NL9500292A - Werkwijze voor omzetting van een zetmeelmateriaal, en daarvoor bruikbaar enzympreparaat. - Google Patents

Description

BESCHRIJVING

Titel: Werkwijze voor ontzetting van een zetmeelmateriaal, en daarvoor bruikbaar enzympreparaat

GEBIED VAN DE UITVINDING

De uitvinding ligt op het gebied van de zetmeeltechnologie en betreft meer in het bijzonder werkwijzen voor het omzetten van zetmeel onder toepassing van enzymen. Dergelijke werkwijzen zijn in het algemeen gericht op de bereiding van derivaten van zetmeel, die een gewijzigde polymerisatiegraad hebben.

De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op een enzymatische werkwijze voor het bereiden van zetmeelderivaten met een ten opzichte van het uitgangszetmeel gewijzigde polymerisatiegraad, waarbij het niet-reducerende karakter van het uitgangszetmeel in hoofdzaak behouden blijft.

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING

Op basis van bestaande kennis in de stand van de techniek is het mogelijk, door zetmeel met behulp van cyclomaltodextrine glucanotransferases (EC 2.4.1.19) om te zetten in cyclomalto-dextrines, produkten te verkrijgen waarin het niet-reducerende karakter van het uitgangsmateriaal behouden is gebleven. De gevormde cyclische produkten hebben echter andere eigenschappen, zoals een verminderde oplosbaarheid en mogelijkheid tot complex-vorming, dan niet-cyclische glucanen.

De vorming van niet—cyclische niet-reducerende glucanen is tot nu toe mogelijk gebleken door bij temperaturen beneden 60 C zetmeel—hydrolysaten met een reducerend karakter om te zetten in preparaten met een niet-reducerend karakter. Voor de vorming van niet-reducerende sacchariden worden thermolabiele enzymen uit mesofiele micro-organismen toegepast, zoals beschreven is in de Europese octrooipublikatie EP 0 606 753 A2. Een van de enzymen is een niet—reducerend saccharide—vormend enzym, dat de vorming van niet-reducerende sacchariden eindigend met een trehalose struktuur katalyseert. Enzymen van dit type zullen hierin als niet-reducerend glucaan (NRG) vormende enzymen worden aangeduid.

In de werkwijze volgens EP 0 606 753 A2 wordt uitgegaan van een zetmeelstroop met een verlaagde polymerisatiegraad, welke is verkregen door hydrolyse van verstijfseld en vervloeid zetmeel bij temperaturen boven 60°C volgens algemeen bekende werkwijzen. Bij deze stroopbereiding neemt het reducerende karakter van het zetmeel toe, evenals de vorming van gekleurde componenten welke een gevolg zijn van Maillardreacties. De ongewenste aanwezigheid van dergelijke reactieproducten, ontstaan door de reactie van aldosen met aminogroepen, betekent dat bij de productie van de stropen bij voorkeur uitgangsmateriaal wordt gebruikt dat vrij is van eiwitten, peptiden en aminozuren, alsmede dat Maillard-produkten en materiaal met nog vrije amino-groepen, aanwezig in de verkregen stropen, volgens algemeen bekende werkwijzen moeten worden verwijderd om verdere Maillardering tijdens drogen tegen te gaan.

Een werkwijze waarbij zetmeel, eventueel direkt in een ééntrapsproces, kan worden omgezet in niet-reducerende produkten met gewijzigde polymerisatiegraad zou daarom een belangrijke verbetering betekenen.

Men zou een dergelijke direkte omzetting van zetmeel in niet-reducerende produkten kunnen proberen te realiseren door de thermolabiele enzymen volgens EP 0 606 753 A2, die slechts werkzaam zijn bij temperaturen lager dan 60°C, te combineren met hydrolytische enzymen welke in staat zijn zetmeel beneden de verstijfselingstemperatuur af te breken. Amylases die hiertoe in staat zijn, worden bijv. beschreven in een artikel van Wijbenga et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 35 (1991) 180-184). Het belangrijkste reactieproduct hierbij is echter glucose, dat niet als uitgangsmateriaal kan dienen voor NRG-vormende enzymen uit octrooischrift EP 0 606 753 A2.

Een andere benadering zou kunnen bestaan uit afbraak met thermostabiele enzymen welke werkzaam zijn boven 60°C, waardoor gewerkt kan worden boven de verstijfselingstemperatuur van zetmeel. Hydrolytische enzymen, zoals α-, β- en gluco-amylases, welke hiertoe in staat zijn, zijn commercieel beschikbaar en vinden in de industrie uitgebreide toepassing.

Voordelen van een dergelijke procesvoering bij hogere temperatuur zijn: verminderde kans op microbiële contaminatie, verhoogde reactie-snelheid en een lagere viscositeit waardoor hoge substraatconcentraties mogelijk zijn. De combinatie van dergelijke thermostabiele hydrolases met een NRG-vormend enzym (NRGVE) heeft aldus duidelijke voordelen. Voor een dergelijke werkwijze is echter een NRGVE met thermostabiele eigenschappen onontbeerlijk. Dergelijke enzymen zijn niet bekend en ook niet gevonden bij de uitgebreide screening van micro-organismen, die beschreven is in EP 0 606 753 A2.

Het bovenstaande betekent, dat het volgens de huidige stand van de techniek niet mogelijk is zetmeel direkt, d.w.z. in een ééntrapsproces, om te zetten in niet—reducerende glucanen.

Thermostabiele enzymen zouden kunnen worden verkregen door modificatie op eiwit— of DNA—niveau van bij lagere temperatuur werkzame enzymen. Als alternatief hiervoor zouden ze geïsoleerd kunnen worden uit de natuur, in het bijzonder uit (niet nood zakelijk thermofiele) organismen, welke kunnen behoren tot de domeinen der Archaea, Bacteria en Eukarya.

Verrassenderwijze is vastgesteld dat uit micro—organismen behorend tot het domein der Archaea inderdaad thermostabiele enzymen geïsoleerd kunnen worden waarmee een dergelijke werkwijze uitgevoerd kan worden. Met name is gevonden dat een thermofiel archaeon dat behoort tot het genus Sulfolobus, in het bijzonder Sulfolobus solfataricus DSM-1617, een enzym produceert dat de benodigde eigenschappen bezit om toegepast te kunnen worden in een werkwijze die boven 60°C kan worden uitgevoerd.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

De uitvinding heeft betrekking op thermostabiele enzym-preparaten, omvattende een NRG-vormende entiteit die katalytisch werkzaam is bij temperaturen hoger dan 60°C, zodat reacties boven de verstijfselingstemperatuur van zetmeel mogelijk zijn.

Voorts heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het omzetten van zetmeel onder toepassing van een combinatie van thermostabiele enzymen waaronder een NRG-vormende entiteit, in produkten met een gewijzigde polymerisatiegraad onder behoud van het niet-reducerende karakter van het zetmeelpreparaat.

Zoals nader zal worden toegelicht, maakt de toepassing van thermostabiele NRG-vormende enzymen, in combinatie met thermo-stabiele zetmeelafbrekende hydrolases, zoals amylases, iso-amylases, (amylo-)pullulanases als ook met transferases, de directe produktie uit zetmeel van niet-cyclische glucanen van verschillende ketenlengte mogelijk, waarbij het niet-reducerende karakter van het uitgangsmateriaal behouden blijft.

Als uitgangsmateriaal in de werkwijze volgens de uitvinding wordt een zetmeelmateriaal toegepast. De term zetmeelmateriaal duidt hier op natief zetmeel en hiervan afgeleide produkten met een verschillende polymerisatiegraad. Het te gebruiken zetmeelmateriaal kan van diverse oorsprong zijn zoals aardappelzetmeel, maïszetmeel, tarwezetmeel, tapiocazetmeel, erwtenzetmeel, waxy-maiszetmeel en andere amylose-vrije of amylose-arme (dus amylopectine-rijke) zetmelen, en hoog-amylose zetmeel. Men kan ook een gemodificeerd zetmeel toepassen dat verkregen is door chemische, enzymatische en/of fysische modificatie van natief zetmeel. De term zetmeelmateriaal als hier gebruikt omvat tevens dergelijke gemodificeerde zetmeelprodukten.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

De uitvinding omvat een werkwijze voor omzetting van een zetmeelmateriaal, gekenmerkt doordat de omzetting plaatsvindt onder toepassing van een thermostabiele niet-reducerend-glucaan-vormende enzymactiviteit (NRGVE). De omzetting vindt volgens de uitvinding bij voorkeur plaats bij 60-120°C, liefst 70-80°C, en bij pH 4-9, liefst pH 5-7.

Met NRG-vormende entiteit of enzymactiviteit wordt in het bijzonder gedoeld op enzymen die de reactie Gn --> Gn_2T kunnen katalyseren, waarin G een glucosyl-residue, T een trehalosyl-eenheid, en n een geheel getal voorstellen.

Het volgens de uitvinding te gebruiken thermostabiele NRVGE is bij voorkeur afkomstig uit micro-organismen, meer in het bijzonder uit Sulfolobus solfataricus DSM 1617 of een daarvan afstammend of afgeleid micro-organisme. Met "afkomstig uit" en "afgeleid van" wordt hierin slechts bedoeld de oorsprong aan te geven, en met name niet bedoeld te beperken tot "geproduceerd door". Aldus omvat de uitvinding de mogelijkheid dat het enzym geproduceerd wordt door een recombinante gastheer, verschillend van het organisme dat het enzym van nature produceert.

Hoewel gemodificeerde en gederivatiseerde zetmeelprodukten als uitgangsmateriaal kunnen fungeren, zoals hierboven reeds is aangegeven, wordt bij voorkeur als uitgangszetmeelmateriaal een natief zetmeel toegepast.

Het zetmeelmateriaal wordt volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding gedepolymeriseerd onder gelijktijdige vorming van niet-reducerende glucanen. De depolymerisatie wordt bij voorkeur uitgevoerd met thermostabiele glucanases, zoals in het bijzonder thermostabiele a-amylases, iso-amylases, pullulanases, amylo-pullulanases of combinaties hiervan. Gelijktijdig met de depolymerisatie worden niet-reducerende glucanen gevormd ten gevolge van de katalytische werking van de NRGVE. Tijdens de procesvoering en tijdens vervolgprocessen wordt de vorming van Maillard-produkten onderdrukt dankzij de permanente afwezigheid van reducerende uiteinden.

Volgens een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt door gebruik van geschikte glucanases, in het bijzonder enzymen zoals amylases, glucosidases, amyloglucosidases of combinaties hiervan, uit de niet-reducerende glucanen trehalose gevormd. Een hiervoor bruikbaar enzym kan bijvoorbeeld worden gevonden in Sulfolobus solfataricus. Bruikbare enzymen voor het vrijmaken van trehalose uit de gevormde NRG worden onder andere beschreven in EP 0 628 630 A2.

Volgens weer een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding worden de niet-reducerende glucanen door toepassing van gluco-syltransferases gemodificeerd. Zo omvat de uitvinding bijv. een werkwijze waarbij door toepassing van een fosforylase in aanwezigheid van een glucosyldonor, zoals glucose—1—fosfaat, de polymerisatiegraad van de niet-reducerende glucanen wordt verhoogd. Bij voorkeur wordt een thermostabiel fosforylase bij 60-120°C toegepast. Het thermostabiele fosforylase is hierbij bij voorkeur verkregen uit micro—organismen, behorend tot de orde der Thermococcales, de orde der Thermoproteales, het genus Bacillus, het genus Thermus of het genus Thermotoga, of een daarvan afstammend of afgeleid micro—organisme, meer in het bijzonder afkomstig uit Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woesei,

Thermoproteus tenax, Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldolyticus, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus species ATCC 27737, Thermotoga maritima, of een daarvan afstammend of afgeleid micro-organisme. Ook hiervoor geldt dat het volgens de uitvinding niet noodzakelijk is, dat een uit een bepaald organisme afkomstig enzym feitelijk uit dit organisme wordt gewonnen; produktie door een recombinante gastheer wordt door de uitvinding uitdrukkelijk omvat.

Volgens de uitvinding worden bij voorkeur niet-reducerende glucanen bereid, die in voeding, cosmetica, farmaceutische of industriële produkten gebruikt kunnen worden. Bijv. worden niet-reducerende glucanen bereid, die als vetvervanger of zoetstof in voeding en voedingsmiddelen, of als stabilisator of als vulstof in voeding, cosmetica of farmaceutische produkten gebruikt kunnen worden.

De verkregen niet-reducerende glucanen kunnen ook (bijv. chemisch, fysisch of enzymatisch) gederivatiseerd worden, bijv. om detergentia te synthetiseren. Bij voorkeur worden daartoe de apolaire molecuulstaarten van het detergens gekoppeld aan (de uiteinden van) de niet-reducerende glucanen.

Gevormde derivaten, zoals detergentia, kunnen weer worden gehydrolyseerd, bijv. middels een biokatalytische methode of door toepassing van fysische/chemische methoden. Indien daarbij de a 1,4-binding tussen de trehalosyl-eenheid en de naastgelegen glucosyl-eenheid wordt gehydrolyseerd (bijv. in een verbinding met formule XGn_2TX, waarin X een substituent voorstelt en G, T en n de eerder vermelde betekenissen hebben), leidt dit tot de vorming van een enkelvoudig gesubstitueerde trehalosyl-eenheid (bijv. een verbinding met de formule TX). Een dergelijke enkelvoudig gesubstitueerde trehaloseverbinding is via conventionele weg moeilijk te synthetiseren omdat trehalose uit twee dezelfde eenheden is opgebouwd. De enkelvoudig gesubstitueerde trehaloseverbinding kan vervolgens verder worden gederivati-seerd, bijv. tot een door verschillende groepen gesubstitueerde trehalose-eenheid met formule YTX, waarin Y en X verschillende substituenten zijn.

Reducerende derivaten, zoals detergentia, kunnen ook worden bereid middels hydrolyse van de 1,1-binding, hetzij middels een biokatalytische methode, hetzij met behulp van fysisch/chemische methoden.

De uitvinding omvat ook een werkwijze waarbij het trehalose (bijv. fysisch, chemisch of katalytisch) verder gederivatiseerd wordt, bijvoorbeeld ter bereiding van detergentia, waarbij van het detergens de apolaire delen aan (de uiteinden van) het tre halose zijn gekoppeld. Ook dan geldt dat reducerende detergentia op koolhydraatbasis kunnen worden bereid door middel van hydrolyse van de 1,1-binding van trehalose, waarbij de hydrolyse van de 1,1-binding middels een biokatalytisch proces of middels fysisch/chemische methoden kan plaatsvinden.

De uitvinding omvat voorts de niet-reducerende glucanen en daarvan afgeleide produkten, verkrijgbaar dan wel verkregen met de bovenstaand gedefinieerde werkwijze. Ook omvat de uitvinding de toepassing van niet-reducerende glucanen en daarvan afgeleide produkten zoals bovenstaand gedefinieerd, in voeding, cosmetica, farmaceutische of industriële produkten, in het bijzonder als vetvervanger of zoetstof in voedingsmiddelen, als stabilisator of als vulstof in voedingsmiddelen, cosmetica en farmaceutische produkten, of als detergentia.

De uitvinding wordt tevens belichaamd in een thermostabiel niet-reducerend-glucaan-vormend enzym, dat werkzaam is bij een temperatuur van 60-120°C, liefst 70-80°C. In het bijzonder omvat de uitvinding thermostabiel NRGVE, afkomstig uit Sulfolobus solfataricus DSM 1617 of een daarvan afstammend of afgeleid micro-organisme. Ook verschaft de uitvinding een enzympreparaat, omvattende een thermostabiel niet-reducerend-glucaan-vormend enzym (NRGVE) als bovenstaand gedefinieerd, in combinatie met een enzym, gekozen uit de groep bestaande uit a-amylases, iso-amylases, pullulanases, amylopullulanases, amylases, glucosi-dases, amyloglucosidases, en glucosyltransferases (bijvoorbeeld fosforylases). Bij voorkeur zijn in zo’n enzympreparaat alle daarin aanwezige enzymen thermostabiel.

Een volgens de uitvinding te gebruiken thermostabiel enzym kan op de volgende wijze worden verkregen.

Medium en fermentatieomstandigheden

Sulfolobus solfataricus DSM-1617 kon gekweekt worden in een daarvoor geschikt medium zoals dat bestaande uit de volgende bestanddelen: gistextract (2,0 g/1), KH2P04 (3,1 g/1), (NH4)2S04 (2,5 g/1), MgS04.7H20 (0,2 g/1), CaCl2.2H20 (0,25 g/1) en sporenelementen (0,0018 g/1 MnCl2.4H20, 0,0045 g/1 Na2B407.10H2O, 0,22.10-3 g/1 ZnS04.7H20, 0,05.10-3 g/1 CuC12.2H20, 0,03.10-3 g/1 Na2Mo04.2H20, 0,03.10-3 g/1 V0S04.2H20 en 0,01.10-3 g/1 CoS04.7H20) . Met 0,1 M H2S04 werd de pH op 3,5 ingesteld.

Volumina van 5 liter medium werden gesteriliseerd in fermentors met een volume van 7 liter (Applikon, Schiedam, Nederland) door gedurende 45 minuten bij 120°C en 1,2 bar te autoclaveren. Voorcultures werden gekweekt in 250 ml erlenmeyers met 70 ml medium (20 minuten geautoclaveerd bij 120°C en 1,2 bar) bij 80°C en 150 rpm in een schudwaterbad. De fermentors werden beënt met 280 ml voorkweek. Groei in de fermentors vond plaats bij 80°C met een beluchting van 0,35 liter lucht/liter medium/minuut bij een roersnelheid van 400 rpm. Groei werd gevolgd door de optische dichtheid van de culture bij 550 nm en 1 cm weglengte te meten. Aan het begin van de stationaire fase bij een fermentatieduur van ca. 40 uur kan de fermentatie worden beëindigd. Door centrifugeren konden cellen worden gescheiden van de cultuurvloeistof.

Winning van NRGVE is mogelijk uit cellen en uit celvrije cultuurvloeistof. Hierbij kunnen bestaande technologieën voor concentrering, zoals indamping, ammoniumsulfaatprecipitatie, acetonprecipitatie en membraanfiltratie, en voor zuivering, zoals ionenwisselaarchromatografie, gelfiltratie, iso-electric focussing, hydrofobe interactie chromatografie, affiniteits-chromatografie en preparatieve electroforese worden gebruikt.

Zo kon NRGVE gewonnen worden uit celextracten. Cellen werden daartoe opgenomen in 10 mM Tris-HCl buffer (3 ml/g cellen natgewicht) en vervolgens bij 0°C met behulp van ultrasoon geluid (desintegrator Soniprep 150, MSE) gedesintegreerd. Na centrifugatie bij 6°C en 35000 g gedurende 60 minuten werd het ruwe celvrij extract gedialyseerd tegen 0,05 M acetaatbuffer pH 5,5. Een ruw enzympreparaat werd vervolgens verkregen na 65% ammoniumsulfaatprecipitatie gevolgd door acetonprecipitatie met twee volume eenheden koude aceton. Na cent rifugatie bij 6°C en 5000 g gedurende 10 minuten werden de neergeslagen eiwitten geresuspendeerd in 0,05 M acetaatbuffer pH 5,5 en gedialyseerd tegen deze buffer bij 6°C.

Het zo verkregen ruwe enzympreparaat kon verder worden gezuiverd middels gelfiltratie bij 6°C met een Hiload 26/60 Superdex kolom (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Zweden).

De chromatografische omstandigheden waren als volgt: kolomvolume: 325 ml; elutiesnelheid: 1 ml/min; eluens: 0,05 M acetaatbuffer, 0,15 M NaCl pH 5,5; fractievolume: 5,5 ml; opbreng: 10 ml ruw enzympreparaat.

De volgende analyses werden uitgevoerd.

Eiwit

De elutie werd gevolgd door de absorptie bij 280 nm te meten. Eiwitconcentraties werden bepaald volgens de Bradford-methode met een kit van Bio-Rad en BSA (runder serum albumine) als standaard.

ΟΊ icrosaochar i riesamenstellina van_react ICPiOdUCten

De oligosaccharidesamenstelling werd bepaald middels HPLC. HPLC met een kat ionenwisselaar werd uitgevoerd met Benson BCX4 kat ionenwisselaar in de calcium vorm (deeltjesgrootte 15-20 μπ\, kolom 250 x 10 mm), met 100 ppm Ca-EDTA als mobiele fase, een elutiesnelheid van 0,4 ml/min, een kolomtemperatuur van 85 C en een monstergrootte van 20 μΐ. De brekingsindex van het geëlueerde materiaal werd bepaald met een Jasco 830-RI detector bij 40°C en geregistreerd met een SP4400 Chromjet intregrator van Spectra Physics bij een papiersnelheid van 2,5 mm/min. HPLC met een anionenwisselaar werd uitgevoerd met een Dionex CarboPac PA1 kolom (250 x 4 mm) met een CarboPac PA1 guardkolom. Detectie vond plaats met een Dionex PAD II gepulste amperometrische detector met een gevoeligheid van 1 μΟ . De elutiesnelheid bedroeg 1 ml/min, druk 90 bar en het monstervolume 20 μΐ (150 μΐ preflush). Als mobiele fase werd 0,1 M NaOH (eluent A) gebruikt met een gradiënt van 0 — 0,6 M natriumacetaat (eluent B) op de volgende wijze: %B in eluent; 5% (0 min) — 35% (10 min) - 60¾ (20 min) - 100% (25-27 min) - 5% (28-35 min) .

NRG-vormende activiteit

Substraat: 0,6% oplosbaar zetmeel (Merck) waaruit met behulp van iso—amylase (Hayashibara Biochem Lab, Japan) de cx 1, 6 bindingen waren verwijderd, opgelost in buffer; enzym/substraat-verhouding: 0,5 ml enzym + 6 ml substraat; temperatuur: 7 0°C; reactietijd: 18,5 uur; buffer: 0,05 M natriumacetaatbuffer pH 5,5; analyse: afname reducerende eindgroepen volgens Nelson-Somogyi; activiteit uitgedrukt in units per ml waarbij 1 unit (U) gelijk is aan de afname van 1 μπιοί reducerend vermogen per minuut (amylase-activiteit kon op dezelfde manier worden bepaald als toename van reducerende eindgroepen).

Aldus werd één piek met NRG-vormende activiteit verkregen eluerend tussen 71 en 138 ml na begin van de void piek; volgens een ijklijn opgesteld met ribonuclease A (13,7 kDa), chymotryp-sinogeen A (25 kDa), ovalbumine (43 kDa), albumine (67 kDa), β-amylase (200 kDa) en apoferritin (443 kDa) overeenkomend met een molecuulgewicht van ca. 5*104 Da. De actieve fracties uit een aantal gelfiltraties werden verzameld. Na dialyse tegen 20 mM piperazine pH 5,5 met 0,02% NaNg werd dit materiaal verder gezuiverd middels anionenwisselaarchromatografie met een Mono Q HR 10/10 FPLC-kolom (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Zweden).

De chromatografische omstandigheden waren als volgt: kolomvolume: 8 ml; elutiesnelheid: 2 ml/min; eluens: 20 mM piperazine pH 5,5; gradiënt: 0-0,5 M NaCl in eluens in 45 min gevolgd door 0,5-lM NaCl in 25 min en 1 M NaCl gedurende 20 min; fractievolume: 60 ml tijdens opbrengen, 2 ml tijdens gradiënt-elutie; opbrengvolume: 867 ml met 38 mg eiwit.

Bepalingen werden uitgevoerd zoals hiervoor beschreven, waarbij NRG-vormende activiteit bepaald werd met 0,2 ml enzym en met 4 ml 0,6% malto-oligosacchariden met een gemiddelde polymerisatiegraad van ca. 6 (DP6) als substraat (volgens HPLC maltopentaose, maltohexaose en maltoheptaose bevattende in de verhouding 1:3:1,4).

Aldus kon NRG-vormende activiteit, welke in de doorloop aanwezig bleek met 85% van het opgebrachte eiwit, van een onder deze omstandigheden aan het kolommateriaal gebonden amyloly-tische activiteit welke elueerde tussen 14 en 27 min na starten van de gradiënt, worden gescheiden.

Materiaal, aanwezig in de doorlopen van een aantal anion-wisselaarchromatografieën uitgevoerd als hiervoor beschreven, werd na dialyse tegen 0,02 M Tris/HCl pH 7,5 + 0,02% NaN3 verder gezuiverd, door anionenwisselaarchromatografie inet een Mono Q HR 10/10 kolom onder de volgende omstandigheden: kolomvolume: 8 ml; elutiesnelheid: 1 ml/min; eluens: 0,02 M Tris/HCl pH 7,5; gradiënt: 0-0,075 M NaCl in eluens in 5 min gevolgd door 0,075-0,225 M NaCl in 60 min, 0,225-0,5 M NaCl in 30 min en 0,5 M NaCl gedurende 25 min; fractievolume: 59 ml tijdens opbrengen, 1 ml tijdens gradiëntelutie; opbrengvolume: 1450 ml met 46 mg eiwit.

Bepalingen werden uitgevoerd zoals hiervoor beschreven, waarbij NRG-vormende activiteit werd bepaald met 0,025 ml enzym en 4 ml 0,6% DP6.

Op deze manier elueerde NRG-vormende activiteit tussen 12 en 35 minuten na starten van de gradiënt. Dit materiaal werd onderworpen aan een dialyse tegen Milli-Q water. Een gezuiverd NRGVE bruikbaar in de werkwijze kon vervolgens worden verkregen door herhaalde scheiding met behulp van het Rotofor isoelectric focusing systeem van Bio—Rad onder de volgende condities, opbrengvolume eerste run: 10 ml gedialyseerd monster bevattende 5,5 mg eiwit (15 mg op basis A280 BSA 1 mg/ml=0,68) met 45 ml Milli-Q water, 2,6 ml Ampholine 3,5-10 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Zweden) en ureum in een eindconcentratie van 3 M; vermogen: 12 W, constant; looptijd: 4 uur; fracties: 20 met een volume van 2,5 ml.

De pH in de fracties liep op van 4,03 tot 10,78. De NRG-vormende activiteit werd bepaald na dialyse tegen 0,02 M Tris/ HC1 pH 7,5 met 0,25 ml enzym en 4 ml 0,6% DP6. Aldus werd activiteit gevonden tussen fracties met pH 4,66 en 7,22.

Met dit materiaal werd een 2e run uitgevoerd waarbij de volgende variabelen werden toegepast: opbrengvolume tweede run.

8 ml van fracties uit de eerste run focusserend tussen pH 4,66 en 7,22 bevattende 1,5 mg (4,7 mg eiwit op basis A280 BSA 1 mg/ml=0,68), met 49 ml Milli-Q water en ureum in een eind-concentratie van 3 M; vermogen: 12 W, constant; looptijd. 3 uur, fracties: 20 met volume van 2,5 ml.

De pH in de fracties liep op van 4,05 tot 11,87. De NRG-vormende activiteit werd, na dialyse tegen 0,02 M Tris/HCl pH 7,5, bepaald met 0,15 ml enzym en 4 ml 0,6% DP6 na 2 uur incubatie.

Aldus werd één piek aan activiteit gevonden met 1,4 mg eiwit, tussen fracties met pH 4,71 en 7,01 met de top bij pH 5,7.

Voor het zo verkregen gezuiverde en gedialyseerde NRGVE-preparaat werden de volgende eigenschappen vastgesteld. pH-traiect

Substraat: 1,2% DP6; buffer: 0,1 M bis-tris-propaan + 0,1 M citraat + 0,1 M maleaat + 0,02% NaN3; pH 3-9,5 oplopend in stappen van 0,5; enzym/substraatverhouding: 0,2 ml substraat met 0,2 ml buffer van de gewenste pH en 0,005 ml NRGVE; reactietijd: 17,5 uur; temperatuur: 70°C; analyse: verandering in reducerende eindgroepen volgens Nelson-Somogyi.

Er werd activiteit gevonden tussen pH 4,5 en 9,0 met een optimum bij pH 6,0. pH-stabiliteit

Buffer: 0,1 M bis-tris-propaan + 0,1 M citraat + 0,1 M maleaat + 0,02% NaN3; pH 3-9,5 met stappen van 0,5 pH-eenheid; enzym: 0,05 ml NRGVE met 0,150 ml buffer van de gewenste pH; temperatuur: 21°C; reactietijd: 1 uur; analyse: activiteit werd bepaald als hierboven bij pH 6,0 in een mengsel met het geincu-beerde enzymmengsel, 1,5 ml buffer pH 6,0 en 1,3 ml 1,4% DP6.

Er bleek dat activiteit van NRGVE was behouden bij incubaties uitgevoerd bij pH 5,5-9,5 en verdwenen na incubatie bij pH 3 en 3,5.

Temperatuur-traiect

Substraat: 1,2% DP6 in buffer; buffer: 0,1 M bis-tris-propaan + 0,1 M citraat + 0,1 M maleaat + 0,02% NaN3 pH 6,0; enzym/substraatverhouding: 0,15 ml substraat met 0,15 ml NRGVE; reactietijd: 0,5 uur; temperatuur: 50-100°C, in stappen van 5°C; analyse: verandering in reducerende eindgroepen.

Activiteit werd geconstateerd in het gehele temperatuur-gebied met een optimum bij 75°C.

Temperatuur-stabiliteit

Buffer: 0,1 M bis-tris-propaan + 0,1 M citraat + 0,1 M maleaat + 0,02% NaN3, pH 6; enzym: 0,1 ml NRGVE; temperatuur: 75-100°C, in stappen van 5°C; reactietijd: 0,5 en 3,5 uur; analyse: activiteit werd bepaald als hierboven bij pH 6,0 met 0,1 ml van het geïncubeerde enzymmengsel en 0,1 ml buffer met 1,2% DP6 gedurende 4 uur bij 70°C.

Op deze manier werd gevonden dat activiteit was behouden bij incubaties uitgevoerd bij 75-90°C; na 0,5 uur bij 95 C resteerde nog 94% van de activiteit van het NRGVE en na 3,5 uur nog 47 %. Na 0,5 uur bij 100°C resteerde nog 1% activiteit.

Kenmerkend voor de werking van het NRGVE is de mogelijkheid om bij temperaturen boven 60°C, niet-reducerende glucanen te vormen uit reducerende substraten zoals DP6.

Productie van niet-reducerende glucanen uit PF6

Substraat: 1,2% DP6 in buffer; buffer: 0,1 M bis-tris-propaan + 0,1 M citraat + 0,1 M maleaat + 0,02% NaN3, pH 6; enzym/substraatverhouding: 4 ml NRGVE met 4 ml substraat; reactietijd: 18 uur; temperatuur: 70°C; analyse: verandering in reducerende eindgroepen; HPLC.

Aldus werd de hoeveelheid reducerende eindgroepen met 68% teruggebracht. Het verdwijnen van reducerend vermogen bleek gepaard te gaan met het verschijnen, op chromatogrammen die na HPLC met anionenwisselaar waren verkregen, van nieuwe pieken met retentietijden van 6,5, 7,7 en 8,8 minuten naast die van maltopentaose, maltohexaose en maltoheptaose met retentietijden van 10,4, 11,5 en 12,4 minuten.

Deze pieken verdwenen na incubatie van 1,5 ml van het reactiemengse1 met 1 ml van een oplossing met 1,05 mg/ml amylo glucosidase (Aspergillus niger, 75 u/mg; Merck, Darmstadt, Duitsland) in 0,05 M maleaatbuffer pH 5,0 gedurende 21 uur bij 37°C. Na deze behandeling bleek dat pieken werden gevormd met retentietijden van 2,2 en 3,0 min overeenkomend met die van α,α-trehalose en glucose. Uit HPLC met kationenwisselaar kon voor het di- en mono-saccharide een massaverhouding van 1:3,4 bepaald worden. Na behandeling met een oplossing van amyloglucosidase in combinatie met 0,032 mg/ml trehalase (varkensnier, 0,68 u/mg; Sigma, St.Louis, USA) bleek uitsluitend een piek met een retentietijd van 3,0 min gevormd te worden.

Hieruit kon worden geconcludeerd dat door NRGVE reducerende glucanen met de bruto formule Gn waarbij G staat voor een glucosyl-residue en onderschrift n voor een geheel getal, worden omgezet in niet-reducerende glucanen met de bruto formule Gn_2T waarbij T staat voor een trehalosyl eenheid.

Een karakteristieke eigenschap van preparaten welke niet-reducerende glucanen bevatten, is vermindering van verkleuring ontstaan ten gevolge van de Maillardreactie.

Maillardreactie

Vorming niet-reducerende glucanen bevattend DP6-preparaat: 3 ml 2% DP6 in 0,1 M acetaatbuffer pH 5,7 +4 mM calciumchloride + 0,04% NaN-j werd gedurende 18 uur bij 80°C geïncubeerd met 3 ml NRVGE. Na incubatie bleek de hoeveelheid reducerende eindgroepen met 51% te zijn verminderd ten opzichte van op dezelfde manier behandeld DP6 dat niet met NRVGE maar met 3 ml 0,02 M Tris/HCl was geïncubeerd.

Reactie : 2 ml van bovenstaande vloeistoffen + 0,4 ml 10ï glycine + 1,6 ml 2,2 mM NaOH; pH 7,1; reactietijd: 17 uur; temperatuur: 95°C; analyse: toename absorptie bij 450 nm.

Op deze manier werd met DP6 een toename van de absorptie van 0,005 naar 0,164 geconstateerd en met het niet-reducerende glucanen bevattende DP6 een toename van 0,008 naar 0,045.

De werkwijze volgens de uitvinding kan uitgevoerd worden met door Sulfolobus solfataricus DSM-1617 geproduceerd NRGVE, maar elk ander organisme dat een boven 60°C werkzaam NRGVE produceert, kan ook gebruikt worden. Na kweek van dergelijke organismen op daarvoor geschikte wijze kunnen NRGVE bevattende bronnen, zoals cellen, celextracten of celvrije cultuurvloei-stoffen, als zodanig in de werkwijze gebruikt worden. Eventueel kan voor het gebruik concentrering middels bestaande technologieën, zoals centrifugeren en filtratie plaatsvinden. In gevallen dat componenten zoals hydrolytische activiteiten aanwezig in deze enzymbronnen een belemmering voor uitvoering van de werkwijze vormen, kan een dergelijke activiteit worden onderdrukt, bijv. door toepassing van inhibitors, of kan het NRGVE gezuiverd worden. Zoals hierboven beschreven voor het NRGVE, afkomstig uit Sulfolobus solfataricus DSM-1617, kunnen hiervoor bestaande technieken toegepast worden.

NRG-vormende enzympreparaten kunnen in geïmmobiliseerde vorm toegepast worden waardoor ze eenvoudig van het reactie— mengsel gescheiden kunnen worden. Dit geldt eveneens voor de enzymen in de combinatie waarmee de werkwijze volgens de uitvinding wordt uitgevoerd.

In enzymcombinaties welke in de werkwijze volgens de uitvinding toegepast worden, kan naast NRGVE in principe ieder enzym met thermostabiele eigenschappen worden toegepast en bij voorkeur enzymen behorende tot de klasse der oxidoreductases, hydrolases, transferases, lyases of isomerases waaronder die enzymen behorende tot de subklassen EC 1.1, EC 2.4, EC 2.7. EC

3.1, EC 3.2, EC 4.2, EC 5.1, EC 5.3, EC 5.4 en in het bijzonder deze deel uitmakende van de sub—subklassen EC 1.1.3, EC 2.4.1,

EC 2.7.1, EC 3.1.3, EC 3.2.1, EC 4.2.2, EC 5.1.3, EC 5.3.1, EC

5.4.1, EC 5.4.2, waarbij speciaal van belang zijn, enzymen die actief zijn met zetmeel als substraat.

De samenstelling van de thermostabiele enzymcombinatie in de werkwijze is bepalend voor de samenstelling van de uiteindelijk verkregen producten. Een deskundige in het veld kan de product samenstelling beïnvloeden door een gerichte keuze van de enzymen in combinatie waarmee het NRGVE wordt toegepast. Zo kunnen door toepassing van een hydrolase zoals een iso-amylase (EC 3.2.1.68) of een pullulanase (EC 3.2.1.41) uit zetmeel oligosacchariden met een polymerisatiegraad (DP) groter dan 5 worden verkregen, welke als substraat kunnen dienen voor het in combinatie toegepaste NRGVE. Door toepassing van de werkwijze op deze manier is het mogelijk een produkt te verkrijgen dat volledig uit niet—reducerende glucanen bestaat. Bij toepassing van andere enzymen in de combinatie, met name hydrolases zoals a-amylase (EC 3.2.1.1), β-amylase (EC 3.2.1.2), amyloglucosidase (EC 3.2.1.3), α-glucosidase (EC 3.2.1.20), amylo-pullulanase of transferases zoals amylomaltase (EC 2.4.1.25) of cyclomalto-dextrine glucanotransferases (EC 2.4.1.19) kunnen producten met een lage DP, zoals glucose, worden gevormd welke niet door het in de combinatie aanwezig NRGVE als substraat gebruikt kunnen worden. Om dergelijke reactieproducten te scheiden van de uitgangsstoffen kunnen bewezen technologieën zoals membraanfiltratie of batchgewijze voeding/verdunning van respectievelijk enzymcombinatie/substraat en product worden toegepast . Ook reacties in twee-fasensystemen kunnen worden toegepast.

Door het scheiden van uitgangsstoffen van reactieproducten kan ook een rendementsverbetering op treden als gevolg van het opheffen van eindproduktremming.

De mogelijkheden om ongewenste reactieproducten te scheiden kan verbeterd worden door specifieke derivatisering van een dergelijke component. Zo kan door toevoeging van glucose oxidase (EC 1.1.3.4) glucose worden omgezet in gluconzuur, welk reactie-produkt selectief verwijderd kan worden middels bestaande technologieën.

In de werkwijze volgens de uitvinding kunnen enzymen worden toegevoegd welke de gevormde niet-reducerende glucanen als substraat kunnen gebruiken zoals hexosyltransferases (EC 2.4.1), in het bijzonder de glucosyltransferases zoals 4-a-glucanotrans-ferase (EC 2.4.1.25) en trehalose fosforylase (EC 2.4.1.64) en speciaal fosforylase (EC 2.4.1.1) welke afhankelijk van reactie-omstandigheden, met name de concentratie aan anorganisch fosfaat (P^) , de overdracht van een glucosyleenheid kan bewerkstelligen van of naar een niet-reducerend uiteinde van een glucaan. In voorbeeld 3 wordt dit aangetoond voor fosforylase uit aardappel.

Uit onder andere door aanvraagster verricht onderzoek is gebleken dat thermostabiele fosforylases voorkomen in de domeinen der Archaea, Bacteria en Eukarya, met name in micro-organismen behorend tot de orde der Thermococcales, de orde der Thermoproteales, het genus Bacillus, het genus Thermus of het genus Thermotoga, te weten Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woesei, Thermoproteus tenax, Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldolyticus, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus species ATCC 27737 en Thermotoga maritima.

Afhankelijk van het beoogde resultaat kan op een door de deskundige te bepalen moment de enzymcombinatie van samenstelling veranderd worden, bijvoorbeeld door gebruik te maken van geïmmobiliseerde enzymen, waarbij zo nodig de reactie-omstandigheden kunnen worden aangepast.

De deskundige in het veld kan door juiste combinatie van enzymen met de werkwijze volgens de uitvinding als produkt niet- reducerende glucanen of daarvan afgeleide produkten verkrijgen met een polymerisatiegraad van 2 en hoger.

In gevallen waarin het wenselijk is om niet-reducerende glucanen niet van te voren aan de te bereiden produkten toe te voegen, kan de werkwijze volgens de uitvinding in situ worden uitgevoerd, te denken valt hierbij aan de bereiding van zetmeel— bevattende bakkerij-produkten waarbij temperaturen boven 60°C worden toegepast, zoals brood-bereiding.

De werkwijze volgens de uitvinding wordt uitgevoerd bij temperaturen boven 60°C met zetmeelmateriaal als substraat. Het zetmeelmateriaal kan aanwezig zijn in waterig maar ook in een waterbeperkt milieu. Een waterige oplossing van het zetmeelmateriaal, bij voorkeur met een zetmeelconcentratie tussen 0,1 en 50 gewichtsprocent, wordt verkregen door verhitting boven de verstijfselingstemperatuur van het toegepaste zetmeelmateriaal of door voorverstijfseld zetmeelmateriaal op te lossen in water.

De werkwijze volgens de uitvinding wordt uitgevoerd met een combinatie van enzymen waarbij door de deskundige in het veld op basis van bekende gegevens over de afzonderlijke enzymen onder meer betreffende pH-, temperatuur- en substraat-afhankelijkheid, een optimale combinatie van omstandigheden voor toepassing van de gewenste combinatie aan enzymen bepaald kan worden.

Bij toepassing van het NRGVE afkomstig uit Sulfolobus solfataricus DSM-1617 kan de werkwijze uitgevoerd worden bij een temperatuur tussen 60 en 120°C, bij voorkeur tussen 70 en 80 C.

De pH—waarden bij gebruik van NRGVE uit Sulfolobus solfataricus DSM-1617 kunnen liggen tussen 4,5 en 9 en bij voorkeur tussen pH 5 en 7. De reactietijd is niet gelimiteerd maar ligt bij voorkeur tussen 1 en 100 uur.

De NRG-bevattende produkten die worden gevormd met de werkwijze volgens de uitvinding, kunnen als zodanig gebruikt worden of met bekende technologieën zoals centrifugeren, filtreren, reverse osmosis en indampen worden ontdaan van onzuiverheden en worden geconcentreerd. Zo nodig kunnen reducerende glucanen en andere ongewenste componenten zoals zouten worden verwijderd met daarvoor ter beschikking staande technieken. Resultaten hierboven beschreven met HPLC met anionenwisselaar geven aan dat ionenwisselaarchromatografie bijvoorbeeld gebruikt kan worden om de verschillende glucanen van elkaar te scheiden.

Het verkregen NRG kan toegepast worden in werkwijzen waar zetmeelmateriaal wordt gebruikt en waarbij het ontbreken van reducerend vermogen van belang is. Toepassingen van zetmeel en zetmeelderivaten worden bijv. gevonden in de papier, golfkarton, kleefstoffen, wasmiddelen, textiel en voedingsmiddelenindustrie, in de kosmetische en farmaceutische industrie en in de olie- en gaswinningsindustrie. Dergelijke toepassingen zijn onder andere beschreven door R.J. Alexander in "Maltodextrins: Production, Properties and Applications" (in: Starch hydrolysis products: worldwide technology, production and application. F.W. Schenck, R.E. Hebeda eds., VCH Publishers, New York, 1992, pp. 233-275). Zonder volledig te willen zijn, betreft het werkwijzen waarbij toepassing plaatsvindt als vetvervanger, zoetstof, stabilisator, vulstof, sproeidrooghulpstof, adsorbens voor smaakstoffen, was-verzachter, bleekactivator, oppervlakte-actieve stof, emulgator (detergens), complexerend agens, sequestreermiddel en in coatings en boorvloeistoffen. Door toepassing van NRG worden reacties voorkomen, waarbij het reducerende einde van zetmeel kan zijn betrokken, zoals die bijvoorbeeld op kunnen treden met zuurstof, met amino-groepen van in producten aanwezige aminozuren, peptiden en eiwitten of met in de producten aanwezige fijn-chemicaliën, zoals smaakstoffen. NRG's zouden derhalve kunnen dienen als vervanger van gehydrogeneerde of geoxideerde zetmeelmaterialen.

Bovengenoemde stabiliteit is ook van voordeel bij gebruik van NRG's in plaats van zetmeelmateriaal als uitgangsmateriaal voor derivatiseringsreacties welke in het algemeen worden uitgevoerd onder zure of basische omstandigheden en/of verhoogde temperatuur. Bijvoorbeeld bij veretheringsreacties van zetmeelmaterialen in alkalisch milieu zal door toepassing van NRG's sprake zijn van een sterk verminderde bruinkleuring.

In het middels de werkwijze volgens de uitvinding gevormde NRG is een extra niet-reducerend uiteinde gevormd dat gebruikt kan worden voor verdere derivatisering. Dit kan bijvoorbeeld in een continue proces waarbij de werkwijze volgens de uitvinding wordt uitgevoerd in een membraanreactor met als enzymcombinatie een amylase en NRGVE. Het gevormde NRG met een lage DP wordt daarbij verwijderd en kan in een volgend compartiment worden gederivatiseerd. Een dergelijke derivatisering kan inhouden koppeling van apolaire staarten aan niet-reducerende uiteinden waardoor detergentia worden gevormd.

In het met behulp van de werkwijze volgens de uitvinding verkregen NRG is middels NRGVE een trehalosyl-eenheid geïntroduceerd.

Het op basis van zetmeel middels de werkwijze volgens de uitvinding gevormd NRG en de daarvan afgeleide stoffen bevatten een trehalosyl eenheid welke gekenmerkt wordt door een specifiek type binding. Het glucaan is daardoor voorzien van een, voor het glucaan, unieke binding. Naast de mogelijkheden die door het ontbreken van het reducerende uiteinde ontstaan, opent deze nieuwe binding additionele mogelijkheden voor werkwijzen waarbij het NRG wordt toegepast. Zo biedt deze nieuwe binding de mogelijkheid om NRG en daarvan afgeleide stoffen gericht te hydrolyseren. Hiervoor kunnen fysische, chemische en enzymatische werkwijzen gebruikt worden zoals toepassing van NRGVE onder condities waarbij een reversie van de in dit patentschrift beschreven reactie optreedt. Condities voor uitvoeren van een dergelijke werkwijze zijn door een deskundige in het veld te bepalen en kunnen inhouden dat de reactie wordt uitgevoerd in een waterbeperkt milieu.

Voorts is het voor een deskundige in het veld mogelijk om door toepassing van biokatalytische, fysische of chemische werkwijzen de a 1,4-binding tussen de trehalosyl-eenheid en de naastgelegen glucosyl-eenheid te hydrolyseren, hetgeen voor van NRG afgeleide stoffen kan leiden tot de vorming van een enkelvoudig gesubstitueerde trehalosyl-eenheid. Een dergelijke hydrolyse zou biokatalytisch kunnen worden uitgevoerd, bijv. door toepassing van een a-amylase eventueel in combinatie met α-glucosidase of amyloglucosidase.

De uitvinding biedt dus de mogelijkheid om langs enzymatische weg niet-reducerende glucanen te bereiden welke door hun specifieke eigenschappen een uitbreiding c.q. verbetering betekenen van de mogelijkheid om zetmeelproducten toe te passen en welke als basis kunnen dienen voor verdere derivatisering waarbij nieuwe produkten kunnen worden verkregen en/of waarop nieuwe werkwijzen kunnen worden gebaseerd.

De uitvinding wordt toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden.

Voorbeeld 1

In 8 fermentaties van Sulfolobus solfataricus DSM-1617 onder hiervoor beschreven omstandigheden, waarbij cellen werden geoogst bij een OD550 tussen 0,54 en 0,66, werd een gemiddelde celopbrengst verkregen van 1,52 g/1 natgewicht. Cellen werden gescheiden van cultuurvloeistof door centrifugatie. Uit de cellen werd op de hiervoor beschreven wijze een gezuiverd enzym-preparaat verkregen met 18,6 μg eiwit per ml en een specifieke activiteit van 2 U/mg. Bepalingen vonden plaats als hiervoor beschreven.

Het gezuiverde NRGVE bevattende preparaat werd toegepast in een werkwijze waarin aardappelzetmeel werd gehydrolyseerd met een commercieel a-amylase.

2,5 ml van het gezuiverd NRGVE-preparaat werd gemengd met 2.5 ml van een oplossing met 0,4 μΐ Termamyl 120L (Novo Nordisk, Kopenhagen, Denemarken) per liter 0,1 M acetaatbuffer pH 5,7 + 4 mM CaCl2 + 0,04 % NaN3 en 5 ml 1,2% natief aardappelmeel (85% droge stof; AVEBE, Foxhol, Nederland) in dezelfde buffer. Het reactiemengsel werd geïncubeerd bij 80°C en na 24 en 48 uur werd 2 ml monster genomen dat, om de reactie te stoppen, in ijs-water werd gezet en met 50 μΐ 1M Tris/HCl pH 8,5 op pH 8,0 werd gebracht. In de monsters werd het aantal reducerende eindgroepen bepaald en middels HPLC met kationenwisselaar het gehalte aan produkten met een DP1-7, dit als maat voor de afbraak van het zetmeel door het α-amylase. Het reducerend vermogen, uitgedrukt als dextrose equivalent (DE), bedroeg na 24 uur 6,9 en na 48 uur 11,1. Het gehalte aan DP1-7 was daarbij respectievelijk 3,1 en 3.5 g/1, overeenkomende met 62 en 68% afbraak. HPLC met anionen-wisselaar toonde verder de aanwezigheid van produkten met retentietijden, overeenkomend met die van niet-reducerende glucanen. Ter vergelijking werd dezelfde reactie uitgevoerd met 2.5 ml buffer zonder NRGVE. Na 24 uur bedroeg in dit reactie-mengsel de DE 11,2 en na 48 uur 18,5. Het gehalte aan DP1-7 bedroeg respectievelijk 2,5 en 3,3 g/1, overeenkomende met 51 en 65% afbraak van het natieve meel. HPLC met anionenwisselaar monsters gaf geen aanwijzing voor de aanwezigheid van niet-reducerende glucanen in dit monster. Bij een gelijke afbraak is door toepassing van een enzymcombinatie met NRGVE het reducerend vermogen dus aanzienlijk lager gebleven.

Voorbeeld 2

Het gezuiverde NRGVE preparaat uit voorbeeld 1 werd in combinatie met een commercieel pullulanase toegepast.

Een oplossing met 0,72 % oplosbaar zetmeel (90% droge stof; Merck, Darmstadt, Duitsland) in 0,1 M acetaatbuffer pH 5,7 + 4 mM CaCl2 + 0,04 % NaN3 werd verstijfseld door 15 minuten te verhitten bij 100°C. Na afkoelen tot 60°C werd aan 5 ml van deze oplossing 0,4 ml van het gezuiverd NRGVE preparaat toegevoegd en 0,6 ml van een oplossing met 40 μΐ Promozyme 200L (Novo Nordisk, Kopenhagen, Denemarken) per liter in buffer. Eenzelfde incubatie werd uitgeveerd zonder NRGVE. Na 16,5 uur incubatie van de reactiemengse1s bij 60°C werd de DE bepaald. Zonder NRGVE bleek deze door de werking van Promozyme te zijn gestegen van 0,91 naar 0,98. Combinatie van Promozyme met NRGVE resulteerde in een DE van 0,87 waarbij met behulp van HPLC met anionenwisselaar in dit monster de aanwezigheid van produkten met een retentietijd, overeenkomend met die van niet-reducerende glucanen, kon worden aangetoond.

Voorbeeld 3

Een reactiemengsel, bestaande uit 3 ml 0,1 M acetaatbuffer + 4 mM CaCl2 + 0,04% NaN3 met 2% DP6 en 3 ml van het gezuiverde NRGVE preparaat, werd gedurende 18 uur geïncubeerd bij 80°C. Het aantal reducerende uiteinden bleek in dit reactiemengsel in vergelijking met een incubatie, uitgevoerd zonder NRGVE, met 51% te zijn afgenomen. Beide produkten, DP6 en NRG-bevattend DP6, werden gebruikt als substraat voor fosforylase, gewonnen volgens bekende methoden uit aardappel. Reactiemengsels, bestaande uit 0,375 ml van bovenstaande mengsels, met een activiteit van 2 eenheden per ml, 2,5 ml fosforylase (2 eenheden per ml) en 5 ml 3% a-glucose-l-fosfaat (G-l-P) in 0,05 M bis-tris-propaan pH 7 werden gedurende 24 uur geïncubeerd bij 35°C. De afname in G-l-P berekend uit de gevormde hoeveelheid anorganisch fosfaat, bepaald met de methode van Chen, bleek in beide reactiemengsels gelijk (40%). Ook de gevormde hoeveelheid polymeer materiaal, bepaald met de anthron-zwavelzuur methode, na dialyse van 2 ml van de reactiemengsels tegen 0,1 M bis-tris-propaan pH 7, bleek gelijk. Na bepaling van het reducerend vermogen van het polymere materiaal uit beide reactiemengsels kon voor het polymeer uit het reactiemengsel met DP6 een DP van 50 worden berekend en voor het reactiemengsel met NRG-bevattend DP6 een DP van 75. Om aan te tonen dat NRG gebruikt was als primer voor het gevormde polymeer, werden de na dialyse verkregen oplossingen met amylc-glucosidase behandeld door 0,2 ml van de gedialyseerde oplossingen met 0,4 ml amyloglucosidase (1 mg/ml; Aspergillus niger, 75 u/mg; Merck, Darmstabc, Duitsland) in 0,1 M acetaatbuffer pH 4,1 te incuberen gedurende 15 uur bij 35°C. Na incubatie was met HPLC met anionenwisselaar geen trehalose aantoonbaar in polymeer verkregen met DP6, maar wel in dat, verkregen met NRG-bevattend DP6 als primer.

Claims (34)

1. Werkwijze voor omzetting van een zetmeelmateriaal, met het kenmerk, dat de omzetting plaatsvindt onder toepassing van een thermostabiele niet-reducerend-glucaan-vormende enzymactiviteit (NRGVE).

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de omzetting plaatsvindt bij 60-120°C, liefst 70-80°C.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de omzetting plaatsvindt bij pH 4-9, liefst pH 5-7.

4. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-3, met het kenmerk, dat het thermostabiele NRVGE afkomstig is uit micro-organismen.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het thermostabiele NRGVE afkomstig is uit Sulfolobus solfataricus DSM 1617 of een daarvan afstammend of afgeleid micro-organisme.

6. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-5, met het kenmerk, dat als zetmeelmateriaal een natief zetmeel wordt toegepast.

7. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-6, met het kenmerk, dat het zetmeelmateriaal wordt gedepolymeriseerd onder g0iΐjktijdige vorming van niet—reducerende glucanen.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de depolymerisatie wordt uitgevoerd met behulp van thermostabiele glucanases, in het bijzonder thermostabiele a-amylases, iso-amylases, pullulanases, amylopullulanases of combinaties hiervan.

9. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-8, met het kenmerk, dat door toepassing van glucanases, zoals amylases, glucosidases, amyloglucosidases of combinaties hiervan, trehalose wordt gevormd uit de niet—reducerende glucanen.

10. Werkwijze volgens een van de conclusies 1—9, met het kenmerk, dat de niet-reducerende glucanen onder toepassing van glucosyltransferases worden gemodificeerd.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat door toepassing van fosforylase in aanwezigheid van een glucosyl donor, zoals glucose-l-fosfaat, de polymerisatiegraad van de niet-reducerende glucanen wordt verhoogd.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat een thermostabiel fosforylase bij 60-120°C wordt toegepast.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat een thermostabiel fosforylase wordt gebruikt dat verkregen is uit micro-organismen, behorend tot de orde der Thermococcales, de orde der Thermoproteales, het genus Bacillus, het genus Thermus of het genus Thermotoga, of een daarvan afstammend of afgeleid micro-organisme.

14. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat een thermostabiel fosforylase wordt toegepast dat afkomstig is uit Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woesei, Thermoproteus tenax, Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldolyticus, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus species ATCC 27737, Thermotoga maritima, of een daarvan afstammend of afgeleid micro-organisme.

15. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-14, met het kenmerk, dat niet-reducerende glucanen worden bereid, die in voeding, cosmetica, farmaceutische of industriële produkten gebruikt kunnen worden.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat niet-reducerende glucanen worden bereid, die als vetvervanger of als zoetstof in voeding en voedingsmiddelen, of als stabilisator of als vulstof in voeding, cosmetica of farmaceutische produkten gebruikt kunnen worden.

17. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-16, met het kenmerk, dat de niet-reducerende glucanen gederivatiseerd worden.

18. Werkwijze volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat uit de niet-reducerende glucanen detergent ia worden gesynthetiseerd.

19. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat van het detergens de apolaire molecuulstaarten worden gekoppeld aan (de uiteinden van) de niet-reducerende glucanen.

20. Werkwijze volgens een van de conclusies 17-19, met het kenmerk, dat gederivatiseerde niet-reducerende glucanen worden gehydrolyseerd.

21. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat van de gederivatiseerde niet —reducerende glucanen de <x 1,4—binding tussen de trehalosyl-eenheid en de naastgelegen glucosyl-eenheid wordt gehydrolyseerd, waarbij een enkelvoudig gesubstitueerd trehalose wordt verkregen.

22. Werkwijze volgens een van de conclusies 1—20, met het kenmerk, dat reducerende derivaten, zoals detergentia, worden bereid middels hydrolyse van de 1,1-binding.

23. Werkwijze volgens conclusie 22, met het kenmerk, dat de hydrolyse van de 1,1—binding biokatalytisch of met behulp van fysisch/chemische methoden wordt bewerkstelligd.

24. Werkwijze volgens conclusie 9 of 21, met het kenmerk, dat het eventueel gesubstitueerde trehalose gederivatiseerd wordt.

25. Werkwijze volgens conclusie 24, met het kenmerk, dat op basis van het trehalose detergentia worden bereid.

26. Werkwijze volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat van hot detergens de apolaire delen aan (de uiteinden van) het trehalose zijn gekoppeld.

27. Werkwijze volgens conclusie 26, met het kenmerk, dat reducerende detergentia op koolhydraatbasis worden bereid door middel van hydrolyse van de 1,1-binding van trehalose.

28. Werkwijze volgens conclusie 27, met het kenmerk, dat de hydrolyse van de 1,1-binding middels een biokatalytisch proces of middels fysisch/chemische methoden plaatsvindt.

29. Niet-reducerende glucanen en daarvan afgeleide produkten, verkrijgbaar dan wel verkregen met de werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies.

30. Toepassing van niet-reducerende glucanen en daarvan afgeleide produkten zoals gedefinieerd in conclusie 29, in voeding, cosmetica, farmaceutische of industriële produkten, in het bijzonder als vetvervanger of als zoetstof in voedingsmiddelen, als stabilisator of als vulstof in voedingsmiddelen, cosmetica en farmaceutische produkten, of als detergentia.

31. Thermostabiel niet-reducerend-glucaan-vormend enzym, dat werkzaam is bij een temperatuur van 60-120°C, liefst 70-80°C.

32. Enzym volgens conclusie 31, afkomstig uit Sulfolobus solfataricus DSM 1617 of een daarvan afstammend of afgeleid micro-organisme.

33. Enzympreparaat, omvattende een thermostabiel niet-reducerend-glucaan-vormend enzym (NRGVE) als gedefinieerd in conclusie 31 of 32, in combinatie met een enzym, gekozen uit de groep bestaande uit oc-amylases, iso-amylases, pullulanases, amylopullulanases, amylases, glucosidases, amyloglucosidases, en glucosyltransferases, zoals fosforylases.

34. Enzympreparaat volgens conclusie 33, waarin elk van de daarin aanwezige enzymen thermostabiel is.