KR0140244B1 - 사이클로덱스트린 생성효소 및 그를 생산하는 미생물 - Google Patents

사이클로덱스트린 생성효소 및 그를 생산하는 미생물

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KR0140244B1 KR1019950000121A KR19950000121A KR0140244B1 KR 0140244 B1 KR0140244 B1 KR 0140244B1 KR 1019950000121 A KR1019950000121 A KR 1019950000121A KR 19950000121 A KR19950000121 A KR 19950000121A KR 0140244 B1 KR0140244 B1 KR 0140244B1
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Abstract

본 발명은 내열성 사이클로덱스트린 글루카노트란스퍼라제를 생산하는 신규한 미생물인 바실러스 스테아로터모필러스 ET101, 전기 미생물이 생산하는 반응최적온도가 적절하게 높은[효소의 불활성화가 용이한 범위내] 신규한 사이클로덱스트린 글루카노트란스퍼라제 및 전기 효소를 이용하여 사이클로덱스트린을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 신규한 사이클로덱스트린 생성효소에 의한 사이클로덱스트린 제조방법은, 반응 중 효소를 다시 보충첨가하는 문제점을 해결함과 동시에, 전분의 사이클로덱스트린으로의 전환율을 증가시킬 수 있음은 물론, 반응온도가 높아짐에 따른 사이클로덱스트린의 생성속도의 향상을 이룰 수 있고 높은 반응온도에서 사이클로덱스트린을 생산함으로써, 제조시 미생물의 오염을 방지할 수 있다는 효과가 있다.

Description

사이클로덱스트린 생성효소 및 그를 생산하는 미생물
제1도는 토양에서 분리한 본 발명의 바실러스 스테아로터모필러스 ET101(Bacillus stearothermophilus ET101)의 전자현미경사진이다.
제2도는 사이클로덱스트린 생성효소의 SDS-PAGE 및 등전점 분석결과를 나타내는 사진이다.
제3도는 사이클로덱스트린 생성효소의 온도특성을 나타내는 그래프이다.
제4도는 사이클로덱스트린 생성효소의 온도안정성을 나타내는 그래프이다.
제5도는 사이클로덱스트린 생성효소의 pH 특성 및 안정성을 나타내는 그래프이다.
제6도는 본 발명의 사이클로덱스트린 생성효소를 가지고 제조된 사이클로덱스트린의 HPLC 크로마토그램이다.
제7도는 본 발명의 사이클로덱스트린 생성효소를 가지고 제조된 사이클로덱스트린의 얇은막 크로마토그램(TLC)이다.
제8도는 본 발명의 사이클로덱스트린 생성효소를 이용한 전분의 액화 후, 시간별 사이클로덱스트린 생성비율을 나타내는 그래프이다.
제9(a)도는 본 발명의 사이클로덱스트린 생성물에 베타-아밀라제(β-amylase)를 반응시키기 전의 크로마토그램이다.
제9(b)도는 본 발명의 사이클로덱스트린 생성물에 베타-아밀라제(β-amylase)를 반응시킨 후의 크로마토그램이다.
제10도는 본 발명의 사이클로덱스트린 생성물에 베타-아밀라제(β-amylase)를 반응시켰을 때의 얇은막 크로마토그램(TLC)이다.
(발명의 상세한 설명)
본 발명은 신규한 사이클로덱스트린 생성효소 및 그를 생산하는 미생물에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 사이클로덱스크린 생성효소인 신규한 내열성 사이클로덱스트린 글루카노트란스퍼라제를 생산하는 미생물인 바실러스 스테아로터모필러스 ET101(Bacillus stearothermophilus ET101), 그로부터 분리한 사이클로덱스트린 생성효소 및 전기 사이클로덱스트린 생성효소를 이용한 사이클로덱스트린의 제조방법에 관한 것이다.
사이클로덱스트린(cyclodextrin)은 1891년 빌리어(Villier)에 의해 처음 발견된 포도당의 중합체로서, 6개 이상의 포도당이 알파-1,4-글루코사이크결합(α-1,4-glucoside linkage)을 이룬 환상의 올리고당이다. 특히, 6,7,8개의 포도당으로 이루어진 것을, 각각 알파-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin), 베타-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin), 감마-사이클로덱스트린(γ-cyclodextrin)이라고 한다(이하, 본 발명에서 사이클로덱스트린이라 함은, 알파-, 베타-, 감마-사이클로덱스트린 및 그들의 혼합물을 일컫는다).
사이클로덱스트린은 소수성 물질을 포접할 수 있는 공동(空洞)을 가지고 있어서, 식품, 의약, 농약 및 향료 등에서 휘발성 물질의 안정화, 고미(苦味)의 제거, 불용성 물질의 가용화 및 색깔의 안정화 등의 목적으로 이용되는 매우 유용한 물질로 알려져 있다.
사이클로덱스트린은 전분에 사이클로덱스트린 생성효소인 사이클로덱스트린 글루카노트란스퍼라제(cyclodextrin glucanotransferase, EC 2.4.1.19., 이하 편의상 CGTase라 함) 및/또는 그의 생산미생물을 반응시켜 제조하며, 일반적으로 전분을 액화효소로서 액화시킨 다음, 사이클로덱스트린을 수득하는 방법에 의해 제조된다.
그러나, 이 방법은 사이클로덱스트린 이외에 포도당, 맥아당 및 올리고당 등의 부산물이 다량 생성되므로서, 다음과 같은 단점을 갖게 된다:첫째, 사이클로덱스트린의 생성율이 낮으며; 둘째, 고순도의 사이클로덱스트린을 제조하기 위해서 반응생성물을 정제하여야 하고; 셋째, 수용액중에 사이클로덱스트린 이외의 카보닐그룹(알데히드기 또는 케톤기)을 갖는 덱스트린이 존재하게 되는 경우, 이들 성분이 아미노 카보닐 반응을 일으켜 최종 제품의 품질을 손상시키며; 넷째, 사이클로덱스트린 이외의 부산물은 단맛을 내므로 그 사용이 제한된다. 따라서, 당업계에서는 부산물이 적은 사이클로덱스트린을 효율적으로 제조하는 방법을 개발하여야 할 필요성이 절실히 요구되어 왔다.
일본국 특허공고 소화 제46-2380호에서는 기질전분의 D.E.(dextrose equivalent)를 15 이하로 처리하는 방법이 제안되었으며, 일본국 특허공개 소화 제52-25043호에서는 사이클로덱스트린 글루카노트란스퍼라제를 액화효소로 이용하는 방법을 사용하여, 사이클로덱스트린의 생성율을 높이는 방법이 제안되었다. 또한, 열처리 전분 또는 생전분으로부터 사이클로덱스트린을 제조하는 방법도 알려져 있다(참조:대한민국 특허출원 제93-20680호, 제93-26531호).
그러나, 전기 종래의 각 사이클로덱스트린 제조방법의 경우, 사이클로덱스트린 제조시 반응온도가 높기 때무네, 60℃ 이상에서 열안정성이 결여된 종래의 사이클로덱스트린 생성효소로는 원하는 결과를 얻기 힘들었음은 물론, 65℃ 이상에서 열안정성을 가져야 한다는 결정적인 문제점이 노출되어 왔다(참조:대한민국 특허출원 제93-26531호, 일본국 특허공개 소화 제52-25043호).
이에, 대한민국 특허공개 제88-701730호에서는 써모안에어로박터종(Thermoanaerobacter sp.) 또는 써모안에어로븀종(Thermoanaerobium sp.)을, 대한민국 특허공고 제91-2852호에서는 바실러스 코아굴란스종(Bacillus coagulans sp.)을, 대한민국 특허공고 제92-6397호, 일본국 특허공고 소화 제53-27791호 및 일본국 특허공개 소화 제60-120984호에서는 바실러스 스테아로터모필러스종(Bacillus stearothermophilus sp.)을 기원으로 하는 내열성 사이클로덱스트린 생성효소를 개시하고 있다.
그러나, 대한민국 특허공개 제88-701730호의 사이클로덱스트린 생성효소는 내열성이 매우 강하기 때문에, 효소의 반응후 효소를 불활성화 시키기 어려운 단점이 있으며, 대한민국 특허공고 제91-2852호 및 제92-6397호, 일본국 특허공고 소화 제53-27791호 및 일본국 특허공개 소화 제60-120984호의 사이클로덱스트린 생성효소는 75℃ 이하에서 최대의 활성을 나타내는 단점이 있었다. 또한, 일본국 특허공개 소화 제52-25043호의 방법에 의한 사이클로덱스트린의 제조는, 사이클로덱스트린 생성효소에 의해 전분을 액화한 다음, 반응최적온도로 온도를 하강시키고, 여기에 다시 사이클로덱스트린 생성효소를 보충 첨가해야 하는 문제점이 있었다.
이에, 본 발명의 발명자들은 신규의 사이클로덱스트린 생성효소를 생산하는 미생물을 토양으로부터 분리하고, 이 미성물이 생산하는 효소의 특성을 규명한 결과, 종래의 사이클로덱스트린 생성효소보다 반응최적온도가 적절하게 높은(효소의 불활성화가 용이한 범위내의) 효소임을 확인하였다. 또한, 이 효소를 사용하여 사이클로덱스트린을 제조할 경우, 종래의 제조방법의 문제점들을 해결할 수 있다는 것을 확인하였다. 그리하여, 본 발명의 미생물을 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 따라 동정하여 본 결과, 바실러스 스테아로터모필러스종(Bacillus stearothermophilus sp.)임을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 첫번째 목적은, 내열성 사이클로덱스트린 글루카노트란스퍼라제를 생산하는 신규한 미생물인 바실러스 스테아로터모필러스 ET101(Bacillus stearothermophilus ET101)를 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 목적은, 전기 미생물이 생산하는 반응최적온도가 적절하게 높은(효소의 불활성화가 용이한 범위내) 신규한 사이클로덱스트린 글루카노트란스퍼라제를 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 목적은, 전기 효소를 이용하여 사이클로덱스트린을 제조하는방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 미생물의 분리와 동정실험, 분리된 미생물로부터의 효소의 정제와 특성, 및 정제된 효소를 이용한 사이클로덱스트린의 제조와 분석으로 나누어 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
Ⅰ. 미생물이 분리 및 동정
본 발명의 미생물은 토양으로부터 55℃에서 생육이 가능하며 전분의 가수분해능력이 있는 균을 전분이 포함된 LB배지에서 요오드 탈색방법으로 1차 선별한다. 1차 선별된 균들의 배양액을 조효소액으로 하고, 4% 가용성 전분용액을 기질로 하여 반응시킨 다음, 페놀프탈레인 변색법을 이용하여 사이클로덱스트린의 생성여부를 확인하는 방법으로 2차 선별한다. 이와 같이 선별된 미생물은 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 따라 동정하여, 바실러스 스테아로터모필러스종(Bacillus stearothermophilus sp.)임을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 미생물을 바실러스 스테아로터모필러스 ET101(Bacillus stearothermophilus ET101)로 명명하고, 1994년 12월 29일, 한국과학기술연구원 부설 유전공학연구소 유전자은행(대한민국 대전직할시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 KCTC 0144BP로 기탁하였다.
Ⅱ. 효소의 정제 및 특성
분리된 본 발명의 미생물은, 전분 4%를 함유하는 SH배지에 50℃ 24시간 배양한 다음, 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 상등액을 황산암모니움으로 분획한다. 그런 다음, Q-Sepharose 및 Mono Q 컬럼크로마토그래피를 통과시켜 효소를 정제하며, 정제된 효소의 순도검정은 SDS-PAGE 전기영동법으로 확인한다. 4% 전분용액 1ml에 효소를 첨가하여 역가를 측정하므로서 효소의 반응최적온도, 열안정성 및 pH 특성을 확인한다. 본 발명의 효소는 분자량 66,800달톤, 등전점 pI 5.0, 반응최적온도 80℃ 및 반응최적 pH 6.0 내지 7.0의 특성을 가지고 있는 것으로 확인되었다.
Ⅲ. 효소를 이용한 사이클로덱스트린의 제조 및 분석
본 발명의 효소를 전분에 첨가하여 호화개시온도에서, 30분간 액화하는 다음, 60℃로 온도를 낮춘 상태로 반응시켜, 사이클로덱스트린을 제조한다. HPLC 및 얇은 막 크로마토그래피로 분석을 하여 사이클로덱스트린 생성을 확인한다. 반응 1시간 후 44%의 사이클로덱스트린이 제조되었고, α-, β-, γ-사이클로덱스트린 각각의 비율은 1.7:3.2:1이었다.
본 발명의 미생물 및 그로부터의 사이클로덱스트린 생성효소에 의한 사이클로덱스트린 제조방법은:첫째, 효소의 최적반응 온도가 높아짐에 따라, 전분의 액화시에도 본 발명의 효소의 이용이 가능하기 때문에, 액화 후, 효소를 다시 보충첨가하는 문제점을 해결함과 동시에, 전분의 사이클로덱스트린으로의 전환율을 증가시킬 수 있으며; 둘째, 반응온도가 높아짐에 따른 사이클로덱스트린의 생성속도의 향상을 이룰 수 있고; 및, 셋째, 높은 반응온도에서 사이클로덱스트린을 생성하므로, 제조시 미생물의 오염을 방지할 수 있는 효과가 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1:사이클로덱스트린 생성효소를 생산하는 미생물의 분리 및 동정
토양을 채취하여 증류수에 현탁한 후, 희석하여 LB 아가 배지위에 도말하였다. 이것을 55℃에서 배양시킨 다음, 생육하는 콜로니를 1차 선별하였고, 1차 선별된 미생물을 4% 전분이 함유된 LB배지에서 배양하였다.그런 다음, 원심분리하여 균체를 제거한 배양액을, 능금산(malate)-NaOH 완충용액(pH 6.0)으로 제조한 4% 가용성 전분과 반응시키고 수산화나트륨용액과 페놀프탈레인 용액을 첨가하여 페놀프탈레인의 붉은 색을 탈색하는 미생물을 2차 선별하였다. 선별된 미생물은 자동미생물동정기(VITEK SYSTEMS, Biomerieux Vitec Inc., USA)와 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 수록되어 있는 일반 미생물 동정법에 따라 동정하였다.
하기 표 1에는 본 발명의 미생물과, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 수록되어 있는 바실러스 스테아로터모필러스(Bacillus stearothermophilus)의 특성을 비교하여 나타내었다. 하기 표 1의 결과로부터, 본 발명의 미생물은 바실러스 스테아로터모필러스종(Bacillus stearothermophilus sp.)으로 확인되었는 바, 바실러스 스테아로터모필러스 ET101(Bacillus stearothermophilus ET101)로 명명하고, 1994년 12월 29일, 한국과학기술연구원 부설 유전공학연구소 유전자은행(대한민국 대전직할시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 KCTC 0144BP로 기탁하였다.
제1도는, 본 발명에서 선별된 바실러스 스테아로터모필러스 ET101의 전자현미경 사진을 나타낸다. 본 발명의 바실러스 스테아로터모필러스 ET101균주는 크기가 1.05 내지 2.6㎛인 간균으로, 운동성이 있으며 65℃의 고온에서 생육이 가능하였다.
*:Bacillus stearothermophilus의 공시균주로서 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 개시된 것임.
(ND:활용할 데이타 없음, d:11 내지 89%의 균주가 양성반응)
실시예 2:사이클로덱스트린 생성효소의 생산 및 정제
본 발명의 바실러스 스테아로터모필러스 ET101균주를 4% 가용성 전분이 포함된 SH배지에 접종하여, 50℃에서 24시간 배양한 다음, 원심분리하여 상등액을 얻었다. SH배지의 조성은 하기 표 2에 나타내었으며, 배양조건은 온도 50℃, 24시간이었다. 상등액을 황산암모니움으로 분획한 다음, 컬럼 크로마토그래피로서 Q-Sepharose 및 Mono Q 컬럼을 통과시켜 효소를 정제하였다. 정제된 효소의 순도검정 및 등전점 확인을 위하여 SDA-PAGE 전기영동 및 등전점 분석을 실시하였다(참조:제2도). 그 결과, SDS-PAGE 전기영동에서는 분자량 66,800달톤의 단일밴드를 얻었으며, 등전점 분석결과는 pH 5.0이었다.
실시예 3:사이클로덱스트린 생성효소의 반응최적온도 및 열안정성
순수하게 분리정제된 효소의 반응최적온도를 측정하기 위하여, 4% 가용성 전분을 50mM 능금산-NaOH 완충용액(pH 6.0)에 용해시킨 다음, 1ml를 취하여 효소를 첨가하고 각각의 온도에서 10분간 반응시킨 후 역가를 측정하였다. 제3도에 나타낸 바와 같이. 본 발명의 효소의 반응최적온도는 80℃이며, 대략 65℃ 내지 85℃의 범위에서 높은 효소활성을 확인하였다.
또한, 효소의 열안정성을 측정하기 위하여 50mM 능금산-NaOH 안충용액(pH 6.0)에 효소를 가하였다. 그런 다음, 각각의 온도에서 방치시간을 달리하고, 빙수조로 옮겨 남아있는 역가를 측정하였다. 이때, 효소 1U는 1분 동안, 1mg의 β-사이클로덱스트린을 생성하는 효소의 양으로 정의되었다(참조 제4도). 제4도에서, (-▼-), (-●-),(-◆-) 및, (-▲-)는 부분 정제된 효소;(-○-), (-大-) 및 (-□-)는 15mM의 CaCl2를 첨가한 효소를 각각 나타낸다. 제4도에서 보듯이, 온도 60℃에서 60분 동안에는, 최초 효소역가의 90% 이상이 남아 있었으며, 70℃에서도 CaCl2존재시 60분 동안, 최초 효소역가의 90% 이상이 남아 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 사이클로덱스트린 생성효소는 60 내지 70℃ 범위내에서 안정한 효소활성을 유지한다는 것을 알 수 있었다.
[실시예 4]
사이클로덱스트린 생성효소의 pH 특성
본 발명의 효소의 pH에 대한 영향을 측정하기 위하여, 구연산 완충 용액(pH 5.0), 인산염 완충용액(pH 6.0), Tris-HCl 완충용액(pH 7.0), Tris-HCl 완충용액(pH 8.5), 글라이신-NaOH 완충용액(pH 10.5)를 사용하여 각 pH에서의 효소의 역가와 pH 안정성을 측정하였다.
제5도에서 보듯이, 본 발명의 효소의 반응최적 pH는 6.0이였으며, pH 안정성의 경우에는 pH 6.0 내지 8.0의 범위에서 최초효소역가의 90% 이상의 활성을 나타내었다.
실시예 5:사이클로덱스트린 생성효소를 이용한 사이클로덱스트린의 제조
13% 옥수수 전분을 능금산-NaOH 완충용액(pH 6.0)에 용해시키고 본 발명의 효소를 4.27U/g-기질로 첨가하여, 90℃에서 30분간 액화시킨 다음, 이어서 60℃로 온도를 내려 반응을 유지하였다. 제6도에는, 제조된 사이클로덱스트린을 HPLC로 분석한 결과를 나타내며, 제7도에는, 얇은 막 크로마토그래피(TLC)로 분석한 결과를 나타낸다. 제7도에서 S레인은 표준물질마커로서, G1, G2, G3, G4 및 G5는 각각 포도당, 맥아당, 말토트리오스(maltotriose), 말토테트라오스(maltotetraose) 및 말토펜타오스(maltopentaose)를 나타내며; 0, 1, 2, 3, 4레인은 각각 0, 1, 2, 3, 24시간의 반응 이후에 생성된 사이클로덱스트린을 나타내고; α, β, γ레인은 각각 α-, β-, γ-사이클로덱스트린의 표준물질을 나타내고; 및, 우측의 1, 2, 3, 4레인은 각각 가용성 전분 1%를 기질로 1,2, 3, 24시간의 반응 후에 생성된 사이클로덱스트린을 나타낸다. 반응시간별로, 각 사이클로덱스트린의 생성을 확인한 결과, 반응 1시간 후에 옥수수전분으로부터 44%의 사이클로덱스트린 전환율을 확인하였고(참조:제8도), 이때, α-, β-, γ-사이클로덱스트린 각각은, 1.7:3.2:1의 비율로 생성되었다. 비환원성 말단에 작용하는 효소인 β-아밀라제(β-amylase, Barly)를 산물에 처리하여 본 결과, 아무런 분해도 일어나지 않으므로서, 비환원성 말단이 없는사이클로덱스트린임이 확인되었다(참조:제9(a)도, 제9(b)도 및 제10도), 제9(a)도 및 제9(b)도는 각각 제조된 사이클로덱스트린에 β-아밀라제를 처리하기 전과 후의 크로마토그램으로, 피크(peak) 1번은 글루코스, 피크 2번은 말토오스, 피크 3번은 말토트리오스, 피크 4번은 α-사이클로덱스트린, 피크 5번은 β-사이클로덱스트린 및 피크 6번은 γ-사이클로덱스트린을 각각 나타낸다. 제10도는 제조된 사이클로덱스트린산물에 β-아밀라제를 반응시켰을 때의 얇은막 크로마토그램 사진으로서, 제1레인의 G1, G2, G3, G4 및 G5는 각각 포도당, 맥아당, 말토트리오스, 말토테트라오스 및 말토펜타오스를 나타내고, 레인 A는 β-아밀라제를 처리하기전, 레인 B는 β-아밀라제를 처리한 후의 크로마토그램을 각각 나타내며; 및, α, β, γ레인은 각 α-, β-, γ-사이클로덱스트린의 표준물질을 나타낸다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 내열성 사이클로덱스트린 글루카노트란스퍼라제를 생산하는 신규한 미생물인 바실러스 스테아로터모필러스 ET101, 전기 미생물이 생산하는 반응최적온도가 적절하게 높은(효소의 불활성화가 용이한 범위내) 신규한 사이클로덱스트린 글루카노트란스퍼라제 및 전기 효소를 이용하여 사이클로덱스트린을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 신규한 사이클로덱스트린 생성효소에 의한 사이클로덱스트린 제조방법은, 반응 중 효소를 다시 보충첨가하는 문제점을 해결함과 동시에, 전분의 사이클로덱스트린으로의 전환율을 증가시킬 수 있음은 물론, 반응온도가 높아짐에 따른 사이클로덱스트린의 생성속도의 향상을 이룰 수 있고 높은 반응온도에서 사이클로덱스트린을 생산하므로서, 제조시 미생물의 오염을 방지할 수 있다는 효과가 있다.

Claims (3)

  1. 내열성이 우수한 사이클로덱스트린 글루카노트란스퍼라제를 생산하는 바실러스 스테아로터모필러스 ET101(Bacillus stearothermophilus ET101)(KCTC 0144BP).
  2. 하기와 같은 생화학적 특성을 나타내는, 제1항의 바실러스 스테아로터모필러스 ET101(KCTC 0144BP)로부터 수득한 사이클로덱스트린 글루카노트란스퍼라제: ⅰ) 분자량:66,800달톤; ⅱ) 등전점:pI 5.0; ⅲ) 반응최적온도:65℃ 내지 85℃; 및, ⅳ) pH 안정성:pH 6.0 내지 8.0.
  3. 전분을 호화개시온도 이상에서 추가의 사이클로덱스트린 생성효소 첨가없이 제2항의 사이클로덱스트린 글루카노트란스퍼라제와 반응시키는 공정을 포함하는 사이클로덱스트린의 제조방법.
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