JPH0759559A - オリゴ糖の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 α−１→３結合を分子内に含むニゲロース等
のオリゴ糖を大量かつ安価に供給する。 【構成】 Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属し、選択的にα
−１→３結合をもたらす糖転移酵素の１種または２種以
上を生産する能力を有する真菌を好気的に培養し、培養
物中の該糖転移酵素を蓄積せしめ、これを採取すること
を特徴とする糖転移酵素の製造法。真菌の例は、Ａｃｒ
ｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．Ｓ４Ｇ１３（ＦＥＲＭ ＢＰ−
４３７３）。 【効果】 本発明の糖転移酵素を、α−１→４グルコシ
ド結合したポリサッカライドまたはオリゴサッカライド
を含む基質に作用させると、α−１→３結合を分子内に
含むニゲロース等のオリゴ糖が高生産率で生成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規糖転移酵素を産生す
る新規な真菌を提供するものである。さらに本発明は、
菌体の並存した状態で或いは存在しない状態で、澱粉及
びその分解物の中から選ばれた基質の非還元末端グルコ
ース部の３位に、グルコース単位をα−１→３結合する
新規な酵素に関する。本酵素はまた、基質にα−１→３
結合をもたらした後に、当該α−１→３結合を保持した
まま近接するα−１→４結合を切断して、得られたオリ
ゴ糖を低分子化する活性をも有する。さらにまた本発明
は、該酵素の調製法並びにそれを用いた、α−１→３結
合を分子内に含むニゲロース［３−Ｏ−α−Ｄ−グルコ
ピラノシルグルコース］等のオリゴ糖の製造法に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】オリゴ糖はその構成単糖、結合様式及び
立体構造に応じ、従来から甘味料、医薬品、酵素の検定
用基質、あるいは種々の薬品中間体などの用途に使用さ
れている。天然のものに加え、これまでマルトオリゴ
糖、イソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクト
オリゴ糖、カップリングシュガー等のオリゴ糖が開発さ
れてきた。特にイソマルトオリゴ糖、カップリングシュ
ガー等は、糖転移反応で生成するオリゴ糖であり、前者
はトランスグルコシダーゼによるα−１→６結合のグル
コオリゴ糖、後者はサイクロデキストリン合成酵素（CG
Tase）によるα−１→４結合のマルトオリゴシルシュク
ロース等を主成分としている。

【０００３】オリゴ糖を含む糖質は、食品中の最も重要
な栄養素として、また食生活に不可欠な甘味料として広
く利用されてきた。甘味料のみに着目するとしても、砂
糖等のオリゴ糖は自然な味質のため各種人工甘味料に比
べ圧倒的シェアを有している一方、資化され易く肥満原
因になり、血糖値上昇につながる等の問題も指摘されて
いる。最近、前記したα−１→４及びα−１→６結合の
オリゴ糖が砂糖に比べ低カロリー食品であるとして利用
されつつあるが、いずれもまだ資化され易く十分なもの
ではない。

【０００４】一方これらに代わり、例えばニゲロース、
ニゲロシルグルコース［３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノ
シルマルトース］等のα−１→３結合を分子中に有する
ニゲロオリゴ糖を新しい機能性甘味料・食品素材または
医薬品用途に活用する可能性が探索されつつある。しか
しながらこれを可能とするには、この種のオリゴ糖の大
量調製法の開発が不可欠である。

【０００５】α−１→３結合のオリゴ糖は、天然には極
く微量にしか存在しない。その上、一般に利用可能な基
質からこれを酵素的又は化学的に取得しようとしても、
公知のα−グルコシダーゼによる縮合・転移反応では極
く僅かしか生成しない（フジモト，Ｈ．，ニシダ，Ｈ．
及びアジサカ，Ｋ．：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，５２，１３４５−，１９８８）。麹カビAspergil
lus oryzaeの酵素により、マルトースからニゲロースが
得られた旨の学術報告はあるものの、その生成量は少な
く実用上の価値は小さい。僅かに、α−１→３及びα−
１→４結合を有するElsinoe 属微生物産生の特殊な多糖
（エルシナン）を、α−アミラーゼで酵素分解して調製
した例（特開昭５５−１９００４）が見られる程度であ
る。しかし、この方法では原料となる微生物産生多糖が
大量に得られず、α−１→３結合のオリゴ糖を大量に安
価に供給することは困難であった。

【０００６】また、本来α−１→４結合での転移反応を
もたらすCGTaseを用い、澱粉からニゲロースを調製せん
とした例もあるが、通常の５０倍以上の強い条件が必要
であったという（コバヤシ，Ｓ．：食品工業，２０−，
１９８８，特開平３−２２９５８）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】以上のような従来技術
の問題点に鑑み、本発明者らは、選択的にα−１→３結
合の転移反応をもたらす糖転移酵素を探索し、これをα
−１→４グルコシド結合したポリサッカライドまたはオ
リゴサッカライドを含む基質に作用させることにより、
α−１→３結合を分子内に含むニゲロース等のオリゴ糖
を大量かつ安価に供給することを試みた。選択性が重視
されるのは、基質に大量に存在するα−１→４グルコシ
ド結合に作用するようでは、酵素利用効率が極端に低下
するからである。特に、本文中に規定するニゲロオリゴ
糖生成活性とα−グルコシダーゼ活性との比が５×１０
² 以上である、選択性糖転移酵素の提供が望ましい。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、単独で若
しくは菌体とともに選択的にα−１→３結合への転移反
応を触媒するような糖転移酵素を産生する菌を探索した
結果、群馬県の土壌より本目的に適合するＡｃｒｅｍｏ
ｎｉｕｍ属に属するＳ４Ｇ１３株を発見した。本株を好
気的に培養することにより、選択的にα−１→３結合へ
の転移反応を触媒する新規糖転移酵素を生産・蓄積せし
め、これを適当な基質、特にマルトオリゴ糖に作用させ
ると、α−１→３結合を分子内に含むニゲロース等のオ
リゴ糖が高生産率で生成することを見いだし、本発明を
完成した。

【０００９】本発明は、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属
し、α−１→３結合をもたらす糖転移酵素の１種または
２種以上を生産する能力を有する真菌に関する。この目
的には、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属するＳ４Ｇ１３株
が適している。

【００１０】本発明はまた、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に
属し、α−１→３結合をもたらす糖転移酵素の１種また
は２種以上を生産する能力を有する真菌を培養し、培養
物中の該糖転移酵素を蓄積せしめ、これを採取すること
を特徴とする糖転移酵素の製造法である。

【００１１】本発明は、第３に下記の性質を有する糖転
移酵素（１）に関する。

【００１２】（１）２％マルトース０．４ｍｌ及び１０
ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）０．２ｍｌに本酵素
（１Ｕ）を４０℃で作用させると、１時間後に５．０％
のニゲロシルグルコースが、また１２時間後に３．８％
のニゲロース、１８．７％のニゲロシルグルコース及び
３．６％のニゲロシルマルトース［３−Ｏ−α−Ｄ−グ
ルコピラノシルマルトトリオース］が生成する。

【００１３】（２）本酵素は重合度の低いマルトオリゴ
糖、例えばマルトース、マルトトリオース、マルトテト
ラオースによく作用し、重合度の高い可溶性澱粉、アミ
ロース、アミロペクチン、プルラン等には作用しにく
い。また、α，β，γ−サイクロデキストリン等の環状
オリゴ糖やトレハロース、イソマルトース、イソマルト
トリオース、パノース等には作用しない。

【００１４】（３）本酵素は４０℃においてｐＨ７−８
が至適であり、ｐＨ４−１０で安定である。

【００１５】（４）本酵素はｐＨ７において至適温度は
５０−６０℃であり、５５℃では６６％の残存活性を有
する。

【００１６】（５）本酵素は鉄イオン、銅イオン、コバ
ルトイオン、銀イオン、亜鉛イオン、ニッケルイオンに
より阻害される。ＳＤＳ、ＥＤＴＡによっては阻害され
ない。

【００１７】（６）本酵素の分子量はゲル濾過ＨＰＬＣ
で２４００００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで１２８０００と５
３０００である。後者の数字は、このそれぞれの分子量
を有する二つのサブユニットが酵素中に存在することを
示唆する。

【００１８】（７）本酵素の等電点はｐＩ２．７であ
る。

【００１９】本発明は、第４に下記の性質を有する糖転
移酵素（２）に関する。

【００２０】（１）２％マルトース０．４ｍｌ及び１０
ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）０．２ｍｌに本酵素
（１Ｕ）を４０℃で作用させると、１時間後に５．０％
のニゲロシルグルコースが、また１２時間後に３．０％
のニゲロース、１６．４％のニゲロシルグルコース及び
２．３％のニゲロシルマルトースが生成する。

【００２１】（２）本酵素は重合度の低いマルトオリゴ
糖、例えばマルトース、マルトトリオース、マルトテト
ラオースによく作用し、重合度の高い可溶性澱粉、アミ
ロース、アミロペクチン、プルラン等には作用しにく
い。また、α，β，γ−サイクロデキストリン等の環状
オリゴ糖やトレハロース、イソマルトース、イソマルト
トリオース、パノース等には作用しない。

【００２２】（３）本酵素は４０℃においてｐＨ６−８
が至適であり、ｐＨ５−１０で安定である。

【００２３】（４）本酵素はｐＨ７において至適温度は
５０−６０℃であり、５５℃では３９％の残存活性を有
する。

【００２４】（５）本酵素はカルシウムイオン、鉄イオ
ン、銅イオン、マンガンイオン、コバルトイオン、銀イ
オン、亜鉛イオン、ニッケルイオンにより阻害される。
ＳＤＳ、ＥＤＴＡによっては阻害されない。

【００２５】（６）本酵素の分子量はゲル濾過ＨＰＬＣ
で１４００００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで７００００と５３
０００である。ここで第２のサブユニットの分子量が、
糖転移酵素（１）のそれと共通していることは興味深
い。

【００２６】（７）本酵素の等電点はｐＩ３．６であ
る。

【００２７】第５の発明は、α−１→４グルコシド結合
したポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む
基質に、α−１→３結合をもたらす糖転移酵素のうち１
種または２種以上を作用させることを特徴とするオリゴ
糖の製造法に関する。

【００２８】本発明の新規糖転移酵素の生産菌として用
いる真菌は、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属し、所期の性
能を有するものであれば良く、例えば本発明者らが群馬
県の土壌中より単離したＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．
Ｓ４Ｇ１３が挙げられる。

【００２９】本菌の菌学的性質は以下に示す通りであ
る。

【００３０】生育：麦芽寒天培地、ツァぺック培地、オ
ートミール培地、ＰＤＡ培地、ＭＹ培地での生育は緩や
かであり、２０℃１０日間で直径１５−３６ｍｍに達す
る。集落は最初やや黄色味を帯びた白色で、後に淡橙色
を呈する。

【００３１】気生菌糸は直立で盛り上がり、放射しわ状
を呈する。生育ｐＨは４−１０．５で最適ｐＨは中性付
近、生育温度範囲は２０−３５℃で、最適生育温度は２
５−３０℃である。

【００３２】形態：菌糸の直径は０．５−３．０μｍ、
無色で菌糸には隔壁が認められる。

【００３３】分生子：分生子は亜球形（１−２×４−５
μｍ）で、無色、球状に塊る。分生子柄は無色で細長く
先細りし、無分岐あるいは輪生状に菌糸側面より突出し
ている。

【００３４】以上に示した性質を菌類分類法に照合する
と、本菌はＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属しており、本発
明者らは本菌をＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．Ｓ４Ｇ１
３と命名した。本菌は平成５年８月２日付にて工業技術
院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４３７３
として国際寄託されている。前述した如く本発明におい
て使用する真菌は、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属し、か
つまた上述の性能を有するもので有れば良く、Ａｃｒｅ
ｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．Ｓ４Ｇ１３及びその変種・変異種
に限定されるものではない。

【００３５】本菌株を用い本発明の糖転移酵素を得るに
は、培地に菌株を接種し、常法に従い培養すれば良い。
培地中には、資化し得る炭素源及び窒素源を適量含有せ
しめると好ましい。この窒素源及び炭素源については、
特に制限はないが、例えば、コーングルテン、大豆粉、
コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペ
プトン、肉エキス等が挙げられる。

【００３６】一方、炭素源としては、α−１→４グルコ
シド結合を有するポリサッカライドまたはオリゴサッカ
ライド、例えば澱粉やその分解物・加工物やマルトー
ス、マルトオリゴ糖などの資化し得るマルトオリゴ糖が
挙げられる。中でも、マルトース、マルトオリゴ糖が好
ましい。

【００３７】その他に、燐酸、Ｍｇ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｍ
ｎ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ 等の無機塩や、更には無機
・有機微量栄養源を適宜培地中に添加することもでき
る。

【００３８】かくして調製された糖転移酵素の採取及び
精製は常法に準じて行うことができる。即ち、遠心分離
又は瀘過等の固液分離手段により菌体を除去して粗酵素
液とすることができる。また、必要に応じて塩析・有機
溶媒による沈殿処理・限外瀘過等の分離手段により粗酵
素標品を得、更に、例えば各種カラムクロマトグラフィ
ー等の手法を用いることで精製結晶化して、精製酵素と
して使用することも可能である。酵素の精製は各種方法
により行う事ができるが、その一例を示すと次の通りで
ある。

【００３９】製造方法 ４℃の低温下で、５Ｌのコルベン９本による液体培養に
よって得られた培養液を遠心分離後、限外瀘過（１３Ｋ
Ｃｕｔ）により濃縮し、更に２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に透析して、粗酵素液（１５６Ｕ／ｍｌ）６
６ｍｌを調製する。

【００４０】次いで、本粗酵素液を２０ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ７．０）により平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール
カラム（５０ｍｍ内径×１４ｃｍ）に載せ、０．１５→
０．３Ｍ ＮａＣｌでグラジェント溶出する。主要な活
性ピークを回収し、２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）
に透析し、０．１Ｍ ＮａＣｌ−５０ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００
ＳＷ（８ｍｍ×３０ｃｍ）ＨＰＬＣカラムに供し、同緩
衝液で溶出する。

【００４１】上記の方法によりポリアクリルアミドゲル
電気泳動的に単一バンドを示す２つの標品（（１），
（２））を得る事ができる。尚、この標品の回収率はそ
れぞれ１９％，９％で、比活性は粗酵素液からそれぞれ
４０倍、４１倍に上昇した。

【００４２】上述のようにして得られる糖転移酵素
（１）は以下の性質を有する。

【００４３】（１）作用 ２％マルトース０．４ｍｌ及び１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝７．０）０．２ｍｌに本酵素（１Ｕ、活性測定法は
下記（４）に示す）を４０℃で作用させると、１時間後
に５．０％のニゲロシルグルコースが、また１２時間後
に３．８％のニゲロース、１８．７％のニゲロシルグル
コース及び３．６％のニゲロシルマルトースが生成す
る。

【００４４】（２）基質特異性 本酵素は重合度の低いマルトオリゴ糖、例えばマルトー
ス、マルトトリオース、マルトテトラオースによく作用
し、重合度の高い可溶性澱粉、アミロース、アミロペク
チン、プルラン等には作用しにくい。また、α，β，γ
−サイクロデキストリン等の環状オリゴ糖やトレハロー
ス、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース
等には作用しない。

【００４５】（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ 本酵素は４０℃においてｐＨ７−８が至適であり、ｐＨ
４−１０で安定である。ｐＨ値と糖転移活性との関係は
図１に示す如くであり、その測定法は以下の条件で下記
（４）に示す測定法に従った。

【００４６】測定条件：温度４０℃、ｐＨ３．０−６．
０では５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０−８．０では５
０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ９．０−１１．０では５０ｍＭ
グリシン緩衝液を用いた。

【００４７】（４）活性測定法 ２％マルトース０．４ｍｌに対し酵素液を含む２０ｍＭ
燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを加え、４０℃で
１時間反応させた後、グルコアミラーゼ３Ｕを含む１Ｍ
酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）０．１ｍｌを加えて４０℃２
時間反応させ、未反応の基質マルトースをグルコースに
完全分解した。本反応液をＨＰＬＣ分析に供し、上記条
件下で、ピーク面積で１％のニゲロシルグルコースを生
じる酵素濃度を１Ｕ／ｍｌと便宜的に定義した。

【００４８】ＨＰＬＣ測定条件：カラムＡｍｉｎｅｘ
ＨＰＸ−４２Ａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ） カラム温度８０℃ 移動相脱気純水０．６ｍｌ／ｍｉｎ 検出器ＲＩ （５）至適温度と温度安定性 至適温度は各温度で上記（４）に従って活性を測定し
た。温度安定性は酵素液を各温度に３０分間保持した
後、残存活性を測定した。

【００４９】図２に示す如く、本酵素はｐＨ７において
至適温度は５０−６０℃であり、５５℃では６６％の残
存活性を有する。

【００５０】（６）阻害 各種金属イオン（Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺ については５０ｍＭ、他
のイオンについては１ｍＭ）及び界面活性剤（１ｍＭ）
を活性測定時に共存させ、その影響を検討し、その結果
を表１に示す。

【００５１】本酵素は鉄イオン、銅イオン、コバルトイ
オン、銀イオン、亜鉛イオン、ニッケルイオンにより阻
害される。ＳＤＳ、ＥＤＴＡによっては阻害されない。

【００５２】

【表１】 表１ 金属イオンEDTA及びSDS 相対活性（％） − 100 Ｋ⁺ 100 Ｎａ⁺ 98 Ｃａ²⁺ 83 Ｆｅ³⁺ 28 Ｆｅ²⁺ 60 Ｍｇ²⁺ 81 Ｃｕ²⁺ 10 Ｍｎ²⁺ 66 Ｃｏ²⁺ 8 Ａｇ⁺ − Ｚｎ²⁺ 3 Ｎｉ²⁺ 32 ＳＤＳ 98 ＥＤＴＡ 108 （７）本酵素の分子量はゲル濾過ＨＰＬＣで２４０００
０、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで１２８０００と５３０００であ
る。

【００５３】（８）本酵素の等電点はｐＩ２．７であ
る。

【００５４】また、上述のようにして得られる糖転移酵
素（２）は以下の性質を有する。

【００５５】（１）作用 ２％マルトース０．４ｍｌ及び１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝７．０）０．２ｍｌに本酵素（１Ｕ）を４０℃で作
用させると、１時間後に５．０％のニゲロシルグルコー
スが、また１２時間後に３．０％のニゲロース、１６．
４％のニゲロシルグルコース及び２．３％のニゲロシル
マルトースが生成する。

【００５６】（２）基質特異性 本酵素は重合度の低いマルトオリゴ糖、例えばマルトー
ス、マルトトリオース、マルトテトラオースによく作用
し、重合度の高い可溶性澱粉、アミロース、アミロペク
チン、プルラン等には作用しにくい。また、α，β，γ
−サイクロデキストリン等の環状オリゴ糖やトレハロー
ス、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース
等には作用しない。

【００５７】（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ 本酵素は４０℃においてｐＨ６−８が至適であり、ｐＨ
５−１０で安定である。ｐＨ値と糖転移活性との関係は
図３に示す通りである。条件は酵素（１）の場合に準じ
た。

【００５８】（４）至適温度と温度安定性 図４に示す如く、本酵素はｐＨ７において至適温度は５
０−６０℃であり、５５℃では３９％の残存活性を有す
る。

【００５９】（５）阻害 結果を表２に示す。

【００６０】本酵素はカルシウムイオン、鉄イオン、銅
イオン、マンガンイオン、コバルトイオン、銀イオン、
亜鉛イオン、ニッケルイオンにより阻害される。ＳＤ
Ｓ、ＥＤＴＡによっては阻害されない。

【００６１】

【表２】 表２ 金属イオンEDTA及びSDS 相対活性（％） − 100 Ｋ⁺ 98 Ｎａ⁺ 89 Ｃａ²⁺ 33 Ｆｅ³⁺ 32 Ｆｅ²⁺ 33 Ｍｇ²⁺ 65 Ｃｕ²⁺ 8 Ｍｎ²⁺ 29 Ｃｏ²⁺ 16 Ａｇ⁺ 4 Ｚｎ²⁺ 5 Ｎｉ²⁺ 29 ＳＤＳ 94 ＥＤＴＡ 103 （７）本酵素の分子量はゲル濾過ＨＰＬＣで１４０００
０、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで７００００と５３０００であ
る。

【００６２】（８）本酵素の等電点はｐＩ３．６であ
る。

【００６３】

【作用】本発明によれば、α−１→３結合を分子内に含
むニゲロース等のオリゴ糖を効率よく大量に生産するこ
とが可能であり、この種オリゴ糖を前記の用途をはじめ
とする各種利用分野において活用することが期待され
る。

【００６４】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説
明するが、これらを本発明を限定する趣旨のものと解し
てはならない。

【００６５】実施例１ マルトース ４％、酵母エキス ０．５％、ポリペプト
ン ０．５％、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．１％、ＭｇＳＯ₄ ・
７Ｈ₂ Ｏ ０．０２％を含む１００ｍｌの培地にＡｃｒ
ｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．Ｓ４Ｇ１３を植菌し、３０℃で
２日間振とう培養することによって前培養液を得た。こ
の前培養液を上述の培地１０００ｍｌに接種し、３０℃
で２日間振とう培養した。この培養液を遠心分離して上
清液を調製し、更に限外瀘過により濃縮して、ニゲロオ
リゴ糖生成活性２５．６Ｕ／ｍｌ、α−グルコシダーゼ
活性８．１×１０^-3Ｕ／ｍｌを有する粗酵素３６ｍｌを
調製した。

【００６６】実施例２ 実施例１の方法に従って調製した粗酵素液１０ｍｌに２
％Ｇ６，７（マルトヘキサオース／ヘプタオース含有シ
ロップ）１０ｍｌを加え、４０℃で１５時間反応させ
た。更に、グルコアミラーゼ６０Ｕを含む１Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ４．５）を０．４ｍｌ加えて４０℃で２時間反
応せしめ、未反応の基質をグルコースに完全分解し、Ｈ
ＰＬＣ分析に供した。図５に示す如く２糖、３糖、４糖
及び５糖の溶出位置にグルコアミラーゼで分解されない
オリゴ糖が検出され、このオリゴ糖を分取しＮＭＲ等の
機器解析により構造を決定した。２糖の ¹Ｈ、¹³Ｃ−Ｎ
ＭＲチャートは標品ニゲロースと一致し、３糖はアセチ
ル化してＨＭＢＣ、 ¹Ｈ− ¹Ｈ ＣＯＳＹ、¹³Ｃ− ¹Ｈ
ＣＯＳＹ等の２次元ＮＭＲ解析によりニゲロシルグル
コースと同定した。同様にして４糖はニゲロシルマルト
ースと同定した。

【００６７】

【化１】

【００６８】実施例３ 実施例１の方法に従って調製した７．５ｌの培養液か
ら、限外瀘過により培養上清液（粗酵素）５００ｍｌを
調製し、マルトース１００ｇを加えて４０℃、９日間反
応させた。この反応液を混床イオン交換クロマトグラフ
ィー、活性炭処理に供して不純物及び単糖を除去した
後、精密瀘過（０．２２μｍ）した。更に、凍結乾燥法
により粉末化し、ニゲロース、ニゲロシルグルコースな
どを含むオリゴ糖含有シロップ７５ｇを得た。その分析
チャートを図６に示す。

【００６９】実施例４ 実施例１の方法に従って１５ｌの培養液から、限外瀘過
により培養上清液（粗酵素）１０００ｍｌを調製し、マ
ルトース２００ｇを加えて４０℃、９日間反応させた。
この反応液をｐＨ＝４．５に調整し、α−グルコシダー
ゼ１ｇ（天野製薬ＡＦ６０００）を加えて４０℃、１０
日間反応せしめ、未反応の基質を完全分解した。その後
混床イオン交換クロマトグラフィー、活性炭クロマトグ
ラフィーに供して、精密瀘過（０．２２μｍ）した。更
に、凍結乾燥法により粉末化し、ニゲロース３０ｇを得
た。分析チャートを図７に示す。

【００７０】実施例５（基質の種類とオリゴ糖の生成率） 実施例１の方法に従って得たα−グルコシダーゼ活性
６．０×１０^-3Ｕ／ｍｌの粗酵素液０．１ｍｌに、２％
各種基質溶液０．５ｍｌを加え４０℃、１２時間反応さ
せた。この反応液に、グルコアミラーゼ（２Ｕ 生化学
工業）を加え４０℃、１．５時間反応せしめ、未反応の
基質を完全分解した。その後、反応液をＡｍｉｄｅ−８
０ ＨＰＬＣカラム（東ソー）に供し、グルコース、ニ
ゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトー
ス及びより高重合度のオリゴ糖の生成量を分析した。図
８に示すように、上記反応条件ではグルコースには反応
せず、マルトース以上のマルトオリゴ糖および可溶性澱
粉には反応可能である。２％マルトヘキサオース／マル
トヘプタオースシラップを基質としたとき、ニゲロー
ス、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトース及び
より高重合度のオリゴ糖の総生成量が最大となった。

【００７１】実施例６（基質濃度とオリゴ糖の生成率） 実施例１の方法に従って得たα−グルコシダーゼ活性
６．０×１０^-3Ｕ／ｍｌの粗酵素液０．１ｍｌに、１
％、２％、５％、１０％可溶性澱粉またはマルトヘキサ
オース／マルトヘプタオースシラップ溶液０．５ｍｌを
加え４０℃、１２時間反応させた。この反応液に、グル
コアミラーゼ（２Ｕ 生化学工業）を加え４０℃、１．
５時間反応せしめ、未反応の基質を完全分解した。その
後、反応液をＡｍｉｄｅ−８０ ＨＰＬＣカラム（東ソ
ー）に供し、グルコース、ニゲロース、ニゲロシルグル
コース、ニゲロシルマルトース及びより高重合度のオリ
ゴ糖の生成量を分析した。図９に示したように、ともに
基質濃度が２％のときに、ニゲロース、ニゲロシルグル
コース、ニゲロシルマルトース及びより高重合度のオリ
ゴ糖の総生成量が最大となった。

【００７２】実施例７（酵素量とオリゴ糖の生成率） ２％可溶性澱粉及びマルトヘキサオース／ヘプタオース
シラップに、実施例１のようにして得たα−グルコシダ
ーゼ活性６．０×１０^-3Ｕ／ｍｌの粗酵素を、液量を変
えて添加し、４０℃、１２時間反応させた。この反応液
に、グルコアミラーゼ（２Ｕ 生化学工業）を加え４０
℃、１．５時間反応せしめ、未反応の基質を完全分解し
た。その後、反応液をＡｍｉｄｅ−８０ ＨＰＬＣカラ
ム（東ソー）に供し、グルコース、ニゲロース、ニゲロ
シルグルコース、ニゲロシルマルトース及びより高重合
度のオリゴ糖の生成量を分析した。図１０に示したよう
に、いずれの場合も粗酵素液０．１ｍｌを添加したと
き、ニゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマ
ルトース及びより高重合度のオリゴ糖の総生成量が最大
となった。

【００７３】実施例８（反応ｐＨとオリゴ糖の生成率） ２％可溶性澱粉及びマルトヘキサオース／ヘプタオース
シラップ０．５ｍｌに、実施例１の方法に従って得たα
−グルコシダーゼ活性６．０×１０^-3Ｕ／ｍｌの粗酵素
を加え、ｐＨ＝４，６，９に調整し４０℃、１２時間反
応させた。この反応液に、グルコアミラーゼ（２Ｕ 生
化学工業）を加え４０℃、１．５時間反応せしめ、未反
応の基質を完全分解した。その後、反応液をＡｍｉｄｅ
−８０ＨＰＬＣカラム（東ソー）に供し、グルコース、
ニゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルト
ース及びより高重合度のオリゴ糖の生産量を分析した。
図１１に示したように、基質がマルトヘキサオース／マ
ルトヘプタオースシラップの時は、弱アルカリ側でオリ
ゴ糖の総生成量が減少した。一方、基質が可溶性澱粉の
場合は、中性付近でオリゴ糖の総生成量が最大となっ
た。

【００７４】実施例９（反応温度とオリゴ糖の生成率） ２％可溶性澱粉及び、マルトヘキサオース／ヘプタオー
スシラップ０．５ｍｌに、実施例１の方法に従って得た
α−グルコシダーゼ活性６．０×１０^-3Ｕ／ｍｌの粗酵
素を加え、反応温度を３０，４０，５０℃と変化させ、
１２時間反応せしめた。この反応液に、グルコアミラー
ゼ（２Ｕ 生化学工業）を加え４０℃、１．５時間反応
せしめ、未反応の基質を完全分解した。その後、反応液
をＡｍｉｄｅ−８０ ＨＰＬＣカラム（東ソー）に供
し、グルコース、ニゲロース、ニゲロシルグルコース、
ニゲロシルマルトース及びより高重合度のオリゴ糖の生
成量を分析した。図１２で示したように基質が澱粉の時
は、４０℃でオリゴ糖の総生成量が最大となり、一方、
基質がマルトヘキサオース／ヘプタオースシラップの時
は４０℃、５０℃と高温になるにつれてオリゴ糖の総生
成量が増大する。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＨ値と糖転移活性との関係の説明図である。

【図２】至適温度と温度安定性との関係の説明図であ
る。

【図３】至適ｐＨ及び安定ｐＨの説明図である。

【図４】至適温度と温度安定性との関係の説明図であ
る。

【図５】ＨＰＬＣ分析結果図である。

【図６】オリゴ糖含有シロップの分析チャートである。

【図７】精製ニゲロースの分析チャートである。

【図８】基質の種別ごとのグルコース、ニゲロース、ニ
ゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトース及びより高
重合度のオリゴ糖の総生成量を示す図である。Ｇ１はグ
ルコース、Ｇ２はマルトース（以下同様）であり、但し
Ｇ６，７はマルトヘキサオース／ヘプタオースシラップ
を意味する。図９以降でも同じ。

【図９】基質濃度と、グルコース、ニゲロース、ニゲロ
シルグルコース、ニゲロシルマルトース及びより高重合
度のオリゴ糖の総生成量との関係図である。

【図１０】酵素添加量と、グルコース、ニゲロース、ニ
ゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトース及びより高
重合度のオリゴ糖の総生成量との関係図である。

【図１１】反応ｐＨと、グルコース、ニゲロース、ニゲ
ロシルグルコース、ニゲロシルマルトース及びより高重
合度のオリゴ糖の総生成量との関係図である。

【図１２】反応温度と、グルコース、ニゲロース、ニゲ
ロシルグルコース、ニゲロシルマルトース及びより高重
合度のオリゴ糖の総生成量との関係図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属し、α−１
   →３結合をもたらす糖転移酵素の１種または２種以上を
   生産する能力を有する真菌。
2. 【請求項２】 Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．Ｓ４Ｇ１
   ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３７３）。
3. 【請求項３】 Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属し、α−１
   →３結合をもたらす糖転移酵素の１種または２種以上を
   生産する能力を有する真菌を培養し、培養物中に該糖転
   移酵素を蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
   糖転移酵素の製造法。
4. 【請求項４】 培養が好気的になされる請求項３に記載
   の製造法。
5. 【請求項５】 澱粉及びその分解物の中から選ばれた基
   質に作用し、その非還元末端グルコース部の３位にグル
   コース単位をα−１→３結合する活性、並びにその後に
   α−１→３結合を保持したまま近接するα−１→４結合
   を切断して得られたオリゴ糖を低分子化する活性を有す
   る糖転移酵素。
6. 【請求項６】 本文中に規定するニゲロオリゴ糖生成活
   性とα−グルコシダーゼ活性との比が５×１０² 以上で
   ある、選択性糖転移酵素。
7. 【請求項７】 下記の性質を有する糖転移酵素（１）。 （１）２％マルトース０．４ｍｌ及び１０ｍＭ燐酸緩衝
   液（ｐＨ＝７．０）０．２ｍｌに本酵素（１Ｕ）を４０
   ℃で作用させると、１時間後に５．０％のニゲロシルグ
   ルコースが、また１２時間後に３．８％のニゲロース、
   １８．７％のニゲロシルグルコース及び３．６％のニゲ
   ロシルマルトースが生成する。 （２）本酵素は重合度の低いマルトオリゴ糖、例えばマ
   ルトース、マルトトリオース、マルトテトラオースによ
   く作用し、重合度の高い可溶性澱粉、アミロース、アミ
   ロペクチン、プルラン等には作用しにくい。また、α，
   β，γ−サイクロデキストリン等の環状オリゴ糖やトレ
   ハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パ
   ノース等には作用しない。 （３）本酵素は４０℃においてｐＨ７−８が至適であ
   り、ｐＨ４−１０で安定である。 （４）本酵素はｐＨ７において至適温度は５０−６０℃
   であり、５５℃では６６％の残存活性を有する。 （５）本酵素は鉄イオン、銅イオン、コバルトイオン、
   銀イオン、亜鉛イオン、ニッケルイオンにより阻害され
   る。ＳＤＳ、ＥＤＴＡによっては阻害されない。 （６）本酵素の分子量はゲル濾過ＨＰＬＣで２４０００
   ０、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで１２８０００と５３０００であ
   る。 （７）本酵素の等電点はｐＩ２．７である。
8. 【請求項８】 下記の性質を有する糖転移酵素（２）。 （１）２％マルトース０．４ｍｌ及び１０ｍＭ燐酸緩衝
   液（ｐＨ＝７．０）０．２ｍｌに本酵素（１Ｕ）を４０
   ℃で作用させると、１時間後に５．０％のニゲロシルグ
   ルコースが、また１２時間後に３．０％のニゲロース、
   １６．４％のニゲロシルグルコース及び２．３％のニゲ
   ロシルマルトースが生成する。 （２）本酵素は重合度の低いマルトオリゴ糖、例えばマ
   ルトース、マルトトリオース、マルトテトラオースによ
   く作用し、重合度の高い可溶性澱粉、アミロース、アミ
   ロペクチン、プルラン等には作用しにくい。また、α，
   β，γ−サイクロデキストリン等の環状オリゴ糖やトレ
   ハロース、イソマルトース、イソマルトトリオース、パ
   ノース等には作用しない。 （３）本酵素は４０℃においてｐＨ６−８が至適であ
   り、ｐＨ５−１０で安定である。 （４）本酵素はｐＨ７において至適温度は５０−６０℃
   であり、５５℃では３９％の残存活性を有する。 （５）本酵素はカルシウムイオン、鉄イオン、銅イオ
   ン、マンガンイオン、コバルトイオン、銀イオン、亜鉛
   イオン、ニッケルイオンにより阻害される。ＳＤＳ、Ｅ
   ＤＴＡによっては阻害されない。 （６）本酵素の分子量はゲル濾過ＨＰＬＣで１４０００
   ０、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで７００００と５３０００であ
   る。 （７）本酵素の等電点はｐＩ３．６である。
9. 【請求項９】 α−１→４グルコシド結合したポリサッ
   カライドまたはオリゴサッカライドを含む基質に、α−
   １→３結合をもたらす糖転移酵素のうち１種または２種
   以上を作用させることを特徴とするオリゴ糖の製造法。
10. 【請求項１０】 請求項７に規定する糖転移酵素（１）
    及び／または請求項８に規定する糖転移酵素（２）を作
    用させることを特徴とする、請求項９に記載の製造法。
11. 【請求項１１】 基質がマルトオリゴ糖であることを特
    徴とする、請求項９または請求項１０に記載の製造法。
12. 【請求項１２】 基質がマルトースであることを特徴と
    する、請求項１１に記載の製造法。