallines Produkt.
Diese kristallinen Produkte wurden auf ihre physikochemischen Eigenschaften bestimmt, und die Ergebnisse waren folgendermaßen:

(1) Elementaranalyse (als Anhydrid)

wasserhaltiges Kristall C = 43,13%, H = 6,37%
wasserfreies Kristall C = 43,20%, H = 6,35%
theoretischer Wert C = 43,48%, H = 6,32%

(2) Massenspektrumanalyse (als Anhydrid)

MW = 828 (für die Molekülformel C&sub3;&sub0;H&sub5;&sub2;O&sub2;&sub6;)

(3) Wassergehalt

gemessen nach der Karl-Fischer-Methode
wasserhaltiger Kristall 4,2% (Molverhältnis von Maltotetraosylglucosid zu Wasser = 1 : 2)
wasserfreier Kristall 0,2%

(4) Schmelzpunkt

1 mg wasserhaltiger oder wasserfreier Kristall von Maltotetraosylglucosid wurden in einen speziellen Aluminiumbehälter gegeben und mit einem Differenzialscanning- Kalorimeter DSC-8230 (im Handel erhältlich von RIGAKU International Corporation, Tokyo, Japan) gemessen. Der wasserhaltige Kristall zeigte zwei endothermische Peaks bei 170 bis 172ºC und 230 bis 233ºC, und der wasserfreie Kristall zeigte einen endothermischen Peak bei 230 bis 233ºC. Es wird davon ausgegangen, daß der endothermische Peak bei 230 bis 233ºC beim wasserhaltigen Kristall durch Umwandlung eines wasserhaltigen Kristalls in einen wasserfreien Kristall während der Erhöhung der Temperaturrate verursacht wurde, daher wird angenommen, daß der Schmelzpunkt des wasserhaltigen Kristalls oder wasserfreien Kristalls 170 bis 172ºC bzw. 230 bis 233ºC ist.

(5) Spezifisches Drehvermögen (als Anhydrid)

Die wasserhaltigen und wasserfreien Kristalle hatten folgendes spezifisches Drehvermögen:
[α] + 208.8º (c = 1, 0, H&sub2;O)

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum

Die wasserhaltigen und wasserfreien Kristalle zeigten keine charakteristischen Absorptionsspektren bei der Analyse in ihren wäßrigen Lösungen.

(7) Infrarotabsorptionsspektrum

Zwei mg pulverförmiges wasserhaltiges oder wasserfreies Kristall und 200 mg getrocknetes KBr wurden vermischt und in eine transparente Tablette überführt, die dann im Infrarotspektrum analysiert wurde. Die Ergebnisse des wasserhaltigen und wasserfreien Kristalls sind in den Fig. 5 und 6 gezeigt.

(8) Löslichkeit (als Anhydrid)

Bis zu etwa 1 g wasserhaltiges oder wasserfreies Kristall war in 100 ml 25ºC-wasserlöslich.

(9) Süße

Eine gesättigte Lösung kristallines Maltotetraosylglucosid zeigte eine leicht schmeckbare geringe Süße.

(10) Färbungsreaktion

Die wasserhaltigen und wasserfreien Kristalle färbten sich grün bei der Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, sie waren allerdings negativ bei der Fehling-Reaktion und Jodreaktion.

(11) Struktur (als Anhydrid)

a) Bei der Hydrolyse mit 1 N Schwefelsäure bildeten die Kristalle nur D-Glucose.
b) Bei der Behandlung mit Glucoamylase bildeten die Kristalle jeweils drei Mole Glucose und ein Mol Trehalose.
c) Das Ergebnis bei der Kohlenstoffkernresonanzanalyse (¹³C-NMR) ist in Fig. 7 gezeigt. Alle Kohlenstoffatome des Kristalls wurden dem chemischen Shift von α-D-Glucopyranose, α,α-Trehalose und Maltotetraose gemäß Standardsubstanzen nach Klaus Bock et al., in Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 42, Seiten 193-225 (1984) zugeordnet, und es wird angenommen, daß die Kristalle eine Struktur gemäß O-α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-O-α-Dglucopyranosyl-(1→4)-O-α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-O- α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranosid, das heißt, eine Maltotetraosylglucosidstruktur aufwiesen.

(12) Pulverröntgenstrahlbeugung

Kristallines Maltotetraosylglucosid wurde auf seine Pulverröntgenstrahlbeugungsfigur unter Verwendung von CuKa- Strahlen gemäß der Methode in F. H. Stodola et at. In Journal of the American Chemical Society, Band 78, Sei ten 2,514-2,518 (1956) bestimmt. Die Ergebnisse des wasserhaltigen Kristalls oder wasserfreien Kristalls sind in den Fig. 8 oder 9 gezeigt. Wie aus den Ergebnissen der Fig. 8 und 9 hervorgeht, ergab das wasserhaltige Kristall vorherrschende Beugungswinkel (2θ) von 12,6º, 21,3º, 22,1º und 22,8º, während der wasserfreie Kristall vorherrschende Beugungswinkel von 12,7º, 13,7º, 18,8º und 23,2º bei der Pulverröntgenstrahlbeugungsanalyse ergab.
Wie aus den obigen Ergebnissen hervorgeht, können die erfindungsgemäßen Kristalle als Maltotetraosylglucosid erkannt werden, die bisher unbekannt waren.

Experiment B-2

Akute Toxizität.

Nach der Methode in Experiment B-1 hergestellte wasserhaltige und wasserfreie kristalline Maltotetraosylglucoside wurden auf ihre akute Toxizität in Mäusen nach oraler Verabreichung getestet. Im Ergebnis ist festgestellt worden, daß diese kristallinen Maltotetraosylglucoside eine geringe Toxizität aufweisen und daß keine Maus starb, auch wenn ihnen maximal verabreichte Dosen gegeben wurden. Daraus ist zu schließen, daß ihr LD&sub5;&sub0; um die 50 g/kg oder höher beträgt.
Die folgenden Beispiele A und B erläutern die Herstellung der kristallinen Maltotetraosylglucoside und ihre Anwendungen.

Beispiel A-1

Fünfzig Gew.-Teile 98%iger Maltopentaose, ein Produkt von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, wurden in 200 Gew.-Teilen Wasser unter Erhitzen gelöst, und die erhaltene Lösung wurde auf 40ºC erhitzt und auf einen pH von 7,0 eingestellt, mit einem nach der Methode in Experiment A-2 nicht-reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms in einer Menge von 5 Einheiten/g Maltopentaose vermischt, für 24 Stunden umgesetzt, wonach dann bei 100ºC für 20 Minuten zur Inaktivierung des Enzyms erhitzt wurde. Die erhaltene Lösung enthielt etwa 90% Maltotetraosylglucosid mit einem Rest von Maltopentaose. Die Lösung wurde auf 0,1 N durch Zugabe von Natriumhydroxid eingestellt und bei 100ºC für 2 Stunden zur Zerstörung reduzierender Saccharide erhitzt. Die Lösung wurde mit Aktivkohle entfärbt und mit Ionenaustauscherharzen (H&spplus;- und OH&supmin;-Form) entsalzen, um eine 98%ige Maltotetraosylglucosidfraktion zu erhalten. Die Fraktionen wurden vereint, und die Lösung wurde auf eine Konzentration von 60% eingeengt, in einen Kristallisationsapparat eingegeben und mit einem kristallinen Maltotetraosylglucosid in einer Menge von 2% als Impfkristall vermischt, und die erhaltene Mischung wurde allmählich unter Rühren zur Kristallisierung Bildung einer Masse abgekühlt. Die in dieser Weise erhaltenen Masse wurde von der Mulasse abgetrennt, und es wurde wasserhaltiges kristallines Maltotetraosylglucosid in einer Ausbeute von 99,9% gegenüber dem Ausgangsmaterial von etwa 50% erhalten. Das erhaltene kristalline Maltotetraosylglucosid zeigte keinen Hygroskopizität, wenn es in einem Raum stehengelassen wurde.
Das erfindungsgemäße kristalline Maltotetraosylglucosid ist vorzugsweise verwendbar als Impfkristall sowie als Reagenz, Substrate zur Untersuchung von Amylase in Serum und chemische Rohmaterialien, und es ist weiterhin bevorzugt anwendbar in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, einschließlich Nahrungsmitteln, Getränken, Kosmetika, Pharmazeutika und Formkörpern.

Beispiel A-2

Etwa 20%ige Kartoffelstärke, die 0,1% Calciumcarbonat enthielt, wurden auf einen pH von 6,0 eingestellt und dann mit "TERAMYL® 60 L", eine α-Amylase von Novo Nordisk Bioindustry, Kopenhagen, Dänemark, in einer Menge von 0,3% im Hinblick auf Stärkefeststoff, vermischt, bei 95-100ºC verflüssigt und zur Inaktivierung des Enzyms erhitzt, wobei eine verflüssigte Stärkelösung mit einem DE von 19,5 erhalten wurde. Die erhaltene Lösung wurde auf 40ºC erhitzt und auf einen pH von 6,2 eingestellt, mit einem nach der Methode in Experiment A-2 hergestellten nicht-reduzierenden Saccharid bildenden Enzym in einer Menge von 3 Einheiten/g Stärke zusammen mit Isoamylase, im Handel erhältlich von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okavania, Japan, in einer Menge von 1.000 Einheiten vermischt und für 72 Stunden umgesetzt. Das Lösungsgemisch wurde auf 95ºC für 10 Minuten zur Inaktivierung der Enzyme erhitzt. Die Lösung enthielt etwa 30% Maltotetraosylglucosid, und sie wurde mit Aktivkohle entfärbt, mit Ionenaustauscherharzen (H&spplus; und OH&supmin;-Form) entsalzen und auf eine Konzentration von 40% eingeengt. Dieses Konzentrat wurde dann auf eine ummandelte rostfreie Stahlsäule (in vier Säuren geschaltet, 5,4 cm · 4 m), die mit einem stark-sauren Kationenaustauscher ("XT-1016", Na&spplus;-Form, ein Produkt von Japan Organo, Co., Tokyo, Japan) vorgepackt war, bei 40ºC und einer SV von 0,4 aufgegeben, und mit 60ºC Wasser eluiert, um Fraktionen zu erhalten, die reich an Maltotetraosylglucosid waren. Die Fraktionen enthielten etwa 92º Maltotetraosylglucosid, und die Fraktionen wurden vereint und die Lösung wurde mit Aktivkohle entfärbt, mit Ionenaustauscherharz (H&spplus; und OH&supmin;-Form) entsalzen und in üblicher Weise bis zu einer Konzentration von etwa 80%, d. s. b. (auf Feststofftrockenbasis) eingeengt und in einen Kristallisationsapparat gegeben und mit kristallinem Maltotetraosylglucosid in einer Menge von 1% als Impfkristall vermischt, und die erhaltene Mischung wird allmählich unter Rühren zur Kristallisierung unter Bildung einer Masse abgekühlt. Die so erhaltene Masse wurde in einen Behälter zur Bildung eines Blocks gegeben. Man ließ den Block bei etwa 25ºC für 2 Tage stehen, wonach dann gealtert wurde, mit einem Schneidpulverisiergerät pulverisiert wurde und anschließend im Wirbelbett getrocknet und geglüht wurde, um ein wasserhaltiges kristallines Maltotetraosylglucosidoulver in einer Ausbeute von etwa 30% zu erhalten.
Das so erhaltene Produkt zeigt im wesentlichen keine Hygroskopizität und ist leicht handhabbar, und es ist insbesondere verwendbar in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, einschließlich Nahrungsmitteln, Getränken, Kosmetika, Pharmazeutika und Formkörpern als Lösungsmittel, Geschmacksverbesserungsmittel, Qualitätsverbesserungsmittel, Stabilisator und Träger.

Beispiel A-3

"PINE-DEX #4", ein Stärketeilhydrolysat von Matsutani Chemical Ind., Co., Ltd. Kyoto, Japan, wurde auf eine Konzentration von 20%, 45ºC und pH von 5,5 eingestellt und mit 500 Einheiten/g Stärketeilhydrolysat Isoamylase von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, vermischt und für 24 Stunden zur Zerstörung der α-1,6-Bindungen der Stärke umgesetzt. Die so umgesetzte Lösung wurde bei 100ºC erhitzt und man ließ sie für 10 Minuten stehen und kühlte dann auf 40ºC ab und stellte auf einen pH von 6,5 ein. Die entstandene Lösung wurde mit fünf Einheiten g Feststoff des nach der Methode in Experi ment A-2 hergestellten nicht-reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms und "TERMANYL® 60L", eine α-Amylase von Novo Nordisk Bioindustry, Kopenhagen, Dänemark, in einer Menge von 0,3% im Hinblick auf den Stärkefeststoff vermischt und für 48 Stunden umgesetzt. Die Lösung wurde zur Inaktivierung der Enzyme erhitzt und abgekühlt. Die Lösung enthielt etwa 32% Maltotetraosylglucosid und wurde gereinigt, eingeengt und einer Chromatographie unter Verwendung eines stark-sauren Kationenaustauscherharzes ähnlich wie in Beispiel A-1 unterworfen, um Fraktionen zu erhalten, die reich an Maltotetraosylglucosid sind. Die Fraktionen enthielten etwa 81% Maltotetraosylglucosid. Die Fraktionen wurden vereint und die Lösung wurde mit Aktivkohle entfärbt, mit Ionenaustauscherharz (H&spplus;- und OH&supmin;- Form) entsalzen und in üblicher Weise bis zu einer Konzentration von 70% eingeengt und in einen Kristallisator gegeben und mit kristallinem Maltotetraosylglucosid in einer Menge von 2% als Impfkristall vermischt und die erhaltene Mischung wird allmählich unter Rühren zur Kristallisation unter Bildung einer Masse mit etwa 70% Kristallinität abgekühlt. Die Masse wurde dann aus einer Düse, die am oberen Teil eines Trockentunnels vorgesehen war, bei einem Druck von 150 kg/cm² gesprüht. Zur gleichen Zeit wurde 85ºC-heiße Luft vom oberen Teil des Trockentunnels in Richtung seines Bodens gesendet und das erhaltene Pulver, das auf einem Drahtnetz eines Beförderungsbandes, das am Boden des Trockentunnels vorgesehen war, angehäuft war, wurde allmählich aus dem Trockentunnel befördert, während darauf 45ºC-heiße Luft unter dem Drahtnetz gesendet wurde. Danach wurde das kristalline Pulver einem Alterungstunnel zugeführt und in einem Strom heißer Luft für 24 Stunden zur Vervollständigung seiner Kristallisation und Entwässerung gealtert, wobei ein Pulver, das kristallines Maltotetraosylglucosid enthielt, in einer Ausbeute von etwa 25% gegenüber dem Ausgangsmaterial erhalten wurde.
Das in der Weise erhaltene Produkt, das im wesentlichen nichthygroskopisch ist und leicht handhabbar ist, ist insbesondere einsetzbar in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, einschließlich Nahrungsmitteln, Getränken, Kosmetika, Pharmazeutika und Formkörpern als Süßungsmittel, Geschmacksverbesserungsmittel, Qualitätsverbesserungsmittel, Stabilisator und Träger.

Beispiel A-4

Das wasserhaltige kristalline Maltotetraosylglucosid, das nach den gleichen Methoden wie in Beispiel A-1 hergestellt worden war, wurde bei 100ºC unter vermindertem Druck über Nacht getrocknet, um ein wasserfreies kristallines Maltotetraosylglucosid mit einem Wassergehalt von 0,2% zu erhalten.
Beim Stehenlassen in einem Raum zeigte das Produkt Hygroskopizität und wurde in wasserhaltiges kristallines Maltotetraosylglucosid mit einem Wassergehalt von 4% zur Stabilisierung umgewandelt. Das wasserfreie kristalline Maltotetraosylglucosid kann bevorzugt verwendet werden als hygroskopisches Mittel, Entwässerungsmittel und chemisches Rohmaterial. Es ist weiter einsetzbar in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, einschließlich Nahrungsmitteln, Getränken, Kosmetika, Pharmazeutika und Formkörpern, ähnlich wie das wasserhaltige kristalline Maltotetraosylglucosid in Beispiel A-1.

Beispiel A-5

Ein Gewichtsteil Trehalose und ein Gewichtsteil "PINE-DEX #4", ein Stärketeilhydrolysat von Matsutani Chemical Ind., Co., Ltd. Kyoto, Japan, wurden in drei Gewichtsteilen Wasser unter Erwärmen gelöst, und die erhaltene Lösung wurde auf 65ºC er hitzt und auf einen pH von 6,0 eingestellt, mit 10 Einheiten/g Stärketeilhydrolysat einer Cyclomaltodextringlucanotransferase von Bacillus stearothermophilus von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, vermischt, für 24 Stunden umgesetzt und zur Inaktivierung des Enzyms erhitzt. Danach wurde die Lösung auf 55ºC eingestellt, mit 25 Einheiten/g Stärketeilhydrolysat Pullulanase von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, und 5 Einheiten/g Stärketeilhydrolysat "TERMANYL® 60L", eine α-Amylase von Novo Nordisk Bioindustry, Kopenhagen, Dänemark, vermischt und für 24 Stunden umgesetzt und zur Inaktivierung der Enzyme erhitzt. Die Lösung enthielt etwa 15% Maltotetraosylglucosid. Die so erhaltene Lösung wurde gereinigt und einer Chromatographie unter Verwendung eines stark-sauren Kationenaustauscherharzes in der gleichen Weise wie in Beispiel A-1 unterworfen, um Fraktionen zu erhalten, die reich an Maltotetraosylglucosid waren. Die Fraktionen wurden vereint und die Lösung wurde entfärbt, entsalzen, eingeengt, kristallisiert und in einen Kessel zur Bildung eines Blocks eingegeben. Der Block wurde pulverisiert, getrocknet und klassiert, um ein Pulver, das wasserhaltiges kristallines Maltotetraosylglucosid enthielt, in einer Ausbeute von etwa 10% gegenüber dem Ausgangsmaterial zu erhalten.
Das so erhaltene Produkt zeigte im wesentlichen keine Hygroskopizität und ist leicht handhabbar und es ist insbesondere verwendbar in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, einschließlich Nahrungsmitteln, Getränken, Kosmetika, Pharmazeutika und Formkörpern als Süßungsmittel, Geschmacksverbesserungsmittel, Qualitätsverbesserungsmittel, Stabilisator und Träger.

Beispiel B-1

Süßungsmittel

Ein halbes Gewichtsteil eines Pulvers, das nach der Methode in Beispiel A-2 erhaltenes wasserhaltiges kristallines Maltotetraosylglucosid enthielt, 1,5 Gew.-Teile "SUNMALT®", eine kristalline Maltose von Hayashibara Shoji, Inc., Okayama, Japan und 0,1 Gewichtsteile "α G SWEET", ein a-Glycosylsteviosid von Toyo Sugar Refining Co., Ltd., Tokyo, Japan, wurden bis zur Homogenität vermischt und die Mischung wurde einem Granulator zugeführt, um ein granulaeres Süßungsmittel zu erhalten.
Das Süßungsmittel hatte eine ausgezeichnete Geschmacksqualität und eine etwa um das 2-fache stärkere Süßkraft und die Kalorie, ausgedrückt als Süßungsvermögen, beträgt die Hälfte von dem der Saccharose. Das Süßungsmittel ist als Süßungsmittel mit niedrigem Kaloriengehalt geeignet, um Nahrungsmittel und Getränke mit niedrigem Kaloriengehalt für diejenigen mit Fettleibigkeit oder der Diabetes, deren Kalorienaufnahme eingeschränkt ist, zu süßen und das Süßungsmittel ist ebenfalls geeignet zum Süßen von Nahrungsmitteln und Getränken, die Dentalkaries unterdrücken sollen, da es eine geringe Säureproduktion und Produktion von unlöslichem Glukan durch kariogene Mikroorganismen aufweist.

Beispiel 8-2

Milchsäuregetränk

10 Gew.-Teile entfettete Milch wurden bei 80ºC für 20 Minuten pasteurisiert, auf 40ºC abgekühlt, mit 0,3 Gew.-Teilen eines Starters vermischt und bei 37ºC für 10 Stunden fermentiert. Das Ergebnis wurde homogenisiert, mit 0,4 Gew.-Teilen eines nach der Methode in Beispiel A-3 erhaltenen wasserhaltigen kristallinen Maltotetraosylglucosid, 1,6 Gew.-Teilen "TETRUP®", ein Maltotetraosesirup von Hayashibara Shoji, Inc., Okayama, Japan, einem Gew.-Teil Saccharose und drei Gew.- Teilen isomerisiertem Zucker vermischt, und die Mischung wurde pasteurisiert, indem sie bei 70ºC gehalten wurde. Die Mischung wurde abgekühlt, mit einer geeigneten Menge Geschmacksmittel vermischt und in Flaschen abgefüllt, um ein Milchsäuregetränk zu erhalten. Das Produkt ist ein Milchsäuregetränk hoher Qualität mit Geschmack und Süße, die mit dem sauren Geschmack gutharmonisieren.

Beispiel B-3

Gepulverter Saft

33 Gew.-Teile sprühgetrockneter Orangensaft wurde bis zur Homogenität mit 5 Gew.-Teilen eines wasserhaltigen kristallinen Maltotetraosylglucosidpulvers, das nach der Methode in Beispiel A-5 erhalten wurde, 35 Gew.-Teilen kristalline Maltose, 20 Gew.-Teilen Saccharose, 0,65 Gew.-Teilen Zitronensäureanhydrid, 0,1 Gew.-Teilen Malinsäure, 0,1 Gew.-Teilen L-Ascorbinsäure, 0,1 Gew.-Teilen Natriumcitrat, 0,5 Gew.-Teilen Pullulan und einer geeigneten Menge pulverförmiges Aromamittel vermischt, in ein feines Pulver pulverisiert, in einen Wirbelbettgranulator eingegeben und bei einer Ventilationstemperatur von 40ºC für 30 Minuten granuliert, während darauf ein Stärkesirup als Bindemittel gesprüht wurde und in eine vorbeschriebene Menge aufgeteilt und verpackt wurde, um einen pulverförmigen Saft zu erhalten.
Das Produkt ist ein pulverförmiger Saft, der keinen unangenehmen Geschmack und Geruch aufweist und keine Hygroskopizität und Verfestigung zeigt und sehr stabil über einen längeren Lagerungszeitraum ist.

Beispiel B-4

Schokolade

40 Gew.-Teile Kokarpaste, 10 Gew.-Teile Kakaobutter, 5 Gew.- Teile eines nach der Methode in Beispiel A-1 erhaltenen wasserhaltigen kristallinen Maltotetraosylglucosids, 10 Gew.- Teile kristalline Maltose und 35 Gew.-Teile Saccharose wurden vermischt, und die erhaltene Mischung wurde einem Zerkleinerer zur Verminderung der Teilchengröße zugeführt, einer Konche zugeführt und bei 50ºC für 2 Tage geknetet. Während des Knetens wurden der Mischung 0,5 Gew.-Teile Lecithin zugemischt, wonach ausreichend gemischt und dispergiert wurde. Danach wurde die Mischung bei 31ºC mit einem Thermokontrollgerät gehalten, in Formen gleich vor der Verfestigung mit der Butter gegossen, mit einem Vibrator entlüftet und durch einen 10ºC-Kühltunnel über 20 Minuten zur Vervollständigung der Verfestigung geleitet. Der Inhalt der Formen wurde herausgenommen und verpackt, um eine Schokolade zu erhalten.
Das Produkt, das keine Hygroskopizität zeigte und eine ausgezeichnete Farbe, Glanz und Textur aufwies, hatte eine zufriedenstellende Innentextur und schmilzt angenehm im Mund und zeigt dabei eine angenehme Süße und einen milden Geschmack.

Beispiel B-5

Kaugummi

Drei Gew.-Teile einer Gummibase wurden durch Erhitzen erweicht, mit drei Gew.-Teilen "MABIT®", ein kristallines Maltit von Hayashibara Shoji, Inc., Okayama, Japan, drei Gewichtsteilen Saccharose und einem Gewichtsteil eines Pulvers, das nach der Methode in Beispiel A-2 erhaltenes wasserhaltiges kristallines Maltotetraosylglucosid enthielt, vermischt, mit geeigneten Mengen von Aroma- und Färbemitteln vermischt, mit einer Walze verknetet, geformt und in üblicher Weise verpackt, um einen Kaugummi zu erhalten.
Das Produkt ist ein Kaugummi mit ausgezeichneter Textur, Geruch und Geschmack.

Beispiel B-6

"Uiro-no-moto" (Instant "uiro")

90 Gew.-Teile eines Reispulvers wurden bis zur Homogenität mit 20 Gew.-Teilen Maisstärke, 10 Gew.-Teilen eines nach der Methode in Beispiel A-3 erhaltenen kristallinen Maltotetraosylglucosids, 60 Gew.-Teilen Maltotetraosepulver, 50 Gew.-Teilen Saccharose, 4 Gew.-Teilen Pullulan bis zur Homogenität vermischt, um "uiro-no-moto" zu erhalten. Das "uiro-no-moto" wurde mit geeigneten Mengen "maccauiro" (ein grünes Teepulver) und Wasser verknetet, und die erhaltene Mischung wurde in Behältern aufgeteilt und für 60 Minuten bedampft, um "maccauiro" zu erhalten.
Das Produkt hatte einen glatten Glanz, eine gute Schmackhaftigkeit und einen delikaten Geschmack, und es hat ebenfalls eine lange Lagerungsdauer, weil die Rückbildung von Stärke wirksam unterdrückt wird.

Beispiel B-7

Verfestigte Nahrung für flüssige Nahrungsmittel

Eine Zusammensetzung aus 100 Gew.-Teilen eines nach der Methode in Beispiel A-4 hergestellten kristallinen Maltotetraosylglucosids, 100 Gew.-Teilen kristalline Maltose, 350 Gew.- Teilen Maltötetraosepulver, 270 Gew.-Teilen getrocknetes Eigelb, 209 Gew.-Teilen entfettete Milch, 4,4 Gew.-Teilen Natriumchlorid, 1,85 Gew.-Teilen Kaliumchlorid, 4 Gew.-Teilen Magnesiumsulfat, 0,1 Gew.-Teil Thiamin, 0,1 Gew.-Teil Natriumascorbat, 0,6 Gew.-Teilen Vitamin-E-Acetat und 0,04 Gew.-Teilen Nikotinamid wurden hergestellt, und die Zusammensetzung wurde in 25 g-Aliquote in kleinen laminierten Aluminiumpackungen aufgeteilt, die dann in der Hitze versiegelt wurden.
Eine Packung des Produkts wird in etwa 150-300 ml Wasser gelöst, und die erhaltene Lösung ist als flüssige Nahrung, die parenteral in die Nasenhöhle, in den Magen oder in den Darm verabreichbar ist, verwendbar.

Beispiel B-8

Traumatische Salbe

20 Gew.-Teile eines nach der Methode in Beispiel A-1 erhaltenen wasserhaltigen kristallinen Maltotetraosylglucosids, 280 Gew.-Teile kristalline Maltose und 200 Gew.-Teile Maltotetraosepulver wurden mit 50 Gew.-Teilen Methanol, das 3 Gew.-Teile Jod enthielt, vermischt, und das Ergebnis wurde mit 200 Gew.- Teilen 10% Pullulan gemischt, um eine traumatische Salbe zu erhalten, die eine geeignete Wirkkraft und Haftungsfähigkeit aufwies.
Mit dem Produkt kann ein therapeutischer Zeitraum verkürzt werden, wobei Traumen ohne Narben geheilt werden.

Beispiel B-9

Zuckerbeschichtete Tablette

Eine Rohtablette mit einem Gewicht von 150 mg wurde zuckerbeschichtet unter Verwendung einer Lösung, die 5 Gew.-Teile eines nach dem Verfahren in Beispiel A-2 hergestellten wasserhaltigen kristallinen Maltotetraosylglucosidpulvers enthielt, von 40 Gew.-Teilen kristallinem Maltit, 2 Gew.-Teilen Pullulan (mittleres Molekulargewicht: 200.000), 30 Gew.-Teilen Wasser, 25 Gew.-Teilen Talk und 3 Gew.-Teilen Titaniumoxid, bis das Tablettengewicht auf etwa 230 mg erhöht war, danach wurde mit Zucker beschichtet unter Verwendung der Lösung, die 10 Gew.- Teile des obigen kristallinen Maltotetraosylglucosidpulver, 55 Gew.-Teilen kristallines Maltit, 1 Gew.-Teile Pullulan und 34 Gew.-Teile Wasser, wonach dann mit einem Polierwachs überzogen wurde, um eine zuckerbeschichtete Tablette mit einem glänzenden Aussehen zu erhalten.
Das Produkt ist ausgezeichnet einsetzbar bei der Zuckerbeschichtung und weist eine Stoßbeständigkeit auf, und es erhält seine hohe Qualität über einen längeren Zeitraum.

Beispiel B-10

Milchlotion

Ein halbes Gew.-Teil Polyoxyethylenbehenylether, 1 Gew.-Teil Polyoxyethylensorbittetraoleat, 1 Gew.-Teil öllösliches Glyzerinmonostearat, 0,5 Gew.-Teile Behenylalkohol, 1 Gew.-Teil Avocadoöl, 1 Gew.-Teil eines Pulvers, das wasserfreies kristallines Maltotetraosylglucosid nach der Methode in Beispiel A-2 enthält, 2,5 Gew.-Teile Maltit, 1 Gew.-Teil α-Glykosylrutin und geeignete Mengen Vitamin E und ein germizides Mittel wurden in üblicher Weise durch Erhitzen gelöst, und die Mischung wurde mit 5 Gew.-Teilen 1,3-Butylenglykol, 0,1 Gew.- Teilen Carboxyvinylpolymer und 85,3 Gew.-Teilen gereinigtes Wasser vermischt und mit einem Homogenisator unter Erhalt einer Milchlotion emulgiert.
Das Produkt ist eine feuchtigkeitserhaltende Milchlotion, die insbesondere verwendbar ist als Sonnenschutzmittel und Hautbleichmittel.

Beispiel B-11

Hautcreme

Zwei Gew.-Teile Polyoxyethylenglycolmonostearat, 5 Gew.-Teile selbst-emulgierendes Glyzerinmonostearat, 2 Gew.-Teile α- Glycosylrutin, 1 Gew.-Teile flüssiges Paraffin, 10 Gew.-Teile Glyzeryltrioctanat, 1 Gew.-Teil wasserhaltiges kristallines Maltotetraosylglykosid nach der Methode in Beispiel A-1, 3 Gew.-Teile Maltit und eine geeignete Menge Antiseptikum wurden in üblicher Weise unter Erhitzen gelöst, und die erhaltene Lösung wurde mit 5 Gew.-Teilen 1,3-Butylenglykol und 66 Gew.- Teilen gereinigtem Wasser vermischt, mit einem Homogenisator emulgiert und mit einer geeigneten Menge eines Aromamittels unter Rühren vermischt, um eine Hautcreme zu erhalten.
Das Produkt ist eine Creme, die sich gut auftragen läßt und vorzugsweise verwendbar ist als Sonnenschutzmittel, Hautpflegemittel und Hautbleichmittel.

Beispiel B-12

Zahnpasta

45 Gew.-Teile Calciumhydrogenphosphat, 1,5 Gew.-Teile Natriumlaurat, 25 Gew.-Teile Glyzerin, 0,5 Gew.-Teile Polyoxyethylensorbitanlaurat, 2 Gew.-Teile eines Pulvers, das. wasserhaltiges kristallines Maltotetraosylglucosid nach der Methode in Beispiel A-3 enthält, 3 Gew.-Teile Pullulan, 10 Gew.-Teile Maltit, 0,02 Gew.-Teile Saccharin und 0,05 Gew.-Teile Antiseptikum wurden mit 13 Gew.-Teilen Wasser vermischt, um eine Zahnpasta zu erhalten. Das Produkt, das einen ausgezeichneten Glanz und Detergenz aufweist, ist als Zahnpasta verwendbar.

Beispiel B-13

Düngungsstab

Eine Düngemittelzusammensetzung (N = 14%, P&sub2;O&sub5; = 8%, K&sub2;O = 12 %), Pullulan, ein Pulver, das wasserhaltiges kristallines Maltotetraosylglycosyl nach der Methode in Beispiel A-3 enthält, Calciumsulfat und Wasser wurden im Gewicht von 70, 5, 5, 15 und 5 vermischt und die erhaltene Mischung wurde in-einen Extruder (L/D = 20, Unterdrückungsverhältnis = 1,8, Würfeldurchmesser = 30 mm) gegeben, während bei 80ºC erhitzt wurde, wobei eine Düngemittelstab erhalten wurde.
Das Produkt ist ohne einen Behälter für das Düngemittel handhabbar, und es hat eine geeignete Härte für eine Gesamtbeschichtungsanwendung, und seine Schmelzgeschwindigkeit kann eingestellt werden, indem das Zusammensetzungsverhältnis eingestellt wird. Nach Bedarf kann das Produkt ohne weiteres mit Pflanzenhormonen, landwirtschaftliche Chemikalien und Bodenverbesserern vermischt werden.
Wie aus der obigen Beschreibung hervorgeht, ist, das erfindungsgemäße kristalline Maltotetraosylglucosid eine Substanz, die bisher unbekannt war, sie ist nicht reduzierend, wenig hygroskopisch, stabil und leicht handhabbar, und unterschiedlich von reduzierender Maltopentaose. Da weiterhin das erfindungsgemäße kristalline Maltotetraosylglucosid ohne weiteres getrennt und gereinigt werden kann, ist die Herstellung von kristallinem Maltotetraosylglucosid kostengünstig machbar.
Das kristalline Maltotetraosylglucosid ist geeigneter Weise verwendbar als Reagenz, als Substrat zur Untersuchung von Amylase in Serum und chemischem Material, und es ist bevorzugt verwendbar bei der Herstellung von verschiedenen Zusammensetzungen, einschließlich Nahrungsmitteln, Getränken, Kosmetika, Pharmazeutika. Daher hat die Bereitstellung des erfindungsgemäßen kristallinen Maltotetraosylglucosids und seine Herstellung und Anwendung eine industrielle Bedeutsamkeit auf den jeweiligen relevanten Industriegebieten.

Claims

1. Wasserhaltiges oder wasserfreies kristallines Maltotetraosylglucosid, das Beugungswinkel (26) von 12,6º, 21,3º, 22,1º und 22,8º bei der Pulver-Röntgenstrahl- Beugungsanalyse für das wasserhaltige kristalline Matotetraosylglucosid aufweist oder das Beugungswinkel (2θ) von 12,7º, 13,7º, 18,8º und 23,2º bei der Pulver- Röntgenstrahl-Beugungsanalyse für das wasserfreie kristalline Maltotetraosylglucosid aufweist.

2. Verfahren zur Herstellung von kristallinem Maltotetraosylglucosid von Anspruch 1, welches folgendes umfaßt:

(a) Kristallisieren von Maltotetraosylglucosid aus einer Lösung von Maltotetraosylglucosid; und

(b) Gewinnen des kristallinen Maltotetraosylglucosids.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Maltotetraosylglucosid hergestellt wird, indem eine wäßrige Lösung von Maltopentaose der Wirkung eines nicht-reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms ausgesetzt wird oder eine wäßrige Lösung, die Trehalose und eine stärkehaltige Substanz enthält oder die ein nicht-reduzierendes Saccharid enthält, der Wirkung vom Cyclohatodextringlucanotransferase ausgesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Lösung aus Maltopentaose hergestellt wird, indem die stärkehaltige Substanz der Wirkung von α-Amylase oder einer Mischung aus a Amylase und eines starkeentzweigenden Enzyms ausgesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, worin das nicht-reduzierende Saccharid bildende Enzym ein nichtreduzierendes Saccharid aus einem reduzierendem Teilstärkehydrolysat bilden kann.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, worin das nicht-reduzierende Saccharid eine Trehalosestruktur als Endeinheit aufweist.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, worin das reduzierende Stärkehydrolysat einen Glukosepolymerisationsgrad von 3 oder mehr aufweist.

8. Verfahren zur Herstellung eines kristallinen Maltotetraosylglucosids von Anspruch 1, welches folgendes umfaßt:

(a) Alkalibehandeln einer wäßrigen Lösung von Maltotetraosylglucosid; und

(b) Chromatographieren der erhaltenen Lösung zur Herstellung einer Fraktion, die reich an Maltotetraosylglucosid ist; und

(c) Einengen und Kristallisieren der Fraktion; und

(d) Gewinnen des kristallinen Maltotetraosylglucosids.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Lösung von Maltotetraosylglucosid erhalten wird, indem eine wäßrige Lösung von Maltopentaose der Wirkung eines nichtreduzierenden Saccharid bildenden Enzyms ausgesetzt wird oder eine wäßrige Lösung, die Trehaloseund stärkenhaltige Substanzen enthält oder die ein nicht-reduzierendes Saccharid enthält, der Wirkung von Cyclomaltodextringlucanotransferase ausgesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Lösung von Maltopentaose hergestellt wird, indem eine stärkehaltige Substanz der Wirkung von α-Amylase oder einer Mischung aus α-Amylase und einem stärkeentzweigenden Enzym ausgesetzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, worin das nicht-reduzierende Saccharid bildende Enzym ein nichtreduzierendes Saccharid aus einem reduzierenden Teilstärkehydrolysat bilden kann.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, worin das nicht-reduzierende Saccharid eine Trehalosestruktur als Endheit aufweist.

13. Zusammensetzung, die ein kristallines Maltotetraosylglucosid nach Anspruch 1 enthält.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin die Zusammensetzung das kristalline Maltotetraosylglucosid in einer Menge von 0,1 Gew./Gew.-% oder mehr, auf trockener Feststoffbasis, enthält.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14, worin die Zusammensetzung in Form von Nahrungsmitteln, Getränken, Kosmetika, Pharmazeutika oder Formkörpern vorliegt.

16. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die ein kristallines Maltotetraosylglucosid enthält, welches die Stufe aufweist: Zugabe des kristallinen Maltotetraosylglucosids in ein Material für ein Produkt, das aus der Gruppe aus Nahrungsmitteln, Getränken, Kosmetika, Pharmazeutika und Formkörpern gewählt ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Zusammensetzung in einem der Ansprüche 13 bis 15 definiert ist.