JPS60120984A - 耐熱性サイクロデキストリン・グリコシルトランスフェラ−ゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、耐熱性サイクロデキストリン拳グリコジル）
・ランスフェラーゼ及びその製造法に関するものである
。

サイクロデキストリン・グリコジルトランス７ｘラーセ
（以下、ＣＧＴ−ａｓｅと略す）は。

占−＜からバチルス・マセランスのアミラーセ′として
知られていたが、現在では、バチルス−サーキュランス
、バチルス−ステアロサーモフィラス、バチルス・メカ
チリウム、好アルカリ性バチルス属細菌などからも得ら
れることが判明している。そしてこれらの細菌から得ら
れるＣＧＴ−ａｓｅｉ粉とを用いて、グツαコース分子
６個、７個又は８個からなるα−１β−１γ−サイクロ
デキストリンやその他の高級サイクロデキストリン類又
は枝伺きサイクロデキストリン類が製造される。

ところで、サイクロテキストリン類はグルコース分子が
α−１，４−結合で環を形成した非還元性の物質である
が、他の物質と包接化合物を形成する特性がある。この
特性は、α−１β−１γ−の３種のサイクロデキスＩ・
リンのうち、特にβ−タイプのものにおいて顕著であり
、しかも、分〜精製が比較的容易であることから、木タ
イプのサイクロデキストリンは、Ｔ業師に最も有用であ
る。

しかるに、従来使用されてきた大力のＣＧＴ−ａｓｅは
、温度に対する安定性を欠くものが殆とであって、５０
〜６０°Ｃ以下の温和な条件でしか作用させることがで
きないため、ノ１（質が酵素反一応中雑菌による汚染を
受け、腐敗を起こしやすいという欠点がある。ただ、バ
チルス・ステアロサーモフィルスの産生するＣＧＴ−ａ
ｓｅは多少耐熱性を持ち、７０〜７５°Ｃという比較的
高温度でも活性を失わないが、未酵素により生産される
サイクロデキストリンの主成分はα−タイプであるため
、］二業師に重要なβ−型サイクロテキストリンの生産
には適さない。

未発明治らは、以−１−のような従来のＣＧＴ−ａｓｅ
の欠点を改良すべく、耐熱性ＣＧＴ−ａｓｅイ１刀ｒ菌
を自然界にめて広く検索した結果、バチルス科、へチル
ス属に属する新株の細菌バチルス・ステアロサーモフィ
ルス　５Ｅ−４株が多Ｈの耐熱性ＣＧ　Ｔ　−ａ　ｓ　
ｅを産生じ、しかも、そのＣＧＴ−ａｓｅかβ−サイク
ロテキストリンを主成分として生ＪＩＬすることを見出
した。本発明はこれらの発見に基づくものである。

本発明の酵素は、中等度好熱細菌によって多量にＩｔｆ
Ｘ生されるが、作用適温が７５〜８０°Ｃの高温である
こと、β−サイクロデキストリンを主成分として生産す
るなどの点で、これまでに報告されているＣＧＴ−ａｓ
ｅとは全く異なっている。

次に、本発明における耐熱性ＣＧＴ−ａｓｅの諸性賀に
ついて述べる。

ｆｌｌ　作用 本酵素を可溶性と粉に作用させると、還元力はほとんど
生成しないにも拘らず、ヨウ素呈色はその作用か進むに
つれて急速に減少し、消失してしまう。

■　可溶性Ｖ粉との反応液にトリクロルエチレンを加え
て激しく振盪後、冷所に放置すると白色法Ｖを生ずる。

これは、可溶性澱粉からの生成物かサイクロデキスＩ・
リンであるため、ｌ・リクロルエチレンと包接化合物を
形成して沈澱したものと考えられる。

０１、レイシ、藪粉を本酵素で液化し、そのまま８０°
Ｃにて反応させ、生成物を高速液体クロマトグラフで分
析したところ３．α−７β−９γ−の各サイクロデキス
）・リンが検出されたが、β−サイクロテキストリンの
含量か最も多かった。この結果から、本酵素は、β−サ
イクロテキストリンを］二成分として生産する耐熱性Ｃ
ＧＴ−ａｓｅであると考えられる。

（２］　基質特異性 可溶性Ｖ粉、バレイショ澱粉のほか、アミロース、デキ
スＩ・・〕ン、トウモロコシＶ粉、コムギ澱粉などにも
作用する。

［３１活性′Ａ１１ｌ定法 ００２Ｍの塩化カルシウムを含むＯ，ｌ　Ｍの酢酸すト
リウム緩衝液、ｌ）１５．８の１％可溶性澱粉溶ｉｏ、
５ｍｌに適当に稀釈した酵素液０．５ｍｌを加え、８０
°Ｃ５１０分間反応させた後、水５ｍｌを加えて冷却し
、直ちにＬＭのグリシン−塩ｌ！ａ緩種１液（１’Ｈ３
，Ｏ）　ｌ　ｍｌを加えて反応を停止させ、さらにこの
液に、００１Ｍのヨウ素・０．２５　Ｍのヨウ化カリウ
ム溶液１ｍｌを加えて発色させ、６６０ｎｍの吸光度を
測定した。この測定条件にて６６０　ｎｍの吸光度を１
分間に１０％減少させる酵素聞を１０］位とした。

１４１　至適ＰＨ及び安定ｐＨ １）■４〜６の範囲は酢酸緩衝液、ＰＨ６〜８（至ａ　
＋）Ｈの場合はＰＨ４〜７まで）の範囲はリン酸緩衝液
、１）■８〜９の範囲はトリス塩酸緩衝液、ｐＨ９〜１
１はグリシン−水酩化ナトリウム緩衝液を用いた。

至適１）Ｈは、前項■に述べた活性測定法のうち、可溶
性鍛粉のｐＨを変えて行った。第１図に示される通り、
本酵素の至適ｐＨ６，０伺近である。

安定水素イオン濃度範囲は、０．１　Ｍの各ｐＨの緩衝
液中で６５°Ｃ，ｔＯ分間保った後、残存活性をＪｌｌ
ｌ定することによりめた。結果を第２図に示す。本酵素
はＰＨ６〜９５で安定である。但し、リン酸緩衝液は、
他の緩衝液よりも本酵素を不安定にするようである。

１５］　至適温度及び温度安定性 至適温度は、前■項に述べた活性測定法のうち温度のみ
を変えて測定した。本酵素の至適温度は、第３図に示す
ように７５〜８０°Ｃであった。

温度安定性は、０．１Ｍ酢酸緩樹液、　ｒＨ６，０にて
各温度に１０分間保った後、残存活性を測定することに
よりめた。結果を第４図に示す。

図示の如く、本酵素は７０°Ｃまで安定であった。

（６１安定化及び阻害 カルシウムの２ＸＩＯ−２Ｍの存在化で耐熱性か２０°
Ｃ高まった（第４図参照）。

−力、水銀の２Ｘ１０’Ｍの存在下で活性がｔｉ１１害
された。

１７１　精製方法 Ｊ’Ｂｂ液から菌体を分離した培養上清は、その春まま
でも酵素源として使用できるが、必要に応じて公知の精
製方法１例えば澱粉への吸着と、脱着、塩析、透析、イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲルＨ１４過などを用い
て精製することができる。

１８１　沈降係数・分子量 超遠心沈降速度法によって沈降係数Ｓ２ｏイ＝６、６２
３　、超遠心沈降平衡法によって分イ量７９．０００の
値かＩＩられ、またＳＤＳ電気泳動法により分−ｒｉＡ
、　８０，０００の値が得られた。

１９１　等重点 １Ｆ気泳動沃によってめた等電点は６６である。

本発明の１１１４熱性ＣＧＴ−ａｓｅの製造に用いられ
る細菌は、／＜チルス属に属する中等度好熱細菌である
が、特に、次に述べるバチルス・ステアロサーモフィラ
ス　５Ｅ−４株は、本発明の酵素生産のため有用である
。

バチルス・ステアロサーモフィラス　５Ｅ−４株は、土
壌から発見、分離されたもので、Ｔ業技術院微生物工業
研究所において昭和５８年１１月７１コイ・ｊ倣］−研
菌寄第７３４３号（ＦＥＲＭ　Ｐ−７３４３）として受
理されている。

以下、バチルス・ステアロサーモフィラス　５Ｅ−４株
の菌学的性質を記載する。

■　形態学的性質＋１培養的性質 （１］　肉汁寒天平板培養 菌の生育は非常に早く良好である。１２〜２４時間で０
．２〜０．５　ｍｍ径の点状に生育し、端の方は不安定
である。表面は滑らか乃至やや粗く、光沢かあり中心伺
近は隆起状である。灰白色乃至淡黄色半透明で培地に色
素を生成しない。

栄香細胞の大きさは０８〜１２ルｍＸ１．６〜３６ｐＬ
ＩＩ＋で両端に丸見を帯びた桿菌で、多形性は有しない
。細胞の中心部と端部との間に胞子を形成する。胞子の
大きさは、１０〜１．４ｇｍ×１２〜１．５ｇｍの押型
で、やや膨らんでいる。周鞭毛をもち、運動性があるが
活発ではない。ときには、２連もしくはそれ以」二に連
なり、また、非常に長い細胞もみられる。

ダラム染色性は陽性、抗酸性を有しない。

第５図に木閑の電子顕微鏡写真（Ｘ１３，４００）を示
す。菌体の周囲の陰影からカプセルの存在が推定される
Ｓ ｆ２］　肉汁寒天斜面培養 ５５℃、１２〜２４時間で生育し、コロニーは半透明、
灰白色乃至淡黄色である。菌層はやや薄い。

［３］　肉汁液体培養 ５５°Ｃ，１２〜２４時間で生育し、培地は濁る。濁り
は一様であるが１時折沈渣を生じる。

表面にリングを形成せず、色素、ガスの生成も見られな
い。

５５℃、ｌＯ日間培養し、冷却したところ凝固した（菌
は生育しており、濁りがみられた）ことから、セラチン
液化を起こさないものと判定される。

１５１　リｉ・マスミルク リドマスは青色から赤紫に、ブロムフレツールパープル
は青色から薄い青黄色となり、酸の生成はほとんどみら
れない。しかし、培養液を傾斜させてみると底部に凝固
のような沈澱が見られた。

１６１　サブロー・デキストロース寒天平板培養生育し
ない。

＋１　生理的性質 （１）　硝酸塩の還元 還元しない。

（２）　脱窒反応 脱窒反応は認められない。

［３１ＭＲテスト 陽性 ＋４１ＶＰテスト 陰性。

１５１　インド−ル生成 生成しない。

］６１　硫化水素の生成 生成する。

１７１　１粉の加水分解 加水分解する。

１８１　クエン酸の利用性 利用しない。

＋９１　硝酸塩及びアンモニウム塩の利用利用しない。

１１１３１　色素の生成 生成しない。

１１１１　ウレアーゼ゛ 陰＋ｌ　。

０７１　オギシターセ 陽性。

口、＜１　カタラーセ 陽性。

［１４１アンモニアの生成 生成する。

ｂ　アセトインの生成 生成しない。

川　ジヒドロアセトンの生成 生成しない。

１１７１　生育Ｐ■範囲 ＩＩ８５．０〜９０゜ １８１　生育温度範囲 ４０℃以−１ニア０℃以下、最適５５〜６００Ｃ１ （１９）酸素要求性 好気性。

（２０）Ｏ−Ｆテスト 好気性で生育が認められ、醜を生成す る。

（２１）炭素源の利用性 グルコース、フルクト−ス、マンニト−ル、トレハロー
ス、マンノース、マル ト−ス、セロビオース、藪粉、ショ糖、グリセリンを利
用し、酸を生成する。ガスの発生は認められない。

（２２）耐用性 ２％塩化ナトリウムの存在で殆ど生育しない。

（２３）アシ化すＩ・リウム耐性 ００２％アジ化すトリウムの存在下で生育しない。

（２４）リゾチーム向性 ００１％リゾチームの存在下で生育しない。

■　抗生物質に酎する感受性試験 ディスク法にて抗生物質に対する感受性試験を行った。

培養は、肉汁寒天平板にて温度５５°Ｃで行った。（使
用ディスクは、栄研化学社製モノディスク）。結果を生
育阻止帯のｌＩｎ＋で示す。

１）アンピシリン　２３．８　Ｉｌｍ ［２＋　ベンジルペニシリン　１７．３ｍｍ［３）　ク
ロキカシリン　１８．７ｍｍ１４１　スルペニシリン　
１８．３ｍｍ１５）　ピラシリン　１８．３　ｍｍ １口　エリスロマイシン　８．３　；ｎｍ１７１　キク
サマイシン　８．３　ｍｍ１６）　オレアンドマイシン
　３．３ｍｍ１９１　セフｙロリジ７　２１．８ｍｍ１
１０１　セファシリジン　２０．０　ｍｍ１１１１　セ
ファシリジン　１６３１ ａ２Ｉ　テトラサイクリン　１６．ＯｍｍＬＫＩ　ミノ
サイクリン　１７．３ｍｍ０４１　リコマイシン　９．
８　ｍｍ ピッ　りロラムフェニコール　７．３ｍｍ吟　ゲンタマ
イシン　１１．３ｍｍ ［１７］　カナマイシン　８．８　ｍｍｌ１８１　アミ
カシン　９．０　ｍｍ （＋９）＝＋リスチア　０．Ｏｍｍ （２０）ナリジスク酸　０．Ｏｍｍ Ｌ記結果から、本菌株は、ペニシリン系、セファロスポ
リン系及びテトラサイリン系の抗生物質に特に感受性が
強く、これらにより強く生育を阻止されることが分る。

本発明者は、以上の菌株が、上述の菌学的性質から／ヘ
ージェイズ自マニュアルｅオブφデタミネイティブ・パ
クテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａ４ｏｆ
　Ｄｅｔｅｒ’ｍ１ｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ）第７版及び第８版に基づき、バチルス・ステア
ロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の新菌株であると同定し、こ
れをバチルス・ステアロサーモフィラス　５Ｅ−４株と
命名した。因に、本所菌株をバチルス・ステアロサーモ
フィラスの代表菌株（タイプストレイン）であるＩＡＭ
　１１０６２株と比較すると１本菌株は、■遅動性が弱
い；■硝酸塩還元能がない；■肉汁寒天培地中生育が良
好である；及び耐熱性のＣＧ　Ｔ　−ａ　ｓ　ｅを生産
する等の差異を有することにより該株と区別される。　
ところで、バチルス・ステアロサーモフィラスには、Ｃ
ＧＴ−ａｓｅを生産する株があることか既に報告されて
いる（特願昭４８−１１０８６８）。しかし本発明と比
較したとき、ＣＧＴ−ａｓｅ生産菌の菌学的性質は勿論
、被産生ＣＧＴ−ａｓｅ自体Ｃ酵素的性質にも著差が認
められるので１本発明に係る菌株及びＣＧＴ−ａｓｅは
これまでに報告されている類縁菌株及び類縁酵素とは全
く異なったものであると考えられる。即ち、例えば、菌
学的性質において、これまでの報告では、菌の形状が繊
維状又は鎖状となっているのに対し、本発明の菌の形状
は両端に丸味を帯びた桿菌であり、繊維状や鎖状にはな
らない。また、生理学的性質において、既報の菌株はゼ
ラチンの加水分解反応が陽性（ゼラチンを液化）である
のに対し、本発明の菌株ではゼラチンの加水分解反応が
陰性である。

一方、酵素的性質においても、既知のＣＧＴ−ａｓｅは
、等電点が４．４５であり、その反応の特徴として反応
初期にα−サイクロデキストリンを主成分として生成し
、反応後期にはβ−サイクロデキストリンを主成分とす
る。しかるに、本発明の酵素は等電点が６６であり、し
かも反応初期から後期に亘ってβ−サイクロデキスＩ・
リンを−）ユ成分として産生ずることを特徴とする。

以」−の諸特徴から、本発明に係る耐熱性ＣＧＴ−ａｓ
ｅは、これまでに報告されている耐熱性ＣＧＴ−ａｓｅ
とは全く異なる新規酵素であると判〉ｉ′される。

以下、実験記録を索いて本発明実施の態様を説＋Ｊ＋す
るか、例示は勿論説明用のものであるから、本発明の技
術的範囲は、これらによって何ら限定されるものではな
い。

［本発明酵素の製造］ 実験ｌ　酵素の生産 新分離菌バチルス・ステアロサーモフィラス　５Ｅ−４
株　（Ｆ、ＥＲＭ　Ｐ　−陽７３４３）を、可溶性澱粉
２％、コーンステイープリカー２．３％、尿素１％及び
炭酸カルシウム０゜５％からなる無菌培地１００ｖａｌ
　（５００ｍｌ容振盪フラスコ）に１白金耳量植菌し、
５０°Ｃ１１５時間振盪培養し、種培養液を得た。

１−の種培養液３０１を、前記組成からなる無菌培地３
，０００　ｍｌ　（５，０００ｍｌ容ジャーファーメン
ター中）に加え、５０℃にて８時間通気、撹拌、培養し
た。この培養液２．０００ｍ１を、同組成からなる殺菌
した培地１２５Ｍ（２００Ｍ容培養タンク）に種ｌｉｔ
として加え、５０°Ｃ１４８時間培養した。培養後、ｊ
８養液を１３，０ＯＯＸＧにて連続、遠心分離し、透明
な培養！！液１２０Ｑｔｌ−得た。なお、この培養濾液
の全活性は１，８２０万単位であった。

実験２　酵素の精製 実験１で得られた培養液を４°Ｃに冷却し、硫安を２５
％飽和とした後、湿熱処理Ｖ粉１ｋｇを加えて一夜撹拌
し、酵素を澱粉に吸着させた。次いで澱粉を成敗し、冷
水で洗浄後、５０°Ｃに保った００５Ｍグリシン−水酸
化すトリウム緩衝液（ＰＨ８，５）中に分散させ、１０
分間撹拌して吸着した酵素を溶出させた。

溶出後、濾過して固液分離し、礼０００ｍ１の溶出液を
得た。この溶出液に、硫安を３５％飽和となるように溶
解し、−夜装置して生じた沈澱を遠心、除去後、さらに
硫安を６５％飽和となるように溶解して一夜放置し、酵
素を沈Ｖさせた。沈毅した酵素を遠心分離によって集め
、Ｏ，ＯＩＭ）リス塩酸緩衝液（ＰＨ７５）に溶解後、
同緩衝液にて一夜透析し、不溶物を遠心分離して、硫安
塩析分画３７０ｍ１を得た。

この硫安塩析分画を、予め０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ＰＨ７，５）にて平衡化させたＤＥＡＥ−イオン交換
樹脂カラム（φ２．５　Ｘ　８０ａｍ）に通じて酵素を
吸着させ、同緩衝液にてカラムを充分に洗浄した後、同
緩＃液による０〜０．４　Ｍ食塩濃度勾配を利用して酵
素を溶出させ、精製酵素液８３０ｍ１を得た。

下表１に、本酵素の精製工程の結果を示す。

（以下余白） 表１ （以下余白） 木精製酵素は、超遠心的に均一であり、ｐＨ４０、Ｉｌ
ｌ　９．３及びＳＤＳの各ディスク電気泳動結果も弔−
なタンパク質まで精製されていることを支持している。

なお、超遠心沈降速度法によって沈降係数Ｓ　２０ｗ　
＝　６．６２３、沈降平衡法によって分子１ｉｉ７９，
０００が得られた。また、等電点′心気泳動法によって
等電点ｐｌ　６．６　、　Ｓ　Ｄ　Ｓ電気泳動法によっ
て分子量８０．０００が得られた。

［本発明酵素の作用］ 実験３　サイクロデキストリンの合成 ０．０２Ｍの塩化カルシウムを含む０．１　Ｍの酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５，８）の１％可溶性藪粉溶液１
ｍｌに、本発明酵素の４００単位に相当する酵素液を加
え、ａｏ’ｃにて６０分間反応させた。反応抜水水中に
て冷却し、トリクロルエチレン０．５ｍｌを加えて激し
く混合し、氷水中に放置したところ、白色の沈澱を生じ
た。この結果から、本酵素は、澱粉に作用し、サイクロ
デキストリンを合成することが分る。

バレイショ澱粉２０ｇを、０．０２Ｍの塩化カルシウム
を含む０．１　Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，８
）　８０ｍｌに分散させ、本発明酵素の８，０００単位
に相当する酵素液を加え、８０℃にて液化させ、そのま
ま８０℃にて反応させた。反応液から経時的にサンプリ
ングし、サイクロデキストリンの生成量を高速液体クロ
マトグラフィーにて分析した。結果を第６図に示す。こ
の結果から、本発明酵素は、反応の開始から終了まで一
貫してβサイケはデキストリンを主成分として生成し、
しかも、α：β：γの各サイクロデキストリンの生成割
合は１　：　１．７　：　０．６とほぼ一定しているこ
とがわかる。

なお、高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通り
であった。

装　置：東洋ソータ製ＨＬＣ−８０３ Ｄ型 カラム：ハイ／ヘー　ＮＨ−２ 溶　媒ニアセトニトリル：水＝７０：３０流　速＋１ｍ
ｌ／ｍｉｎ 検出基：ＲＩ ＹＶｉ！４　糖転移作用（その１） バレイショ厳粉２０ｇを、０．０２Ｍの塩化カルシウム
を含む０．１　Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐｌ　５．
８．８０１に分散させ、本発明酵素の８，０００単位に
相当する酵素液を加え、８０°Ｃにて液化させ、さらに
グラニユー糖２ｏｇを液化液に溶解し、８０℃にて４８
時間反応させた。反応前後の高速液体クロマトグラフィ
ーによる分析結果を第７図に示す。反応前後のシューク
ロース分析から、７４％のシュークロースに糖転移して
いることが認められた。なお、この反応物の固形分当り
のＤＥは、０．８９であった。また、反応物中にはサイ
クロテキストリンの存在が認められなかった。これらの
結果から、本発明酵素の作用」−の特徴として、反応組
成中に糖転移受容体が存在する場合は、サイクロデキス
トリンが生成せｒ糖転移反応が進行し、しかも、還元糖
の生成がほとんど見られないことを特記できる。

実験５　糖転移作用（その２） ステビオサイド２０ｇとデキストリン２０ｇとを０．０
２　Ｍの塩化カルシウムを含む０．１Ｍの酢酸すトリウ
ム緩衝液（Ｐ８５．８）　８０　ｍｌ中に溶解ネせ、本
発明酵素の８，０００単位に相当する酵素液を加えてｓ
ｏ’ｃにて２４時間反応させた。反応前後での高速液体
クロマトグラフィーによるステビオサイドの分析結果を
第８図に示す。この結果から、ステビオサイドに糖転移
していることが認められる。

以−１二説明したように１本発明によれば、産業−ヒ信
用なβ−サイクロデキストリンを雑菌汚染の恐れなしに
工業的に生産することができるので、産業−ヒ多犬の寄
与を果しうる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明による酵素の至適ｐＨ範囲を示すグラ
フ、第２図は、本発明酵素の安定ＰＨ範囲を示すグラフ
、第３図は、本発明酵素の至適ｐＨｔｉ囲を示すグラフ
、第４図は本発明酵素の安定温度範囲を示すグラフ、第
５図は、本発明に係るバチルス串ステアロサーモフィラ
ス　５Ｅ−４株の１菌体の電子顕微鏡写真（Ｘ１３，４
００）、第６図は、本発明酵素によるサイクロデキスト
リンの生産状況を示す高速液体クロマトグラム、第７図
は、ショ糖に対する本発明酵素の作用を示す高速液体ク
ロマトクラム、第８図は、ステビオサイドに対する本発
明酵素の作用を示す高速液体クロマトグラムである。 第　４団 第３閉 （％） Ｉ！Ｉ＋！１σ 第　５　図 ’ｉｌＬ子顕微鏡写真（ｘ　１３，４００）第　６　図 １１［） ６１１ ８１１ ｃ　ｌ１ｌｉＶ、＞、ｙ＜（％） 第　７　図 第　８　図 反応後 一丁・糸先、？ｒｌｊ　ｉＥ書（自発）１　・１汁１の
表示 １１（（和５８年１２月２Ｈ付提出の特許願（出願番号
未着）２　発明の名称 １Ｉｌ１４熱性サイクロデキストリン・グリコジルトラ
ンスフエラー住　所　広島県福１１１市桜馬場町２番２
８号名　称　池１［１糖化王業株式会社 イし名水）　］二　植刃 ４代理人 ５　補１１命令の「１伺　な　し ６、袖１１により増加する発明の数　０７、袖１１の対
象 （１）　明細、Ｉシの［特Ａ’ｌ’ＪＩ求の範囲」の欄
（２）明＊ｌｌ　’＋！−＝の「発明の詳細な説明」の
欄（３）明細潟の「図面のｆｌｉ１中な説明」の欄（１
）図面の「第２１＜」、「第３図」及び「第４図」８　
抽１１の内容 （１）明細Δの「特許請求の範囲」を別紙のとおりにＣ
りめる。 （２）明細書、第３ページ、下から６〜７行目：ｒＣＧ
Ｔ−ａｓｅｉＤｍとを用いて、」とあるのを「ＣＧＴ−
ａｓ旦ヱ用いて、」と収める。 （３）同、嬉６−ζ−シ、１０行目：［９Ｊ析したとこ
ろ３．　ｏ−、Ｊとｌ・るｄ４％［カ析したとこ５ｏ−
’、ＪとＣりめる。 り４）同、菓８ページ、１行目、［至適ｐ８６．０付近
」とあるのを「ユｊ１と杜は遥工目１近」とＣ９める。 （５）同、同ベージ、下から４行目＝ｒ本酵素は７０°
Ｃまて」とあるのを「本醇素ｔ」Σ旦℃まで」と改める
。 （６）同、Ｍ１０ページ、下から６〜７行目二［良好で
ある。１２〜２４時闇」とあるのをｒ更好二支ｋ””Ｃ
２土？ア？Ａ粒皿」とＣハ′、る。 （７〉　同、菓１２ページ、４行目：「セラチン涌出を
」とあるのを「（ラチン濠化を」と改める。 （８）同、第２２ページを別葉のとおりにＣめる。 （９ン　同、第２６−−−シ、下刃・らＯ〜７行目：［
ステヒオリ−１′１・１．二塘転移しζいる」とあるの
を［ステヒ１１．１Ｉ−１′［・の７８％且璃敷移旦ヌ
入と４１どｄりめる。 （９〕　同、泥２７ペーン、３行目：「至適ｐ　＋−１
範囲」とあるのを「至適温度靴囲」と改める。 り１０）同、同ページ、９行目：［状況を示ジー高速、
ル体りロフトジラム、第７図は、」とあるのを「状況を
示すクラ２、第７図は、」とｄりめる。 （１１）図面の第２〜第４図を添付訂正図面のとおり補
正する。 ８　）禿イ」書類の目１↑ （１）別　紙　１通 （２）　明卸１書の第２２頁　１通 （３）訂正図面　１通 ［別　紙コ 「２、特許請求の範囲 （１］　作用適温が７５〜８０°Ｃである耐熱性サイク
ロテキストリン・グリコジルトランスフェラーゼ。 ［２］藪粉に作用させたとき主生産物としてβ−サイク
ロテキス）・リンを生産する４￥許請求の範囲第１項記
載の酵素。 ［３）　下記の酵素学的特性を有する特許請求の範囲第
１項又は第２項記載の耐熱性サイクロデキストリン・グ
リコジルトランスフェラーゼ：■　基質特異性：可溶性
澱粉、バレイショ藪粉、アミロース、デキストリン、ト
ウモロコシ６没粉又はコムキＶ粉に作用。 （リ　作用にの特異性：■の基質に作用してβ−サイク
ロデキストリンを主に生産。 （明　至適作用ｐＨ：　６付近 （４）　安定ＰＨ範囲・６〜９５ （５）　全通作用温度ニア５〜８０°Ｃ空　安定温度：
５０°Ｃ迄、但゛し、カルシウム（２Ｘ１０　Ｍ）の共
存により安定温度限界が２０°ｃ　−Ｉ　Ｘ。 出　沈−降係数：　Ｓ２ｏ、　＝　６．６２３四分子！
ｉｌ　、超遠心沈降平衡法にて７９，０００ＳＤＳ電気
泳動法にてａｏ、ｏｏ。 １　等′重点＝６６ １４１　バチルス・ステアロサーモフィルス　ＳＥ４株
の生産する特許請求の範囲第１項から第３ｒｎのいずれ
かに記載の酵素。 １５１　バチルス属に属する中等度（ｌ−ｆ熱細菌を培
養して耐熱性サイクロデキストリン・グリコジルトラン
スフェラーゼを１１ｆ、生させることを特徴とする耐熱
性サイクロデキストリン・グリコジルトランスフェラー
ゼの製造方法。 １６１　バチルス属に属する中等度好熱細菌が、バチル
ス・ステアロサーモフィルス　ＳＥ４株である’４ｈ訂
請求の範囲第５項記載の製造方法。」表１ （以下余白） 第３図 温度

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）　作用適温が７５〜８０℃である耐熱性サイクロ
   デキストリン・グリコジルトランスフェラーゼ。 （２］藪粉に作用させたとき主生産物としてβ−サイク
   ロデキストリンを生産する特許請求の範囲第１項記載の
   ｅｆＪ素。 ［３］　下記の酵素学的特性を有する特許請求の範囲第
   １項又は第２項記載の耐熱性サイクロデキストリンφグ
   リコジルｉ・ランスフェラーゼ；（’Ｈ）、！ｑ質特異
   性：可溶性澱粉、バレイショ藪粉、アミロース、テキス
   トリン、Ｉ・ウモロコシ澱粉又はコムギ澱粉に作用。 （？）　作用−］二の特異性：■の基質に作用してβ−
   サイクロデキストリンを主に生産。 ■　至適作用ｐＨ：　６伺近 ■　安定ＰＨ範囲：６〜９５ （φ　至適作用温度ニア５〜８０°Ｃ （コ）　安定温度ニア０°Ｃ迄、但し、カルシウム（２
   Ｘ１０　Ｍ）の共存により安定温度限界か２０８Ｃ、Ｊ
   −’ｊｔ０ ■　沈降係数；　ｓ２ｏ、　＝　６．６２３■分子址：
   超遠心沈降平衡法にて７９，０００ＳＤＳ電気泳動法に
   て８０．０００ ■等電点：６．６ １４１　へチルス魯ステアロサーモフィルス　ＳＥ４株
   の生産する特許請求の範囲第１項から第３項のいずれか
   に記載の酵素。 １５１　バチルス属に属する中等度好熱細菌を培養して
   耐熱性サイクロデキストリン壷グリコジルトランスフェ
   ラーゼを産生させることを特徴とする耐熱性サイクロデ
   キストリン・グリコジルトランスフェラーゼの製造方法
   。 １６’ｌ　バチルス属に属する中等度好熱細菌か、ハチ
   ルス・ステアロサーモフィルス　ＳＥｄ株である特許請
   求の範囲第５項記載の製造方法。