JPH07143876A - 非還元性糖質生成酵素とその製造方法並びに用途 - Google Patents

非還元性糖質生成酵素とその製造方法並びに用途

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JPH07143876A JP5349216A JP34921693A JPH07143876A JP H07143876 A JPH07143876 A JP H07143876A JP 5349216 A JP5349216 A JP 5349216A JP 34921693 A JP34921693 A JP 34921693A JP H07143876 A JPH07143876 A JP H07143876A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 澱粉部分分解物から非還元性糖質の製造方法
の確立とその用途開発を目的とする。 【構成】 本発明は、グルコース重合度が３以上から選
ばれる１種または２種以上の還元性澱粉部分分解物から
トレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する新規
非還元性糖質生成酵素とその製造方法、それを産生する
微生物、加えて、この新規非還元性糖質生成酵素を用い
て製造される末端にトレハロース構造を有する非還元性
糖質、これを含有する低還元性糖質、およびこれらから
製造されるトレハロース、並びにこれら非還元性糖質を
含有せしめた組成物を主な構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、非還元性糖質生成酵素
とその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には、グル
コース重合度３以上から選ばれる１種または２種以上の
還元性澱粉部分分解物からトレハロース構造を有する非
還元性糖質を生成する新規非還元性糖質生成酵素とその
製造方法、それを産生する微生物、加えて、この新規非
還元性糖質生成酵素を用いて製造される末端にトレハロ
ース構造を有する非還元性糖質、これを含む低還元性糖
質、および、これらから製造されるトレハロース、並び
にこれら非還元性糖質を含有せしめた組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】グルコースを構成糖とする非還元性糖質
として、古くからトレハロース（α，α−トレハロー
ス）が知られており、その存在は、『アドバンシズ・イ
ン・カーボハイドレイト・ケミストリー（Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）』、第１８巻、第２０１乃至２２５頁（１９６
３年）アカデミック・プレス社（米国）および『アプラ
イド・アンド・エンビロメンタル・マイクロバイオロジ
ー（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ
ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）』、第５６巻、第３
２１３乃至３２１５頁（１９９０年）などにも記載され
ているように、少量ながら、微生物、きのこ、昆虫など
広範囲に及んでいる。トレハロースのような非還元性糖
質は、アミノ酸や蛋白質等のアミノ基を有する物質とア
ミノカルボニル反応を起こさず、含アミノ酸物質を損な
わないことから、褐変、劣化を懸念することなく利用、
加工できることが期待され、その工業的製造方法の確立
が望まれている。
【０００３】トレハロースの製造方法としては、例え
ば、特開昭５０−１５４４８５公報で報告されている微
生物菌体を用いる方法や、特開昭５８−２１６６９５公
報で提案されているマルトース・ホスホリラーゼとトレ
ハロース・ホスホリラーゼとの組合せでマルトースを変
換する方法などが知られている。しかしながら、微生物
菌体を用いる方法は、該菌体を出発原料とし、これに含
まれるトレハロースの含量が、通常、固形物当り１５ｗ
／ｗ％（以下、本明細書では、特にことわらない限り、
ｗ／ｗ％を単に％と略称する）未満と低く、その上、こ
れを抽出、精製する工程が煩雑で、工業的製造方法とし
ては不適である。また、マルトース・ホスホリラーゼお
よびトレハロース・ホスホリラーゼを用いる方法は、い
ずれもグルコース−１リン酸を経由しており、その基質
濃度を高めることが困難であり、また、両酵素の反応系
が可逆反応で目的物の生成率が低く、更には、両酵素の
反応系を安定に維持して反応をスムーズに進行させるこ
とが困難であって、未だ、工業的製造方法として実現す
るに至っていない。
【０００４】これに関係して、『月刊フードケミカ
ル』、８月号、第６７乃至７２頁（１９９２年）、「澱
粉利用開発の現状と課題」の「オリゴ糖」の項におい
て、「トレハロースについては著しく広い応用範囲が考
えられるが、本糖の澱粉糖質からの直接糖転移、加水分
解反応を用いた酵素的生産は、現在のところ学術的には
不可能であるといわれている。」と記載されているよう
に、澱粉を原料とし、酵素反応によってトレハロースを
製造することは、従来、学術的にも不可能であると考え
られてきた。
【０００５】一方、澱粉を原料として製造される澱粉部
分分解物、例えば、澱粉液化物、各種デキストリン、各
種マルトオリゴ糖などは、通常、その分子の末端に還元
基を有し還元性を示すことが知られている。このような
澱粉部分分解物を、本明細書では、還元性澱粉部分分解
物と称する。一般に、還元性澱粉部分分解物は、固形物
当りの還元力の大きさをデキストロース・エクイバレン
ト（ＤｅｘｔｒｏｓｅＥｑｕｉｖａｌｅｎｔ，ＤＥ）と
して表している。この値の大きいものは、通常、分子が
小さく低粘度で、甘味が強いものの、反応性が強く、ア
ミノ酸や蛋白質などのアミノ基を持つ物質とアミノカル
ボニル反応を起こし易く、褐変し、悪臭を発生して、品
質を劣化し易い性質のあることが知られている。
【０００６】このような還元性澱粉部分分解物の種々の
特性は、ＤＥの大小に依存しており、還元性澱粉部分分
解物とＤＥとの関係は極めて重要である。従来、当業界
では、この関係を断ち切ることは不可能とさえ信じられ
てきた。
【０００７】還元性澱粉部分分解物とＤＥとの関係を断
ち切る唯一の方法は、還元性澱粉部分分解物を高圧水素
添加法などによって、その還元基を糖アルコールに変換
して非還元性糖質にする方法である。しかし、この方法
は、高圧オートクレーブを必要とし、多量の水素やエネ
ルギーを消費するのみならず、防災上からも高度な安全
施設や管理を必要としている。その上、得られる還元性
澱粉部分分解物の糖アルコールは、原料の還元性澱粉部
分分解物がグルコースのみからなるのに対し、グルコー
スとソルビトールとから構成される点で異なり、それを
摂取することによって、一過性ではあるが、難消化、緩
下の症状を起こす懸念もある。従って、還元性澱粉部分
分解物の構成糖であるグルコースを変えることなく、そ
の還元力を低減若しくは消滅させる方法の確立が望まれ
る。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来信じら
れてきた還元性澱粉部分分解物とＤＥとの関係を打破
し、還元性澱粉部分分解物の新たな用途を開拓するた
め、還元性澱粉部分分解物からの非還元性糖質の新規製
造方法とその非還元性糖質並びにその用途を提供しよう
とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために、還元性澱粉部分分解物からトレハロ
ース構造を有する非還元性糖質を生成する全く新しい非
還元性糖質生成酵素の実現に期待を込めて、この酵素を
産生する微生物を土壌より広く検索してきた。その結
果、岡山県岡山市の土壌から、新たに分離した新規微生
物、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生
物Ｍ−１１、および岡山県総社市の土壌から新たに分離
した新規微生物、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ）属に属する新規微生物Ｑ３６が、還元性澱粉
部分分解物からトレハロース構造を有する非還元性糖質
を生成する新規非還元性糖質生成酵素を産生することを
見いだし、この非還元性糖質生成酵素を還元性澱粉部分
分解物に作用させることにより、目指していたトレハロ
ース構造を有する非還元性糖質が容易に製造しうること
を見いだし、また、還元性澱粉部分分解物に、この非還
元性糖質生成酵素を作用させ、次いでグルコアミラーゼ
またはα−グルコシダーゼを作用させることにより、容
易にトレハロースを製造しうることを見いだし、本発明
を完成した。更に、この非還元性糖質生成酵素を産生す
る微生物を、公知菌より広く検索した。その結果、ブレ
ビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、
フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ク
ルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
属、テラバクター（Ｔｅｒｒａｂａｃｔｅｒ）属に属す
る微生物も、本発明の非還元性糖質生成酵素を産生する
ことが判明し、前記のリゾビウム属、アルスロバクター
属に属する微生物由来の非還元性糖質生成酵素と同様
に、還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造
を有する非還元性糖質を生成することを見いだし、本発
明を完成した。併せて、この非還元性糖質、これを含む
低還元性糖質および／またはトレハロースを含有せしめ
た飲食物、化粧品、医薬品などの組成物を確立して本発
明を完成した。
【００１０】次に本発明のリゾビウム属に属する微生物
Ｍ−１１の同定試験結果を示す。なお、同定試験は、
『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版セン
ター、１９８５年）に準じて行った。
【００１１】
【Ａ 細胞形態】
肉汁寒天培養、２７℃ 通常０．６乃至０．８×１．０乃至１．５μｍの桿菌。
単独、希に対をなし、連鎖した細胞も観察される。多形
性なし。運動性あり。無胞子。鞭毛は周鞭毛。非抗酸
性。グラム陰性。カプセル陰性。異染顆粒陽性。Ｐｏｌ
ｙ−β−ｈｙｄｒｏｘｙ ｂｕｔｙｒａｔｅを蓄積。
【００１２】
【Ｂ 培養的性質】
（１） 肉汁寒天平板培養、２７℃ 形状 ：円形 大きさは２４時間で約１．５ｍｍ。 周縁 ：全縁 隆起 ：偏平状ないし半レンズ状 光沢 ：あり 表面 ：平滑 色調 ：半透明、クリーム色 （２） デキストロース・トリプトン寒天平板培養、２
７℃ コロニーは半透明、クリーム色、ｍｕｃｏｉｄ生成 （３） 酵母エキス・マンニトール寒天平板培養、２７
℃ 形状 ：円形 大きさは５日で約３ｍｍ。 色調 ：半透明、クリーム色、ｍｕｃｏｉｄ生成 （４） コンゴーレッド含有酵母エキス・マンニトール
寒天平板培養、２７℃ コロニーは仄かなピンク色で、ほとんどコンゴーレッド
を吸収しない。 （５） ２ｗ／ｖ％ＮａＣｌ含有酵母エキス・マンニト
ール寒天平板培養、２７℃ 生育する。 （６） 肉汁寒天斜面培養、２７℃ 生育 ：良好 形状 ：糸状 （７） 肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃ 液化しない。
【００１３】
【Ｃ 生理学的性質】 （１） 硝酸塩の還元性 ：陽性 （２） 脱窒反応 ：陰性 （３） メチルレッド試験 ：陰性 （４） ＶＰ試験 ：陰性 （５） インドールの生成 ：陰性 （６） 硫化水素の生成 ：陽性 （７） 澱粉の加水分解 ：陰性 （８） クエン酸の利用 ：陽性 （９） 無機窒素源の利用 ：アンモニウム塩および硝酸塩と もに利用できる。 （１０） 色素の生成 ：可溶性色素の生成はない （１１） ウレアーゼ ：陽性 （１２） オキシダーゼ ：陰性 （１３） カタラーゼ ：陽性 （１４） 生育の範囲 ：ｐＨ ５．５乃至９．０ 温度 ４乃至３５℃ （１５） 酸素に対する態度 ：好気性 （１６） 炭素源の利用性と酸生成の有無 利用性 酸生成 Ｄ−グルコース 利用する 陽性 Ｄ−ガラクトース 利用する 陽性 Ｄ−フラクトース 利用する 陽性 Ｌ−アラビノース 利用する 陽性 Ｄ−キシロース 利用する 陽性 Ｌ−ラムノース 利用する 陽性 マルトース 利用する 陰性 スクロース 利用する 陽性 ラクトース 利用する 陰性 トレハロース 利用する 陰性 ラフィノース 利用する 陽性 マンニトール 利用する 陰性 デキストリン 利用する 陰性 ズルシトール 利用する 陰性 （１７） アミノ酸の脱炭酸試験 ：Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、 Ｌ−オルニチンいずれに対して も陰性。 （１８） アミノ酸の利用 ：Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、 Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム 、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリ ンいずれも利用する。 （１９） ＤＮａｓｅ ：陰性 （２０） ３−ケトラクトースの生成：陰性 （２１） ＤＮＡのＧ−Ｃ含量 ：６１％
【００１４】以上の菌学的性質に基づいて、『バージー
ズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオ
ロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）』、第
１巻（１９８４年）を参考にして、公知菌との異同を検
討した。その結果、リゾビウム属に属する微生物である
ことが判明した。本菌は、リゾビウム・メリロッチ（Ｒ
ｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）に近い性質を示
すものの、この菌とは違って、マルトース、ラクトー
ス、マンニトールから酸を生成しない点に違いが認めら
れ、また、還元性澱粉部分分解物からトレハロース構造
を有する非還元性糖質を生成する非還元性糖質生成酵素
を産生する文献未記載の特徴を有している。
【００１５】これらの結果より本発明者等は、本菌を新
規微生物リゾビウム・スピーシーズ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ
ｍ ｓｐ．）Ｍ−１１と命名し、平成４年１２月２４日
付で、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託し、微生
物受託番号 微工研条寄第４１３０号（ＦＥＲＭ ＢＰ
−４１３０）として受託された。
【００１６】本発明では、上記菌のみならず、リゾビウ
ム属に属し、還元性澱粉部分分解物からトレハロース構
造を有する非還元性糖質を生成する非還元性糖質生成酵
素を産生する他の菌株、更には、それら菌株の変異株な
ども適宜用いられる。
【００１７】次に本発明のアルスロバクター属に属する
微生物Ｑ３６の同定試験結果を示す。なお、同定試験
は、リゾビウム属に属するＭ−１１の場合と同様に、
『微生物の分類と同定』、（長谷川武治編、学会出版セ
ンター、１９８５年）に準拠して行った。
【００１８】
【Ａ 細胞形態】
（１） 肉汁寒天培養、２７℃ 通常０．５乃至０．７×０．８乃至１．６μｍ桿菌。単
独。多形性あり。運動性なし。無胞子。鞭毛なし。非抗
酸性。グラム陽性。カプセル陰性。 （２） ＥＹＧ寒天培養、２７℃ 桿菌−球菌の生育サイクルを示す。
【００１９】
【Ｂ 培養的性質】
（１） 肉汁寒天平板培養、２７℃ 形状 ：円形。大きさは３日間で２乃至２．５ｍｍ。 周縁 ：全縁 隆起 ：半レンズ状 光沢 ：湿光 表面 ：平滑 色調 ：半透明、白色乃至淡い黄色 （２） 肉汁寒天斜面培養、２７℃ 生育度 ：良好 形状 ：糸状 （３） 酵母エキス−ペプトン寒天斜面培養、２７℃ 生育度 ：良好 形状 ：糸状 （４） 肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃ 液化する。
【００２０】
【Ｃ 生理学的性質】 （１） 硝酸塩の還元性 ：陽性 （２） 脱窒反応 ：陰性 （３） メチルレッド試験 ：陰性 （４） ＶＰ試験 ：陽性 （５） インドールの生成 ：陰性 （６） 硫化水素の生成 ：陽性 （７） 澱粉の加水分解 ：陰性 （８） セルロースの分解 ：陰性 （９） クエン酸の利用 ：陽性 （１０） 無機窒素源の利用 ：アンモニウム塩および硝酸塩と もに利用できる。 （１１） 色素の生成 ：なし （１２） ウレアーゼ ：陽性 （１３） オキシダーゼ ：陰性 （１４） カタラーゼ ：陽性 （１５） 生育の範囲 ：ｐＨ ５乃至１０ 温度 ４乃至３７℃ （１６） 酸素に対する態度 ：好気性 （１７） 炭素源の利用性と酸生成の有無 利用性 酸生成 Ｄ−グルコース 利用する 陰性 Ｄ−ガラクトース 利用する 陰性 Ｄ−フラクトース 利用する 陰性 Ｌ−アラビノース 利用する 陰性 Ｄ−キシロース 利用する 陰性 Ｌ−ラムノース 利用する 陰性 マルトース 利用する 陰性 スクロース 利用する 陰性 ラクトース 利用する 陰性 ラフィノース 利用する 陰性 マンニトール 利用する 陰性 デキストリン 利用する 陰性 ズルシトール 利用する 陰性 （１８） アミノ酸の利用 ：Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、 Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム 、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリ ンいずれも利用する。 （１９） ＤＮａｓｅ ：陽性 （２０） ３−ケトラクトースの生成：陰性 （２１） 細胞壁の主要ジアミノ酸 ：リジン （２２） ＤＮＡのＧ−Ｃ含量 ：６３％
【００２１】以上の菌学的性質をもとにして、『バージ
ーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリ
オロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓ
ｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）』、
第２巻（１９８４年）を参考にして、公知の菌株とその
異同を検討した。その結果、本菌は、アルスロバクター
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物である
ことが判明した。また、本菌は、還元性澱粉部分分解物
からトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する
非還元性糖質生成酵素を産生する文献未記載の特徴を有
している。
【００２２】これらの結果より本発明者等は、本菌を新
規微生物アルスロバクター・スピーシーズ（Ａｒｔｈｒ
ｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｑ３６と命名し、平成５年６
月３日付けで、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託し、受託番号 ＦＥＲＭＢＰ−４３１６として受託さ
れた。
【００２３】本発明では上記菌株のみならず、アルスロ
バクター属に属し、還元性澱粉部分分解物からトレハロ
ース構造を有する非還元性糖質を生成する非還元性糖質
生成酵素を産生する他の菌株、更には、それら菌株の変
異株なども適宜用いられる。
【００２４】本発明に用いられる微生物としては、本発
明の非還元性糖質生成酵素産生能を有するものであれば
よく、例えば、前記の新規微生物リゾビウム・スピーシ
ーズＭ−１１ ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０およびアルス
ロバクター・スピーシーズＱ３６ ＦＥＲＭ ＢＰ−４
３１６だけでなく、公知微生物であるブレビバクテリウ
ム・ヘロボルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅ
ｌｏｖｏｌｕｍ）ＡＴＣＣ１１８２２、フラボバクテリ
ウム・アクアティレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｑｕａｔｉｌｅ）ＩＦＯ３７７２、ミクロコッカス・
ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）Ｉ
ＦＯ３０６４、ミクロコッカス・ロゼウス（Ｍｉｃｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）ＡＴＣＣ１８６、クルト
バクテリウム・シトレウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｃｉｔｒｅｕｍ）ＩＦＯ１５２３１、マイコバク
テリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ＡＴＣＣ１９４２０、テラバクタ
ー・ツメスセンス（Ｔｅｒｒａｂａｃｔｅｒ ｔｕｍｅ
ｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ１２９６０なども有利に利用でき
る。
【００２５】本発明の微生物の培養に用いる培地は、微
生物が生育でき、本発明の非還元性糖質生成酵素を産生
しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地
のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が資化しう
る物であればよく、例えば、グルコース、フラクトー
ス、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビト
ール、糖蜜、還元性澱粉部分分解物などの糖質、また、
クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができ
る。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類
により適宜選択される。例えば、還元性澱粉部分分解物
の場合には、通常、２０％以下が望ましく、菌の生育お
よび増殖からは５％以下が好ましい。窒素源としては、
例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物
および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、
カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機
窒素含有物が用いられる。また、無機成分としては、例
えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナ
トリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅
塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用いられる。
更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用
いられる。
【００２６】培養は、通常、温度４乃至４０℃、好まし
くは２０乃至３７℃、ｐＨ４乃至１０、好ましくは５乃
至９から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は
微生物が増殖し始める時間以上の時間であればよく、好
ましくは１０時間乃至１００時間である。また、培養液
の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５
乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節
したり、撹拌したり、通気に酸素を追加したり、また、
ファーメンター内の圧力を高めるなどの手段が採用され
る。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいず
れでもよい。
【００２７】このようにして、微生物を培養した後、本
発明の酵素を回収する。本酵素活性は、培養物の菌体お
よび除菌液いずれにも認められ、菌体および除菌液を粗
酵素液として採取することも、また、培養物全体を粗酵
素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去
するには公知の固液分離法が採用される。例えば、培養
物そのものをそのまま遠心分離する方法、あるいは、プ
レコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平
膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適
宜採用される。除菌液をそのまま酵素液として用いるこ
とができるが、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮
方法としては、例えば、硫安塩析法、アセトンおよびア
ルコール沈殿法、平膜、中空糸膜など膜濃縮法などが採
用される。
【００２８】更に、除菌液およびその濃縮物を公知の方
法により固定化することもできる。例えば、イオン交換
体への結合法、樹脂および膜などとの共有結合・吸着
法、高分子物質を用いた包括法などが採用される。ま
た、培養物から分離した菌体もそのまま粗酵素として用
いることができるが、これを固定化して用いてもよい。
一例として、これをアルギン酸ナトリウムと混合して、
塩化カルシウム溶液中に滴下して粒状にゲル化させて固
定化する。この粒状化物をさらにポリエチレンイミン、
グルタールアルデヒドで処理して固定化してもよい。菌
体から酵素を抽出して、その抽出液を粗酵素液として用
いることもできる。例えば、超音波による破砕法、ガラ
スビーズおよびアルミナによる機械的破砕法、フレンチ
プレスによる破砕法などで菌体から酵素を抽出し、遠心
分離または膜濾過などで清澄な粗酵素液を得ることがで
きる。
【００２９】本酵素液はそのまま用いることができる
が、公知の方法によって更に精製して利用することもで
きる。一例として、培養液の処理物を硫安塩析して濃縮
した粗酵素標品を透析後、ＤＥＡＥ−トヨパール樹脂を
用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続い
て、ブチルトヨパール樹脂を用いた疎水カラムクロマト
グラフィー、トヨパール ＨＷ−５５樹脂を用いたゲル
濾過クロマトグラフィーを用いて精製することにより、
電気泳動的に単一な酵素を得ることができる。
【００３０】このようにして得られる本発明の非還元性
糖質生成酵素は、下記の理化学的性質を有する。 （１） 作用 グルコース重合度３以上から選ばれる１種または２種以
上の還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造
を有する非還元性糖質を生成する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約７６，０００乃至８
７，０００ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．６乃
至４．６。 （４） 至適温度 ｐＨ７．０、６０分間反応で、３５乃至４０℃付近。 （５） 至適ｐＨ ４０℃、６０分間反応で、ｐＨ約６．４乃至７．２。 （６） 温度安定性 ｐＨ７．０、６０分間保持で、３５乃至４０℃付近まで
安定。 （７） ｐＨ安定性 ２５℃、１６時間保持で、ｐＨ約５．５乃至１１．０。
【００３１】本発明の非還元性糖質生成酵素の活性測定
方法は、基質としてマルトペンタオース１．２５ｗ／ｖ
％（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）４ｍｌに酵素
液を１ｍｌ加え４０℃で６０分間反応させた後、１００
℃で１０分間加熱して反応を停止させ、その反応液を正
確に脱イオン水で１０倍に希釈し、その希釈液の還元力
をソモギー・ネルソン法にて測定する。対照として、あ
らかじめ１００℃で１０分間加熱することにより失活さ
せた酵素液を用いて同様に測定する。上記の測定方法を
用いて、１分間に１μｍｏｌｅのマルトペンタオースに
相当する還元力を減少させる酵素量を１単位と定義し
た。
【００３２】本酵素の基質としては、澱粉、アミロペク
チン、アミロースなどの澱粉をアミラーゼまたは酸など
によって部分的に加水分解して得られる還元性澱粉部分
分解物が用いられる。アミラーゼで分解した直鎖または
枝分かれ構造を有する還元性澱粉部分分解物としては、
例えば、『ハンドブック・オブ・アミレーシズ・アンド
・リレイテツド・エンザイムズ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏ
ｆ Ａｍｙｌａｓｅｓａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｎｚ
ｙｍｅｓ）』（１９８８年）パーガモン・プレス社（東
京）に記載されている、α−アミラーゼ、マルトトリオ
ース生成アミラーゼ、マルトテトラオース生成アミラー
ゼ、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサ
オース生成アミラーゼなどのアミラーゼで分解した還元
性澱粉部分分解物を用いる。更には、還元性澱粉部分分
解物を調製する際、プルラナーゼおよびイソアミラーゼ
などの枝切酵素を作用させることも随意である。また、
還元性澱粉部分分解物として、マルトオリゴ糖、例え
ば、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペ
ンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース
などの１種または２種以上を用いることも有利に実施で
きる。
【００３３】基質濃度は特に限定されない。例えば、
０．１％の基質溶液として用いた場合でも、本酵素の反
応は進行するが、工業的には、２％以上、望ましくは、
５乃至５０％の高濃度反応が好適であり、トレハロース
構造を有する非還元性糖質を有利に生成できる。また、
基質溶液中に完全に溶けきれない不溶性基質を含有する
ものであってもよい。反応温度は酵素反応が進行する温
度、すなわち５５℃附近までで行えばよいが、好ましく
は４０乃至５０℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通
常、５乃至１０の範囲に調整すればよいが、好ましくは
約ｐＨ６乃至８の範囲に調整する。反応時間は酵素反応
の進行により適宜選択する。
【００３４】上記の反応によって得られた非還元性糖質
を含む反応液は、基質に用いた還元性澱粉部分分解物と
比較して、顕著に還元力が低下している。例えば、基質
にマルトペンタオースを用いた場合、本酵素反応により
反応液が示す還元力は、基質マルトペンタオース溶液の
示す始発還元力の約９３％が消失し、約７％にまで低下
する。
【００３５】反応液は、常法により、濾過、遠心分離な
どして不溶物を除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＯＨ
型イオン交換樹脂で脱塩して精製し、濃縮し、シラップ
状製品とする。更に、乾燥して粉末状製品にすることも
随意である。必要ならば、更に、精製、例えば、イオン
交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマト
グラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなど
のカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコールお
よびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能
を有する膜による分離、更には、酵母での発酵処理、ア
ルカリ処理などによる残存している還元性糖質の分解除
去などの方法を１種または２種以上組み合わせて精製す
ることにより、最高純度の非還元性糖質製品を得ること
も容易である。
【００３６】とりわけ、工業的大量生産方法としては、
イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用が好適であ
り、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５
８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチ
オン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより
夾雑糖類を除去し、目的物の含量を向上させた非還元性
糖質を有利に製造することができる。この際、固定床方
式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用
することも随意である。
【００３７】このようにして得られた本発明のトレハロ
ース構造を有する非還元性糖質またはこれを含む低還元
性糖質を、必要により、アミラーゼ、例えば、α−アミ
ラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどや、ま
たはα−グルコシダーゼで分解し、甘味性、還元力など
を調整したり、粘性を低下させたりすることも、また、
水素添加して残存する還元性糖質を糖アルコールにして
還元力を消滅せしめることなどの更なる加工処理を施す
ことも随意である。
【００３８】とりわけ、本発明の非還元性糖質またはこ
れを含む低還元性糖質に対して、グルコアミラーゼまた
はα−グルコシダーゼを作用させることにより容易にト
レハロースを製造することができる。即ち、これらの非
還元性または低還元性糖質にグルコアミラーゼまたはα
−グルコシダーゼを作用させてトレハロースとグルコー
スとの混合溶液とし、これを、前述の精製方法、例え
ば、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどにより、
グルコースを除去し、トレハロース高含有画分を採取す
る。これを精製、濃縮して、シラップ状製品を得ること
も、更に濃縮して過飽和にし、晶出させてトレハロース
含水結晶または無水トレハロース結晶を得ることも有利
に実施できる。
【００３９】トレハロース含水結晶を製造するには、例
えば、純度約６０％以上、濃度約６５乃至９０％のトレ
ハロース高含有液を助晶缶にとり、０．１乃至２０％の
種晶共存下で、温度９５℃以下、望ましくは１０乃至９
０℃の範囲で、撹拌しつつ徐冷し、トレハロース含水結
晶を含有するマスキットを製造する。マスキットからト
レハロース含水結晶またはこれを含有する含蜜結晶を製
造する方法は、例えば、分蜜方法、ブロック粉砕方法、
流動造粒方法、噴霧乾燥方法など公知の方法を採用すれ
ばよい。
【００４０】分蜜方法の場合には、通常、マスキットを
バスケット型遠心分離機にかけ、トレハロース含水結晶
と蜜（母液）とを分離し、必要により、該結晶に少量の
冷水をスプレーして洗浄することも容易な方法であり、
より高純度のトレハロース含水結晶を製造するのに好適
である。噴霧乾燥方法の場合には、通常、濃度７０乃至
８５％、晶出率２０乃至６０％程度のマスキットを高圧
ポンプでノズルから噴霧し、結晶粉末が溶解しない温
度、例えば、６０乃至１００℃の熱風で乾燥し、次いで
３０乃至６０℃の温風で約１乃至２０時間熟成すれば非
吸湿性または難吸湿性の含蜜結晶が容易に製造できる。
また、ブロック粉砕方法の場合には、通常、水分１０乃
至２０％、晶出率１０乃至６０％程度のマスキットを約
０．１乃至３日間静置して全体をブロック状に晶出固化
させ、これを粉砕または切削などの方法によって粉末化
し乾燥すれば、非吸湿性または難吸湿性の含蜜結晶が容
易に製造できる。
【００４１】また、無水結晶トレハロースを製造するに
は、トレハロース含水結晶を乾燥して変換させることも
できるが、一般的には、水分１０％未満の高濃度トレハ
ロース高含有溶液を助晶缶にとり、種晶共存下で５０乃
至１６０℃、望ましくは８０乃至１４０℃の範囲で撹拌
しつつ無水結晶トレハロースを含有するマスキットを製
造し、これを比較的高温乾燥条件下で、例えば、ブロッ
ク粉砕、流動造粒、噴霧乾燥などの方法で晶出、粉末化
して製造される。
【００４２】このようにして製造される本発明の非還元
性糖質、これを含む低還元性糖質およびトレハロース
は、原料の還元性澱粉部分分解物と比較して、還元性が
低く安定であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプ
チド、蛋白質などのアミノ酸を有する物質と混合、加工
しても、褐変することも、異臭を発生することもなく、
混合した他の素材を損なうことも少ない。また、還元性
澱粉部分分解物の場合とは違って、還元力が、低いにも
かかわらず低粘度であり、平均グルコース重合度が低い
ものの場合には、良質で上品な甘味を有している。
【００４３】更に、アミラーゼ、例えば、すい臓由来α
−アミラーゼにより分解し、低分子非還元性オリゴ糖や
低分子マルトオリゴ糖を生成し、また、これらオリゴ糖
も、α−グルコシダーゼや小腸酵素でも容易に分解し、
グルコース及びトレハロースを生成し、更に、生成した
トレハロースはトレハラーゼにより容易にグルコースに
まで分解することから、経口摂取により、消化吸収さ
れ、カロリー源として利用される。虫歯誘発菌などによ
って、醗酵されにくく、虫歯を起こしにくい甘味料とし
ても利用できる。
【００４４】また、安定な甘味料であることにより、結
晶製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスター
チ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤
の糖衣剤として利用することも有利に実施できる。ま
た、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘
性、他の糖の晶出防止性、難醗酵性、糊化澱粉の老化防
止性などの性質を具備している。
【００４５】また、無水結晶トレハロースの場合には、
食品、医薬品、化粧品、その原材料、または加工中間物
などの含水物の脱水剤としても有利に利用でき、安定で
高品質の粉末、顆粒、錠剤など固状物を容易に製造する
ことができる。
【００４６】従って、本発明の非還元性糖質、またはこ
れを含む低還元性糖質およびこれらから製造されるトレ
ハロースは、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定
剤、賦形剤、脱水剤などとして、飲食物、嗜好物、飼
料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利
用できる。
【００４７】本発明の非還元性糖質、これを含む低還元
性糖質およびこれらから製造されるトレハロースは、そ
のまま甘味付のための調味料として使用することができ
る。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、マルトー
ス、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メープルシュガー、イソマ
ルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、
ラクトスクロース、ソルビトール、マルチトール、ラク
チトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリ
コシルステビオシド、レバウディオシド、グリチルリチ
ン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエ
ステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような
他の甘味料の１種または２種以上の適量と混合して使用
してもよく、また必要ならば、デキストリン、澱粉、乳
糖などのような増量剤と混合して使用することもでき
る。
【００４８】また、本発明の非還元性糖質、これを含む
低還元性糖質およびこれらから製造されるトレハロース
の粉末乃至結晶状製品は、そのままで、または必要に応
じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、
球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成型
して使用することも随意である。
【００４９】また、本発明の非還元性糖質、これを含む
低還元性糖質およびこれらから製造されるトレハロース
の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他
の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性
も大きいので、一般の飲食物の甘味付、呈味改良に、ま
た品質改良などに有利に利用できる。
【００５０】例えば、アミノ酸、ペプチド類、醤油、粉
末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、
マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし
酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、
焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、
ダシの素、核酸系調味料、複合調味料、みりん、新みり
ん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味
料として有利に使用できる。
【００５１】また、例えば、せんべい、あられ、おこ
し、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊
羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、
パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリ
ン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリ
ーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレ
ート、チューインガム、キャラメル、キャンディーなど
の洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、
果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペ
ースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプ
レッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロ
ップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、
べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たく
あん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素類、ハム、ソー
セージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、
かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカ
の塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの
各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造
されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻など
の惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン
詰、缶詰類、合成酒、洋酒などの酒類、コーヒー、紅
茶、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲
料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミ
ックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更に
は、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍
食品などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、ま
た、品質改良などに有利に利用できる。
【００５２】また、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚な
どの飼育動物のために飼料、餌料などの嗜好性を向上さ
せる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練
歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トロー
チ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤な
ど各種固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧
品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、または
呈味改良剤、矯味剤として、さらには品質改良剤、安定
剤などとして有利に利用できる。
【００５３】品質改良剤、安定剤としては、有効成分、
活性などを失い易い各種生理活性物質またはこれを含む
健康食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、イ
ンターフェロン−α、−β、−γ、ツモア・ネクロシス
・ファクター−α、−β、マクロファージ遊走阻止因
子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、イ
ンターロイキンＩＩなどのリンホカイン、インシュリ
ン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、
卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン、ＢＣＧワクチン、
日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチ
ン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グ
ロブリンなどの生物製剤、ペニシリン、エリスロマイシ
ン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、スプレ
プトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質、チア
ミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロ
チノイド、エルゴステロール、トコフェロールなどのビ
タミン、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロ
テアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナ
ーゼ、ラクターゼなどの酵素、薬用人参エキス、スッポ
ンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリス
エキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの
生菌、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、その
有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の液状、
ペースト状または固状の健康食品や医薬品などに容易に
製造できることとなる。
【００５４】以上述べたような各種組成物にトレハロー
ス構造を有する非還元性糖質、これを含む低還元性糖
質、およびこれらから製造されるトレハロースを含有せ
しめる方法は、その製品が完成するまでの工程に含有せ
しめればよく、例えば、混和、溶解、融解、浸漬、浸
透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶出、固化など公
知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常０．１％以
上、望ましくは１％以上含有せしめるのが好適である。
【００５５】次に実験により本発明をさらに具体的に説
明する。
【００５６】まず、新規微生物リゾビウム・スピーシー
ズ Ｍ−１１からの非還元性糖質生成酵素の生産、精製
およびその性質などを説明し、次いで、アルスロバクタ
ー・スピーシーズ Ｑ３６からの非還元性糖質生成酵素
について同様に説明する。更に、公知微生物からの非還
元性糖質生成酵素について説明する。
【００５７】
【実験１ リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１からの
非還元性糖質生成酵素の生産】マルトース２．０ｗ／ｖ
％、ペプトン０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ
％、リン酸二ナトリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一カリ
ウム０．１ｗ／ｖ％および水からなる液体培地をｐＨ
７．０に調整した。５００ｍｌ容三角フラスコにこの培
地を約１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃
で２０分間滅菌し、冷却して、リゾビウム・スピーシー
ズ Ｍ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）を接種し、
２７℃、１３０ｒｐｍで２４時間培養したものを種培養
液とした。
【００５８】容量３０ｌのファーメンターに種培養の場
合と同組成の培地約２０ｌを入れて滅菌、冷却して温度
３０℃とした後、種培養液１ｗ／ｖ％を接種し、温度３
０℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、約２４時間通
気撹拌培養した。培養液の本酵素活性は約１．５単位／
ｍｌであった。培養液の一部を採り遠心分離して菌体と
培養液上清とに分離し、更に菌体を５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）で元の培養液と同じ液量の懸濁液とし
た後、菌体懸濁液と培養液上清の酵素活性を測定したと
ころ、菌体懸濁液には約０．６単位／ｍｌの酵素活性
が、また、培養液上清には約０．９単位／ｍｌの酵素活
性が認められた。
【００５９】
【実験２ 酵素の精製】実験１で得られた培養液約１８
ｌを超高圧菌体破砕装置ミニラボ（大日本製薬株式会社
製）で処理し、含まれる菌体を破砕した。処理液を遠心
分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）することによ
り、約１６ｌの上清を得た。その液に飽和度０．２にな
るように硫安を溶解させ、４℃、１時間放置した後、遠
心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）することによ
り上清を回収した。
【００６０】更に、その液に飽和度０．６になるように
硫安を溶解させ、４℃、２４時間放置した後、遠心分離
（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して硫安塩析物を回
収した。得られた硫安塩析物を１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して２
４時間透析し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分
間）して不溶物を除いた。その透析液（３６０ｍｌ）を
２回に分けて、ＤＥＡＥ−トヨパールゲル（東ソー株式
会社製造）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィ
ー（ゲル量３００ｍｌ）を行った。
【００６１】本酵素はＤＥＡＥ−トヨパールゲルに吸着
し、食塩を含む同緩衝液でカラムから溶出した。得られ
る酵素活性画分を、２Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透
析し、その透析液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３
０分間）して不溶物を除き、得られる上清をブチルトヨ
パール６５０ゲル（東ソー株式会社製造）を用いた疎水
カラムクロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行っ
た。吸着した本酵素を硫安２Ｍから０Ｍのリニアグラジ
エントによりカラムから溶出させ、酵素活性画分を回収
した。続いて、トヨパールＨＷ−５５樹脂（東ソー株式
会社製造）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル
量３００ｍｌ）を行い、酵素活性画分を回収した。精製
の各工程における酵素活性量、比活性、収率を表１に示
す。
【００６２】
【表１】
【００６３】表１の工程でゲル濾過溶出液として得られ
た精製酵素標品をポリアクリルアミドゲル（ゲル濃度
７．５％）を用いる電気泳動法で純度を検定したとこ
ろ、蛋白バンドは単一であることが示され、得られた酵
素標品は電気泳動的に単一な純度の高い標品であった。
【００６４】
【実験３ 酵素の性質】実験２で得られた精製酵素標品
をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ゲル濃度１０％）
を用いる電気泳動法に供し、同時に泳動した分子量マー
カー（日本バイオ・ラド・ラボラトリーズ株式会社製）
と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量約
７７，０００乃至８７，０００ダルトンであった。
【００６５】精製酵素標品をポリアクリルアミドゲル
（２％アンフォライン含有、スウエーデン国、ファルマ
シア・エルケイビー社製）を用いる等電点電気泳動法に
供し、泳動後、ゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を
求めたところ、等電点は約３．６乃至４．６であった。
【００６６】本酵素活性に対する温度の影響、ｐＨの影
響は活性測定方法に準じて調べた。結果を図１（温度の
影響）、図２（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度
は、ｐＨ７．０、６０分間反応で、４０℃付近、至適ｐ
Ｈは、４０℃、６０分間反応で、約７．０であった。本
酵素の温度安定性は、酵素溶液（５０ｍＭリン酸緩衝液
を含む、ｐＨ７．０）を各温度に６０分間保持し、水冷
した後、残存する酵素活性を測定することにより求め
た。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの５０ｍＭ緩
衝液中で２５℃、１６時間保持した後、ｐＨを７に調整
し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。そ
れぞれの結果を図３（温度安定性）、図４（ｐＨ安定
性）に示した。本酵素の温度安定性は４０℃付近まで安
定であり、ｐＨ安定性は約６乃至９であった。
【００６７】
【実験４ 非還元性糖質の調製】基質として、グルコー
ス、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、または
マルトヘプタオースの２０％水溶液を調製し、それぞれ
に実験２で得られた精製酵素を基質固形物グラム当たり
２単位の割合で加え、４０℃、ｐＨ７．０で４８時間作
用させた後、脱塩し、ワコービーズ ＷＢ−Ｔ−３３０
カラム（和光純薬工業株式会社製）を用いた高速液体ク
ロマトグラフィーで反応生成物を分析した。高速液体ク
ロマトグラフィーは、室温下で行い、溶離液として水を
流速０．５ｍｌ／分で流し、示差屈折計ＲＩ−８０１２
（東ソー株式会社製造）で分析した。その結果を表２に
示す。
【００６８】
【表２】
【００６９】表２の結果から明らかなように、反応物中
には残存するそれぞれの基質と新たに生成したそれぞれ
の糖質ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、ＰＶからな
り、それ以外の糖質はほとんど検出されない。それぞれ
の生成率はグルコース重合度３のＰＩが比較的低いもの
の、グルコース重合度４以上のＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩ
Ｖ、ＰＶは８５％以上の高い生成率であることが判明し
た。なお、グルコース、マルトースからは、新たな糖質
を生成しないことが判明した。
【００７０】それぞれの反応物から新たに生成した糖質
を精製するため、脱色、脱塩、濃縮後、アルカリ金属型
強酸性カチオン交換樹脂（ＸＴ−１０１６、Ｎａ+型、
架橋度４％、東京有機化学工業株式会社製造）を用いた
カラム分画を行った。樹脂を内径２．０ｃｍ、長さ１ｍ
のジャケット付ステンレス製カラム３本に充填し、直列
につなぎ、カラム内温度を５５℃に維持しつつ、反応糖
液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに５５℃の温水
をＳＶ０．１３で流して分画し、新たに生成した糖質含
量９７％以上の高純度画分を採取した。得られた高純度
画分を真空乾燥し、それぞれ高純度糖質標品を調製し
た。基質原料に対する収率は、固形物換算で、それぞれ
ＰＩで約９％、ＰＩＩで約６５％、ＰＩＩＩで約８２
％、ＰＩＶで約８０％、ＰＶで約７７％であった。その
純度は、それぞれＰＩで９７．５％、ＰＩＩで９８．６
％、ＰＩＩＩで９９．５％、ＰＩＶで９８．４％、ＰＶ
で９８．４％であった。
【００７１】またこれらの新たに生成した高純度糖質標
品の還元力をソモギー・ネルソン法で測定し、ＤＥで表
した。結果は表３にまとめた。
【００７２】
【表３】
【００７３】表３の結果から明らかなように、いずれの
標品にも僅かな還元力しか認めらなかった。その僅かな
還元力は、その標品中に微量に混入、残存している基質
由来の還元性マルトオリゴ糖に起因するものと推定さ
れ、新たに生成した糖質はいずれも実質的に非還元性で
あると判断される。
【００７４】
【実験５ メイラード反応】実験４において調製した糖
質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、またはＰＶ
の１０％とグリシン１％と、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）とを含む溶液を１００℃で９０分間保ち、冷
却後、この溶液の４８０ｎｍ、１ｃｍセルにおける吸光
度を測定した。対照として、それぞれの原料であるマル
トトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオー
ス、マルトヘキサオース、またはマルトヘプタオースを
用いて、同様に、処理し、４８０ｎｍにおける吸光度を
測定した。それらの結果を表４に示す。
【００７５】
【表４】
【００７６】表４の結果から明らかなように、新たに生
成した非還元性糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、Ｐ
ＩＶ、ＰＶのいずれもメイラード反応による着色度は極
めて低く、それぞれ原料の基質であるマルトオリゴ糖の
着色度の僅かに３乃至６％程度であり、本発明の新規酵
素によって生成する非還元性糖質はメイラード反応をほ
とんど示さない糖質であることが判明した。
【００７７】
【実験６ グルコアミラーゼによる酵素分解】実験４に
おいて調製した非還元性糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩ
ＩＩ、ＰＩＶまたは、ＰＶのそれぞれ５０ｍｇを、５０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１ｍｌに溶解し、１単位
のグルコアミラーゼ（生化学工業株式会社製造）を加
え、４０℃で６時間保ち、酵素分解した後、高速液体ク
ロマトグラフィーで分解物を分析したところ、いずれの
標品からも分解物としてグルコースとトレハロースのみ
が検出された。検出されたグルコース含量、トレハロー
ス含量、その組成モル比の結果を表５に示す。
【００７８】
【表５】
【００７９】表５の結果から明らかなように、グルコア
ミラーゼにより、非還元性糖質ＰＩはグルコース１分子
とトレハロース１分子に分解され、非還元性糖質ＰＩＩ
はグルコース２分子とトレハロース１分子に分解され、
非還元性糖質ＰＩＩＩはグルコース３分子とトレハロー
ス１分子に分解され、非還元性糖質ＰＩＶはグルコース
４分子とトレハロース１分子に分解され、非還元性糖質
ＰＶはグルコース５分子とトレハロース１分子に分解さ
れることが判明した。
【００８０】また、グルコアミラーゼの反応特性を考慮
すると、これら非還元性糖質の構造はトレハロース分子
にグルコース分子がα−１，４−結合、もしくはα−
１，６−結合で結合した糖質で、それぞれ、ＰＩはトレ
ハロース１分子にグルコース１分子が結合したグルコー
ス重合度３の非還元性糖質で、ＰＩＩはトレハロース１
分子にグルコース２分子が結合したグルコース重合度４
の非還元性糖質で、ＰＩＩＩはトレハロース１分子にグ
ルコース３分子が結合したグルコース重合度５の非還元
性糖質で、ＰＩＶはトレハロース１分子にグルコース４
分子が結合したグルコース重合度６の非還元性糖質で、
ＰＶはトレハロース１分子にグルコース５分子が結合し
たグルコース重合度７の非還元性糖質であると判断され
る。なお、同様に、非還元性糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、
ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、またはＰＶにβ−アミラーゼを作用
させたところ、非還元性糖質ＰＩ、ＰＩＩは分解され
ず、ＰＩＩＩはマルトースの１分子とＰＩの１分子に分
解され、ＰＩＶはマルトースの１分子とＰＩＩの１分子
に分解され、ＰＶはマルトースの２分子とＰＩの１分子
に分解されることが判明した。
【００８１】以上の結果から、本発明の非還元性糖質生
成酵素による反応は、基質の低分子化および高分子化を
伴わない、換言すれば、グルコース重合度の変化を伴わ
ない、分子内変換反応と判断され、また、この非還元性
糖質生成酵素によって生成した非還元性糖質、ＰＩ、Ｐ
ＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶおよびＰＶは、それぞれ、α−
グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロー
ス、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテ
トラオシルトレハロースおよびα−マルトペンタオシル
トレハロースで示されるα−グリコシルトレハロース
（Ｇn−Ｔ：但し、Ｇはグルコース残基を意味し、ｎは
１以上の整数を意味し、Ｔはα，α−トレハロースを意
味する。）であると判断される。
【００８２】
【実験７ 各種の酵素による分解】実験４において調製
した非還元性糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩ
Ｖ、またはＰＶのそれぞれを基質として、ブタすい臓由
来α−アミラーゼ（シグマ社販売）、コメ由来α−グル
コシダーゼ（シグマ社販売）、またはラット小腸アセト
ン粉末酵素（シグマ社販売）のそれぞれに作用させた
後、分解物の糖組成を高速液体クロマトグラフィーで分
析した。α−アミラーゼの反応は、それぞれの基質１０
ｍｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）１ｍｌに
溶解し、これに、酵素活性１単位加え、３７℃で１８時
間保って行った。α−グルコシダーゼの反応は、５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を用いた以外、α−アミラ
ーゼの場合と同様の条件で行った。ラット小腸アセトン
粉末酵素の場合も、５０ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）を用いた以外、α−アミラーゼの場合と同様の
条件で行った。α−アミラーゼによる分解物の糖組成を
以下の表６に、α−グルコシダーゼおよびラット小腸ア
セトン粉末酵素による分解物の糖組成を以下の表７、表
８に示す。
【００８３】
【表６】
【００８４】
【表７】
【００８５】
【表８】
【００８６】表６の結果から明らかなように、糖質標
品、ＰＩ及びＰＩＩは、α−アミラーゼによりほとんど
分解されないものの、糖質標品、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、お
よびＰＶはα−アミラーゼにより低分子のオリゴ糖、Ｐ
Ｉ、ＰＩＩ、マルトトリオース、マルトース及びグルコ
ースにまで分解されることが判明した。
【００８７】また、表７、表８の結果から明らかなよう
に、糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、ＰＶ
いずれもα−グルコシダーゼ及びラット小腸アセトン粉
末酵素により、実験６のグルコアミラーゼの場合と同様
に、グルコースとトレハロースにまで分解されることが
判明した。
【００８８】また、同様にα−グルコシダーゼ及びラッ
ト小腸アセトン粉末酵素によって分解されたそれぞれの
反応物に、更に、１単位のブタ腎臓由来トレハラーゼ
（シグマ社販売）を加え、ｐＨ５．７、３７℃で１８時
間作用させ、高速液体クロマトグラフィー法で糖組成を
分析したところ、糖質標品、ＰＩ、ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、
ＰＩＶ、ＰＶいずれの場合も、α−グルコシダーゼ及び
ラット小腸アセトン粉末酵素により生成したトレハロー
スはトレハラーゼによりグルコースにまで分解すること
が判明した。
【００８９】上述のように、 （１） 非還元性糖質生成酵素は、グルコース重合度３
以上から選ばれる１種または２種以上の還元性澱粉部分
分解物から、そのグルコース重合度を変化することな
く、トレハロース構造を有する非還元性糖質を生成して
いる。 （２） 非還元性糖質ＰＶは、α−アミラーゼにより、
主に非還元性糖質ＰＩＩとマルトトリオースを生じ、非
還元性糖質ＰＩＩは、グルコアミラーゼにより、トレハ
ロース１分子とグルコース２分子を生じている。 これらの結果から、本発明の非還元性糖質生成酵素は、
還元性澱粉部分分解物の還元性末端を非還元性のトレハ
ロース構造に分子内変換する全く新しい作用機作の酵素
であると判断される。
【００９０】
【実験８ 急性毒性】７週齢のｄｄ系マウスを使用し
て、実験４において調製した非還元性糖質標品、ＰＩ、
ＰＩＩ、ＰＩＩＩ、ＰＩＶ、またはＰＶを経口投与して
急性毒性試験を行った。その結果、これら非還元性糖質
はいずれも低毒性の物質で、投与可能な最大投与量にお
いても死亡例は認められなかった。従って、正確な値と
はいえないが、それらのＬＤ50値は、いずれも５０ｇ／
ｋｇ以上であった。
【００９１】
【実験９ アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６か
らの非還元性糖質生成酵素の生産】リゾビウム・スピー
シーズ Ｍ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）に代え
て、アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４３１６）を用いた以外は、実験１と同様に
ファーメンターで約７２時間培養した。培養液の非還元
性糖質生成酵素の酵素活性は、約１．２単位／ｍｌであ
った。実験１と同様にして菌体懸濁液と培養液上清の酵
素活性を測定したところ、それぞれ約０．５単位／ｍｌ
および約０．７単位／ｍｌであった。
【００９２】
【実験１０ 酵素の精製】実験９の方法で得られた培養
液約１８ｌを用いて、実験２と同様に精製した。精製の
各工程結果は表９にまとめた。
【００９３】
【表９】
【００９４】表９の工程で、ゲル濾過溶出液として得ら
れた精製酵素標品を、実験２の場合と同様に電気泳動法
で純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であること
が示され、得られた酵素標品は電気泳動的に単一な純度
の高い標品であった。
【００９５】
【実験１１ 酵素の性質】実験１０で得られた精製酵素
標品を、実験３の場合と同様に、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法で分子量を測定したところ、約７
６，０００乃至８６，０００ダルトンであった。また、
本精製酵素標品の等電点を実験３の場合と同様に等電点
電気泳動法で求めたところ、ｐＩ約３．６乃至４．６で
あった。また、本酵素活性に対する温度の影響、ｐＨの
影響、および本酵素の温度安定性、ｐＨ安定性につい
て、実験３の場合と同様にして求めた。結果は、温度の
影響を図５に、ｐＨの影響を図６に、温度安定性を図７
に、ｐＨ安定性を図８に示した。
【００９６】図から明らかなように酵素の至適温度は４
０℃付近、至適ｐＨは約６．５乃至７．０である。温度
安定性は４０℃付近までであり、ｐＨ安定性は約６．０
乃至９．５である。
【００９７】
【実験１２ 非還元性糖質の調製】実験１０で得られた
精製酵素標品を用いて、実験４および実験６の方法に従
って、非還元性糖質の調製とその構造確認の実験を行っ
たところ、リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の
非還元性糖質生成酵素の場合と同様に、グルコース重合
度３以上から選ばれる１種または２種以上の還元性澱粉
部分分解物から末端にトレハロース構造を有するグルコ
ース重合度３以上から選ばれる１種または２種以上の非
還元性糖質を生成することが判明した。
【００９８】
【実験１３ 公知微生物からの非還元性糖質生成酵素の
生産とその性質】公知微生物のうち、本発明の非還元性
糖質生成酵素産生能の確認された表１０に示す特定の微
生物を、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ＡＴＣＣ１
９４２０の場合に３７℃で培養した以外は、実験１の場
合と同様にファーメンターで２７℃で７２時間培養し
た。それぞれの培養液約１８ｌを用いて、実験２の場合
と同様に、培養液を破砕装置にかけ、その上清を硫安塩
析、透析し、更にイオン交換カラムにかけ、部分精製酵
素標品を得、その性質を調べた。結果を表１０にまとめ
た。
【００９９】
【表１０】
【０１００】また、これら公知菌由来の部分精製酵素を
用いて、実験１２の方法に従って、非還元性糖質の調製
とその構造確認を行ったところ、いずれの酵素もリゾビ
ウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非還元性糖質生成
酵素の場合と同様に、グルコース重合度３以上から選ば
れる１種または２種以上の還元性澱粉部分分解物から末
端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上
から選ばれる１種または２種以上の非還元性糖質を生成
することが判明した。
【０１０１】
【実験１４ 非還元性糖質生成酵素の部分アミノ酸配
列】 （１）Ｎ末端アミノ酸配列 実験２の方法で得られたリゾビウム・スピーシーズ Ｍ
−１１由来の精製酵素標品および実験１０の方法で得ら
れたアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来の精
製酵素標品の一部をそれぞれ蒸留水に対して透析した
後、蛋白量として約８０マイクログラムをＮ末端アミノ
酸配列分析用の試料とした。Ｎ末端アミノ酸配列は、プ
ロテインシーケンサー モデル４７３Ａ（アプライドバ
イオシステムズ社製造、米国）を用い、Ｎ末端から１０
残基まで分析した。それぞれ得られたＮ末端配列を表１
１に示す。
【０１０２】
【表１１】
【０１０３】表１１から明らかなように、Ｎ末端アミノ
酸配列は、その末端アミノ酸がリゾビウム・スピーシー
ズ Ｍ−１１由来酵素の場合バリンまたはメチオニン
で、アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６の場合の
メチオニンと異なっているものの、分析したアミノ酸配
列１０残基中の８残基までが一致している。その中でも
第２番目のＬ−アルギニン残基から第４番目のＬ−プロ
リン残基まで３残基のアミノ酸配列、および第６番目の
Ｌ−セリン残基から第１０番目のＬ−ロイシン残基まで
５残基のアミノ酸配列は両酵素間で完全に一致してい
る。すなわち、Ｎ末端アミノ酸配列は、Ｘ1−アルギニ
ン−トレオニン−プロリン−Ｘ2−セリン−トレオニン
−チロシン−アルギニン−ロイシン−（但し、Ｘ1はバ
リンまたはメチオニンを意味し、Ｘ2はアラニンまたは
バリンを意味する。）の共通配列を有していることが判
明した。
【０１０４】（２）内部部分アミノ酸配列 実験２の方法で得られたリゾビウム・スピーシーズ Ｍ
−１１由来の精製酵素標品または実験１０の方法で得ら
れたアルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来の精
製酵素標品の一部をそれぞれ１０ｍＭトリス・塩酸緩衝
液（ｐＨ９．０）に対して、透析した後、同緩衝液で約
１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。これら試料
液（１ｍｌ）それぞれに１０μｇのリジルエンドペプチ
ターゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２
時間反応させることによりペプチド化した。生成したペ
プチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行った。リゾビ
ウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来酵素の場合、カプセ
ルパックＣ１８カラム（直径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍ
ｍ、株式会社資生堂製造）を用い、流速０．６ｍｌ／
分、室温で、０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸−１６ｖ
／ｖ％アセトニトリル溶液から０．１ｖ／ｖ％トリフル
オロ酢酸−４８ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液の６０分間
のリニア−グラジエントの条件で行った。アルスロバク
ター・スピーシーズ Ｑ３６由来酵素の場合、マイクロ
ボンダパックＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ×長さ１５
０ｍｍ、ウオーターズ社製造、米国）を用い、流速０．
９ｍｌ／分、室温で０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸−
３０ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液から０．１ｖ／ｖ％ト
リフルオロ酢酸−５５ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液の６
０分間のリニア−グラジエントの条件で行った。カラム
から溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測
定することにより検出した。他のペプチドとよく分離し
たそれぞれ３ペプチド［リゾビウム属酵素由来ペプチ
ド、Ｒ３７（保持時間約３７分）、Ｒ４０（保持時間約
４０分）、Ｒ４２（保持時間約４２分）；アルスロバク
ター属酵素由来ペプチド、Ａ１７（保持時間約１７
分）、Ａ２２（保持時間約２２分）、Ａ４０（保持時間
約４０分）］を分取し、それぞれを真空乾燥した後、２
００μｌの０．１ｖ／ｖ％乃至５０ｖ／ｖ％アセトニト
リル溶液に溶解した。それらペプチド試料をプロテイン
シーケンサーに供し、それぞれ１０残基までアミノ酸配
列を分析した。得られた内部部分アミノ酸配列を表１２
に示す。
【０１０５】
【表１２】
【０１０６】表１２から明らかなように、リゾビウム・
スピーシーズ Ｍ−１１酵素のペプチドＲ３７の配列
と、アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６酵素のペ
プチドＡ１７の配列とは完全に一致し、また、ペプチド
Ｒ４０とペプチドＡ２２の配列も完全に一致した。ペプ
チドＲ４２とペプチドＡ４０とでは、分析した１０残基
中の７残基が一致している。すなわち、ペプチドＲ４２
とペプチドＡ４０の部分アミノ酸配列は、グルタミン酸
−グリシン−アルギニン−Ｘ3−セリン−Ｘ4−チロシン
−アラニン−Ｘ5−アラニン−（但し、Ｘ3は、グリシン
またはグルタミンを意味し、Ｘ4はプロリンまたはアル
ギニンを意味し、Ｘ5はバリンまたはグルタミン酸を意
味する。）の共通配列を有している。
【０１０７】以下、本発明の非還元性糖質、それを含む
低還元性糖質およびトレハロースの製造方法を実施例Ａ
で、非還元性糖質、それを含む低還元性糖質および／ま
たはトレハロースを含有せしめた組成物を実施例Ｂで示
す。
【０１０８】
【実施例Ａ−１】リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）を実験１の方法に準じ
て、ファーメンターで約３６時間培養した。培養後、Ｓ
Ｆ膜を用いて除菌濾過し、約１８ｌの培養濾液を回収
し、更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、本発明の非還元性
糖質生成酵素濃縮液約１ｌ（１７．７単位／ｍｌ）を回
収した。
【０１０９】６％馬鈴薯澱粉乳を加熱糊化させた後、ｐ
Ｈ４．５、温度５０℃に調整し、これにイソアミラーゼ
（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉グラム当た
り２５００単位の割合になるように加え、２０時間反応
させた。その反応液をｐＨ６．０に調整し、オートクレ
ーブ（１２０℃）を１０分間行い、次いで４５℃に冷却
し、これにα−アミラーゼ（ノボ社製造、商品名ターマ
ミール６０Ｌ）を澱粉グラム当たり１５０単位の割合に
なるよう加え、２４時間反応させた。
【０１１０】その反応液をオートクレーブ（１２０℃）
を２０分間行った後、４５℃に冷却し、これに上記の方
法で調製した非還元性糖質生成酵素を澱粉グラム当たり
１単位の割合になるよう加え、９６時間反応させた。そ
の反応液を９５℃に加熱し１０分間保った後、冷却し、
濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色
し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製
し、更に濃縮して濃度７０％のシラップを固形物当り約
９１％で得た。
【０１１１】本品は、ＤＥ１８．８であって、非還元性
糖質を固形物当り、ＰＩ ８．３％、ＰＩＩ ５．５
％、ＰＩＩＩ ３７．７％、ＰＩＶ １．４％、および
ＰＶ１．３％を含有しており、温和で上品な甘味、適度
の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良
剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、
医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１１２】
【実施例Ａ−２】実施例Ａ−１の方法で得られた糖液を
原糖液とし、非還元性糖質の含量を高めるため、アルカ
リ金属型強酸性カチオン交換樹脂（ＸＴ−１０１６、Ｎ
ａ+型、架橋度４％、東京有機化学工業株式会社製造）
を用いたカラム分画を行った。樹脂を内径５．４ｃｍの
ジャケット付ステンレス製カラム４本に充填し、直列に
つなぎ樹脂層全長２０ｍとした。カラム内温度を５５℃
に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、こ
れに５５℃の温水をＳＶ０．１３で流して分画し、グル
コース及びマルトース高含有画分を除去し、非還元性糖
質高含有物を採取した。更に、精製、濃縮し、真空乾燥
し、粉砕して、非還元性糖質高含有粉末を固形物当り収
率約６１％で得た。
【０１１３】本品は、ＤＥ５．７であって、非還元性糖
質を、固形物当たり、ＰＩ ９．３％、ＰＩＩ ７．４
％、ＰＩＩＩ ５５．５％、ＰＩＶ ２．１％、ＰＶ
１．９％を含有しており、実施例Ａ−１と同様に、温和
で上品な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈
味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各
種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用
できる。
【０１１４】
【実施例Ａ−３】３３％とうもろこし澱粉乳に最終濃度
０．１重量％となるように炭酸カルシウムを加えた後、
ｐＨ６．５に調整し、これにα−アミラーゼ（ノボ社製
造、商品名ターマミール６０Ｌ）を澱粉グラム当たり
０．２重量％になるよう加え、９５℃で１５分間反応さ
せた。その反応液をオートクレーブ（１２０℃）を１０
分間行った後、５５℃に冷却し、これに特開昭６３−２
４０７８４号公報で開示されているマルトテトラオース
生成アミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を
澱粉グラム当たり５単位の割合になるように加え、６時
間反応させ、これにα−アミラーゼ（上田化学株式会社
製造、商品名α−アミラーゼ２Ａ）を澱粉グラム当たり
３０単位加え、更に、６５℃で４時間反応させた。その
反応液を、オートクレーブ（１２０℃）を１０分間行
い、次いで４５℃に冷却し、実施例Ａ−１の方法で調製
した非還元性糖質生成酵素を澱粉グラム当たり２単位の
割合になるよう加え、６４時間反応させた。その反応液
を９５℃で１０分間保った後、冷却し、濾過して得られ
る濾液を、常法に従って活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ
型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して
濃度７０％のシラップを固形物当り収率約９０％で得
た。
【０１１５】本品は、ＤＥ１０．５であって、非還元性
糖質を、固形物当たり、ＰＩ ３．７％、ＰＩＩ ４
３．７％、ＰＩＩＩ １．２％、ＰＩＶ １．１％、お
よびＰＶ ０．６％を含有しており、温和で上品な甘
味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、
品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、
化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１１６】
【実施例Ａ−４】実施例Ａ−３の方法で得られた糖液を
原糖液とし、本液の非還元性糖質ＰＩＩ（グルコース重
合度４）の含量を高めるため、分画用樹脂として、塩型
強酸性カチオン交換樹脂（ダウケミカル社販売、商品名
ダウエックス５０Ｗ−Ｘ４、Ｍｇ++型）を用いた以外
は、実施例Ａ−２の方法に従ってカラムクロマトグラフ
ィーを行い、非還元性糖質ＰＩＩ高含量画分を採取し
た。更に、精製、濃縮し、噴霧乾燥して、非還元性糖質
高含有粉末を固形物当り収率約４０％で得た。
【０１１７】本品は、非還元性糖質を固形物当り、ＰＩ
８．５％、ＰＩＩ ６８．０％、ＰＩＩＩ １．４％
含有しており、そのＤＥは、３．５を示し、極めて還元
性が少なく、実施例Ａ−３と同様に、温和で上品な甘味
を有しており、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定
剤、賦形剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など
各種組成物に有利に利用できる。
【０１１８】
【実施例Ａ−５】マルトペンタオース（株式会社林原生
物化学研究所製造）の２０％水溶液に実施例Ａ−１の方
法で調製した非還元性糖質生成酵素をマルトペンタオー
スグラム当たり１．０単位の割合になるよう加え、４５
℃で４８時間反応させた。反応によりマルトペンタオー
スの約９３％が非還元性糖質ＰＩＩＩに変換した。その
反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、濾過して
得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型
及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩し、濃縮した。更
に、非還元性糖質ＰＩＩＩ（グルコース重合度５）の含
量を高めるため実施例Ａ−２と同様に、アルカリ金属型
強酸性カチオン交換樹脂を用いたカラム分画を行い、Ｐ
ＩＩＩ高含有画分を採取した。本画分溶液を精製、濃縮
し、噴霧乾燥して、高純度非還元性糖質粉末を固形物当
り収率約５５％で得た。
【０１１９】本品は、非還元性糖質を、固形物当たり
ＰＩＩＩ、９９．０％を含有しており、そのＤＥは、約
０．２％未満しか示さず、極めて還元性が低い。本品
は、かすかな甘味を有しており、甘味料、呈味改良剤、
品質改良剤、安定剤などとして各種飲食物、化粧品、医
薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１２０】
【実施例Ａ−６】澱粉部分分解物（松谷化学工業株式会
社製造、商品名パインデックス＃４）４０重量部を水６
０重量部に加熱溶解し、この溶液を４５℃、ｐＨ６．５
に調整した後、実施例Ａ−１の方法で調製した非還元性
糖質生成酵素を澱粉部分分解物グラム当たり１単位の割
合になるように加えて９６時間反応させ、次いで１００
℃に１０分間加熱して、酵素を失活させた。本反応液を
濃度約２０％まで希釈し、グルコアミラーゼ（ナガセ生
化学工業株式会社製造、商品名グルコチーム）を澱粉部
分分解物グラム当たり１０単位加えて４０時間反応さ
せ、次いで加熱して酵素を失活させた。本溶液を、常法
に従って、活性炭にて脱色し、イオン交換樹脂にて脱塩
し、濃度約６０％に濃縮した。本糖液中には固形物当た
り２９．５％のトレハロースを含有していた。分画用樹
脂として、塩型強酸性カチオン交換樹脂（オルガノ株式
会社販売、商品名ＣＧ６０００、Ｎａ型）を用いた以外
は、実施例Ａ−２の方法に従ってカラムクロマトグラフ
ィーを行い、トレハロース高含有画分を採取した。本高
含有液は、固形物当たり約９０％のトレハロースを含有
していた。本溶液を濃度約７５％に濃縮した後、助晶缶
にとり、種晶としてトレハロース含水結晶約２％を加え
て徐冷し、晶出率約４５％のマスキットを得た。本マス
キットを乾燥塔上のノズルより１５０ｋｇ／ｃｍ2の高
圧にて噴霧した。これと同時に８５℃の熱風を乾燥塔の
上部より送風し、底部に設けた移送金網コンベア上に結
晶粉末を捕集し、コンベアの下より４５℃の温風を送り
つつ、該粉末を乾燥塔外に徐々に移動させて、取り出し
た。この結晶粉末を熟成塔に充填して温風を送りつつ、
１０時間熟成させ、結晶化と乾燥を完了し、トレハロー
ス含水結晶粉末を得た。
【０１２１】本品は、実質的に吸湿性を示さず、取扱い
が容易であり、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定
化剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品などの
各種組成物に有利に利用できる。
【０１２２】
【実施例Ａ−７】馬鈴薯澱粉１重量部を澱粉当たり０．
０１ｗ／ｗ％の割合にα−アミラーゼ（ナガセ生化学工
業株式会社製造、商品名ネオスピターゼ）を含む水６重
量部に撹拌混合し、ｐＨ６．０に調整後、この懸濁液を
８５乃至９０℃に保ち、糊化と液化を同時に起こさせ、
直ちに１２０℃に５分間加熱して、ＤＥ１．０未満にと
どめ、これを５５℃に急冷し、ｐＨ７．０に調整し、こ
れに株式会社林原生物化学研究所製造、商品名プルラナ
ーゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）および実施例Ａ−３で
述べたマルトテトラオース生成アミラーゼをそれぞれ澱
粉グラム当たり１５０単位および８単位の割合で加え、
ｐＨ７．０、５０℃で３６時間反応させた。
【０１２３】この反応液を、オートクレーブ（１２０
℃）を１０分間行い、次いで、４５℃に冷却し、これに
実験１３の方法で調製したブレビバクテリウム・ヘロボ
ルムＡＴＣＣ１１８２２由来の非還元性糖質生成酵素を
澱粉グラム当たり２単位の割合になるよう加え、６４時
間反応させた。この反応液を９５℃で１０分間保った
後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、
活性炭で脱色し、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂により脱
塩して精製し、更に濃縮して、噴霧乾燥して非還元性糖
質含有粉末を固形物当たり収率約９０％で得た。
【０１２４】本品は、ＤＥ １１．２であって、非還元
性糖質を、固形物当たり、ＰＩ ２．９％、ＰＩＩ ６
１．５％およびＰＩＩＩ ０．８％を含有しており、温
和で上品な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、
呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、
各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利
用できる。
【０１２５】
【実施例Ａ−８】アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ
３６（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１６）を実験９の方法に準
じて、ファーメンターで約７２時間培養した。培養液を
遠心分離して除菌し、上清をＵＦ膜で約１０倍に濃縮
し、本発明の非還元性糖質生成酵素濃縮液（約１５．２
単位／ｍｌ）を回収した。
【０１２６】３０％とうもろこし澱粉乳を用いて、実施
例Ａ−３の方法に準じて、α−アミラーゼ（ノボ社製
造）、マルトテトラオース生成アミラーゼ（株式会社林
原生物化学研究所製造）およびα−アミラーゼ（上田化
学株式会社製造）を作用させ、オートクレーブ（１２０
℃）処理し、次いで、４５℃に冷却し、これに上記の方
法で調製した非還元性糖質生成酵素を澱粉グラム当たり
２単位になるよう加え、６４時間反応させた。次いで１
００℃に１０分間加熱して酵素を失活させた。本反応液
を、実施例Ａ−６の方法に準じて、グルコアミラーゼ
（ナガセ生化学工業株式会社製造）を作用させ、脱色、
脱塩して濃度約６０％に濃縮した。本糖液中には、固形
物当たり約２５％のトレハロースを含有していた。本糖
液を実施例Ａ−６の方法に準じて塩型強酸性カチオン交
換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行い、トレ
ハロース高含有画分を採取した。本高含有液は、固形物
当たり約９５％のトレハロースを含有していた。本溶液
を蒸発釜にとり、減圧下で煮詰め、水分約４．０％のシ
ラップとし、助晶機に移し、これに種晶として無水結晶
トレハロースをシラップ固形物当たり１％加え、９５℃
で５分間撹拌助晶し、次いで、アルミ製バットに取り出
し、１００℃で６時間晶出熟成させてブロックを調製し
た。次いで、本ブロックを切削機にて粉砕し、流動乾燥
して、水分約０．３％の無水結晶トレハロース粉末を得
た。
【０１２７】本品は、食品、医薬品、化粧品、その原材
料、または加工中間物などの含水物の脱水剤としてのみ
ならず、上品な甘味を有する白色粉末甘味料としても有
利に利用できる。
【０１２８】
【実施例Ｂ−１ 甘味料】実施例Ａ−４の方法で得た非
還元性糖質高含有粉末１重量部に、α−グリコシルステ
ビオシド（東洋精糖株式会社販売、商品名αＧスイー
ト）０．０１重量部およびＬ−アスパルチル−Ｌ−フェ
ニルアラニンメチルエステル（味の素株式会社販売、商
品名アスパルテーム）０．０１重量部を均一に混合し、
顆粒成型機にかけて、顆粒状甘味料を得た。本品は、甘
味の質が優れ、蔗糖の約２倍の甘味度を有し、甘味度当
たりカロリーは、蔗糖の約１／２に低下している。
【０１２９】本甘味料は、それに配合した高甘味度甘味
物の分解もなく、安定性に優れており、低カロリー甘味
料として、カロリー摂取を制限している肥満者、糖尿病
者などのための低カロリー飲食物などに対する甘味付に
好適である。
【０１３０】また、本甘味料は、虫歯誘発菌による酸の
生成が少なく、不溶性グルカンの生成も少ないことよ
り、虫歯を抑制する飲食物などに対する甘味付にも好適
である。
【０１３１】
【実施例Ｂ−２ ハードキャンディー】濃度５５％蔗糖
溶液１００重量部に実施例Ａ−３の方法で得た非還元性
糖質含有シラップ３０重量部を加熱混合し、次いで減圧
下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン
酸１重量部および適量のレモン香料と着色料とを混和
し、常法に従って成型し、製品を得た。
【０１３２】本品は、歯切れ、呈味良好で、蔗糖の晶
出、変形も起こらない高品質のハードキャンディーであ
る。
【０１３３】
【実施例Ｂ−３ チューインガム】ガムベース３重量部
を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに蔗糖４重量部
および実施例Ａ−６の方法で得たトレハロース含水結晶
粉末３重量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混
合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成形、
包装して製品を得た。
【０１３４】本品は、テクスチャー、風味とも良好なチ
ューインガムである。
【０１３５】
【実施例Ｂ−４ 加糖練乳】原乳１００重量部に実施例
Ａ−１の方法で得た非還元性糖質含有シラップ３重量部
および蔗糖１重量部を溶解し、プレートヒーターで加熱
殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰し
て製品を得た。
【０１３６】本品は、温和な甘味で、風味もよく、乳幼
児食品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味
用に有利に利用できる。
【０１３７】
【実施例Ｂ−５ 乳酸菌飲料】脱脂粉乳１７５重量部、
実施例Ａ−２の方法で得た非還元性糖質高含有粉末８０
重量部および特開平４−２８１７９５号公報で開示され
ているラクトスクロース高含有粉末５０重量部を水１，
２００重量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０
℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスタータ
ーを３０重量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌
飲料を得た。
【０１３８】本品は、風味良好な乳酸菌飲料である。ま
た、本品は、オリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定に保持す
るだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用をも有する。
【０１３９】
【実施例Ｂ−６ 粉末ジュース】噴霧乾燥により製造し
たオレンジ果汁粉末３３重量部に対して、実施例Ａ−２
の方法で得た非還元性糖質高含有粉末５０重量部、蔗糖
１０重量部、無水クエン酸０．６５重量部、リンゴ酸
０．１重量部、Ｌ−アスコルビン酸０．１重量部、クエ
ン酸ソーダ０．１重量部、プルラン０．５重量部、粉末
香料適量をよく混合撹拌し、粉砕し微粉末にしてこれを
流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これに、
実施例Ａ−１の方法で得た非還元性糖質含有シラップを
バインダーとしてスプレーし、３０分間造粒し、計量、
包装して製品を得た。
【０１４０】本品は、果汁含有率約３０％の粉末ジュー
スである。また、本品は異味、異臭がなく、長期に安定
であった。
【０１４１】
【実施例Ｂ−７ カスタードクリーム】コーンスターチ
１００重量部、実施例Ａ−３の方法で得た非還元性糖質
含有シラップ１００重量部、マルトース８０重量部、蔗
糖２０重量部および食塩１重量部を充分に混合し、鶏卵
２８０重量部を加えて撹拌し、これに沸騰した牛乳１，
０００重量部を徐々に加え、更に、これを火にかけて撹
拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透
明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ
香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。
【０１４２】本品は、なめらかな光沢を有し、温和な甘
味で美味である。
【０１４３】
【実施例Ｂ−８ あん】原料あずき１０重量部に、常法
に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きして、
水溶性夾雑物を除去して、あずきつぶあん約２１重量部
を得た。この生あんに、蔗糖１４重量部、実施例Ａ−３
の方法で得た非還元性糖質含有シラップ５重量部および
水４重量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダオイル
を加えてつぶあんをこわさないように練り上げ、製品の
あんを約３５重量部得た。
【０１４４】本品は、色焼けもなく、舌ざわりもよく、
風味良好で、あんパン、まんじゅう、だんご、もなか、
氷菓などのあん材料として好適である。
【０１４５】
【実施例Ｂ−９ パン】小麦粉１００重量部、イースト
２重量部、砂糖５重量部、実施例Ａ−７の方法で得た非
還元性糖質含有粉末１重量部および無機フード０．１重
量部を、常法に従って、水でこね、中種を２６℃で２時
間発酵させ、その後３０分間熟成し、焼き上げた。
【０１４６】本品は、色相、すだちともに良好で適度な
弾力、温和な甘味を有する高品質のパンである。
【０１４７】
【実施例Ｂ−１０ ハム】豚もも肉１，０００重量部に
食塩１５重量部および硝酸カリウム３重量部を均一にす
り込んで、冷室に１昼夜堆積する。これを水５００重量
部、食塩１００重量部、硝酸カリウム３重量部、実施例
Ａ−７の方法で得た非還元性糖質含有粉末４０重量部お
よび香辛料からなる塩漬液に冷室で７日間漬け込み、次
いで、常法に従い、冷水で洗浄し、ひもで巻き締め、燻
煙し、クッキングし、冷却包装して製品を得た。
【０１４８】本品は、色合いもよく、風味良好な高品質
のハムである。
【０１４９】
【実施例Ｂ−１１ 粉末ペプチド】４０％食品用大豆ペ
プチド溶液（不二製油株式会社製造、商品名ハイニュー
トＳ）１重量部に、実施例Ａ−６の方法で得たトレハロ
ース含水結晶粉末２重量部を混合し、プラスチック製バ
ットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチ
ドを得た。
【０１５０】本品は、風味良好で、プレミックス、冷菓
などの製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管
流動食などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に
利用できる。
【０１５１】
【実施例Ｂ−１２ 粉末卵黄】生卵から調製した卵黄を
プレート式加熱殺菌機で６０乃至６４℃で殺菌し、得ら
れる液状卵黄１重量部に対して、実施例Ａ−８の方法で
得た無水結晶トレハロース粉末４重量部の割合で混合し
た後バットに移し、一夜放置して、トレハロース含水結
晶に変換させてブロックを調製した。本ブロックを切削
機にかけて粉末化し、粉末卵黄を得た。
【０１５２】本品は、プレミックス、冷菓、乳化剤など
の製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管流動
食などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に利用
できる。また、美肌剤、育毛剤などとしても有利に利用
できる。
【０１５３】
【実施例Ｂ−１３ 化粧用クリーム】モノステアリン酸
ポリオキシエチレングリコール２重量部、自己乳化型モ
ノステアリン酸グリセリン５重量部、実施例Ａ−２の方
法で得た非還元性糖質高含有粉末２重量部、α−グリコ
シル ルチン１重量部、流動パラフィン１重量部、トリ
オクタン酸グリセリル１０重量部および防腐剤の適量
を、常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２重量
部、１，３−ブチレングリコール５重量部および精製水
６６重量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に
香料の適量を加えて撹拌混合しクリームを製造した。
【０１５４】本品は、抗酸化性を有し、安定性が高く、
高品質の日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に
利用できる。
【０１５５】
【実施例Ｂ−１４ 固体製剤】ヒト天然型インターフェ
ロン−α標品（株式会社林原生物化学研究所製造、コス
モ・バイオ株式会社販売）を、常法に従って、固定化抗
ヒトインターフェロン−α抗体カラムにかけ、該標品に
含まれるヒト天然型インターフェロン−αを吸着させ、
安定剤であるウシ血清アルブミンを素通りさせて除去
し、次いで、ｐＨを変化させて、ヒト天然型インターフ
ェロン−αを実施例Ａ−５の方法で得た高純度非還元性
糖質粉末を５％含有する生理食塩水を用いて溶出した。
【０１５６】本液を精密濾過し、約２０倍量の無水結晶
マルトース粉末（株式会社林原商事販売、商品名ファイ
ントース）に加えて脱水、粉末化し、これを打錠機にて
打錠し、１錠（約２００ｍｇ）当たりヒト天然型インタ
ーフェロン−αを約１５０単位含有する錠剤を得た。
【０１５７】本品は、舌下錠などとして、一日当たり、
大人１乃至１０錠程度が経口的に投与され、ウイルス性
疾患、アレルギー性疾患、リューマチ、糖尿病、悪性腫
瘍などの治療に有利に利用できる。とりわけ、近年、患
者数の急増しているエイズ、肝炎などの治療剤として有
利に利用できる。本品は、本発明の非還元性糖質と無水
結晶マルトースが共に安定剤として作用し、室温で放置
してもその活性を長期間よく維持する。
【０１５８】
【実施例Ｂ−１５ 糖衣錠】重量１５０ｍｇの素錠を芯
剤とし、これに実施例Ａ−６の方法で得たトレハロース
含水結晶粉末４０重量部、プルラン（平均分子量２０
万）２重量部、水３０重量部、タルク２５重量部および
酸化チタン３重量部からなる下掛け液を用いて錠剤重量
が約２３０ｍｇになるまで糖衣し、次いで、同じトレハ
ロース含水結晶粉末６５重量部、プルラン１重量部およ
び水３４重量部からなる上掛け液を用いて、糖衣し、更
に、ロウ液で艶出しして光沢の在る外観の優れた糖衣錠
を得た。
【０１５９】本品は、耐衝撃性にも優れており、高品質
を長期間維持する。
【０１６０】
【発明の効果】上記から明らかなように、本発明の新規
非還元性糖質生成酵素は、温和な酵素反応条件下で還元
性の澱粉部分分解物をそのグルコース重合度を変えるこ
となく非還元性糖質に高収率で変換する。その非還元性
糖質の分離、精製も容易であり、このようにして得られ
る非還元性糖質、これを含む低還元性糖質およびこれら
から製造されるトレハロースは安定性に優れ、良質で上
品な甘味を有している。また、経口摂取により消化吸収
され、カロリー源となる。非還元性糖質、これを含む低
還元性糖質およびトレハロースは、甘味料、呈味改良
剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食
物、化粧品、医薬品など各種組成物の製造に有利に利用
できる。
【０１６１】従って、本発明の確立は、安価で無限の資
源である澱粉に由来する澱粉部分分解物から、従来、望
むべくして容易に得られなかったトレハロース構造を有
する非還元性糖質、これを含む低還元性糖質、およびこ
れから容易に製造されるトレハロースを、工業的に大量
かつ安価に供給できる全く新しい道を拓くこととなり、
それが与える影響の大きさは、澱粉科学、酵素科学、生
化学などの学問分野は言うに及ばず、産業界、とりわけ
食品、化粧品、医薬品分野は勿論のこと、農水畜産業、
化学工業にも及び、これら産業界に与える工業的意義は
計り知れないものがある。
【図面の簡単な説明】
【図１】リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非
還元性糖質生成酵素の活性に及ぼす温度の影響を示す図
である。
【図２】リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非
還元性糖質生成酵素の活性に及ぼすｐＨの影響を示す図
である。
【図３】リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非
還元性糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図４】リゾビウム・スピーシーズ Ｍ−１１由来の非
還元性糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図５】アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来
の非還元性糖質生成酵素の活性に及ぼす温度の影響を示
す図である。
【図６】アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来
の非還元性糖質生成酵素の活性に及ぼすｐＨの影響を示
す図である。
【図７】アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来
の非還元性糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。
【図８】アルスロバクター・スピーシーズ Ｑ３６由来
の非還元性糖質生成酵素のｐＨ安定性を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 19/14 Ｚ 7432−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:41）

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 還元性澱粉部分分解物からトレハロース
    構造を有する非還元性糖質を生成する非還元性糖質生成
    酵素。
  2. 【請求項２】 還元性澱粉部分分解物が、グルコース重
    合度３以上から選ばれる１種または２種以上の還元性澱
    粉部分分解物であり、非還元性糖質が、末端にトレハロ
    ース構造を有する非還元性糖質であることを特徴とする
    請求項１記載の非還元性糖質生成酵素。
  3. 【請求項３】 非還元性糖質生成酵素が、微生物由来の
    酵素であることを特徴とする請求項１または請求項２記
    載の非還元性糖質生成酵素。
  4. 【請求項４】 微生物が、リゾビウム属、アルスロバク
    ター属、ブレビバクテリウム属、フラボバクテリウム
    属、ミクロコッカス属、クルトバクテリウム属、マイコ
    バクテリウム属およびテラバクター属から選ばれる微生
    物である請求項３記載の非還元性糖質生成酵素。
  5. 【請求項５】 下記の理化学的性質を有する非還元性糖
    質生成酵素。 （１） 作用 グルコース重合度３以上から選ばれる１種または２種以
    上の還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造
    を有する非還元性糖質を生成する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約７６，０００乃至８
    ７，０００ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．６乃
    至４．６。 （４） 至適温度 ｐＨ７．０、６０分間反応で、３５乃至４０℃付近。 （５） 至適ｐＨ ４０℃、６０分間反応で、ｐＨ約６．４乃至７．２。 （６） 温度安定性 ｐＨ７．０、６０分間保持で、３５乃至４０℃付近まで
    安定。 （７） ｐＨ安定性 ２５℃、１６時間保持で、ｐＨ約５．５乃至１１．０。
  6. 【請求項６】 グルコース重合度３以上から選ばれる１
    種または２種以上の還元性澱粉部分分解物から末端にト
    レハロース構造を有する非還元性糖質を生成する作用を
    有し、部分アミノ酸配列として、 （１） Ｘ1−アルギニン−トレオニン−プロリン−Ｘ2
    −セリン−トレオニン−チロシン−アルギニン−ロイシ
    ン−（但し、Ｘ1はバリンまたはメチオニンを意味し、
    Ｘ2はアラニンまたはバリンを意味する。） （２） グリシン−バリン−グルタミン酸−アスパラギ
    ン酸−トレオニン−アラニン−フェニルアラニン−フェ
    ニルアラニン−アルギニン−チロシン− （３） ロイシン−バリン−グルタミン−ロイシン−ト
    レオニン−メチオニン−プロリン−グリシン−バリン−
    プロリン− （４） グルタミン酸−グリシン−アルギニン−Ｘ3−
    セリン−Ｘ4−チロシン−アラニン−Ｘ5−アラニン−
    （但し、Ｘ3はグリシンまたはグルタミンを意味し、Ｘ4
    はプロリンまたはアルギニンを意味し、Ｘ5はバリンま
    たはグルタミン酸を意味する。） から選ばれる１種または２種以上の部分アミノ酸配列を
    有する非還元性糖質生成酵素。
  7. 【請求項７】 還元性澱粉部分分解物からトレハロース
    構造を有する非還元性糖質を生成する非還元性糖質生成
    酵素産生能を有する微生物を栄養培地に培養して、得ら
    れる培養物から該非還元性糖質生成酵素を採取すること
    を特徴とする還元性澱粉部分分解物からトレハロース構
    造を有する非還元性糖質を生成する非還元性糖質生成酵
    素の製造方法。
  8. 【請求項８】 微生物が、リゾビウム属、アルスロバク
    ター属、ブレビバクテリウム属、フラボバクテリウム
    属、ミクロコッカス属、クルトバクテリウム属、マイコ
    バクテリウム属およびテラバクター属から選ばれる微生
    物である請求項７記載の非還元性糖質生成酵素の製造方
    法。
  9. 【請求項９】 グルコース重合度３以上から選ばれる１
    種または２種以上の還元性澱粉部分分解物から末端にト
    レハロース構造を有する非還元性糖質を生成する非還元
    性糖質生成酵素産生能を有する微生物を栄養培地に培養
    して、得られる培養物から該非還元性糖質生成酵素を採
    取することを特徴とするグルコース重合度３以上から選
    ばれる１種または２種以上の還元性澱粉部分分解物から
    末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成す
    る非還元性糖質生成酵素の製造方法。
  10. 【請求項１０】 リゾビウム・スピーシーズ（Ｒｈｉｚ
    ｏｂｉｕｍ ｓｐ．）Ｍ−１１（工業技術院微生物工業
    技術研究所、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）、
    または、アルスロバクター・スピーシーズ（Ａｒｔｈｒ
    ｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｑ３６（工業技術院生命工学
    工業技術研究所、受託番号 ＦＥＲＭＢＰ−４３１６）
    からなる非還元性糖質生成酵素産生能を有する微生物。
  11. 【請求項１１】 グルコース重合度３以上から選ばれる
    １種または２種以上の還元性澱粉部分分解物を含有する
    溶液に、グルコース重合度３以上の１種または２種以上
    の還元性澱粉部分分解物からトレハロース構造を有する
    非還元性糖質を生成する非還元性糖質生成酵素を作用さ
    せることを特徴とする還元性澱粉部分分解物の還元力を
    低減させる方法。
  12. 【請求項１２】 グルコース重合度３以上から選ばれる
    １種または２種以上の還元性澱粉部分分解物を含有する
    溶液に、グルコース重合度３以上から選ばれる１種また
    は２種以上の還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロ
    ース構造を有する非還元性糖質を生成する非還元性糖質
    生成酵素を作用させ、得られる末端にトレハロース構造
    を有する非還元性糖質、またはこれを含む低還元性糖
    質。
  13. 【請求項１３】 澱粉を部分的に加水分解して得られる
    グルコース重合度３以上から選ばれる１種または２種以
    上の還元性澱粉部分分解物を含有する溶液に、グルコー
    ス重合度３以上から選ばれる１種または２種以上の還元
    性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造を有する
    非還元性糖質を生成する非還元性糖質生成酵素を作用さ
    せ、得られる末端にトレハロース構造を有する非還元性
    糖質、またはこれを含む低還元性糖質。
  14. 【請求項１４】 グルコース重合度３以上から選ばれる
    １種または２種以上の還元性澱粉部分分解物を含有する
    溶液に、グルコース重合度３以上から選ばれる１種また
    は２種以上の還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロ
    ース構造を有する非還元性糖質生成酵素を生成する非還
    元性糖質生成酵素を作用させ、末端にトレハロース構造
    を有する非還元性糖質および夾雑糖質含有溶液とし、こ
    れを強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグ
    ラフィーにかけ、得られる含量を向上させた末端にトレ
    ハロース構造を有する非還元性糖質。
  15. 【請求項１５】 グルコース重合度３以上から選ばれる
    １種または２種以上の還元性澱粉部分分解物を含有する
    溶液に、グルコース重合度３以上から選ばれる１種また
    は２種以上の還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロ
    ース構造を有する非還元性糖質を生成する非還元性糖質
    生成酵素を作用させ、得られる末端にトレハロース構造
    を有する非還元性糖質またはこれを含む低還元性糖質を
    含有せしめた組成物。
  16. 【請求項１６】 組成物が、飲食物、化粧品または医薬
    品である請求項１５記載の組成物。
  17. 【請求項１７】 グルコース重合度３以上から選ばれる
    １種または２種以上の還元性澱粉部分分解物を含有する
    溶液に、グルコース重合度３以上から選ばれる１種また
    は２種以上の還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロ
    ース構造を有する非還元性糖質を生成する非還元性糖質
    生成酵素を作用させ、次いでグルコアミラーゼ、または
    α−グルコシダーゼを作用させ、得られるトレハロー
    ス。
  18. 【請求項１８】 トレハロースが含水結晶、または無水
    結晶である請求項１７記載のトレハロース。
  19. 【請求項１９】 グルコース重合度３以上から選ばれる
    １種または２種以上の還元性澱粉部分分解物を含有する
    溶液に、グルコース重合度３以上から選ばれる１種また
    は２種以上の還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロ
    ース構造を有する非還元性糖質生成酵素を作用させ、次
    いでグルコアミラーゼ、またはα−グルコシダーゼを作
    用させ、トレハロースおよび夾雑糖類含有溶液とし、こ
    れを強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグ
    ラフィーにかけ、得られる含量を向上させたトレハロー
    ス。
  20. 【請求項２０】 グルコース重合度３以上から選ばれる
    １種または２種以上の還元性澱粉部分分解物を含有する
    溶液に、グルコース重合度３以上から選ばれる１種また
    は２種以上の還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロ
    ース構造を有する非還元性糖質を生成する非還元性糖質
    生成酵素を作用させ、次いでグルコアミラーゼまたはα
    −グルコシダーゼを作用させ、得られるトレハロースを
    含有せしめた組成物。
  21. 【請求項２１】 組成物が、飲食物、化粧品または医薬
    品である請求項２０記載の組成物。
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